KR20140064990A - 나노구조체를 포함하는 신규의 망간 - Google Patents

나노구조체를 포함하는 신규의 망간 Download PDF

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Abstract

본원에는 같은 자리 비스포스포네이트 기를 5개 이상 포함하는 고분자 골격체를 포함하는 나노구조체로서, 상기 같은 자리 비스포스포네이트 기들은 서로 독립적으로 -R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2(식 중, R1 및 R2는 음 전하, H, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R3 및 R4 중 1개 이상은 고분자 골격체에 연결된 기이되, 다만 R3 및 R4 중 하나만이 이와 같이 연결된 기이고, R3 및 R4 중 다른 하나는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기이거나, 또는 이러한 기의 잔기이거나, 또는 H, OH, OR5 및 R5로 이루어진 군으로부터 선택되며, R5는 저급 알킬임)의 형태로서 혼입되어 있는 것인 나노구조체가 개시되어 있다. 본 발명의 고분자 골격체는 망간 이온들을 포함할 수 있다. 본원에는 또한 망간을 함유하는 나노구조체, 이러한 망간 함유 나노구조체를 포함하는 조성물, 그리고 이와 같은 망간 함유 나노구조체의 MRI 콘트라스트 제제로서의 용도도 개시되어 있다.

Description

나노구조체를 포함하는 신규의 망간{NOVEL MANGANESE COMPRISING NANOSTRUCTURES}
본 발명은 상자성 망간(II) 이온들이 혼입되어 있는 고분자 나노구조체를 킬레이트화하는 것뿐만 아니라, 상기 나노구조체를 제조하는 방법, 및 생물 재료의 가시화 또는 조영에 있어서 나노구조체의 용도에 관한 것이다.
자기 공명 조영술, 즉 MRI는 원자 핵을 자화함으로써 신체의 연조직을 가시화하는 의료용 조영 방식이다. 이 기술은, 예를 들어 신경계, 혈관계 및 종양의 조영과 같이 임상학적으로 용도가 많이 있다.
보통 신체를 구성하는 물 분자에 풍부하게 존재하는 수소 핵들이 조영되는 것이다. MRI 신호의 강도는 핵의 성질, 존재비 그리고 국소적 자성 환경에 따라서 달라진다. 이와 같은 인자들은 종 이완 시간(T1, 재자화 시간 상수) 및 횡 이완 시간(T2, 신호 감쇠 시간 상수)에 영향을 미치고, 결과적으로는 신호 강도에 영향을 주게 된다. 그러므로, MRI에 있어서 콘트라스트 원(source of contrast)은 수소 핵의 국소 농도와 자성 환경의 조합이다. T1 또는 T2 콘트라스트를 강조함으로써 다양한 형태학적 특징들이 강화될 수 있다. 국소 자성 환경은, 콘트라스트 제제가 존재함으로 인하여 변형될 수 있으며, 이 콘트라스트 제제의 자기적 특성들에 따라서 신호는 증가(포지티브 콘트라스트) 또는 감소(네거티브 콘트라스트) 할 수 있다. 포지티브 콘트라스트 제제가 종종 바람직한데, 그 이유는 휘도가 크다는 것이 콘트라스트 제제가 많이 존재한다는 것을 나타낼 때 영상을 해상하는 작업이 더욱 간단해지기 때문이다. 포지티브 콘트라스트 제제의 작용 원리는 종 이완 시간(T1)(각각의 스캔(scan) 후에 물 분자들이 얼마나 신속하게 재자화되는지를 나타내는 시간)을 단축시키는 것이다. 포지티브 콘트라스트 제제가 존재할 경우, 소정의 시간 동안 더욱 많은 신호가 수집될 수 있다.
뿐만 아니라, 화합물이 T1에 미치는 영향력은 이완율(relaxivity)로 나타내어지므로, 이완율이 커지면 신호 증가량도 많아진다. 이완율(r)은, 구조 의존적 방식으로 주파수 의존적이며, 상이한 출처의 문헌들로부터 얻어진 데이터들의 비교를 까다롭게 만든다. 임상용 MRI 스캐너의 자기장은 일반적으로 1.5테슬라(T) 또는 3테슬라이어서, 1.91T(81.3MHz의 양성자 공명 주파수에 해당하는 수치임; 합리적 타협점)에서의 이완율이 측정된다. 기타 다른 주파수, 예를 들어 60MHz에서도 이완율이 측정될 수 있다. 시판중인 가돌리늄 기반 콘트라스트 제제의 이완율은 임상학적으로 관련된 분야에서 4/mMGd/s에 가깝다.
현재는, 수용성 가돌리늄 킬레이트가 시장을 우점하고 있다. 상기 킬레이트의 물리적 크기는 작기 때문에(<1㎚), 콘트라스트 효과를 어느 정도 한정하는 세포외 공간(조직들을 이루는 세포들 간 공간과 혈액이 차지하는 공간)에 신속하게 분포된다. 상자성 금속 이온, 예를 들어 가돌리늄을 생체내에서 사용할 때의 문제점은 이 이온들이 독성을 가진다는 점인데, 현재 시판되고 있는 콘트라스트 제제 중 킬레이트가 이러한 문제점을 상당히 성공적으로 대처한다. 그러나, 최근에는 킬레이트가 소량의 가돌리늄을 방출하며, 이 가돌리늄은 신장 기능이 매우 떨어져 있을 가능성이 있는 환자에게 문제가 되고 있다는 것이 밝혀졌다(이 경우, “콩팥성 전신 섬유화증(NSF)”이라고 칭하여지는 심각한 부작용이 발생하는 것이 발견되었음(Grobner et al. Nephrology, Dialysis and Transplantation 2006, 21,1104; Sieber et al. Invest. Radiol. 2008, 43, 65)).
NSF라는 문제는, T1-단축 콘트라스트 제제로서 가돌리늄 이외에 기타 다른 것이 사용될 수 있는지에 대한 궁금증을 자아내고 있는데, 망가포디피르는 콘트라스트 제제로서 사용되고 있는 망간(II) 킬레이트이다(Elizondo, G. et al. Radiology, 178, 73, 1991). 상기 망가포디피르의 생체 내 안정성은 중간 정도이며, 주입 후 다량의 망간이 이온으로서 방출되어 간에 축적되어, 건강한 조직과 암 조직 간의 우수한 콘트라스트를 제공한다. 망간은 살아있는 유기체에 있어서 필수적인 미량 원소이므로 적당량의 망간이 방출되는 것은 그다지 심각한 문제가 아니고, 망간을 처리하는 메커니즘도 존재한다. 그러나, 망가포디피르는 판매량이 많지 않아서 현재는 생산 중단된 상태이다. 망간 이온은 가돌리늄보다 자성이 약하고, 대부분의 망간 화합물은 이완율이 낮으며, 망간 기반 콘트라스트 제제의 잠재성을 나타내는 주목할만한 예들이 몇몇 존재한다(Pan, D. et al. WIREs Nanomed Nanobiotechnol, 3, 162, 2011). 만일 유리한 특성들이, 화학적 접근 가능성이 크고, 적당한 크기를 가지며, 생체 불활성이 더욱 큰 구조체에 더하여질 수 있다면, 그것 또한 눈에 띄는 이점이 될 수 있다. 본 발명에는 이러한 점을 달성하는 재료 군이 개시되어 있다.
나노입자 기반 콘트라스트 제제 다수가 당업계에 공지되어 있다. 이것들 중 일부로서 산화 철을 기반으로 하는 제제가 간 특이적 콘트라스트 제제로서 사용된 적이 있지만, 이것 또한 판매량이 많지 않아서 더 이상 시판되고 있지 않다. 이러한 입자들을 실험상 사용하는 것에 관한 부피가 큰 문헌이 입수될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bulte, J. W. M. 및 Modo, M. M. J. Eds. “Nanoparticles in Biomedical Imaging” Springer, 2008]). 본 발명은 나노크기의 구조체들을 다루고 있지만, 이 구조체들은 보통 그것의 명칭이 의미하는 코어-외피형은 아니고, 오히려 고도로 가교된 고분자를 기반으로 한다.
MRI에 사용될 킬레이트 기들과 상자성 금속 이온들을 운반하는 고분자 재료에 관한 부피가 큰 문헌이 있다. 일반적으로 본 발명에 기술된 바만큼 높지는 안지만 이완율은 크게 증가될 수 있다. 본 출원인들이 가지고 있는 지식을 최대한으로 동원하였을 때, 상기 문헌들 중 어느 것에도 본 발명의 비스포스포네이트를 운반하는 고분자 골격체가 개시되어 있지 않다.
다음과 같은 문헌의 예들은 관련 배경 기술이 개시된 간행물의 예로서, 결코 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 해석되어서는 안된다.
문헌[Rongved P. Carbohydr Res 214, 315 (1991)]에는, 탄수화물 주쇄를 가지고 여기에 킬레이트 기들이 부착된, 일련의 고분자 재료가 기술되어 있다. 본 발명의 재료에 가장 가까운 재료는, 이완율이 20MHz에서 16/mMGd/s인 가돌리늄(III)-덱스트란 포스페이트이다. 상기 이완율은 본 발명에 개시된 재료의 이완율보다 상당히 낮다. 이 재료의 안정성은 알려져 있지 않다. 인은, 본 발명의 포스포네이트와는 반대로, 포스페이트 에스테르로서 결합된 포스페이트 기에 혼입되어 있다. 그러므로, 상기 문헌의 재료는 본 발명의 범주에 포함되지 않는다.
Rongved의 문헌에는 또한 이완율이 19.2/mMMn/s인 망간(II)-EDTA-수크로스-에피클로로히드린 접합체와, 이완율이 12.8/mMMn/s인 망간(II)-EDTA-아미노에틸덱스트란 접합체도 개시되어 있다. 상기 이완율 수치는 둘 다 본 발명의 재료들의 이완율 수치보다 상당히 낮은데, 그 이유는 특히 상기 수치들이 낮은 주파수인 20MHz에서 측정되었기 때문이다. 상기 문헌의 재료들은 본 발명의 범주에 포함되지 않는다.
WO 제2010135167호에는 폴리스티렌 기반 비스포스포네이트 재료가 기술되어 있다. 하지만, 이 기술에서는 나노구조체를 제조하려는 시도는 행하여지지 않았으며, 오히려 부피가 큰 재료를 제조하려는 시도가 행하여졌다.
상기 문헌에는 (본 발명의 고분자 기반 구조와는 대조적으로) 특이적인 화학 구조를 가지고 분자량이 매우 큰 덴드리머를 사용하는 것에 관하여 기술되어 있다.
MR 콘트라스트 제제로서 사용되는 덴드리머의 가장 널리 알려진 예로서는 가도머 17(Gadomer 17)(Turetschek, K. et al. J. Magn. Reson. Imaging 20, 138 (2004))이 있으나, 이 가도머 17은 임상용으로 사용되고 있지 않다. 이와 같이 나노 크기의 구조체에 대한 접근법은 비용이 매우 많이 드는 화학 합성법이라는 단점을 가진다. 이와 같이 비용이 많이 드는 이유는, 부분적으로 화학 단계들이 다수 존재하고, 부분적으로는 생성 가능한 다수의 불순물을 정제 및 동정하는데 어려움이 따르기 때문이다. 뿐만 아니라, 본 발명의 발명자들에 의해 실측된 이완율 수치만큼의 이완율을 가지는 제제는 본 발명의 발명자들이 알기로는 당업계에 보고된 바 없다.
거대 분자 제제를, 종양 진단 감도와 분리도를 크게 만드는 MRI 콘트라스트 제제로서 사용함에 있어 얻어지는 우수한 결과들 이면에 깔려있는 이론적 설명은, 증강된 투과 및 정체 효과(Enhanced Permeation and Retention(EPR) effect)(수동적 종양 표적화(passive tumor targeting)이라고도 칭하여짐)이다. 이는, 건강한 조직들의 모세 혈관들은 3㎚ 내지 4㎚ 초과의 분자에 실질적으로 불투과성인 반면에, 신속하게 성장하는 종양 조직의 모세 혈관들은 건강한 조직의 모세 혈관들에 비하여 상기와 같은 크기의 분자에 대한 투과성이 훨씬 크다는 사실에 바탕을 두고 있다. 결코 임의적이거나 제한적이지는 않지만, EPR 효과는 본 발명의 유리한 종양 조영 특성의 기초가 된다고 생각될 수 있다.
가돌리늄의 포스포네이트 함유 단량체 킬레이트 다수가 당업계에 공지되어 있는 반면에, 망간-인 조합체는 이보다는 덜 알려져 있지만 전혀 알려져 있지 않은 것은 아니다(Pan, D. et al. WIREs Nanomed Nanobiotechnol 3, 162, 2011). 상기 킬레이트 자체의 MRI 특성은 어떠한 방식으로든 주목될 정도는 아니지만, 보고된 킬레이트의 이완율은 중간 정도이다. 비스포스포네이트를 운반하는 것에 관한 일례는 문헌[Vitha, T. et al. Dalton Transactions p 3204 (2009)]에서 확인된다.
본 발명은 나노구조체를 포함하는 신규의 망간을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 개시 내용의 제1 양태는, 같은 자리 비스포스포네이트 기 P=O(OR1)(OR2)(본 발명의 내용에 있어서는 -R4R3C(P=O(OR1)(OR2))2-(식 중, R1 및 R2는 독립적으로 음 전하, H, 알킬 및 아릴로부터 선택됨)와 동일함)를 5개 이상 포함하거나 이 기가 5개 이상 결합되어 있는 고분자 골격체 또는 스캐폴딩(scaffolding)을 기반으로 하는 나노 크기의 구조체를 포함하는 나노구조체에 관한 것이다.
본 개시 내용의 제2 양태는, 같은 자리 비스포스포네이트 기 P=O(OR1)(OR2)(본 발명의 내용에 있어서는 상기 언급된 바와 같이 -R4R3C(P=O(OR1)(OR2))2-(식 중, R1 및 R2는 독립적으로 음 전하, H, 알킬 및 아릴로부터 선택됨)와 동일함)를 5개 이상 포함하거나 이 기가 5개 이상 결합되어 있는 고분자 골격체 또는 스캐폴딩을 기반으로 하는 나노 크기의 구조체에 혼입되어 있는, 상자성 망간 이온들을 포함하는 나노구조체에 관한 것이다.
“나노 크기의”란 용어는, 일반적으로 100㎚보다 작은 것을 포함하는 것으로 해석되지만, 본 발명의 중심 사상은, 대체로 구형을 띄고 있으며, 평균 크기(수력학적 직경)가 1㎚ 내지 100㎚, 또는 몇몇 구체예에서는 2㎚ 내지 50㎚, 3㎚ 내지 10㎚ 또는 3㎚ 내지 7㎚인 고도의 분지형 또는 가교형 구조를 가지는 실체이다.
본 개시 내용의 제2 양태는, 망간 이온들을 포함하는 것과 이러한 이온들을 포함하지 않는 것 둘 다와 같은 형태의 나노구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 개시 내용의 제3 양태는, 이러한 나노구조체, 특히 상자성 망간 이온들을 포함하는 나노구조체를 포함하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물과, 이러한 나노구조체, 특히 상자성 망간 이온들을 포함하는 나노구조체의 임상용 콘트라스트 제제, 특히 MRI용 콘트라스트 제제로서의 용도에 관한 것이다.
선행 기술과 비교되었을 때 본원에 개시된 나노구조체의 몇 가지 이점들로서는, 현재 시판중인 재료의 이완율보다 10배 더 큰 이완율을 가지고, 또한 종양 조직에 선택적으로 축적되기에 적당한 크기와 우수한 생체 관용성(biotolerability)을 가진다는 점을 들 수 있다. 이와 같은 이점들은, 본 발명의 나노구조체, 특히 상자성 망간 이온들을 포함하는 나노구조체를, MRI용, 특히 종양 조영용 콘트라스트 제제로서 적당하도록 만든다.
뿐만 아니라, 상자성 성분으로 가돌리늄 대신 망간을 사용하면, 가돌리늄과 관련하여 독성에 대한 문제점을 피하게 된다.
비교적 희소한 가돌리늄 대신에 풍부하게 존재하는 망간을 사용한다는 점도 본 발명의 재료 제조시 비용면에서 유리하게 작용한다.
이하 실시예는 본원에 첨부된 도면들을 참고로 기술되어 있다:
도 1은 본 발명에 의한 나노입자를 얻는 방법을 개략적으로 나타낸 것이고,
도 2는 종양이 발생된 마우스에 본 발명의 나노입자를 주사한 후 5시간 경과시 콘트라스트가 증가하였음을 나타낸 것이다.
도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d는 실시예 23에 기술된 전도도 적정 실험에 관한 곡선이다.
도 4a 및 도 4b는 예비 면역 컬럼(도 4a) 및 면역 컬럼(도 4b) 중 1번 내지 10번 분획들의 SI055 회수량을 도시하는 것이다.
특정 구체예
1. 같은 자리 비스포스포네이트 기를 5개 이상 포함하는 고분자 골격체에 망간 이온들이 혼입 포함되어 있는 나노구조체로서, 같은 자리 비스포스포네이트 기들은 서로 독립적으로
-R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2
(이는 -R4R3C(P=O(OR1)(OR2))2와 동일함)
(식 중, R1 및 R2는 음 전하, H, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R3 및 R4 중 1개 이상은 고분자 골격체에 연결된 기이되, 다만 R3 및 R4 중 하나만이 이와 같이 연결된 기이고, R3 및 R4 중 다른 하나는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기이거나, 또는 이러한 기의 잔기이거나, 또는 H, OH, OR5 및 R5로 이루어진 군으로부터 선택되며, R5는 저급 알킬임)의 형태로서 혼입되어 있는 나노구조체.
2. 망간 이온이 망간(II) 이온인, 구체예 1에 의한 나노구조체.
3. R1 및 R2는 독립적으로 음이온, H, 알킬 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구체예 1 또는 2에 의한 나노구조체.
4. 고분자 골격체에 연결된 기 및/또는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기, 또는 이러한 기의 잔기는
(CH2)n Si(Rx)3(식 중, Rx는 독립적으로 저급 알킬, OH, O- 또는 O-이고, "-"는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타내며, n은 1 내지 5임),
(CH2)nCORy(식 중, Ry는 O-, NH2, NHRz, NRz 2 또는 고분자 골격체에 대한 결합이고, Rz는 저급 알킬이며, n은 1 내지 5이고, "-"는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타냄), 및
(CH2)nSO2Ry(식 중, Ry는 O-, NH2, NHRz, NRz 2 또는 고분자 골격체에 대한 결합이고, Rz는 저급 알킬이며, n은 1 내지 5이고, "-"는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타냄)
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구체예 1 내지 구체예 3 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
5. 실리콘 원자를 포함하는, 구체예 1 내지 구체예 4 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
6. R3 및/또는 R4는 -(CH2)n-Si(Rx)3(식 중, Rx는 독립적으로 저급 알킬, OH, O- 또는 O-이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타내며, n은 1 내지 5임)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구체예 1 내지 구체예 5 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
7. 나노구조체의 수력학적 직경이 2㎚ 내지 50㎚인, 구체예 1 내지 구체예 6 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
8. 나노구조체의 수력학적 직경이 3㎚ 내지 10㎚인, 구체예 1 내지 구체예 7 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
9. 나노구조체의 수력학적 직경이 3㎚ 내지 7㎚인, 구체예 1 내지 구체예 8 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
10. 나노구조체의 수력학적 직경이 10㎚ 내지 50㎚인, 구체예 1 내지 구체예 7 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
11. 나노구조체의 수력학적 직경이 10㎚ 내지 20㎚인, 구체예 1 내지 구체예 7 및 10 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
12. 고분자 골격체가 같은 자리 비스포스포네이트기 1개와 유기 옥시실란기 2개를 함유하는 단량체 잔기들을 포함하는, 구체예 1 내지 구체예 11 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
13. 고분자 골격체가 폴리에틸렌이민으로부터 유래되는, 구체예 1 내지 구체예 11 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
14. P/N 몰비가 0.1 내지 3인, 구체예 13에 의한 나노구조체.
15. P/Mn 몰비가 7 내지 20인, 구체예 1 내지 구체예 14 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
16. Si/Mn 몰비가 5 내지 20인, 구체예 5, 또는 구체예 5에 종속될 때 구체예 6 내지 구체예 12, 구체예 14 및 구체예 15 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
17. Si/P 몰비가 0.7 내지 1.3인, 구체예 5, 또는 구체예 5에 종속될 때 구체예 6 내지 구체예 16 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
18. 망간 이온들이 포스포네이트 기들에 배위되어 있는, 구체예 1 내지 구체예 17 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
19. 상기 나노구조체의 외곽 부에 결합된 친수성 기들을 추가로 포함하는, 구체예 1 내지 구체예 18 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
20. 친수성 기들이 -(CH2CH2O)nCH3 부(식 중, n은 4 내지 50임)를 포함하는, 구체예 19에 의한 나노구조체.
21. 고분자 골격체가 일반 구조
{(X7aO)(X7bO)PO}2-(C){(CH2)nSi(OX7c)(OX7d)(OX7e)}{(CH2)oSi(OX7c)(OX7d)(OX7e)}
(상기 식 중, X7a, X7b, X7c, X7d, X7e는 독립적으로 H, C1-8 알킬 및 벤질로부터 선택되고; n 및 o는 독립적으로 1 내지 5로부터 선택됨)
의 단량체 잔기들을 포함하는, 구체예 1 내지 구체예 20 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
22. 구체예 1 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 의한 나노구조체를 포함하는 조성물.
23. 구체예 1 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 의한 나노구조체를 포함하는 약학 조성물.
24. 구체예 1 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 의한 나노입자, 또는 구체예 22 또는 23에 의한 조성물의 MRI 콘트라스트 제제로서의 용도.
25. 같은 자리 비스포스포네이트를 포함하는 고분자 골격체의 나노구조체를 얻는 단계 및
상기 나노구조체를 망간 이온들과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 구체예 1 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 의한 나노구조체를 얻는 방법.
26. 나노구조체가 한외 여과에 의해 정제되는 단계를 추가로 포함하는, 구체예 25에 의한 방법.
27. 같은 자리 비스포스포네이트가 폴리에틸렌이민으로부터 유래된 고분자 골격체에 그라프트된 후 여기에 망간 이온들이 로딩되는, 구체예 13, 또는 구체예 13에 종속될 때 구체예 14 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 의한 나노구조체를 제조하는 방법.
28. 상기 실란이, 물과 혼화될 수 있는 기타 다른 용매(들) 1개 이상과 물을 함유하는 용매 혼합물 중에 제공되는, 구체예 12, 또는 구체예 12에 종속될 때 구체예 13 내지 구체예 21 중 임의의 하나에 의한 나노입자를 제조하는 방법.
29. 구체예 25 내지 구체예 28 중 임의의 하나에 의한 방법에 의해 얻을 수 있는 생성물.
30. 같은 자리 비스포스포네이트 기들을 5개 이상 포함하는 고분자 골격체를 포함하는 나노구조체로서, 같은 자리 비스포스포네이트 기는 각각 독립적으로
-R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2
(이는 -R4R3C(P=O(OR1)(OR2))2와 동일함)
(식 중, R1 및 R2는 음 전하, H, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R3 및 R4 중 1개 이상은 고분자 골격체에 연결된 기이되, 다만 R3 및 R4 중 하나만이 이와 같이 연결된 기이고, R3 및 R4 중 다른 하나는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기이거나, 또는 이러한 기의 잔기이거나, 또는 H, OH, OR5 및 R5로 이루어진 군으로부터 선택되며, R5는 저급 알킬임)
의 형태로서 혼입되어 있는 나노구조체.
31. R1 및 R2는 독립적으로 음 전하, H, 알킬 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구체예 30에 의한 나노구조체.
32. 고분자 골격체에 연결된 기 및/또는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기, 또는 이러한 기의 잔기가
(CH2)n Si(Rx)3(식 중, Rx는 독립적으로 저급 알킬, OH, O- 또는 O-이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타내며, n은 1 내지 5임),
(CH2)nCORy(식 중, Ry는 O-, NH2, NHRz, NRz 2 또는 고분자 골격체에 대한 결합이고, Rz는 저급 알킬이며, n은 1 내지 5이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타냄), 및
(CH2)nSO2Ry(식 중, Ry는 O-, NH2, NHRz, NRz 2 또는 고분자 골격체에 대한 결합이고, Rz는 저급 알킬이며, n은 1 내지 5이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타냄)
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구체예 30 또는 구체예 31에 의한 나노구조체.
33. 실리콘 원자들을 포함하는, 구체예 30 내지 구체예 32 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
34. R3 및/또는 R4는 -(CH2)n-Si(Rx)3(식 중, Rx는 독립적으로 저급 알킬, OH, O- 또는 O-이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타내며, n은 1 내지 5임)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구체예 30 내지 구체예 33 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
35. 나노구조체의 수력학적 직경이 2㎚ 내지 50㎚인, 구체예 30 내지 구체예 34 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
36. 나노구조체의 수력학적 직경이 3㎚ 내지 10㎚인, 구체예 30 내지 구체예 35 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
37. 나노구조체의 수력학적 직경이 3㎚ 내지 7㎚인, 구체예 30 내지 구체예 36 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
38. 나노구조체의 수력학적 직경이 10㎚ 내지 50㎚인, 구체예 30 내지 구체예 35 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
39. 나노구조체의 수력학적 직경이 10㎚ 내지 20㎚인, 구체예 30 내지 구체예 35 및 구체예 38 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
40. 고분자 골격체가 같은 자리 비스포스포네이트기 1개와 유기 옥시실란기 2개를 함유하는 단량체 잔기들을 포함하는, 구체예 30 내지 구체예 39 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
41. 고분자 골격체가 폴리에틸렌이민으로부터 유래되는, 구체예 30 내지 구체예 40 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
42. P/N 몰비가 0.1 내지 3인, 구체예 41에 의한 나노구조체.
43. Si/P 몰비가 0.7 내지 1.3인, 구체예 33, 또는 구체예 33에 종속될 때 구체예 34 내지 구체예 42 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
44. 상기 나노구조체의 외곽 부에 결합된 친수성 기들을 추가로 포함하는, 구체예 30 내지 구체예 43 중 임의의 하나에 의한 나노구조체.
45. 친수성 기들이 -(CH2CH2O)nCH3 부(식 중, n은 4 내지 50임)를 포함하는, 구체예 44에 의한 나노구조체.
46. 고분자 골격체가 일반 구조
{(X7aO)(X7bO)PO}2-(C){(CH2)nSi(OX7c)(OX7d)(OX7e)}{(CH2)oSi(OX7c)(OX7d)(OX7e)}
(상기 식 중, X7a, X7b, X7c, X7d, X7e는 독립적으로 H, C1-8 알킬 및 벤질로부터 선택되고; n 및 o는 독립적으로 1 내지 5로부터 선택됨)
의 단량체 잔기들을 포함하는, 구체예 30 내지 구체예 45 중 임의의 하나에 의한 나노구조체:
용어의 정의
본원에 사용된 “나노구조체”란 용어는, 총 직경이 1㎚ 내지 100㎚이고, 본질적으로 구의 형태를 가지는(즉 플레이크, 막대, 튜브 및 리본 형태를 제외) 실체를 말한다. 본원에 사용된 상기 용어는, 종종 무기질 또는 금속 코어와 유기 코팅을 가지는“코어-외피 나노입자” 또는 단지 “나노입자”라고 칭하여지는 구조들은 제외한다.
본원에 사용된 “고분자 골격체”란 용어는, 분지가 많은 나무와 유사한 구조 또는 가교가 많은 망상 구조를 이루는, 원자들의 공유 결합 기를 말한다. 고분자 골격체는 공유 결합을 통한 단량체들 및/또는 올리고머들 및/또는 가교제들의 결합으로 형성된다. 통상의 단량체는 고분자 화학에 관한 교과서, 예를 들어 문헌[J. R. Fried, “Polymer Science and Technology” Prentice Hall 1995]에서 찾아볼 수 있다. 단량체의 몇 가지 예로서는 스티렌, 프로필렌, 에틸렌, 테트라플루오로에틸렌, 트리플루오로에틸렌, 디플루오로에틸렌, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 하이드록시에틸 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, H2N-(CH2)n-COOH(식 중, n은 1 내지 10임), 3-아미노벤조산, 4-아미노벤조산, N-비닐 피롤리돈 및 실리콘 전구체, 예를 들어 (CH3COO)2Si(CH3)2가 있다. 고분자의 몇 가지 예로서는 단량체들의 매칭 짝(matching pair)들, 예를 들어 테레프탈산 + 1,4-디아미노 벤젠, 테레프탈산 + 에틸렌 글리콜, 그리고 HCOOH-(CH2)nCOOH + H2N-(CH2)m-NH2(식 중, n 및 m은 독립적으로 1 내지 10임)로 구성된 고분자들이 있다. 단량체 단위가 2개 내지 10개 결합되어 있는 올리고머는 전구체로서 사용될 수 있다. 상기 단량체들의 결합된 기들과 상이한 올리고머에 관한 몇 가지 예로서는 환형 또는 다환형 실란, 예를 들어 헥사메틸시클로트리실록산, 2,4,6,8-테트라메틸시클로테트라실록산 및 데카메틸시클로펜타실록산이 있다. 통상의 가교제들은 고분자 화학에 관한 교과서, 예를 들어 문헌[J. R. Fried, “Polymer Science and Technology” Prentice Hall 1995]에서 찾아볼 수 있다. 가교제의 몇 가지 예로서는 N,N’-메틸렌비스(아크릴아미드), 에피클로로하이드린, 디비닐벤젠, 1,3-디비닐테트라메틸디실록산, 1,3-페닐렌디이소시아네이트, 3,3’-비페닐테트라카복실산 2무수물, 1,4-부탄디올디비닐에테르, 테트라에톡시실란, 올리고실리케이트, 예를 들어 메타 실리케이트, 또는 실세퀴옥산, 유기 실란, 예를 들어 비스(트리에톡시실릴)메탄, 비스(트리에톡시실릴)에탄, 비스(트리에톡시실릴)프로판, 비스(트리에톡시실릴)부탄, 메틸 트리에톡시실란, 에틸 트리에톡시실란 및 프로필 트리에톡시실란이 있다.
이와 같은 고분자 골격체는 나노구조체의 주쇄를 이룬다. 당업자는, 중합 과정의 무작위성이, 재료들을, 유사하되 동일하지는 않은 다수의 분지 패턴들, 가교 위치들 및 분자량을 가지는 조합체로 만든다는 사실을 알게 되었다.
“같은 자리 비스포스포네이트 기”라는 용어는, 하나의 탄소 원자에 의해 분리되어 있는 2개의 포스포네이트 기, 즉 동일한 탄소에 결합된 포스포네이트 기들을 말한다. 이와 같은 같은 자리 비스포스포네이트 기를 포함하는 화합물들은 종종 1,1-비스포스포네이트(또는 1,1-디포스포네이트)라고 칭하여지기도 한다. 같은 자리 비스포스포네이트 기 중에 존재하는 포스포네이트 기들은 치환될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 포스포네이트 기들은 각각 화학식 -P=O(OR1)(OR2)(식 중, R1 및 R2는 독립적으로 음 전하, H, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 가진다.
“고분자 골격체에 결합된 기”라는 용어는, 공유 결합이 명백하게 고분자 골격체의 수소 원자를 치환하는 화학 기를 말한다. 이러한 정의에 포함되는 화학 기들로서는 일반적으로 탄화수소, 에테르, 아미드 또는 에스테르의 길이가 짧은 선형 잔기들이 있다. 통상적인 몇 가지 예로서는 -(CH2)n-, -(CH2)nCO-, -(CH2)nCOO-, -(CH2)nCONH- 및 -(CH2)nSi(O-)3이 있다. 이와 같은 내용 중 “길이가 짧은”이란 용어는 n이 1 내지 8인 경우를 말한다.
“고분자 골격체의 기 형성부”란 용어는, 2개의 포스포네이트 기들이 고분자 골격체의 동일한 탄소 원자 상에 존재하는 부를 말한다.
“고분자 골격체에 결합될 수 있는 기”란 용어는, 고분자 골격체에 결합되는 것으로 칭하여지는 상기 기들의 전구체들을 말한다. 이에 관한 몇몇 예로서는 -(CH2)nOH, -(CH2)nBr, -(CH2)nCOCl-, -(CH2)nCOCH3, -(CH2)nCOCH2CH3, -(CH2)nCOO-, -(CH2)nCONH2 및 (CH2)nSi(OEt)3가 있다.
본원에 사용된“생체 불활성”이란 용어는, 재료가 생체 적합성인 경우, 즉 재료가 살아있는 유기체에 무해한 동시에 생체 내 분해에 안정한 경우를 말한다.
본원에 사용된“DLS”란 용어는, 입자 크기 분석 방법인 동적 광 산란(광자 상관 분광 분석법 또는 준 탄성 광산란이라고도 칭하여질 수 있음)의 두문자어이다. 상세한 설명 및 특허 청구의 범위에 언급된 바와 같은 소정의 DLS 크기는, 달리 특정되지 않은 한, 이온 세기가 150mM NaCl인 중성 수용액 중(25℃)에서 측정된 샘플의 용적 평균 피크가 최대인 위치를 말한다.
본원에 사용된“구형의”란 용어는, 단축이 장축의 절반보다 작은 형태를 가지는 나노구조체(즉 구조체의 (무게) 중심 점을 통과하는 최장 축이 동일한 점을 통과하는 최단 축의 길이의 2배 이하인 나노구조체)를 일컫는 의미를 가진다.
본원에 사용된 “친수성 유기 잔기”란 용어는, 수성 용매 중 가용성을 증강시키는 유기 잔기를 말하는 것으로서, 본 발명에 있어서는 생체 불활성이되, 다만 폴리펩티드와 복합 탄수화물은 제외되는 잔기를 함축하는 의미를 갖는다. 적당한 친수성 유기 잔기들의 예로서는, 분자 조성이 (aO+bN)/(cC+dS+eSi+fP) > 0.3(여기서, a, b, c, d, e 및 f는 각각 산소(O), 질소(N), 탄소(C), 황(S), 실리콘(Si) 및 인(P)의 몰 백분율임)인 임의의 탄소 함유 기가 있다.
본원에 사용된 “활성화 실란”이란 용어는, 화학식 RnSi(X)4-n(식 중, X는 알콕시 기, 아릴옥시 기, 할로겐, 디알킬아미노 기, 질소 함유 복소환 또는 아실옥시 기임)을 가지는 실란을 말한다.
본원에 사용된 “옥시실란”이란 용어는, 1개 이상의 산소 원자가 실리콘 원자에 결합되어 있는 임의의 유기 화합물을 말한다. 이에 관한 비제한적 예로서는 다음과 같은 것들이 있다:
Figure pct00001
본원에 사용된 “유기 실란”이란 용어는, 1개 이상의 탄소실리콘 결합을 포함하는 유기 화합물을 말한다.
본원에 사용된 “유기-옥시실란”이란 용어는, 1개 이상의 탄소 원자와 1개 이상의 산소 원자가 실리콘 원자와 결합하여 포함되어 있는 유기 화합물을 말한다. 이에 관한 비제한적인 예로서는 다음과 같은 것들이 있다:
Figure pct00002
본원에서 “탄화수소” 및 “탄화수소 사슬”이란 용어는, 수소와 탄소로 이루어진 유기 잔기를 나타내는 의미로 사용된다. 탄화수소는 전체가 포화될 수 있거나, 아니면 1개 이상의 불포화 결합을 포함할 수 있다. 탄화수소는 탄소 원자를 임의의 수(1개 내지 50개)만큼 포함할 수 있다.
본원에 사용된 “알킬”이란 용어는, 전체가 포화된(이중 결합 또는 삼중 결합을 포함하지 않는) 탄화수소 기를 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 말한다. 본 발명에 있어서 알킬 기는 1개 내지 15개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 본 발명의 화합물 중 알킬 기는 “C1-15알킬” 또는 유사한 명칭으로 명명될 수 있다. 통상의 알킬 기로서는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸 및 헥실 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된“저급 알킬”이란 용어는, 탄소 원자를 1개 내지 8개 가지는 알킬을 말한다.
본원에 사용된“저급 알코올”이란 용어는, 탄소 원자를 1개 내지 8개 가지는 알코올을 말한다.
달리 특정되지 않는 한, 본원에 있어서 수치의 범위, 예를 들어 “1 내지 8”또는 “1~8”은, 이러한 범위에 속하는 각각의 정수를 일컫는데; 예를 들어 “1개 내지 8개의 탄소 원자”란 어구는, 알킬 기가 1개의 탄소, 2개의 탄소, 3개의 탄소 등으로부터 8개 이하의 탄소를 포함할 수 있는 경우를 의미한다. 그러나, 당업자들에게 명백한 예외도 몇 가지 존재한다. 특히 본원에 있어서 수치 범위가, 나노구조체 내 몰비, 예를 들어 P/N 몰비 또는 Si/P 몰비, 직경 또는 크기, pH, 기간(시간), 농도, 삼투압 또는 온도에 대해 주어질 때, 상기 범위는 이 범위에 포함되는 모든 십진수들도 포함한다.
본원에 사용된 “알콕시”란 용어는, 화학식 -OR(식 중, R은 C1-8알킬임)인 기, 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시(이소프로폭시), n-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, 아밀옥시 및 이소-아밀옥시 등을 말한다. 알콕시는 선택적으로 치환될 수도 있다.
본원에 사용된 “아릴옥시”란 용어는, 화학식 RO-(식 중, R은 아릴임)인 기를 말하는데, 여기서, “아릴”이란, 전체가 비국소화된 pi-전자계를 가지는, 2개 이상의 고리가 융합된 경우(고리가 2개의 인접한 탄소 원자들을 공유하는 경우) 또는 탄소환(모두 탄소인) 고리를 말한다. 아릴 고리는 4원 내지 20원 고리일 수 있다. 아릴 기의 예로서는 벤젠, 나프탈렌 및 아줄렌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아릴 기, 예를 들어 페녹시, 나프탈레닐옥시, 아줄레닐옥시, 안트라세닐옥시, 나프탈레닐티오 및 페닐티오 등은 선택적으로 치환될 수도 있다. 아릴옥시는 선택적으로 치환될 수도 있다.
본원에 사용된 “아실”이란 용어는, 카보닐 기, 즉 -C(=O)-를 말한다.
본원에 사용된 “아실옥시”란 용어는, 카보닐 기를 통하여 산소 원자가 결합되어 있는 경우, 즉 -C(=O)-O-를 말한다.
본원에 사용된 “복소환”이란 용어는, 탄소 원자들과, 1개 내지 5개의 이종 원자들(질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 포함하는 안정한 3원 내지 18원 고리를 말한다. 복소환은 단일환, 이환 또는 삼환일 수 있다.
본원에 사용된 “강염기”란 용어는, 본 발명의 내용 중 수산화물보다 더욱 강하되 수성 환경과는 혼화될 수 없는 염기를 말한다.
본원에 사용된 “수력학적 직경”이란 용어는, 입자가 확산되는 속도와 동일한 속도로 확산되는, 가설에 의한 경질 구의 직경을 말한다. 수화 및 형태는 상기 구의 행동에 포함된다. 상기 용어는 또한 “스톡스 직경(stokes diameter)” 또는 “스톡스-아인슈타인 직경(Stokes-Einstein diameter)”이라고도 알려져 있다.
본원에 사용된 “접합체”란 용어는, 형광 마커, 염료, 스핀-표지, 방사성 마커, 생물 수용체에 대한 리간드, 킬레이트, 효소 억제제, 효소 기질, 항체 또는 항체 관련 구조체인 분자 실체를 말한다. 이에 관한 배경은, 예를 들어 문헌[“Bioconjugate Techniques”, Greg T. Hermanson second edition, Elsevier 2008, ISBN 978-0-12-370501-3]을 참조한다.
“접합을 위한 핸들(handle for conjugation)” 및 “결합점”이란 용어는, 상기 정의된 바와 같이 둘 다 고분자 망상 구조와 결합할 수 있거나 여기에 혼입될 수 있되 접합체에 결합될 수 있는, 2작용성 분자의 반응성 기 1개를 말한다. 통상적이되 독점적이지는 않은 예로서는 (EtO)3SiCH2CH2CH2NH2이 있다.
두문자어 TEOS는 테트라에톡시실란을 나타낸다.
두문자어 DCM은 디클로로메탄을 나타낸다.
축약어 “비스비스”는 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄으로서, 실시예 1b의 생성물을 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
제1 양태에 있어서, 본 발명은 다수 개의 포스포네이트 기, 즉 -P=O(OR1)(OR2)(식 중, R1 및 R2는 독립적으로 음 전하, H, 알킬 또는 아릴로부터 선택됨)를 포함하거나 이 기가 결합되어 있는 고분자 골격체 또는 스캐폴딩을 기반으로 하는 나노 크기의 구조체(나노구조체)에 혼입되어 있는 상자성 망간 이온을 다루고 있다. R1 또는 R2 중 1개 이상이 H일 때, 생성되는 포스폰산은 pH에 의존하는 방식으로 이온화된다.
상기 언급된 바와 같이, “나노구조체”라는 용어는 총 직경이 1㎚ 내지 100㎚인 구조체를 말한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, R1 및 R2는 독립적으로 음 전하, H 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.
비스포스포네이트 기들을 분리하는 탄소 원자, 즉 개입성 탄소 원자의, 고분자 골격체에 대한 결합은 1개 이상 존재한다. 그러므로, 개입성 탄소 원자는 고분자 골격체의 일부일 수 있거나, 아니면 여기에 결합될 수 있다. (R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2(식 중, R1 및 R2 는 독립적으로 H, 알킬 또는 아릴로부터 선택되고, R3 및 R4 중 1개 이상은 재료의 고분자 골격체에 결합될 수 있는 기임) 형태를 가지는 구조체가 특히 유리하다. R3 및 R4 중 어느 하나만이 이와 같은 기인 경우, 나머지 기는 H, OH, OR5(식 중, R5는 저급 알킬임) 및 저급 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, R3 및/또는 R4는 -(CH2)n-Si(Rx)3(식 중, Rx는 독립적으로 저급 알킬, OH, O- 또는 O-이고, 여기서, “-”는 고분자 골격체와의 결합을 나타내며, n은 1 내지 5임)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, R3은 -(CH2)nCO-(식 중, 카보닐 기는 고분자 골격체와 결합을 형성함)이고, R4는 H이며, n은 1 내지 5이다. 이와 같은 구체예들 중 일부에 있어서, n은 1이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, R3 및 R4는 독립적으로 -(CH2)n-SiO3(식 중, n은 1 내지 5이고, 실란은 본 명세서의 후반부에 상세히 기술되어 있는 바와 같이 Si-O-Si 결합을 형성함으로써 고분자 골격체의 일부가 됨)이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, R3 및 R4는 둘 다 -(CH2)n-SiO3이다(식 중, n은 3이고, 실란은 상기 방식으로 상기 고분자 골격체의 일부가 됨).
뿐만 아니라, 본원에 기술된 화합물들을 제조하는데 사용되는 출발 물질들 또는 성분들로서 포스폰 에스테르 또는 포스폰산 대신에 포스폰 아미드, 염화물 또는 플루오르화물을 사용하는 것도 고려될 수 있다. 포스포네이트는 유리된 형태로 존재할 수 있거나, 에스테르, 아미드 또는 이것들의 임의의 혼합물로서 존재할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 포스포네이트는 유리 포스포네이트와 이 포스포네이트의 메틸 에스테르의 혼합물이다.
상기 포스포네이트 기가 결합되어 있는 고분자 골격체는, 예를 들어 고분자 화학에 대한 임의의 교과서(예를 들어, 문헌[J. R. Fried, “Polymer Science and Technology” Prentice Hall 1995])에서 찾아볼 수 있는 바와 같이 널리 공지된 단량체들 다수 개로 구성될 수 있다. 일부 비제한적 예로서는, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아미드, 폴리스티렌, 폴리디메틸실록산(실리콘), 폴리유기실란, 폴리아민, 예를 들어 폴리에틸렌이민 또는 탄수화물; 특히 고도로 분지되었거나 가교된 구조체가 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 개시 내용에 의한 나노구조체는 대체로 구형을 띠고 있으며, 평균 크기(수력학적 직경)가 1㎚ 내지 100㎚인 구조체인데; 몇몇 구체예에서 평균 크기는 2㎚ 내지 50㎚일 수 있고, 다른 구체예에서 평균 크기는 3㎚ 내지 10㎚ 또는 3㎚ 내지 7㎚ 또는 10㎚ 내지 50㎚ 또는 10㎚ 내지 20㎚일 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예, 즉 정맥 콘트라스트 제제로 사용되는 비제한적 예에서, 나노구조체의 평균 수력학적 직경은 3㎚ 내지 7㎚이다.
본 발명의 몇몇 구체예, 예를 들어 재료가 림프절 조영용으로 사용되는 구체예에서, 나노구조체의 평균 수력학적 직경은 10㎚ 내지 50㎚ 또는 10㎚ 내지 20㎚이다.
본 발명에 언급된 수력학적 직경이란, 스톡스-아인슈타인 등식에 따라서 확산 계수로부터 산정되는, 균등한 경질 구의 직경이다. 상기 확산 계수는 동적 광 산란(DLS) 기술에 의해 얻어진 시간 의존적 광 산란 데이터로부터 산정된다. 본 발명의 나노구조체와의 비교 대상으로서, 소 혈청 알부민의 수력학적 직경은 수용액 중 DLS에 의해 측정되는 바에 따르면 6.5㎚인 것으로 확인된다(결정 구조와 많이 일치됨). 수 평균, 용적 평균 또는 산란 강도 평균 중 어느 것이 사용되는지에 따라서, 수치들은 어느 정도 차이가 있을 수 있다. 용적 평균은 재료 덩어리의 크기가 얼마만큼의 입자 크기에 해당하는지를 나타내므로, 일반적으로 용적 평균이 가장 유용하다. 본 명세서에 언급된 평균 직경이란, 용적 평균을 말한다.
본 발명에서 목표로 하는 구형 구조를 형성하기 위해서 분지형 구조나 망상 유사 구조를 가지는 구조체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 망상 구조를 형성하기 위한 한 가지 확립된 방법으로서는, 일정 분율의 2작용성 단량체들을 중합 과정에 포함시킴으로써 가교를 도입하는 방법이 있다. 널리 공지된 예로서는 폴리스티렌과 디비닐벤젠을 가교시키는 것이 있다.
분지 구조체는, 단량체 내에 반응성 위치를 1개 이상 마련함으로써 형성될 수 있다(“The architecture and surface behavior of highly branched molecules” Peleshanko, S., Tsukruk, V. V., Prog. Polym. Sci. 33, 523 (2008)). 널리 공지된 예로서는, 아지리딘을 중합하여 형성된, 고도로 분지화된 폴리에틸렌이민이 있다. 폴리에틸렌이민은 1차, 2차 및 3차 아미노 기들을 조합하여 함유하고, 또한 이하 반응식에 나타낸 바와 같이 무작위 분지 구조를 가진다. 정확한 구조는 오로지 통상적인 것으로서 해석되어야 하지, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명에서 중요한 역할을 하는 비스포스포네이트는 1차 및/또는 2차 아미노 기들에 결합될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 고분자 골격체는 폴리에틸렌이민이다. 통상적인 폴리에틸렌이민 구조체의 단편은 이하에 나타내어져 있다. 점선으로 표시된 결합은 고분자 망상 구조가 계속됨을 나타낸다.
Figure pct00003
폴리아크릴레이트 골격체에 비스포스포네이트가 혼입될 때, 길이가 짧은 링커를 통해 이 비스포스포네이트를 아미드 질소에 결합시키는 것이 고려될 수 있다. 이와 같은 재료로부터 유래된 구조 단편의 통상적이되 비제한적인 예는, 이하 구조를 가질 것이다(하기 구조식 중, R1 및 R2는 본 발명의 명세서 초반에 정의된 바와 같고, n은 1 내지 5이며, 점선으로 표시된 결합들은 단편이 고분자에 포함된다는 것을 나타냄). 또한, 비스포스포네이트를 탄소 골격에 직접 결합시키는 것도 고려될 수 있다.
Figure pct00004
다환 방향족 기반 골격체, 예를 들어 폴리스티렌 또는 폴리비닐피리딘도 구현될 수 있다. 이후, 비스포스포네이트는 방향족 계에 결합된다. 폴리아미드, 예를 들어 폴리비닐피롤리디논도 고려될 수 있다.
본 발명의 구형 나노구조체를 형성하는데에는 가교 정도가 적당해야 한다. 2작용성, 3작용성 또는 4작용성 가교제의 1% 내지 100%가 혼입되는 것이 바람직하다. 통상의 가교제에 관한 비제한적 예로서는, N,N’-메틸렌비스(아크릴아미드), 에피클로로히드린, 디비닐벤젠, 1,3-디비닐테트라메틸디실록산, 1,3-페닐렌디이소시아네이트, 3,3’-비페닐테트라카복실산 2무수물, 1,4-부탄디올디비닐에테르, 테트라에톡시실란, 올리고실리케이트, 예를 들어 메타 실리케이트, 또는 실세퀴옥산, 유기 실란, 예를 들어 비스(트리에톡시실릴)메탄, 비스(트리에톡시실릴)에탄, 비스(트리에톡시실릴)프로판, 비스(트리에톡시실릴)부탄, 메틸트리에톡시실란, 에틸 트리에톡시실란 및 프로필 트리에톡시실란이 있다.
중합도는, 당업계에 공지된 공정 매개 변수들에 변화를 가함으로써 원하는 크기를 가지는 생성물이 얻어지도록 조정된다. 원하는 크기는 수력학적 직경으로서뿐만 아니라 중합도(평균 단량체수)로서도 나타내어질 수 있다. 중합도는 수력학적 직경보다는 유용성이 떨어지긴 하지만, 본 발명의 구조체를 개념화하는 또 다른 방법으로서, 제한적인 것이기보다는 참고 수단이 된다. 예를 들어 밀도가 1g/㎖에 가까운 고분자의 경우, 바람직한 크기 범위는 25개 내지 3,000,000개 또는 25개 내지 375,000개 또는 80개 내지 3000개 또는 80개 내지 1000개의 단량체이다.
상기 고분자 골격체들 전부를, 중합전 단량체들을 혼합하거나, 제1 고분자에 제2 고분자를 그라프트시킴으로써, 임의의 화학적으로 허용 가능한 조합 방식으로 혼합하는 것도 고려될 수 있다.
특히 유리한 골격체 중 한 가지는, 트리알콕시유기실란 R5-Si(OR6)3(식 중, R5는 H 또는 유기 잔기이고, R6는 독립적으로 저급 알킬 또는 아릴임)을 축합 중합함으로써 생성된다. 이와 같은 골격체는 극성이 매우 커서 물과 혼화될 수 있다는 특성을 가지고, 이 골격체의 가교도는 골격체 제조시 공정 매개 변수들에 의해 조절될 수 있다. 트리알콕시실릴 기가 1개 이상 존재하는 단량체를 사용하는 것이 유리하다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 단량체 내에는 알콕시실란 기가 2개 존재한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 상기 알콕시실란은 1개 내지 10개의 탄소 원자 또는 3개 내지 9개의 탄소 원자에 의해 분리된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 상기 알콕시실란은 7개의 탄소 원자에 의해 분리된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 상기 알콕시실란은 3개 또는 5개의 탄소 원자에 의해 분리된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 2개의 포스포네이트 기는 R5 기의 일부를 이룬다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 상기 2개의 실란은 7개의 탄소 원자에 의해 분리되고, 상기 2개의 포스포네이트 기는 R5 기의 일부를 이룬다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 상기 실란은 다음과 같은 일반 구조를 가진다:
{(X7aO)(X7bO)PO}2-(C){(CH2)nSi(OX7c)(OX7d)(OX7e)}{(CH2)oSi(OX7c)(OX7d)(OX7e)}
(상기 식 중, X7a, X7b, X7c, X7d, X7e는 독립적으로 H, C1-8 알킬 및 벤질로부터 선택되고; n 및 o는 독립적으로 1 내지 5로부터 선택됨).
몇몇 구체예에서, 제2 실란, 예를 들어 디실란은 제1 디실란에 의해 형성된 고분자 골격체 상에 그라프트된다.
트리알콕시 실란의 중합에 대한 반응성은 R6 기들의 정체성에 따라서 달라진다. 본 발명의 발명자들은, 이러한 특성이 본 발명의 구조체 제조시 분자 크기를 조절함에 있어 중요한 요소라는 것과, 본 발명의 구조체를 제조하는데 기타 임의의 저급 알킬 기, 아릴, 실릴 아미드, 아실, 플루오르화실릴 또는 염화실릴을 사용하는 것이 고려될 수 있지만, 이것들 중 메틸과 에틸, 특히 에틸이 적당하다는 사실을 파악하였다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, R6는 에틸 기이다.
트리알콕시 실란들이 Si-O-Si 결합을 통해 연결될 수 있는 상이한 방법들이 다수 존재한다. 이량체 구조 요소들과 선형, 분지형 및 환형 구조가 공지되어 있다(R.J. Fessenden, J. S. Fessenden, “Trends in Organosilicon Biological Research”in Advances in Organometallic Chemistry vol. 18 p. 275). 또한, 다양한 크기의 실리콘-산소 케이지 구조체도 문헌(Hanssen, R. J. M. et al. Eur. J. Inorg. Chem 675 (2004))에 개시되어 있으며, 잔기성 알콕시 기 또는 유리 실라놀 기도 상이한 존재비로 존재할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 있어서 중요한 상자성 금속 이온들을 Si-O- 기에 의해 어느 정도 배위시키는 것도 고려될 수 있다. 이와 같은 구조체에 존재할 수 있는 몇몇 구조 요소들은 다음과 같은 반응식 1에 나타내어져 있다(본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안됨).
반응식 1: 본 발명에 사용될 수 있는 Si-O-Si 구조 일부의 예시(하기 반응식 중, R은 임의의 유기 잔기임)
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 중심에 존재하는 같은 자리 비스포스포네이트 구조 R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2는 다가 양이온들, 예를 들어 칼슘을 강하게 결합시킨다는 사실은 널리 알려져 있다. 본 발명의 재료들의 이점은, 생리학적 농도로 존재하는 칼슘, 마그네슘 및 망간 중 망간이 칼슘과 마그네슘에 비하여 선호되는 특성을 보인다는 점이다(이는 이하 실시예 15에 추가로 기술됨).
포스포네이트 기들은 에스테르 형태로서 완전체로 존재할 수 있으며, 전체 또는 일부가 가수 분해되어 자체의 산 형태를 가질 수 있고, 추후, 주변 매질이나 상기된 형태의 것들의 임의의 혼합물의 pH 수치에 따라서 부분 이온화로부터 전체 이온화에 이르기까지 어느 정도 이온화될 수 있다. 중성 또는 염기성 pH에서 망간 이온들을 고분자에 로딩하는 것이 적당하다. pH 12 내지 6 또는 pH 11 내지 8 또는 바람직하게 pH 10.5 내지 9.5의 범위에 속하는 pH 수치들 중 임의의 pH 수치가 유용하다. 이는, 적어도 부분적으로, 또는 (종종) 심지어 완전히 가수 분해된 포스포네이트의 음이온 형태가 금속 이온들을 결합시키는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 암시하는 것이다. 포스포네이트 에스테르 또는 산뿐만 아니라 포스폰 아미드도 재료의 일부로서 고려될 수 있거나, 아니면 이것을 출발 재료로 사용하는 것이 고려될 수 있다.
본 발명의 발명자들은, 비스포스포네이트 구조가 (바람직하게는 친수성인) 고분자 골격체에 혼입되어 망간(II)과 결합할 수 있게 될 때, 이완율은 극적으로 증가된다는 것을 알게 되었다. 단량체 비스포스포네이트 졸레드론산의 망간 킬레이트의 이완율은 2.3/mM Mn/s이고(실시예 17에 나타냄), 망간 + 단량체 비스포스포네이트 메틸렌디포스폰산의 이완율은 1/mM Mn/s이다. 고분자 망간이 로딩된 본 발명의 재료의 이완율은 24/mM Mn/s 내지 48/mM Mn/s이다.
특히, 폴리에틸렌이민이 같은 자리 비스포스포네이트의 활성화된 에스테르로 유도체화되고(실시예 9에 기술됨), 이후, 망간(II) 이온으로 로딩될 때, 이완율이 24/mM Mn/s인 재료가 얻어진다. 상기 이완율 수치는 졸레드론산 착물의 앞서 언급된 이완율 수치보다 훨씬 크므로, 고분자 골격체 내에 비스포스포네이트가 혼입된다는 이점이 보인다. 이러한 재료 중 인 대 질소의 몰비는 0.1 내지 3일 수 있으며, 바람직하게는 0.2 내지 0.8이다.
이완율은 같은 자리 비스포스포네이트와 고분자의 조합체로부터 기원된다는 것을 추가로 보이기 위하여, 상기 조합체 중 고분자 “단독 존재시의(naked)”형태도 테스트되었다. 임의의 첨가물을 포함하지 않는 폴리에틸렌이민은 망간과의 결합성이 매우 떨어지고, 임의의 첨가물이 소량 결합되어 있는 고분자의 이완율은 매우 낮다(0.8/mM/s). 뿐만 아니라, (EtO)2P=O-CH2-CH2-Si(OEt)3로부터 생성된 폴리유기실란의 이완율은 망간이 로딩된 후 3.0/mM Mn/s로서 그다지 눈에 띄게 증가되지 않는다. 모든 것을 종합하였을 때, 상기된 바는 본 발명의 재료가 가지는 고유의 이완율이 놀라울 정도로 높은 것은, 같은 자리 비스포스포네이트를 운반하는 고분자의 모든 특징들을 조합하고, 상자성 금속, 예를 들어 망간을 혼입함으로 인한다는 것을 입증한다.
실시예 22에는, 본 발명의 범위 내에 포함되지 않는, 폴리에틸렌이민의 고분자 골격체에 결합된 1,3-비스포스포네이트의 이완율(18.5/Mm/s)이 본 발명의 같은 자리 비스포스포네이트의 이완율(≥24/Mm/s)보다 얼마나 낮은지가 기술되어 있다. 또한, 본 발명의 발명자들이 이용한 이온 교환 테스트에서 측정되는 바에 의하면, 상기 1,3-비스포스포네이트의 안정성도 떨어진다는 것이 파악되었다. 그러므로, 1,2-비스포스포네이트와 임의의 1,n-비스포스포네이트(여기서, n은 2보다 큼)는, 본 발명의 같은 자리 비스포스포네이트보다 덜 바람직할 것으로 예상하는 것이 합리적일 수 있다.
상자성 금속 이온들은 아마도 (본 발명을 제한하지는 않음) 포스포네이트 기에 킬레이트화되고, 인 대 망간의 비(10 내지 15)는 이완율과 안정성을 고려하였을 때 최선의 타협점인 것으로 보이지만, 7 내지 20 사이의 임의의 지점도 고려될 수 있다. 실시예 11의 표 1에는, 인 대 망간의 비에 변화를 주었을 때의 영향이 상세히 기술되어 있다.
실리콘 대 망간의 바람직한 비는 5 내지 20일 것이며, 인 대 실리콘의 비는 약 1, 예를 들어 0.7 내지 1.3일 것이다.
선택적으로, 친수성의 생체 불활성 재료는 본 발명의 나노구조체의 외곽 부 상에 그라프트될 수 있다. 상기 외곽 부는 유도체화 시약과의 화학 반응에 참여할 수 있는 나노구조체의 일부이다. 상기 외곽 부는 재료의 생체 적합성에 유리할 수 있으며, 다수의 친수성 재료, 예를 들어 탄수화물 또는 친수성 인공 고분자가 고려될 수 있다. 폴리에테르 화합물, 특히 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체들이 특히 유리하다. 제한적이지는 않지만, 메톡시 종결 PEG 유도체들(m-PEG)이 바람직하다. 상기 재료는 금속 킬레이트화 이후 고분자 골격체, 예를 들어 산소, 질소 또는 탄소 원자, 예를 들어 잔기성 포스폰산 또는 실라놀 기에 화학적으로 허용 가능한 임의의 방식으로 그라프트될 수 있거나, 아니면 금속을 포함하지 않는 고분자에 직접 그라프트될 수 있다. 선형 PEG 유도체의 적당한 사슬 길이는 -CH2CH2O- 단위 4개 내지 50개이다. 가장 바람직하게는 5개 내지 20개의 단위, 평균적으로는 약 10개 또는 11개의 단위를 포함하는 조합체이다. 가장 편리하게 나노구조체에 커플링되는 시약들은 아미노 종결되며, 잔기성 포스포네이트 기들과 커플링될 수 있다. 분지형 PEG 유도체들도 유리한데, 실시예 8의 구조체들과 같은 구조체들(유사한 분자량을 가지는 선형 PEG 유도체의 경우보다 구조가 더욱 조밀하고 표면 보호 특성이 더욱 우수함)이 특히 유리하다.
각각의 나노구조체 실체 상에 존재하는 생체 불활성 고분자 기의 수는 10개 내지 1000개 또는 10개 내지 100개 또는 10개 내지 50개일 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 망간 로딩 고분자 비스포스포네이트 나노구조체는, 사슬 길이가 5 내지 20 단량체 잔기인 선형 m-PEG 기들을 포함하며, 이 기들은 아미드 결합을 통해 일정 분율의 포스포네이트 기들과 결합한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 망간 로딩 고분자 비스포스포네이트 나노구조체는 구조 X1의 분지형 PEG 기(실시예 8h)들을 포함하며, 이 기들은 아미드 결합을 통해 일정 분율의 포스포네이트 기들과 결합한다.
본 발명의 나노구조체 접합에 관한 기술을 다양한 활성 분자 실체, 예를 들어 생체 마커나 리포터 실체에 접목하는 것이 고려될 수 있다. 통상의 실시예에 관한 비제한적인 예로서는 펩티드, 펩토이드, 단백질, 항체, DNA 단편, RNA 단편, PNA 단편, 형광단, 킬레이트 또는 소분자 약학 리간드를 들 수 있을 것이다.
본 발명의 제2 주요 양태는 상기 나노구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 최광의에서, 상기 방법은 구형이면서 나노크기를 가지는 고분자 실체들(비스포스포네이트 기들을 다수 포함하는 것들)을 제조하는 제1 단계와, 이 제1 단계의 생성물을 망간(II) 이온들과 접촉시키는 제2 단계를 포함한다. 선택적으로 상기 두 단계들은 (화학적으로 확실히 구분되지만) 동일한 반응 용기 내에서 동시에 진행될 수 있다. 상기 과정의 주요 특징들이 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 한외 여과를 통한 크기별 선별 단계 또는 정제 단계가 상기 과정에 관한 예들 1개 이상에 통합된다.
비스포스포네이트를 다수 개 포함하는 나노크기의 고분자 구는, 기존의 고분자 구(중합 단계(001)에 의해 얻어진 것)로의 그라프트화(002) 또는 비스포스포네이트를 포함하는 단량체 혼합물의 중합(003)을 통해 얻어진다. 어떤 고분자 골격체가 요구되는지에 따라서, 다수의 상이한 중합 개시제들이 고려될 수 있다. 불포화 단량체, 예를 들어 스티렌과 아크릴레이트의 경우에는 다양한 라디칼 개시제들, 예를 들어 과산화벤조일 또는 아조비스이소부티로니트릴이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구체예들 중 하나의 트리알콕시 실란 기반 단량체의 경우에는 자발적 가수 분해 및 축합 반응을 이용하여 중합을 진행시키거나, 아니면 산 또는 염기 촉매 작용을 이용하는 것이 가능하다. 때때로 pH 안정화 염, 예를 들어 중탄산염, 특히 중탄산나트륨, 또는 카복실산염, 예를 들어 아세트산나트륨, 포름산나트륨 또는 포름산 테트라메틸암모늄을 반응 혼합물에 첨가하여, 생성물의 수율을 최적화하고, 크기를 3㎚ 내지 10㎚로 만드는 것이 유리하다는 것이 입증되었다.
단계(003)에는 종종 용매가 바람직하며, 다수의 상이한 용매들이 당업자에 의해 사용될 수도 있긴 하지만, 독성 용매를 피하는 것이 바람직하고, 물과 저급 알코올, 예를 들어 프로판올, 부탄올, 에틸렌 글리콜 또는 1,3-프로판디올을 사용하는 것이 바람직하다. 종종 용매 혼합물을 사용하여 생성물의 수율과 품질을 최적화하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 저급 알코올 중 물 5% 내지 25%의 혼합물이 단계(003)에 사용된다.
상기 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 에탄올, 1- 또는 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 1,2-프로판디올 또는 1,3-프로판디올 중 물 5% 내지 25%의 혼합물이 단계(003)에 사용된다.
단계(003)에 있어서 온도는 실온 초과, 예를 들어 40℃ 내지 130℃ 또는 80℃ 내지 120℃ 또는 100℃ 내지 120℃인 것이 유리하다는 것이 파악되었다. 저급 알코올이 사용될 때, 반응 온도를 원하는 수준으로 만들기 위해서는 밀폐된 내압 용기로 작업을 수행할 필요가 있다.
단계(003)의 지속 시간은 고분자 골격체와 개시 방식에 따라 다르며, 수 초로부터 수 일 또는 수 주에 이를 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예들 중 몇몇 구체예들에 있어서, 트리알콕시 실란은 단계(003)에서 6시간 내지 200시간 또는 6시간 내지 48시간 또는 12시간 내지 36시간, 아니면 약 24시간 동안 사용하는 것이 유리한 것으로 판명되었다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 단계(003)의 조건은 온도 105℃ 내지 115℃ 및 지속 시간 20시간 내지 30시간이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 단계(003)의 조건은 온도 105℃ 내지 115℃ 및 지속 시간 30시간 내지 60시간이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 단계(003)의 조건은 우선 40시간 내지 50시간 동안 온도 90℃ 내지 100℃, 그 후 20시간 내지 30시간 동안 온도 105℃ 내지 115℃이다.
단계(003)에서 단량체 농도는 어떠한 고분자 골격체가 요구되는지에 따라서 다르고, 용매 부재 조건 하에서의 몰 농도로서 다양할 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 구체예들 중 하나에 있어서 트리알콕시 실란의 경우, 단량체 농도는 10mM 내지 500mM 또는 20mM 내지 100mM, 특히 40mM 내지 80mM인 것이 유리하다는 사실이 판명되었다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 단계(003)의 조건은 우선 20시간 내지 50시간 동안 온도 90℃ 내지 100℃, 그 다음 20시간 내지 30시간 동안 온도 105℃ 내지 125℃이고, 단량체 농도는 40mM 내지 60mM이다.
비스포스포네이트 시약을 고분자 골격체에 그라프트시키는 것을 포함하는 단계(002)에서, 조건에는 어느 정도 차이가 있을 수 있다. 온도와 농도에 관한 조건은 특히 더욱 완화될 필요가 있다. 본 발명의 발명자들은, 물이 액체로서 존재할 수 있는 온도, 예를 들어 실온에서 물 중 폴리에틸렌이민 용액, 선택적으로는 물과 보조 용매의 혼합물을 출발 물질로 하고, 이 용액 또는 혼합물을, 커플링 제제, 예를 들어 N-(디메틸아미노프로필)-N’-에틸 카보디이미드의 존재 하에 특정 온도, 예를 들어 실온에서 1시간 내지 48시간, 예를 들어 20시간 내지 24시간 동안 반응성 에스테르 중간체, 예를 들어 N-하이드록시설포숙신이미드 나트륨 염을 형성할 수 있는 화합물의 존재 하에서, 상기 폴리에틸렌 이민과 반응할 수 있는 비스포스포네이트, 예를 들어 3,3-비스(디메톡시포스포릴)프로파논산과 접촉시켜, 고분자 골격체에 비스포스포네이트가 그라프트된 재료를 제조하는 방법을 찾아냈다.
크기별 선별 단계(004)가 나노구조체 전구체(X) 용액 중에서 수행되어, 원치 않는 대형 또는 소형 실체들을 제거한다. 반응 혼합물로부터 유래하는 출발 물질과 용매 잔류물은 또한 이 단계에서 제거된다. 한외 여과는, 일반적으로 표지된 층류 여과 또는 정용 여과의 형태로 실시될 때 특히 바람직한 정제 방법이다. 상기 용액을 공극이 큰 필터를 통과시킴으로써 원치 않는 대형 나노구조체 및/또는 응집체를 제거하는 것이 바람직하다(단계 004a). 이와 같은 필터의 바람직한 공칭 컷-오프 수치는 300kDa 또는 100kDa 또는 50kDa이다. 단계(004b)에 있어서, 요구되는 재료는 공극 크기가 작은 필터 상에 수집된다. 단계(004b)에 바람직한 공극 크기의 공칭 컷-오프 수치는 50kDa, 30kDa 및 10kDa이다.
만일 출발 물질의 크기 분포 범위가 좁다면 크기별 선별 단계(004)는 필요하지 않을 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(002 또는 003)로부터 얻어진 용액은, 우선 100kDa의 필터를 통과하게 되고(단계 004a), 이후에는 30kDa 필터 상에 수집된다(단계 004b).
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(002 또는 003)로부터 얻어진 용액은, 우선 300kDa의 필터를 통과하게 되고(단계 004a), 이후에는 100kDa 필터 상에 수집된다(단계 004b).
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(002 또는 003)로부터 얻어진 용액은, 우선 50kDa의 필터를 통과하게 되고(단계 004a), 이후에는 30kDa 필터 상에 수집된다(단계 004b).
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(002 또는 003)로부터 얻어진 용액은, 우선 100kDa의 필터를 통과하게 되고(단계 004a), 이후에는 10kDa 필터 상에 수집된다(단계 004b). 단계(004b)를 거친 후 재료를 수부의 물로 세척하여 단계(001, 002 또는 003)로부터 단량체나 용매 잔류물을 추가로 제거하는 것이 유리하다.
기타 한외여과 방법(예를 들어, 스핀 필터 또는 투석)들은 측정 정확도가 떨어지긴 하지만 사용될 수는 있다.
원하는 크기 범위를 가지는 입자들도 크기별 배제 크로마토그래피(겔 여과라고도 칭하여짐)에 의해 선별될 수 있다.
상기 고분자가 망간(II)으로 로딩되는 단계(005)는, 상기 고분자 용액을 망간(II) 이온에 가하는 과정을 포함한다. 상기 이온은 고체 또는 용액의 형태로 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 망간(II)의 가용성 염, 예를 들어 플루오르화물, 염화물, 브롬화물, 아세트산염, 질산염 또는 황산염이 바람직하다. 가용성이 떨어지는 망간 공급원, 예를 들어 MnO를 사용하는 것도 고려될 수 있다. 망간 이온의 유효 농도는, 고분자 농도에 따라서 0.1mM 내지 5M, 예를 들어 0.1mM 내지 600mM 또는 0.1mM 내지 10mM이다. 앞서 논의된 바와 같이, 인 대 망간의 비는 중요하다. 중성 또는 염기성 pH에서 망간 이온들을 고분자에 로딩하는 것이 최적이다. pH 12 내지 6 또는 pH 11 내지 8 또는 바람직하게 pH 10.5 내지 9.5 중 임의의 수치에 해당하는 pH가 유효하다. pH가 원하는 수치에서 일정해지는 시간이 경과된 후 망간이 첨가되어야 할 것이다. 본 발명의 발명자들은, 10분 내지 24시간, 예를 들어 1시간 반 내지 2시간이 충분하다는 것을 파악하였다. 나노구조체에 망간을 로딩한 후, pH는 중성(8 내지 6, 또는 7.7 내지 7)으로 조정된다. 로딩에 적당한 온도는 미지의 용매 또는 용매 혼합물의 어는 점으로부터 끓는 점 사이의 임의의 온도일 수 있는데, 실온으로부터 60℃ 사이의 온도가 바람직하다.
선택적인 단계(006)에서 요구되는 크기 범위를 가지는 입자들은 원치 않게 크거나 작은 종들로부터 분리된다. 망간이 첨가될 때 나노구조체의 크기는 단지 상한치와 하한치 사이에서만 변하므로, 이 과정은 종종 반드시 일어나지 않는 것일 수도 있다. 본 단계(006)는 이에 종속되는 몇 개의 단계들, 예를 들어 단계 006a, 006b 등, 또는 순서가 특정되지 않은 종속 단계 006x로 이루어질 수 있다.
한외 여과는, 특히, 일반적으로 표지화된 층류 여과 또는 정용 여과의 형태로 사용될 때, 크기별 선별 단계(006x)에서 행해지는 바람직한 방법이다. 용액을 필터(공극의 크기가 큰 필터)에 통과시켜, 크기가 원치 않게 큰 나노구조체 및/또는 응집체를 제거하는 것이 바람직하다(단계 006a). 이와 같은 필터의 공칭 컷-오프 수치는 바람직하게 300kDa 또는 100kDa 또는 50kDa이다. 단계(006b)에 있어서, 원하는 재료는 공극의 크기가 작은 필터 상에 수집된다. 단계(006b)에 바람직한 필터 공극 크기의 공칭 컷-오프 수치는 50kDa 또는 30kDa 또는 10kDa이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(005)로부터 얻어진 용액은, 우선 100kDa 필터를 통과하고(단계 006a), 이후에는 30kDa 필터에 수집된다(단계 006b).
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(005)로부터 얻어진 용액은, 우선 300kDa 필터를 통과하고(단계 006a), 이후에는 100kDa 필터에 수집된다(단계 006b).
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(005)로부터 얻어진 용액은, 우선 50kDa 필터를 통과하고(단계 006a), 이후에는 30kDa 필터에 수집된다(단계 006b).
단계(006b) 이후, 재료를 수 부의 물로 세척하여, 단계(005)로부터 유래되는 잔류 금속 이온, 단량체 또는 용매 잔류물을 추가로 제거하는 것이 유리하다.
기타 다른 한외여과 방법(예를 들어, 스핀 필터 또는 투석)들도 단계(006x)에서 사용될 수도 있다.
단계(006x)에서, 원하는 크기 범위를 가지는 입자들도 크기별 배제 크로마토그래피(겔 여과라고도 칭하여짐)에 의해 선별될 수 있다.
선택적으로, 상기 망간이 풍부한 고분자 포스포네이트 생성물은 단계(007)에서 정제될 수 있다. 본 단계(007)는 이에 종속되는 몇 개의 단계들, 예를 들어 단계 007a, 007b 등, 또는 순서가 특정되지 않은 종속 단계 007x로 이루어질 수 있다.
정제 단계(007x)에서 행하여지는 한 가지 바람직한 방법으로서는, 소량의 양이온 이온 교환 물질, 예를 들어 설폰화 폴리스티렌으로 처리하여 과량의 망간 또는 느슨하게 결합된 망간을 제거하는 방법이 있다. 시판되고 있는 이온 교환 수지의 용량은 종종 수지 1g당 1mmol 내지 2mmol이고, 단계 b)로부터 유래되는 미정제 재료로서 망간 1몰을 함유하는 재료는 통상적으로 이온 교환 수지의 나트륨 또는 칼륨 형태 1g 내지 100g으로 처리될 것이다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 단계(007x)에서는 30kDa 필터 상에 재료를 수집하는 또 다른 정용 여과가 수행된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 공정 단계(007x)에서는 단계(006)로부터 얻어진 생성물을 폴리스티렌 설포네이트 유형의 이온 교환 수지의 나트륨 형태로 처리하는 것을 포함한다.
친지성 불순물, 예를 들어 미량의 내독소(사멸된 박테리아의 잔류물)를 제거하기 위한 후속 정제 단계(007x)도 추가될 수 있다.
본 발명의 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 단계(006)의 생성물은 활성탄으로 처리된다.
본 발명의 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 단계(006)의 생성물은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 PVDF 필터를 통과한다.
본 발명의 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 단계(006)의 생성물은 고정된 폴리믹신 B로 처리된다.
선택적으로 단계(009)는 도 1에 나타낸 바와 같이 추가될 수 있는데, 이 단계에서 생체 불활성 표면 개질제는 나노구조체의 접근 가능한 부들에 그라프트된다.
선택적으로 가교 단계(단계 010)는, 도 1에 나타낸 바와 같은 공정 중 다수의 단계에 가교제를 혼입함으로써 수행될 수 있다. 단계(001)에서 가교제 중 혼합함으로써 이루어지는 가교는 표준적인 과정이다. 본 발명의 바람직한 구체예들 중 하나에 있어서 단량체는 또한 본래 트리알콕시 실란과 같이 가교되는 성향을 가질 수도 있으므로, 단계(002)에서 생성된 재료는 이미 가교되어 있는 것이다.
본 발명의 제3 주요 양태에 있어서, 재료는 진단 방법, 구체적으로 자기 공명 조영술(MRI)에 사용될 콘트라스트 제제로서 사용된다. 본 발명의 재료는 독성이 작고 이완율이 크다는 특성을 가지는데, 이러한 특성은 본 발명의 재료가 유기체, 구체적으로 인간의 몸을 대상으로 하는 MRI 검사에서 콘트라스트 제제로서 유용하도록 만든다.
수력학적 직경이 3㎚ 초과 또는 4㎚ 초과 또는 5㎚ 초과인, 본 발명의 구체예들에 있어서 이완율도 크고 적당한 크기를 가진다는 특성들이 조합되면, 종양, 특히 고형 종양을 MRI에 의해 조영하는데 적당한 본 발명의 나노구조체를 포함하는 조성물이 만들어진다. 또한, 이와 같은 본 발명의 조성물을 일반적인 해부학적 조영술, 예를 들어 혈관 조영술에 사용될 콘트라스트 제제로서 사용하는 것도 고려될 수 있으며; 특히 심장의 미세 관상 동맥의 혈관 조영술, 또는 경동맥 혈관 조영술, 또는 신동맥이나 대동맥 혈관 조영술은 본 발명의 조성물, 즉 이완율과 콘트라스트 특성이 큰 조성물에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물은 머리, 내부 장기들이나 사지의 구조를 조영하기 위한 것으로서 유리하다. 본 발명의 조성물은 내부 장기들 중 간, 췌장 및 장의 구조를 조영하기 위한 것으로서 특히 유리하다. 결장은 본 발명의 조성물을 정맥 투여하거나 관장에 의해 투여함으로써 조영될 수 있다. 위, 간 및 상부 내장을 조영함에 있어서, 콘트라스트 제제를 경구 투여하는 것도 고려될 수 있다.
본 발명의 재료의 독성은 작고 이완율은 크므로, 이 재료는 세포 태깅 제제(cell tagging agent)로서 유용하다. 환자를 진단 또는 치료하는데 사용되는 세포, 예를 들어 줄기 세포 또는 대식 세포가 체외에서 본 발명의 나노구조체로 로딩된 후 상기 환자에 투여되며, 상기와 같은 세포-나노구조체 복합체의 체내 분포 양태는 MRI에 의해 가시화될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 나노구조체 용액은 조직에 피내 또는 피하 주사된 후(일반적으로 그러하지만 이러한 경로에 한정되는 것은 아님), MRI를 통해 환자의 림프 구조들을 가시화하는데 사용되기도 한다. 전이성 종양이 많이 존재하는 부위인 림프절을 조영하는 것이 특히 유리하다. 이러한 용도로서는 크기가 약 10㎚, 예를 들어 7㎚ 내지 50㎚ 또는 7㎚ 내지 25㎚ 또는 7㎚ 내지 15㎚인 나노구조체가 특히 유용하다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 본 발명의 나노구조체 제제(평균 수력학적 직경 = 8㎚ 내지 15㎚)는 환자에게 피내 투여되고, 이 환자의 림프절은 MRI 방법에 의해 가시화된다.
본 발명의 나노구조체는 이완율이 크고 독성이 작다는 특성을 가지므로, 세포 태깅용 재료를 사용하는 것이 고려될 수 있다. 이와 같은 경우, 세포, 예를 들어 줄기 세포나 대식 세포는 (포유동물의 몸, 예를 들어 인간의 몸에 대하여 외부라고 할 수 있는) 나노구조체로 로딩되고, 이후에는 상기 포유동물에 투여되는데, 이때, MRI 스캐닝에 의해 영상이 생성된다. 나노구조체가 유기체를 통해 운반될 때 이 나노구조체는 세포와 함께 움직일 수 있다.
본 발명의 나노입자가 생체 내에서 사용될 때 이 나노입자는 당업자들에게 널리 공지된 최선의 실무 관례에 따라서 약학적으로 허용 가능한 방법으로 제형되어야 한다. 바람직한 투여 방식은 비경구 투여 방식으로서, 정맥 내 경로가 특히 유리하지만, 동맥 내 투여 경로도 임의의 환경 하에서 유리할 수 있다. 비경구 투여는 종종 액체 제형을 필요로 한다. 본 발명의 나노구조체를 용액으로 만드는데 있어서 바람직한 용매는 물이며, 1개 이상의 보조 용매 또는 첨가제가 0.1% 내지 10% 첨가되면 용액 중 안정성이 개선될 수 있다. 허용 가능한 보조 용매로서는 알코올, 예를 들어 에탄올 또는 글리세롤, 생체 적합성 고분자, 예를 들어 에틸렌글리콜 또는 폴리비닐 알코올, 설폭시화디메틸 또는 N-메틸 피롤리디논이 있다. 뿐만 아니라, 1개 이상의 삼투압 조절제, 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 락토스, 글루코스 또는 기타 다른 당 또는 당 알코올을 첨가하는 것도 유리할 수 있다. 제형은 체액과 등장성일 것이 요망된다. 바람직하게, 정맥 내 사용될 용액의 삼투압은 270mOsm 내지 2000mOsm 또는 280mOsm 내지 1000mOsm 또는 280mOsm 내지 500mOsm, 특히 280mOsm 내지 300mOsm이다. 상기 첨가제들 다수는 또한 동결 건조 후 재구성 효율을 높이는 동해 방지제의 기능을 수행할 수도 있다. 주사된 용액의 생리학적 효과를 낮추기 위해서 전해질을 첨가하는 것이 유리할 수도 있다. 바람직한 전해질은 나트륨, 칼슘 및/또는 마그네슘의 무독성 염의 혼합물일 것이다. 주사 가능한 용액의 pH를 조절하는 것이 바람직한데, 이 경우 주사용으로서 적당한 임의의 완충액을 사용하는 것이 고려될 수 있으며, 완충액들 중 Tris-HCl이 바람직하다. 금속 이온 스캐빈저도 첨가제로서 고려될 수 있다. 몇 가지 통상적인 완충액의 예로서는 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산), DTPA(디에틸렌 트리아민 펜타아세트산) 및 DOTA(1,4,7,10-테트라아자-시클로도데칸-N,N’,N”,N”’-테트라아세트산) 또는 포디피르가 있다. 저장용 병에 담겨있던 고상 이온 스캐빈저 수지를 사용하는 것도 고려될 수 있다.
나노구조체의 농도는 다수의 상이한 방법으로 기술될 수 있으나, 가장 적절한 방법 2가지로서는 질량 농도(용액 1ℓ당 g)와 망간 농도(용액 1ℓ당 mmol)가 있다. 콘트라스트 제제로서 투여되기 적당한 제형 중 망간의 농도 범위는 1mM 내지 500mM 또는 10mM 내지 300mM 또는 10mM 내지 200mM 또는 50mM 내지 200mM 또는 100mM 내지 200mM이다. 상기 농도가 질량 농도로서 나타내어지고, 인 대 망간의 비가 약 6이라고 가정할 때, 콘트라스트 제제 제형에 적당한 질량 농도는 0.5g/ℓ 내지 300g/ℓ 또는 5g/ℓ 내지 200g/ℓ 또는 5g/ℓ 내지 250g/ℓ 또는 5g/ℓ 내지 100g/ℓ 또는 100g/ℓ 내지 250g/ℓ이다. 질량 농도는 mM로 나타내어지는 농도와 대체로 일치하지만, 그 일치하는 정도는 고분자 골격체, 가교도 및 생체 불활성 코팅층이 존재함에 따라서 달라질 것이다.
본 발명의 하나의 구체예는 망간 농도가 100mM 내지 300mM이고 인 대 망간의 비가 7 내지 20인 약학적으로 허용 가능한 정맥내 투여용 제형을 이룬다.
본 발명의 몇몇 구체예는 망간 농도가 10mM 내지 300mM이고 인 대 망간의 비가 7 내지 20인 약학적으로 허용 가능한 정맥내 투여용 제형에 관한 것이다.
본 발명의 대안적 구체예는 같은 자리 비스포스포네이트 기를 5개 이상 포함하는 고분자 골격체를 포함하는 나노구조체로서, 이 경우 같은 자리 비스포스포네이트 기들은 서로 독립적으로
-R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2
(-R4R3C(P=O(OR1)(OR2))2와 동일함)
(식 중, R1 및 R2는 음 전하, H, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, R3 및 R4 중 1개 이상은 고분자 골격체에 연결된 기이되, 다만 상기 R3 및 R4는 중 하나만이 이와 같이 연결된 기이고, R3 및 R4 중 다른 하나는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기이거나, 또는 이러한 기의 잔기이거나, 또는 H, OH, OR5 및 R5로 이루어진 군으로부터 선택되며, R5는 저급 알킬임)
의 형태(상기 논의된 바와 같은 나노구조체이되, 망간 이온들은 전혀 함유되어 있지 않은 것)로서 혼입된다.
이와 같은 나노구조체는 앞서 논의된 구체예들에 의한 나노구조체 제조시 중간체로서 유용하다. 이와 같은 구조체는 망간 이외의 기타 다른 양이온들과 결합할 수 있으며, 또한 그러한 수용력 안에서 유용할 수 있다.
실시예
실시예 1: 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 합성
1a: 1,1-디알릴-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄
Figure pct00007
기계적 교반자가 장착된 반응기(2ℓ 들이)를 진공 하에 130℃에서 건조시킨 다음, 질소 양압 하에 냉각시켰다. 비활성 기체 하에 트랜스퍼 튜브(transfer tube)를 사용하여 상기 반응기를 무수 THF(1ℓ)(알드리치(Aldrich), 99.9%, 250ppm BHT 포함)로 채웠다. 여기에 테트라메틸메틸렌디(포스포네이트)(97.4g, 420mmol) 및 브롬화알릴(183㎖, 255g, 2.11mol)을 첨가하였다(발열되지 않았으며, 산성 기체도 검출되지 않음). 재킷 온도를 0℃로 설정하고, 내부 온도는 6℃로 유지시키고 나서, 여기에 t-부톡시화칼륨(총 첨가량 140.3g, 1.25mol)을 첨가하였다(6회로 나누어 첨가). 이와 같이 첨가하였더니 온도가 약 12℃로 상승하였는데, 이후 이 온도를 6℃(또는 그 이하)로 낮추고 나서 다시 상기 물질을 첨가하였다. 마지막으로 브롬화알릴(9.4㎖, 0.11mol)과 t-부톡시화물(7.3g, 65mmol)을 첨가하여, 나머지 모노알릴화 생성물 수%를 전환하였다(발열은 일어나지 않음). 재킷 내부 온도는 약 2시간 동안 15℃로 설정하였으며, 이후에는 농도가 진한 백색의 반응 혼합물을 밤새 교반하였다(이때의 재킷 온도는 0℃였음). 여기에 포화 NH4Cl(수성) 50㎖를 첨가하여 상기 반응물을 급랭시킨 다음(이때, 온도는 2℃에서 5℃로 상승됨), 톨루엔(1ℓ)을 첨가하고 나서, 상기 반응물 1ℓ를 증류시켜 THF와 과량의 브롬화알릴을 제거하였다. 생성물을 수집하였다(이때의 온도: 63℃ 내지 73℃, 재킷 온도: 70℃ 내지 100℃, 소요 시간: 2시간). 잔류물에 실리카 겔(100g)과 활성 탄(15g)을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 수 분 동안 교반한 다음, 액체를 프릿-필터 스틱을 사용하면서 사이펀으로 옮겼다(또는 통상의 와트만 유리 섬유 필터로 여과하였다). 잔류하는 케이크를 톨루엔으로 세정하였다(3×100㎖). 합하여진 여과물을 와트만 유리 섬유 필터로 여과하여, 남아있던 미량의 활성 탄을 제거하였으며(녹색을 띠는 것을 통해 알 수 있음), 이를 회전 증발기 상에서 농축하여(수조 온도 = 40℃) 연한 황색 액체인 표제 화합물을 얻었다. 미정제 생성물을 세정된 반응기에 다시 넣은 후 이를 톨루엔(50㎖) 및 헵탄(380㎖)의 혼합물 중에 용해하였다. 내부 온도 12℃ 내지 9℃에서 시딩(seeding) 과정을 통해 결정화가 개시될 수 있었다. 2시간에 걸쳐 재킷 온도를 -25℃로 낮춘 다음, 이 온도를 2시간 더 유지시켜 결정화를 종결시켰다. 프릿 필터 스틱을 이용하여 모액을 제거한 다음, 결정 슬러리를 예비 냉각 헵탄(40㎖) 2부로 세정하였다. 생성된 결정을 EtOAc 중에 용해하고 나서, 이 용액을 보텀 밸브를 통해 세정하였다. 감압 하에서 용매를 제거하였더니, 고체인 생성물이 생성되었다(70.0g, 224mmol, 53%, mp는 실온보다 약간 높음).
1H-NMR (CDCl3); 6.35 (m, 2H), 5.20 (m, 4H), 3.68 (d, 12H), 3.00 (abx, 4H).
길이가 짧고 얇은 막으로 된 증류 장치로 생성물을 증류할 수 있었다.
1b: 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄
Figure pct00008
온도 조절 재킷, 내부 온도계 및 기계적 교반자가 장착된 2ℓ 들이 반응기를 톨루엔(330㎖, 알드리치, 무수 톨루엔으로서 확실히 캡으로 밀봉되었던 제품), 테트라메틸-1,1-비스알릴-메틸렌비스(포스포네이트)(70g, 224mmol) 및 트리에톡시실란(123㎖, 655mmol)으로 채웠다. 진공-질소 사이클을 3회 진행시켜 상기 반응 혼합물로부터 산소를 탈기시키고 나서, 진공 사이클 주기가 짧게 유지되도록 주의를 기울여 톨루엔과 실란이 소실되는 것을 막았다. 이때, 산소 제거는 필수적으로 행하여져야 하는 단계이다. 재킷 온도는 30℃로 설정하였다. 칼슈테트 촉매(Karstedt’s catalyst)(4.5㎖, 톨루엔 중 2%, 0.053mmol)를 시린지로 첨가하였다(0.5㎖씩, 사이클 간 여유 시간 30분, 총 4.5시간 소요). 촉매를 다 첨가하고 나서, 온도 조절 재킷의 온도를 30℃로 설정한 다음, 이 혼합물을 밤새 계속 교반하였다. 다음날 아침, 재킷 온도를 40℃로 설정하고, 여기에 증류 헤드를 부가하여, 톨루엔과 과량의 실란을 증류로 제거하였다(이때의 압력 = 62mbar 내지 13mbar, 지속 시간 = 2시간). 여기에 에탄올(800㎖)과 활성 탄(15g)을 첨가한 다음, 이때 생성된 슬러리를 10분 동안 교반하고 나서, 이 혼합물을 보텀 밸브를 통해 수집한 후, 와트만 유리 섬유 필터로 여과하였다. 전체 중량이 일정해질 때까지 용매를 감압 하에 회전 증발기 상에서 제거한 결과(이때의 수조 온도 = 45℃), 연갈색 오일인 생성물 138g(215mmol, 96%)이 생성되었다.
1H-NMR (CDCl3); 3.95 (q, 12 H), 3.77 (d, 12H), 2.37 (m, 4H), 2.12 (m, 4H), 1.32 (t, 18H), 0.88 (t, 4H).
길이가 짧고 얇은 막으로 된 증류 장치로 생성물을 증류할 수 있었다(170℃ 및 0.3mbar).
실시예 2: 1,1-비스(2-트리메톡시실릴에틸)--1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 합성
2a: 1,1-비스(2-t-부톡시에틸)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄
Figure pct00009
질소 대기 하에 무수 THF(500㎖) 중 1,1-비스(디메틸)포스포네이토)메탄(50g, 215mmol)의 얼음 냉각 용액에, 수소화나트륨(18.9g, 미네랄 오일 중 60%, 474mmol)을 30분에 걸쳐 3부 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음, 여기에 1-브로모-2-t-부톡시에탄(90.5g, 500mmol)을 첨가하였다(5부). 3시간 경과 후 얼음 수조를 치운 다음, 실온에서 밤새 계속 교반하였다. 얼음 수조로 다시 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 다음, 여기에 포화 수성 염화암모늄 50㎖를 첨가하여 상기 반응 혼합물을 급랭시켰다. 진공 하에 휘발성 물질을 제거하였으며, 유기물을 디클로로메탄(300㎖) 중에 용해하였다. 여기에 실리카(100g)를 첨가하고 교반한 후, 이때 생성된 슬러리를 여과하고 나서, 필터 케이크를 디클로로메탄으로 세정하였다(3×200㎖). 용매를 제거한 후 생성물을 얻었다.
2b: 1,1-비스(2-하이드록시에틸)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄
Figure pct00010
트리플루오로아세트산(TFA, 50㎖) 및 디클로로메탄(DCM, 50㎖)을 1,1-비스(2-t-부톡시에틸)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(실시예 2a) 2g을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였더니 생성물이 생성되었다.
2c: 1,1-비스(2-메실옥시에틸)-1,1-비스(디메틸-포스포네이토)메탄의 합성
Figure pct00011
실시예 2b의 생성물(1,1-비스(2-하이드록시에틸)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄)(10mmol)을 얼음 냉각된 디클로로메탄(10㎖) 중에 용해하였다. 여기에 피리딘(40mmol, 3.24㎖)과 염화메탄설포닐(3.44g, 30mmol)을 첨가하고 나서, 내부 온도를 5℃보다 높게 유지시켰다. 3시간 경과 후, 여기에 에테르(30㎖)와 물(7㎖)을 첨가하였다. 상 분리가 이루어지면, 유기층을 2M HCl, 5% 수성 탄산수소나트륨과 물로 세정하였다. 황산마그네슘 상에서 건조를 진행시킨 다음, 휘발성 물질을 증발시킨 결과, 생성물이 생성되었다.
2d: 1,1-디비닐-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄
Figure pct00012
질소 대기 하에 무수 THF(500㎖) 중 1,1-비스(2-메실옥시에틸)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(50g, 104mmol)의 얼음 냉각된 용액에, 디에틸이소프로필힐라민(300mmol)을 첨가하였다. 30분 경과 후에 얼음 수조를 치우고 나서, 상기 반응 혼합물을 밤새 실온에서 계속 교반하였다. 휘발성 물질을 진공 하에서 제거한 다음, 유기물을 에테르(300㎖)로 용해하였다. 여기에 실리카(100g)와 활성 탄(15g)을 첨가하여 교반한 다음, 이때 생성된 슬러리를 여과하고, 필터 케이크를 에테르로 세정하였다(3×200㎖). 용매를 제거한 후 생성물을 얻었다.
2e: 1,1-비스(2-트리메톡시실릴에틸)--1,1-비스(디메틸포스포네이토)-메탄
Figure pct00013
무수 톨루엔(20㎖) 중 1,1-디비닐-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(실시예 2d) 용액에, 톨루엔 중 칼슈테트 촉매(2% Pt) 및 트리에톡시실란(6.0mmol, 4.1㎖)의 용액 80㎕를 첨가하였다. 상기 용액을 실온에 2일 동안 방치하여 두었다. 휘발성 물질을 진공 하에서 제거하고, 진공 하에서의 톨루엔 첨가 사이클(addition-of-toluene-vaccum cycle)을 2회 초과 진행시켜 잔류하던 실란을 제거하였다. 잔류물을 톨루엔 중에 취한 다음, 이를 소량의 활성 탄으로 처리하고 나서, 5㎛ PTFE 필터를 통과시킨 다음, 실리카 컬럼 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄 + 0% 내지 10% 메탄올)로 정제하여, 원하는 생성물이 생성되었다.
실시예 3: 1,1-비스(트리메톡시실릴메틸)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 합성
Figure pct00014
질소 대기 하에 무수 THF(500㎖) 중 1,1-비스(디메틸)포스포네이토)메탄(50g, 215mmol)의 얼음 냉각된 용액에, 수소화나트륨(18.9g, 미네랄 오일 중 60%, 474mmol) 3부를 30분에 걸쳐 첨가하였다. 상기 혼합물을 3시간 동안 교반하고 나서, 여기에 클로로메틸트리에톡시실란(500mmol)을 수 부 첨가하였는데, 내부 온도는 5℃ 미만으로 유지시켰다. 3시간 경과 후 얼음 수조를 치우고 나서, 실온에서 밤새 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조를 사용하여 다시 냉각시킨 다음, 여기에 포화 수성 염화암모늄 50㎖를 첨가하여 상기 반응 혼합물을 급랭시켰다. 진공 하에 휘발성 물질을 제거하고 나서, 유기물을 디클로로메탄(300㎖) 중에 용해하였다. 여기에 실리카(100g)를 첨가하여 교반한 후, 이때 생성된 슬러리를 여과한 다음, 필터 케이크를 디클로로메탄으로 세정하였다(3×200㎖). 용매를 제거한 후 생성물을 얻었다.
실시예 4: 1,1-비스(3-트리메톡시실릴프로필)-1,1-비스(디에틸포스포네이토)메탄의 합성
4a: 1,1-디알릴-1,1-비스(디에틸포스포네이토)메탄
Figure pct00015
질소 대기 하에 무수 THF(50㎖) 중 1,1-비스(디에틸)포스포네이토)메탄(4.97㎖, 20mmol)의 얼음 냉각 용액에 브롬화알릴(8.7㎖, 100mmol)을 첨가하였다. 2시간에 걸쳐서 상기 혼합물에 tert-부톡시화 칼륨(6.8g, 60mmol)을 첨가하였다. 이 용액을 밤새 실온에서 교반한 다음, 여기에 포화 수성 염화암모늄 50㎖를 첨가하여 상기 용액을 급랭시켰다. 진공 하에 휘발성 물질을 제거하고, 유기물을 디클로로메탄으로 용해하였다. 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄 + 메탄올(농도 구배: 0% 내지 10%))를 실시하여, 본질적으로 순수한 생성물이 생성되었다(NMR).
4b: 1,1-비스(3-트리메톡시실릴프로필)-1,1-비스(디에틸포스포네이토)메탄
Figure pct00016
무수 톨루엔(25㎖) 중 1,1-디알릴-1,1-비스(디에틸포스포네이토)메탄(실시예 2a)(4.4g, 14.2mmol) 용액에, 톨루엔 중 칼슈테트 촉매(2% Pt) 및 트리에톡시실란(42.7mmol, 7.8㎖) 용액 212㎕를 첨가하였다. 이 용액을 밤새 실온에 방치하여 두었다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 진공 하에서의 톨루엔 첨가 사이클을 2회 초과 진행시켜 잔류하는 실란을 제거하였다. 잔류물을 톨루엔 중에 취한 다음, 이를 소량의 활성 탄으로 처리하고 나서, 5㎛ PTFE 필터를 통과시킨 다음, 실리카 컬럼 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄 + 0% 내지 10% 메탄올)로 정제하였다. 수득량: NMR 순도 90%인 물질 6.9g.
실시예 5: 1,1-비스(3-트리메톡시실릴프로필)-1,1-비스(디이소프로필포스포네이토)메탄의 합성
5a: 1,1-디알릴-1,1-비스(디이소프로필포스포네이토)메탄
Figure pct00017
질소 대기 하에 무수 THF(50㎖) 중 1,1-비스(디이소프로필)포스포네이토)메탄(6.44㎖, 20mmol)의 얼음 냉각된 용액에, 브롬화알릴(8.7㎖, 100mmol)을 첨가하였다. 여기에 tert-부톡시화칼륨(6.8g, 60mmol)을 2시간에 걸쳐 첨가하였다. 상기 용액을 밤새 실온에서 교반하고 나서, 여기에 포화 수성 염화암모늄 50㎖를 첨가하여 상기 용액을 급랭시켰다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 유기물을 디클로로메탄으로 용해하였다. 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄 + 메탄올(구배: 0% 내지 10%))를 진행시켜, 본질적으로 순수한 생성물 6.5g이 생성되었다(NMR).
5b: 1,1-비스(3-트리메톡시실릴프로필)-1,1-비스(디이소프로필포스포네이토)메탄
Figure pct00018
무수 톨루엔(20㎖) 중 1,1-디알릴-1,1-비스(디이소프로필포스포네이토)메탄(실시예 2a)(0.736g, 2.0mmol) 용액에, 톨루엔 중 칼슈테트 촉매(2% Pt) 및 트리에톡시실란(6.0mmol, 4.1㎖) 용액 80㎕를 첨가하였다. 이 용액을 2일 동안 실온에 방치하여 두었다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 진공 하에서의 톨루엔 첨가 사이클을 2회 초과 진행시켜 잔류하는 실란을 제거하였다. 잔류물을 톨루엔 중에 취한 다음, 이를 소량의 활성 탄으로 처리하고 나서, 5㎛ PTFE 필터를 통과시킨 다음, 실리카 컬럼 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄 + 0% 내지 10% 메탄올)로 정제하였다. 수득량: NMR 순도 90%인 물질 1.0g.
실시예 6: 1,1-비스(3-트리메톡시실릴프로필)-1,1-비스(디-(3-메톡시페닐릴)포스포네이토)메탄의 합성
6a: 1,1-비스(디-(3-메톡시페닐릴)포스포네이토)메탄
Figure pct00019
무수 디클로로메탄(50㎖) 중 비스(디클로로포스포네이토)메탄의 얼음 냉각된 용액에, 3-메톡시페놀(1.76㎖, 16mmol)을 첨가하였다. 여기에 트리에틸 아민(4.91㎖, 32mmol) 용액을 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 나서, 이를 얼음 물(150㎖)에 부었다. 여기에 디클로로메탄을 첨가하였더니 상들이 (서서히) 분리되었다. 상기 상들 중 수성 상을 디클로로메탄으로 1회 초과 추출하고, 합하여진 유기 상들을 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 증발이 끝난 후, 미정제 생성물을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피(컬럼 길이 = 10㎝, 직경 = 3㎝)로 정제하였다. 생성물을 연갈색 오일로서 얻었으며, NMR 분광 분석은 순도가 높음을 나타내었다. 수득량: 0.93g.
6b: 1,1-디알릴-1,1-비스(디-(3-메톡시페닐릴)포스포네이토)메탄
Figure pct00020
수소화 나트륨(0.683g, 미네랄 오일 중 60%, 17.1mmol)을 무수 THF(150㎖) 중에 현탁하고 나서, 이를 -30℃로 냉각하였다. 30분에 걸쳐 여기에 무수 THF 중 1,1-비스(디-(3-메톡시페닐릴)포스포네이토)메탄(실시예 4a, 2.92g, 4.87mmol) 용액을 첨가하였는데, 이때, 온도는 -30℃로 유지시켰다. 여기에 브롬화알릴(48.8mmol, 4.21㎖)을 첨가하고 나서, 반응 혼합물의 온도를 1시간 동안 -15℃로 유지시킨 다음, 5일 동안 40℃로 가열하였다. 내용물을 포화 수성 염화 암모늄 75㎖에 첨가하였다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시키고, 이때 생성된 고체를 디클로로메탄으로 분쇄하여 유기물을 추출하였다. 이를 황산 나트륨 상에서 건조시킨 다음 용매를 증발시킨 후, 미정제 생성물을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 헵탄:아세트산에틸 = 6:4)로 정제하였다. 수득량: 1.28g.
6c: 1,1-비스(3-트리메톡시실릴프로필)-1,1-비스(디-(3-메톡시페닐릴)-포스포네이토)메탄
Figure pct00021
무수 톨루엔(20㎖) 중 1,1-디알릴-1,1-비스(디-(3-메톡시페닐릴)포스포네이토)메탄(실시예 4b)(0.794g, 1.16mmol) 용액에, 톨루엔 중 칼슈테트 촉매(2% Pt) 및 트리에톡시실란(1.16mmol, 0.459㎖)의 용액 50㎕를 첨가하였다. 상기 용액을 실온에 4일 동안 방치하여 두고, 매일 여기에 실란 0.7g을 첨가하였더니, 촉매 25㎕가 생성되었다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거한 다음, 톨루엔-진공 사이클을 2회 초과 진행시켜 잔류하던 실란을 제거하였다. 잔류물을 톨루엔 중에 취한 다음, 이를 소량의 활성 탄으로 처리한 후, 5㎛ PTFE 필터를 통과시켜, 실리카 컬럼 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 아세트산 에틸:톨루엔 = 1:1)에 의해 정제하였다. 수득량: 150㎎.
실시예 7: 1,1-비스(3-트리메톡시실릴프로필)-1,1-비스(디시클로프로필메틸)포스포네이토)메탄의 합성
7a: 1,1-비스(디시클로프로필메틸)포스포네이토)메탄
Figure pct00022
무수 디클로로메탄(50㎖) 중 비스(디클로로포스포네이토)메탄(1.00g)의 얼음 냉각된 용액에, 시클로프로필메탄올(1.15g, 16mmol)을 첨가하였다. 여기에 트리에틸 아민 용액(4.91㎖, 32mmol)을 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 이를 얼음 물(150㎖)에 부었다. 여기에 디클로로메탄을 첨가하였더니, 상들이 (서서히) 분리되었다. 수성 상을 1회 초과 추출한 다음(디클로로메탄 사용), 합하여진 유기 상들을 황산 나트륨 상에서 건조시켰다. 증발 과정 이후 미정제 생성물을 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피(컬럼 길이 = 10㎝, 직경 = 3㎝)로 정제하였다. 생성물을 무색 오일로서 얻었으며, NMR 분광 분석은 순도가 높음을 나타내었다. 수득량: 1.04g(66%).
7b: 1,1-디알릴-1,1-비스(디-(시클로프로필메틸)포스포네이토)메탄
Figure pct00023
질소 대기 하에서 무수 THF(20㎖) 중 1,1-비스(디-시클로프로필메틸)-포스포네이토)메탄(실시예 5a)(0.794g, 1.16mmol)의 얼음 냉각 용액에, 브롬화 알릴(0.864㎖, 10mmol)을 첨가하였다. 여기에 tert-부톡시화 칼륨(0.66g)을 2시간에 걸쳐 첨가하였다. 실온에서 4시간 동안 상기 용액을 교반하고 나서, 여기에 포화 수성 염화 암모늄 3㎖를 첨가하여 상기 용액을 급랭시켰다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고 나서, 유기물을 디클로로메탄 중에 용해하였다. 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 헵탄:아세트산 에틸 = 3:7)시켜, 순수한 생성물 0.4g이 생성되었다(수율: 64%).
7c: 1,1-비스(3-트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디-시클로프로필메틸)-포스포네이토)메탄
Figure pct00024
무수 톨루엔(20㎖) 중 1,1-디알릴-1,1-비스(디-(시클로프로필메틸)포스포네이토)-메탄(실시예 5b)(0.373g, 0.76mmol)의 용액에, 톨루엔 중 칼슈테트 촉매(2% Pt) 및 트리에톡시실란(1.59mmol, 0.299㎖)의 용액 30㎕를 첨가하였다. 상기 용액을 실온에 4일 동안 방치하여 두고, 매일 여기에 실란 0.15㎖를 첨가하였더니, 촉매 15㎕가 생성되었다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거한 다음, 톨루엔-진공 사이클을 2회 초과 진행시켜 잔류하던 실란을 제거하였다. 잔류물을 톨루엔 중에 취한 다음, 이를 소량의 활성 탄으로 처리한 후, 5㎛ PTFE 필터를 통과시켜, 실리카 컬럼 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 클로로메탄 + 5% 메탄올)에 의해 정제하였다. 수득량: 376㎎.
실시예 8: N-(2-아미노에틸)-16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14,18-헥사옥사아이코산-20-온 아미드에 접합된 나노구조체 Y1의 합성
실시예 8a: 3-(3-브로모-2,2-비스(브로모메틸)프로폭시)프로프-1-엔
Figure pct00025
질소 대기 하에 0℃에서 수소화 나트륨(1.67g, 42mmol)을 무수 탈기 DMF(40㎖) 중 3-브로모-2,2-비스(브로모메틸)프로판올(9.75g, 30mmol) 및 브롬화 알릴(12.9㎖, 150mmol)에 조심스럽게 첨가하였다. 그 다음, 온도를 실온(22℃)으로 상승시키고 나서, 반응 혼합물을 3시간 더 교바하였다. 이후, 반응 혼합물을 수성 포화 NH4Cl(50㎖)에 조심스럽게 첨가하였다. 그 다음, H2O-상을 디에틸 에테르로 추출하고(2×50㎖), 합하여진 유기 상들을 H2O로 세정하고 나서(5×50㎖), 염수(50㎖)로 세정하였다. 유기 상을 Na2SO4로 건조시킨 다음 여과하였다. 감압 하에서 휘발성 물질을 제거하여, 연황색 오일(9.7g)이 생성되었다. 실리카 상 컬럼 크로마토그래피(헵탄:EtOAc = 9:1)를 수행하여, 투명한 오일로서 생성물이 생성되었다(6.6g; 62%). 1H-NMR (CDCl3); 5.93 (m, 1H), 5.28 (m, 2H), 4.05 (d, 2H), 3.58 (s, 6H), 3.52 (s, 2H).
실시예 8b: 16-(알릴옥시메틸)-16-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14,18,21,24,27,30-데카옥사헨트리아콘탄
Figure pct00026
질소 대기 하에 0℃에서 무수 탈기 DMF(3.5㎖, 24시간 탈수, 4Å MS) 중에 용해된 테트라에틸렌글리콜 모노메틸 에테르(1.91㎖, 9mmol)를, 시린지를 사용하여 무수 탈기 DMF(15㎖, 24시간 탈수, 4Å MS) 중 수소화 나트륨(365㎎, 9mmol)에 조심스럽게 첨가하였다. 그 다음, 온도를 실온으로 상승시키고 나서, 반응 혼합물을 30분 더 교반하였다. 이후, 여기에 3-(3-브로모-2,2-비스(브로모메틸)프로폭시)프로프-1-엔(730㎎, 2.0mmol)을 첨가하고 나서, 다시 온도를 100℃로 상승시켰다. 14시간 경과 후 반응을 종결시키고 나서[HPLC-ELSD-C18, 95:5 내지 5:95 H2O/ACN, 25분 이내, 생성물 Rt = 19.5분], 온도를 다시 실온으로 낮춘 후, 반응 혼합물을 H2O(150㎖)에 조심스럽게 첨가한 다음, H2O-상을 디에틸 에테르로 세정하였다(2×50㎖). 이후, 포화될 때까지 상기 H2O-상에 염화 나트륨을 첨가하였다. 상기 H2O-상을 EtOAc로 추출한 다음(4×50㎖), 합하여진 유기 상들을 염수로 세정하였다(2×30㎖). 황산 나트륨과 숯을 유기 상에 첨가하였다. 투명한 유기 상을 여과하고, 감압 하에서 휘발성 물질을 제거하였다(8mmHg, 40℃, 그 후 0.1mmHg(오일 펌프) 및 40℃, 잔류 DMF 제거용). 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:MeOH 9:1)를 수행한 결과, 생성물 1.05g(70%)이 생성되었다. 1H-NMR (CDCl3); 5.90 (m, 1H), 5.20 (m, 2H), 3.94 (dt, 2H), 3.70-3.55 (m, 48H), 3.45 (s, 6H), 3.43 (s, 2H), 3.40 (s, 9H).
실시예 8c: 16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14-펜타옥사헵타데칸-17-올(4)
Figure pct00027
tert-부톡시화 칼륨(74㎎, 0.66mmol)을 DMSO(3㎖) 중 2(500㎎, 0.66mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 15분 동안 진탕하였다. HPLC 분석 결과(HPLC-ELSD-C18, 95:5에서 5:95 H2O/ACN, 25분 이내), 상기 반응 혼합물이 생성물로 완전히 전환되었음을 알 수 있었다. 실온에서 염수(20㎖)를 첨가한 다음, 수성 상을 아세트산 에틸로 추출하였다(3×20㎖). 합하여진 유기 상들을 염수로 세정한 다음(3×20㎖), 이를 황산 나트륨으로 건조시켰다. 이를 여과하여, 감압 하에서 휘발성 물질을 제거한 결과, 투명한 오일로서 16-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-16-((프로프-1-에닐옥시)메틸)-2,5,8,11,14,18,21,24,27,30-데카옥사헨트리아콘탄이 생성되었다. 그 다음, HCl(0.1M)을 아세톤(4㎖) 중에 용해된 오일에 첨가하고 나서, 혼합물을 55℃에서 30분 동안 진탕하였다. 그 다음, 감압 하에서 휘발성 물질을 제거하여, 투명한 오일로서 420㎎(89%)의 4가 생성되었다. 1H-NMR (CDCl3); 3.66-3.52 (m, 48H), 3.47 (s, 6H), 3.37 (s, 9H).
실시예 8d: tert-부틸 16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14,18-헥사옥사아이코산-20-오에이트(5)
Figure pct00028
tert-부톡시화 칼륨(32㎎, 0.28mmol)을, 무수 THF(3㎖) 중 4(100㎎, 0.14mmol) 및 아세트산 tert-부틸-2-브로모(105㎎, 0.54mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 진탕하였다. 여기에 디에틸 에테르(10㎖) 및 염수(5㎖)를 첨가하고 나서, 수성 상을 아세트산 에틸로 추출하였다(3×20㎖). 합하여진 유기 상들을 염수로 세정한 다음, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에서 휘발성 물질을 제거한 다음, 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(아세트산에틸/메탄올 = 9:1)로 정제하여, 60㎎(52%)의 5가 생성되었다. 1H-NMR (CDCl3); 3.91 (s, 2H), 3.66-3.52 (m, 48H), 3.51 (s, 2H), 3.45 (s, 6H), 3.37 (s, 9H), 1.46 (s, 9H).
실시예 8e: 16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14,18-헥사옥사아이코산-20-온산(6)
Figure pct00029
트리플루오로아세트산(TFA, 0.5㎖) 및 디클로로메탄(0.5㎖)을 5(20㎎)에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕한 다음, 감압 하에서 휘발성 물질을 제거하여, 황색 오일로서 18㎎의 6이 생성되었다.
실시예 8f: N-(2-t-부톡시카보닐아미도에틸)-16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14,18-핵사옥사아이코산-20-온 아미드
Figure pct00030
질소 대기 하에 실온에서, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를, DMF(1㎖, 무수 4Å MS 및 탈기) 중 16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사-펜타데실-2,5,8,11,14,18-헥사옥사아이코산-20-온산(실시예 8e)(153㎎, 0.2mmol), N-Boc-에틸렌디아민(40㎎, 0.25mmol) 및 디이소프로필에틸아민(87㎕, 0.5mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 20시간 동안 진탕하였다. 상기 반응 혼합물에 디에틸 에테르를 첨가하고 나서, 이 혼합물을 H2O로 3회 추출하였다. 합하여진 수성 상들을 NaCl(s)로 포화시키고 나서, 이를 EtOAc로 4회 추출하였다. 합하여진 유기 상들을 Na2SO4로 건조시킨 다음, 여과하고, 감압 하에서 용매를 제거하여, 연황색 오일로서 생성물 190㎎(정량적 수득량)이 생성되었다. HPLC 분석(HPLC-ELSD-C18, 90:10 → 5:95 TFA 0.1%, H2O/ACN 중, 20분 이내)을 수행하여, 14.5분 경과시 단일 피크가 나타나는 것이 확인되었다.
실시예 8g: N-(2-아미노에틸)-16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14,18-헥사옥사아이코산-20-온 아미드
Figure pct00031
TFA(2㎖)를, 디클로로메탄(2㎖) 중 N-(2-t-부톡시카보닐아미도에틸)-16,16-디-2,5,8,11,14-펜타옥사펜타데실-2,5,8,11,14,18-헥사옥사아이코산-20-온 아미드(실시예 8f, 160㎎, 0.18mmol)에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 감압 하에서 휘발성 성분들을 제거한 다음, 잔류물을 무수 톨루엔(Al2O3)과 함께 2회 공동 증발시킨 다음, 오일 펌프를 사용하여 건조시켰다. 그 결과, 생성물이 130㎎ 생성되었다. HPLC 분석(HPLC-ELSD-C18, 90:10에서 5:95 TFA 0.1%, H2O/MeCN 중, 20분 이내)을 수행하여, 10.7분 경과시 단일 피크가 나타나는 것이 확인되었다. MS (ESP+) [M]: 807.5.
실시예 8h: 접합
나노구조체 X1(실시예 10c, 100㎎, 0.4mmol P eq)을 H2O(2㎖) 중에서 음파 처리에 의해 용해하였다. 6M 및 1M NaOH(수성)를 사용하여 pH를 1.9에서 10.4로 맞추었다. 그 다음, 여기에 H2O(2㎖) 중에 용해된 염화 망간(12.5㎎, 0.065mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 30℃에서 30분 동안 진탕하였다. 0.1M HCl(수성)을 사용하여 pH를 8.5에서 7.1로 맞추고 나서, 여기에 실시예 8g로부터 얻은 물질(37㎎, 0.04mmol)과 N-하이드록시설포숙신이미드 나트륨 염(9㎎, 0.04mmol)(H2O(2㎖) 중에 용해)을 첨가하였다. 이후, 여기에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(24㎎, 0.12mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 21시간 동안 진탕한 다음, 여과하였다(5um 튜브 필터). 여과물을 스핀 여과하고(10k 컷-오프, 3000G, 30분), 농축물(4㎖)을 희석하여 15㎖로 만들었다(H2O 사용). 이 과정을 4회 반복하였다. 상기 농축물(4㎖)의 pH를 4.7에서 7.1로 맞추었다(0.1M NaOH(수성) 사용). 여과물을 스핀 여과하고(10k 컷-오프, 3000G, 15분), 농축물(0.5㎖)을 희석하여 4㎖로 만들었다(H2O 사용). 이 과정을 4회 반복하였다. 최종 농축물을 여과하고(시린지 필터 0.2um 사용), 2㎖로 희석하였다(H2O 사용). 용적 입자 크기 분포 = 4㎚ 내지 5㎚. GPC 분석(수퍼로즈(Superose) 12 10/300GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 = 1㎖/분). Rt = 10.3분.
실시예 9: 폴리에틸렌이민-비스포스포네이트 나노구조체 Z의 합성
실시예 9a: 3,3-비스(디메톡시포스포릴)프로파논산 t-부틸 에스테르
Figure pct00032
질소 대기 하에 무수 THF(40㎖) 중 브로모아세트산 tert-부틸(7.35㎖, 50mmol) 및 비스(디메톡시포스포릴)메탄(4.64g, 20mmol)의 얼음 냉각 용액에, tert-부톡시화 칼륨(5.8g, 43mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 나서, 여기에 포화 염화 암모늄 4㎖를 첨가하여 상기 반응 혼합물을 급랭시켰다. 진공 하에서 톨루엔을 첨가/증발 사이클을 2회 수행하여 휘발성 물질을 제거하였다. 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄:메탄올 = 95:5)를 수행하여, 오일로서 생성물이 생성되었다. 수득량 = 4.0g.
실시예 9b: 3,3-비스(디메톡시포스포릴)프로파논산
Figure pct00033
디클로로메탄(10㎖) 중 3,3-비스(디메톡시포스포릴)프로파논산 t-부틸 에스테르(2.5g) 용액에, 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 이를 실온에서 교반한 다음, 진공 하에서 휘발성 물질을 증발시켰다. 톨루엔 일부(5㎖)를 대상으로 진공 증발 사이클을 3회 진행시켜, 생성물 2.2g이 생성되었다.
실시예 9c: 폴리에틸렌이민-비스포스포네이트 나노구조체 Z의 합성
분지형 폴리에틸렌이민(평균 분자량 = 25kDa, 100㎎, 2.5mmol, 1차 아미노기), 3,3-비스(디메톡시포스포릴)프로파논산(1.1g, 3.87mmol) 및 N-하이드록시설포숙신이미드 나트륨 염(100㎎, 0.46mmol)을 H2O(10㎖) 중에 용해하였다(음파 처리, 10분). pH를 1.8에서 6.5로 맞추고 나서(1M NaOH 사용), 여기에 N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(1.0g, 5.2mmol)를 첨가하였다. 실온에서 23시간 동안 반응 혼합물을 진탕하고 나서, 여과하였다(5㎛ 시린지 필터 사용). 여과물을 스핀 여과하고(10k 컷-오프, 3000G, 30분), H2O를 사용하여 체류액(2㎖)을 10㎖로 희석하였다. 이 과정을 4회 반복 수행하였다. H2O를 사용하여 최종 체류액(2㎖)을 6㎖로 희석하였다. DLS에 의한 용적 평균 입자 크기 분포: 4㎚ 내지 5㎚. GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 9.1분.
실시예 10: 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메타네토를 중합하여 나노구조체 X를 제조함
1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(xg, ymmol, 이하 표 1 참조)을, 가압 용기 내에서 수성 80% 1-프로판올 200㎖ 중에 용해하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 48시간 동안 교반한 다음, 다시 110℃에서 24시간 동안 교반하였다. 투명 용액을 실온으로 냉각시킨 다음, 이를 밀리Q H2O(800㎖)로 희석하고 나서, 300k 공칭 분자량 컷-오프(NMWC) 공극 크기 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-300-C-3MA)을 사용하여 정용 여과를 수행하였다. 그 다음, 수집된 투과물(약 980㎖)을 100k NMWC 공극 크기 정용 여과 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-100-C-3MA) 상에 수집하여, 나노구조체 용액을 농축하였다. 대안적으로는, 팔 라이프 사이언시스(Pall Life Sciences)사의 필터, 구체적으로 센트라메이트 T-시리즈 카세트 OS0100T02(100k NMWC 공극 크기 카세트)를 사용하기도 하였다. 밀리Q 물을 반복적으로 첨가한 다음, 수집된 체류액을 여과하였다. 수집된 체류액(X1)의 최종 용적은 약 50㎖였다.
뿐만 아니라, 100k 정용 여과 컬럼을 통과한 투과물을 수집하고 나서, 30k NMWC 공극 크기 필터 카트리지(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-30-C-3MA)를 사용하여 상기 투과물을 여과하였다. 여기에 밀리Q 물을 반복 첨가하고(2회), 수집된 체류액을 여과하였다. 수집된 체류액(X2)의 최종 용적은 약 50㎖였다.
실시예 10a: 100mM 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 중합
X1a. 양: x = 12.8g, y = 20mmol. 정용 여과후 회수율 = 26%(P 회수율 기반); 최종 pH ~2; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 9.2분; 조성(ICP, 몰비): P/Si = 0,9.
X2a. 양: x = 12.8g, y = 20mmol. 정용 여과후 회수율 = 17%(P 회수율 기반); 최종 pH ~2; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.3분; 조성(ICP, 몰비): P/Si = 0.9.
실시예 10b: 80mM 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 중합
X1b. 양: x = 10.4g, y = 16mmol. 정용 여과후 회수율 = 31%(P 회수율 기반); 최종 pH ~2; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 9.2분; 조성(ICP, 몰비): P/Si =1.1.
X2b. 양: x = 10.4g, y = 16mmol. 정용 여과후 회수율 = 19%(P 회수율 기반); 최종 pH ~2; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.4분; 조성(ICP, 몰비): P/Si = 1.1.
실시예 10c: 50mM 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 중합
X1c. 양: x = 6.4g, y = 10mmol. 정용 여과후 회수율 = 21%(P 회수율 기반); 최종 pH ~2; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 9.7분; 조성(ICP, 몰비): P/Si =0.9.
X2c. 양: x = 6.4g, y = 10mmol. 정용 여과후 회수율 = 25%(P 회수율 기반); 최종 pH ~2; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.5분; 조성(ICP, 몰비: P/Si = 0.9;
실시예 10d: 상이한 용매들 중 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄을 중합하여 나노구조체 X를 제조함
1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(3.2g, 5mmol)을, 수성 80% 에틸렌 글리콜(100㎖) 중에 용해하였다. 116℃에서 반응 혼합물을 21시간 동안 교반하였다. 전술된 바와 같이 중합을 진행시켰으되, 다만 수성 80% 1,2-프로판디올(111℃에서 24시간 교반한 다음, 114℃에서 4시간 교반) 또는 수성 80% 디에틸렌 글리콜(108℃에서 20시간 교반한 다음, 114℃에서 2시간 교반) 또는 수성 80% 트리에틸렌 글리콜(115℃에서 22시간 교반) 또는 수성 80% 디(에틸렌 글리콜)메틸 에테르(106℃에서 18시간 교반한 다음, 111℃에서 18시간 교반) 또는 수성 80% 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르(107℃에서 35시간 교반) 또는 수성 80% 글리세롤(114℃에서 19시간 교반)에서 중합을 진행시켰다.
실시예 10e: 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 Pt-스캐빈징
레진테크(Resintech)에 의해 제공된 SIR-200(100g, 킬레이트화 수지, 티올, H형)을 수성 5% 중탄산나트륨 용액(500㎖)과 함께 2회 진탕하고 나서, 다시 밀리Q 물과 함께 2회 진탕하였다. 여과에 의해 물을 걸러낸 다음, 무수 톨루엔(100㎖)을 SIR-200에 첨가하였다. 진공 하에서 휘발성 물질을 제거한 다음, 진공 하에서의 톨루엔 첨가 사이클을 2회 초과 진행시켜 잔류하던 물을 제거하였다. 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(30g, 백금 함량 = 39ppm)을 용기 내에서 무수 톨루엔(300㎖) 중에 용해하였다. 여기에 SIR-200(10g, 전술된 바와 같이 처리)을 첨가하고 나서, 밤새 진탕하였다. SIR-200을 여과하여 제거한 다음, 휘발성 물질을 진공 하에 제거하여, 백금 함량이 0.38ppm인 물질이 생성되었다.
실시예 11. 나노구조체 X에의 망간 로딩과 접선 흐름 여과에 의한 정제를 통해 나노구조체 Y를 제조함
6M 및 1M NaOH(수성)를 사용하여 나노구조체 X(실시예 13) 용액의 pH를 pH2에서 pH10.4로 만든 후, 이를 2시간 동안 방치하여 두었다. 그 다음, 여기에 염화 망간(II) 4수화물(xx㎎, yymmol)을 첨가하여 용해하였다. 이 혼합물을 30℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 반응 후 상기 혼합물의 pH는 약 7.6이었고, 이후, 1M HCl(수성)을 사용하여 pH를 7.4로 만들었다. 밀리Q H2O를 사용하여 이와 같이 반응한 혼합물을 50㎖로 희석하고 나서, 10k NMWC 공극 크기 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-10-C-3MA)을 사용하여 정용 여과를 수행함으로써 유리 Mn 이온을 제거하였다. 대안적으로는, 팔 라이프 사이언시스사의 필터, 구체적으로 센트라메이트 T-시리즈 카세트 OS010T02(10k NMWC 공극 크기 카세트)를 사용하기도 하였다. 체류액을 수집하고 나서, 희석 및 정용 여과 과정을 3회 반복 수행하였다.
Y1a. 나노구조체 X 사용: 실시예 X1a, 15㎖, 3.2mmol P. MnCl2 4H2O 사용: xx =106.7㎎, yy = 0,54mmol. 최종 pH 7.4; 용적 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대 = 5.6㎚; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 9.5분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 5.7, P/Si = 0.9, Si/Mn = 6.2; 이온 교환 안정성(pH 5.5 = 45% 및 pH 7 = 62%).
Y1b. 나노구조체 X 사용: 실시예 X1a, 15㎖, 3.2mmol P. MnCl2·4H2O 사용: xx =107㎎, yy = 0.54mmol. 최종 pH 7.4; 용적 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대 = 6.5㎚; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.1분 & 숄더부(shoulder) 9분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 5.4, P/Si = 0.9, Si/Mn = 6; 이온 교환 안정성(pH 5.5 = 47% 및 pH 7 = 66%).
Y2a. 나노구조체 X 사용: 실시예 X2a, 15㎖, 2mmol P. MnCl2 4H2O 사용: xx =71㎎, yy = 0.36mmol. 최종 pH 7.4; 용적 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대 = 4.1㎚; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.5분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 6.6, P/Si = 0.9, Si/Mn = 7.3; 이온 결합 안정성(pH 5.5 = 43% 및 pH 7 = 60%); 81.33MHz 및 25℃에서 r1 =41mM-1 Mn s-1 .
Y2b. 나노구조체 X 사용: 실시예 X2a, 15㎖, 2mmol P. MnCl2 4H2O 사용: xx =71㎎, yy = 0,36mmol. 최종 pH 7.4; 용적 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대 = 5.6㎚; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.1 분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 5.6, P/Si = 0.9, Si/Mn = 6.2; 이온 교환 안정성(pH 5.5 = 44% 및 pH 7 = 63%).
실시예 11a: 1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄의 중합을 통해 나노구조체 X 를 제조함
11a’:
1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(0.64g, 1mmol)을 수성 80% 에틸렌 글리콜(12㎖) 중에 용해하였다. 포름산나트륨 28㎎(0.42mmol) 내지 140㎎(2.1mmol)과, 염화 망간(II) 4수화물(33㎎, 0.17mmol)을 수성 80% 에틸렌 글리콜(4㎖) 중에 각각 용해하고 나서, 이 용액을 반응 혼합물에 첨가한 후, 이를 114℃에서 22시간 동안 교반하였다.
11a”:
1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(0.64g, 1mmol)을, 수성 80% 에틸렌 글리콜(12㎖) 중에 용해하였다. 포름산칼륨(52㎎, 0.62mmol)과 염화 망간(II) 4수화물(33㎎, 0.17mmol)을 수성 80% 에틸렌 글리콜(4㎖) 중에 각각 용해하고 나서, 이 용액을 반응 혼합물에 첨가한 후, 이 혼합물을 116℃에서 21시간 동안 교반하였다.
11a”’ :
1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(0.64g, 1mmol)을, 수성 80% 에틸렌 글리콜(16㎖) 중에 용해하였다. 포름산테트라메틸암모늄(물중 32wt% 용액, 0.245㎖, 0.62mmol)과 염화 망간(II) 4수화물(33㎎, 0.17mmol)을 수성 80% 에틸렌 글리콜(4㎖) 중에 용해하고 나서, 이 용액을 반응 혼합물에 첨가한 후, 116℃에서 21시간 동안 교반하였다.
실시예 11b: 실란을 첨가하여“경화된”나노구조체 X에의 망간 로딩 및 정용 여과에 의한 정제를 통해 나노구조체 Z를 제조함
나노구조체 X(실시예 10f) 용액 2㎖에, 탈기 염화 망간(II) 4수화물(80% 수성 에틸렌 글리콜 중 용해; 100mM) x㎖를 첨가하여, 인-망간 몰비를 12로 만들었다. 80% 수성 에틸렌 글리콜 중 용해된 탈기 포름산 나트륨(100mM) y㎖를 Mn-로딩된 나노구조체 용액에 첨가하여, 포름산나트륨-망간 몰비를 5 또는 3으로 만들었다. 최종 pH를 체크하고 나서, 이 pH를 약 5 또는 3으로 맞추었으며, 필요한 경우 여기에 NaOH(수성) 또는 HCl(수성)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 100℃에서 12시간 또는 18시간 동안 진탕하였다. 이 혼합물에 에탄올(120mM) 중에 용해한 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) z㎖를 첨가한 다음, 100℃에서 18시간 또는 24시간 동안 추가로 진탕하였다. (처음 가열 단계 이후 TEOS를 사후 첨가하는 방법의 대안으로서는, TEOS 용액을 Mn 로딩된 나노구조체 용액(Na-포름산염 함유)에 직접 혼입시켜, 이를 100℃에서 12시간 또는 18시간 동안 진탕하는 방법이 있다).
상기 혼합물을 가열 및 진탕한 다음, 여기에 NaOH(수성)를 첨가하여 pH를 7.0±0.5로 만들고, 4㎖ 100kDa 원심 분리 필터(밀리포어(Millipore)사 센트리프렙(Centriprep)®)를 사용하여 한외 여과(UF)를 실시하였다. 상기 용액을 처음에 밀리Q로 약 4㎖로 희석한 다음, 10분 내지 15분 동안 스핀(spin)하였다(3000×g). 여과물을 수집한 후, 이를 4㎖ 들이 10kDa 원심분리 필터(밀리포어사 센트리프렙®)로 옮긴 다음, 밀리-Q 물을 사용하여 4㎖로 희석하고 나서, 철저히 혼합하고, 스핀 여과(3000×g, 10분)하였더니, 체류액 약 500㎕가 수집되었다. 희석 및 정용 여과 과정을 3회 반복하였다. 밀리-Q 물을 사용하여 최종적으로 수집된 체류액 500㎕를 1㎖로 희석하였다. 그 다음, Mn 농도 측정, 착물 형성 안정성 테스트(이완율 측정법(relaxometry)에 의해 평가)(실시예 14b), GPC 분석 및 조성(ICP 측정치) 분석을 수행하였다.
Z1a. 비스비스에 상대적인 3% TEOS. 나노구조체 X 사용: 2㎖, 0.2mmol P; x = 167㎕; Na-포름산염-Mn 비: 5; y = 835㎕; z = 25㎕, 가열 전 최종 pH: pH 5; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 12.6분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn =11.61, P/Si = 1.01, Si/Mn = 10.51; 착물 형성 안정성(pH 7) = 24%
Z1b. 비스비스에 상대적인 5% TEOS. 나노구조체 X 사용: 2㎖, 0.2mmol P; x = 167㎕; Na-포름산염-Mn 비: 5; y = 835㎕; z = 41.7㎕, 가열 전 최종 pH: pH 5; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 12.6분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 12.05, P/Si = 1.02, Si/Mn = 11.77; 착물 형성 안정성(pH 7) = 23%
Z1c. 비스비스에 상대적인 3% TEOS. 나노구조체 X 사용: 2㎖, 0.2mmol P; x = 167㎕; Na-포름산염-Mn 비: 5; y = 835㎕; z = 25㎕, 가열전 최종 pH: pH 3.5; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 12.6분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn =13.03, P/Si = 0.93, Si/Mn = 13.96; 착물 형성 안정성(pH 7) = 27%
Z1d. 비스비스에 상대적인 5% TEOS. 나노구조체 X 사용: PL04064, 2㎖, 0.2mmol P; x = 167㎕; Na-포름산염-Mn 비: 5; y = 835㎕; z = 41.7㎕, 가열전 최종 pH: pH 3.5; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 12.6분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 13.31, P/Si = 0.92, Si/Mn = 14.53; 착물 형성 안정성(pH 7) = 26%.
Figure pct00034
실시예 12. 동결 건조 제형된 Mn 로딩 나노구조체
1,1-비스(트리에톡시실릴프로필)-1,1-비스(디메틸포스포네이토)메탄(6.4g, 0.01mmol)을 가압 용기 내 수성 80% 1-프로판올 200㎖에 용해하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 48시간 동안 교반한 다음, 다시 110℃에서 24시간 동안 교반하였다. 온도를 실온으로 낮추었더니, 투명하고 무색인 용액이 수집되었다. 수집된 용액을 밀리Q H2O(800㎖)로 희석한 다음, 이를 300k NMWC 공극 크기 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-300-C-3MA)을 사용하여 여과를 수행하였다. 그 다음, 수집된 투과물(약 980㎖)을 100k NMWC 공극 크기 정용 여과 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-100-C-3MA)을 사용하여 여과함으로써, 고분자 용액을 농축하였다. 밀리Q 물을 반복적으로 첨가하고, 수집된 체류액을 여과하였다. 수집된 체류액의 최종 용적은 약 50㎖였다. 조성(ICP, 몰비):P/Si = 0.84.
뿐만 아니라, 100k 정용 여과 컬럼을 통과한 투과물을 수집한 다음, 이를 30k NMWC 공극 크기 정용 여과 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-30-C-3MA)을 사용하여 여과를 수행하였다. 밀리Q 물을 반복적으로 첨가하고(2회), 수집된 체류액을 여과하였다. 수집된 체류액의 최종 용적은 약 50㎖였다. 조성(ICP, 몰비):P/Si = 0.88.
6M 및 1M NaOH(수성)를 사용하여 100k 정용 여과 컬럼을 통과한 나노구조체(25㎖, 2.1mmol)의 pH를 2.2에서 10.5로 맞추고 나서, 이 나노구조체를 2시간 동안 방치하여 두었다. 그 다음, 여기에 염화 망간(II) 4수화물(45.4㎎, 0.23mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 30℃에서 16시간 동안 진탕하였다. 반응을 마친후 혼합물의 pH는 9.3이었으며, 이후, 1M HCl(수성)을 사용하여 pH를 7.4로 맞추었다. 밀리Q H2O로 상기 혼합물을 희석하여 50㎖로 만들고 나서, 10k NMWC 공극 크기 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-10-C-3MA)을 사용하여 정용 여과를 수행하였다. 체류액을 수집하고 나서, 희석 및 정용 여과 과정을 3회 반복 실시하였다. 최종 수집 용액의 용적은 10㎖였다.
수집된 용액 8.1㎖에 만니톨(0.36g, 2.0mmol)을 첨가하여 농도를 250mM로 만들었다. 이후, 상기 혼합물을 16시간 동안 동결 건조시켰더니, 백색의 거품상 분말이 0.5g 얻어졌다. 동결 건조된 물질의 수용액 20㎎/㎖을 제조한 후 분석하였다. 용적중 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대 수치 = 4.8m nm; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.3분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 9.8, P/Si = 0.9, Si/Mn = 10.7; 이온 교환 안정성(pH 5.5 = 72% 및 pH 7 = 89%); 60 MHz, 37℃에서의 r1 = 39 mM-1 Mn s-1.
실시예 13. 이온 교환 수지를 사용하는, 나노구조체 Y의 추가 정제
과량으로 존재하거나 느슨하게 결합된 Mn 이온을 더 제거하기 위해서, 샘플 Y1을 양이온 교환 물질(설폰화된 폴리스티렌)로 처리하였다: Mn 로딩된 나노구조체 약 10㎖(약 10mM Mn)를, 다우엑스 50WX4(Dowex 50WX4)(Na 형, 물로 미리 헹군 것) 1g과 혼합한 다음, 0.1M NaOH를 사용하여 이 혼합물의 pH를 7.0으로 맞추었다. 상기 혼합물을 16시간 동안 서서히 회전시킨 다음, 3000rpm에서 원심 분리하였다.
실시예 14. 망간 함유 나노구조체의 안정성(“이온 교환 안정성”이라고도 칭하여짐) 측정
우선, 나노구조체 용액의 망간 농도를 측정하고 나서, 이 용액을 물로 희석하여 망간 농도를 1.5mM로 만들고, 최종 용적을 2.2㎖로 만들었다. 희석된 샘플 용액 1000㎖ 2개에 다우엑스 50WX4(Na 형, 물로 미리 헹군 것) 100㎎ 2개를 첨가하였다. 0.1M NaOH 또는 0.1M HCl(일반적으로 수 마이크로리터정도만 필요함)로 상기 용액 2개의 pH를 각각 7.0과 5.5로 만들었다. 이 혼합물이 담긴 바이알을 천천히 회전시켜 상기 혼합물을 16시간 동안 잘 혼합하였다. IEX 입자를 침강시킨 후, 상청액으로부터 유래하는 분취액 100㎕를 분석하였다([Mn]IEX). 샘플 중 망간의 초기 농도를 측정하기 위해서, 전술된 바와 같이 제조된 용액의 나머지를 사용하여 [Mn]start를 측정하였다. 안정성을 다음과 같이 산정하였다: [Mn]IEX/[Mn]start*100 (%).
실시예 14b. 이완율 측정법에 의해 평가된 망간 함유 나노구조체의 착물 형성 안정성 테스트
농도 1mM Mn인 나노구조체 용액의 횡 이완율(r1(ns))을 측정하였다. 1mM Mn을 함유하는 나노구조체 용액을 또 만들고 나서, 여기에 동 몰량의 EDTA를 첨가하였다. 필요할 경우, 이 용액의 pH를 7±0.5로 맞추어야 했다. EDTA가 첨가된 본 나노구조체 용액의 횡 이완율을 측정하였다(r1(ns+EDTA)). AAS용 망간 표준(플루카 77036)을 사용하여 참고 물질로서 1mM 용액을 제조하였으며, 여기에 동 몰량의 EDTA를 첨가하고, pH를 7±0.5으로 만들었다. 횡 이완율을 측정하고(r1(Mn+EDTA)), 이 횡 이완율을 1.6 mM-1s-1로 만들었다. 동량의 EDTA를 첨가한 후 나노구조체로부터 방출된 Mn의 %를 산정하였다:
Figure pct00035
주: 미니스펙(Minispec) mq60 NMR 분석 장치(60MHz)를 사용하여 37℃에서의 이완 시간(T1, 초)을 측정하였으며, 이완율 r1은 다음과 같은 등식을 사용하여 산정하였다:
Figure pct00036
(상기 식 중, T1 H2O = 0.32s; c1= 1mM)
실시예 15. 칼슘 및 망간이 참여하는 금속 교환 반응
NaCl(7.14 g), NaHCO3(1.4 g), KHCO3(0.43 g), NaH2PO4(0.165 g), Mg(OAc)2(0.17 g)로부터 유래하는 무기 성분들을 혼합하여, 혈액의 무기 성분과 대체로 유사하되 칼슘은 포함하지 않는 완충액을 만들고 나서, 이를 희석하여 용적 1.00ℓ로 만들었다. 이를 “혈액 완충액(blood buffer)”이라 명명하였다. 나노구조체 샘플 2개를 대상으로 테스트 A(Y1, 300kDa 및 100kDa 사이의 입자를 차단하는 필터) 및 테스트 B(Y2, 100kDa 및 30kDa 사이의 입자를 차단하는 필터)를 수행하였다. 테스트 튜브는 다음과 같이 준비하였다:
샘플 1: 900㎕ 물 샘플 A 100㎕
샘플 2: 900㎕ 물 샘플 B 100㎕
샘플 3: 900㎕ 혈액 완충액 샘플 A 100㎕
샘플 4: 900㎕ 혈액 완충액 샘플 B 100㎕
샘플 5: 900㎕ 혈액 완충액 + 1.3mM CaCl2 샘플 A 100㎕
샘플 6: 900㎕ 혈액 완충액 + 1.3mM CaCl2 샘플 B 100㎕
A와 혼합된 샘플들을 분석한 결과 총 Mn 농도는 1.3mM이었으며, B와 혼합된 샘플들을 분석한 결과 총 Mn 농도는 1.5mM이었다. 상기 용액들을 실온에서 1시간 동안 항온 처리한 후, 이를 10kDa 컷-오프 스핀 필터에 통과시켰다. 여과물들을 망간에 대해 분석하였다. 그 결과는 표 2에 나타내어져 있다.
Figure pct00037
실시예 16. Mn 로딩된 디메틸-2-(트리에톡시실릴)에틸포스포네이트 고분자
가압 용기 내에서 디메틸-2-(트리에톡시실릴)에틸포스포네이트(DTEP, 0.9g, 3.0mmol)를 수성 80% 1-프로판올 30㎖ 중에 용해하였다. 반응 혼합물을 95℃에서 48시간 동안 교반한 다음, 다시 120℃에서 24시간 동안 교반하였다. 온도를 실온으로 낮추었더니, 투명하고 무색인 용액이 수집되었다. 수집된 용액을 밀리Q H2O(470㎖)로 희석한 다음, 100k NMWC 공극 크기 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-100-C-3MA)을 사용하여 여과를 수행하였다. 그 다음, 수집된 투과물(480㎖)을 30k NMWC 공극 크기 정용 여과 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-30-C-3MA)을 사용하여 여과하여, 고분자 용액을 농축하였다. 밀리Q 물을 반복적으로 첨가하고, 수집된 체류액을 여과하였다. 수집된 체류액의 최종 용적은 약 7.5㎖였다. 조성(ICP, 몰비):P/Si = 0.5.
6M 및 1M NaOH(수성)를 사용하여 DTEP 고분자 용액 7.5㎖(0.4mmol P)의 pH를 2.6에서 10.4로 맞추고 나서, 이 용액을 2시간 동안 방치하여 두었다. 그 다음, 여기에 염화 망간(II) 4수화물(5.9㎎, 0.3mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 30℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 반응을 마친후 혼합물의 pH는 약 9.4였으며, 이후, 1M HCl(수성)을 사용하여 pH를 7.4로 맞추었다. 밀리Q H2O로 상기 반응한 혼합물을 희석하여 50㎖로 만들고 나서, 10k NMWC 공극 크기 컬럼(GE 헬쓰케어 미드지 한외 여과 카트리지 모델: UFP-10-C-3MA)을 사용하여 정용 여과를 수행함으로써, 유리 Mn 이온을 제거하였다. 체류액을 수집하고 나서, 희석 및 정용 여과 과정을 3회 반복 실시하였다. 용적중 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대 수치 = 5.6nm; GPC 분석(수퍼로즈 12 10/300 GL, 100mM NH4CO3, pH = 7.4, 유속 1㎖/분) Rt = 10.3분; 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 2.7, P/Si = 0.5, Si/Mn = 5.7; 이온 교환 안정성(pH 5.5 = 21% 및 pH 7 = 24%); 81.3MHz, 25℃에서의 r1 = 3mM-1 Mn s-1.
실시예 17. Mn이 로딩된 졸렌드론산
졸렌드론산(27㎎, 0.01mmol)을 밀리Q H2O 10㎖에 용해하였다. 염화 망간(II) 4수화물 수용액 100mM를 제조하였다. Mn-용액 10㎕를 졸렌드론산 용액 408㎕ 및 밀리Q H2O 582㎕와 혼합하였다. 6M NaOH(수성)를 사용하여 pH를 7.4로 맞추었다. 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 5.26. 81.3MHz, 25℃에서의 r1 = 2.3mM-1 Mn s-1
실시예 18. Mn이 로딩된 메틸렌디포스폰산
메틸렌디포스폰산(9.2㎎, 0.05mmol)을 밀리Q H2O 5㎖에 용해하였다. 염화 망간(II) 4수화물 수용액 28mM을 제조하였다. Mn-용액 35㎕를 메틸렌디포스폰산 용액 286㎕ 및 밀리Q H2O 679㎕와 혼합하였다. 6M NaOH(수성)를 사용하여 pH를 7.1로 맞추었다. 조성(ICP, 몰비): P/Mn = 4.6. 81.3MHz, 25℃에서의 r1 = 1mM-1 Mn s-1
실시예 19. 기타 금속 이온이 로딩된 나노구조체 X
6M 및 1M NaOH(수성)를 사용하여 나노구조체 X2a의 pH를 2에서 10.4로 만들고나서, 이를 2시간 동안 방치하여 두었다. 그 다음, 여기에 금속 염(xx㎎, yymmol, 이하 표 3 참조), 예를 들어 Fe(II) 염화물의 수화물, Fe(III) 염화물의 수화물, Er(III) 염화물의 수화물 또는 Dy(III) 염화물의 수화물을 첨가하였다. 이 혼합물을 30℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 반응후 상이한 샘플에 있어서 혼합물의 pH는 4.7에서 7.2로 다양하였는데, 이후, 1M HCl(수성)을 사용하여 pH를 7.4로 만들었다. 상기 혼합물을 스핀 여과한 다음(10k MWCO, 3000×g, 15분), 밀리Q H2O를 사용하여 농축물(0.5㎖)을 4㎖로 희석하였다. 이 과정을 4회 반복 수행하였다. 밀리Q H2O를 사용하여 최종 농축물을 4㎖로 희석하였다.
a: 전구체 X2a, 4㎖, 0,11mmol P. FeCl2·4H2O 사용: xx =7.2㎎, yy = 0.04mmol. 최종 pH 7.4; 용적 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대치 = 8.7㎚; 조성(ICP, 몰비): P/Fe = 4.2, P/Si = 0.9, Si/Fe = 4.5; 81.33MHz, 25℃에서의 r1 = 3.1mM-1 Fe s-1.
b: 전구체 X2a, 4㎖, 0,11mmol P. FeCl3·6H2O 사용: xx =9㎎, yy = 0.03mmol. 최종 pH 7.4; 용적중 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대치 = 8.7㎚; 조성(ICP, 몰비): P/Fe = 6.5, P/Si = 0.9, Si/Fe = 7.2; 81.33 MHz, 25℃에서의 r1 = 8.5mM-1 Fe s-1.
c: 전구체 X2a, 4㎖, 0,11mmol P. ErCl3·6H2O 사용: xx =12.7㎎, yy = 0.03mmol. 최종 pH 7.4; 용적중 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대치 = 50㎚; 조성(ICP, 몰비): P/Er = 5.3, P/Si = 0.9, Si/Er = 5.7; 81.33 MHz, 25℃에서의 r1 = 0.4mM-1 Er s-1.
d: 전구체 X2a, 4㎖, 0,11mmol P. DyCl3·6H2O 사용: xx =13.6㎎, yy = 0.04mmol. 최종 pH 7.4; 용적중 입자 크기(150mM NaCl 중 DLS) 최대치 = 10.1㎚; 조성(ICP, 몰비): P/Dy = 4.4, P/Si = 0.9, Si/Dy = 4.7; 81.33 MHz, 25℃에서의 r1 = 0.6mM-1 Dy s-1.
실시예 20. Mn 로딩된 물질의 이완율
일부 Mn 로딩된 물질의 이완율을 표 3에 보였다.
Figure pct00038
실시예 21: 생체 내 조영
MR 영상의 품질과 콘트라스트를 생체(즉, 공격적 생장 EL-4 마우스 림프종이 발생된 마우스)에서 관찰하였다. 림프종이 유도된 C57BL/6 마우스로 쥣과동물의 림프종 세포주 EL-4를 확립하였다. 림프아구 세포는 실험관 내, 즉 현탁액 중에서 C57BL/6 마우스 내 동종 이식편으로서 용이하게 생장하였다.
EL-4 세포(ECACC 85023105)를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 동종 이식된 종양을 발달시켰다. 세포 현탁액을 피하 주사하여 수일에 걸쳐 종양을 발달시켰다. 주사후 6일 내지 10일 경과시 종양을 대상으로 조영술을 실시하였다.
MR 프로토콜을 최적화하고 나서, 2마리의 동물을 대상으로 테스트를 실시하였다. EL-4 종양 발생 동물 7마리로부터 MR 영상을 획득했는데; 이 동물들 중 마우스 4 마리에는 3mM/175㎕ Y2를, 마우스 3 마리에는 17mM/175㎕ 마그네비스트(Magnevist)를 투여하였다[상기 두 그룹에 6초에 걸쳐 주사함].
T1-가중 GE 영상을 획득하였다. 마우스를 자석 위에서 꺼낸 다음, 이 마우스에 콘트라스트 제제를 머금고 있는 카테터를 연결하였다. 그 다음, 임계점(critical point)에서 콘트라스트 제제를 신속하게 주사하여, 이 콘트라스트 제제가 카테터를 통해 동물의 체내에 확산되어 퍼지는 것을 막았다. 예비 콘트라스트 T1 가중 영상을 획득한 직후, 콘트라스트 제제를 주사하였는데, 이때, 플래쉬 동화상을 연속으로 획득하였다(주사전 2회, 주사후 14회, 영상간 획득 간격 8초).
A, B 및 E로 명명된 실험(이하 참조)에서는, Y2 또는 마그네비스트 중 어느 하나를 주사한 후 시계 50×50㎜인 영상 슬라이스 10개를 획득하였다. 그 다음, 시계가 50×50㎜이고, 화소 배열수가 256×256이며 총 비트 스캔 시간이 데이터 세트당 10분 이상인 영상 슬라이스 8개도 획득하였다. 주사후 콘트라스트 영상을 15분마다 확득하였다. 콘트라스트 제제를 주사한 후 획득된 모든 데이터 세트들 중 영상 슬라이스 10개당 1개꼴로 선택하여, 이를 대표적인 증강 영상으로 삼았다(도 2 참조).
실시예 22: 망간이 로딩된 1,3-비스포스포네이트를 포함하는, 폴리에틸렌이민 기반 나노구조체의 합성
22a: 프로필렌-1,3-디포스폰산
브롬화 트리메틸 실릴(16.84㎖, 25.3mmol) 및 테트라에틸프로필렌-1,3-디포스포네이트(10.08g, 31.6mmol)을, 얼음 냉각된 디클로로메탄 5㎖ 중에 용해하였다. 10분 경과 후, 냉각 수조를 치우고나서, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 회전 증발기를 사용하여 휘발성 물질을 제거하였다. 여기에 잔류하던 물(50㎖)을 첨가하면서 교반한 다음, 얼음 냉각시켰다. 20분 경과후, 회전 증발기를 사용하여 물을 제거한 다음, 우선, 톨루엔 첨가-증발 사이클을 2회 진행시킨 후, 밤새 오일-펌프로 진공을 걸어주어 잔류하는 수분을 제거하였다. 1H-NMR 분석 결과, 에틸 기는 사라지고, 메틸렌 기는 여전히 존재하였음이 확인되었다.
22b: 테트라메틸프로필렌-1,3-디포스포네이트
프로필렌-1,3-디포스폰산(600㎎)을 포름산 트리메틸오르토(20㎖) 중에 현탁시킨 다음, 6시간 동안 환류시키고 나서, 이로부터 액체 10㎖를 증발로 제거한 후, 잔류물은 밤새 방치하여 두었다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거한 결과, 오일 형태인 생성물이 생성되었다.
22c: 1-t-부톡시카보닐메틸-O,O,O,O-테트라메틸프로필렌-1,3-디포스포네이트
질소 대기 하에 테트라메틸프로필렌-1,3-디포스포네이트(206㎎, 0.79mmol)를 무수 THF(5㎖) 중에 용해한 다음, 이 용액을 드라이아이스-아세톤 조 내에서 냉각하였다. 여기에 t-BuLi(헵탄 중 2.17M, 1.66mmol)를 시린지로 첨가한 후 10분 경과시 다시 여기에 브로모아세트산 t-부틸(0.23㎖, 1.66mmol)을 첨가하였다. 30분 경과후, 온도를 30분에 걸쳐 -15℃로 상승시켰다. 이 혼합물에 포화 수성 염화 암모늄을 첨가하여 상기 반응 혼합물을 급랭시켰다. 이를 에테르로 추출한 후(2×25㎖), MgSO4로 건조한 다음, 증발시켰더니, 유질의 잔류물이 생성되었다. 실리카 상 플래쉬 크로마토그래피(용출액: 디클로로메탄 + 3% 메탄올)를 수행한 결과, 원하는 생성물 134㎎이 생성되었다.
22d: 1-카복실메틸-O,O,O,O-테트라메틸프로필렌-1,3-디포스포네이트
1-t-부톡시카보닐메틸-O,O,O,O-테트라메틸프로필렌-1,3-디포스포네이트(150㎎)를 디클로로메탄(10㎖) 중에 용해하고 나서, 여기에 트리플루오로아세트산(0.5㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 방치하여 두어 휘발성 물질을 제거하였다. 톨루엔 첨가-증발 사이클을 3회 수행하여 잔류하는 트리플루오로아세트산을 제거하였다. 수득량: 132㎎.
22e: 1-카복실메틸-O,O,O,O-테트라메틸프로필렌-1,3-디포스포네이트의 폴리에틸렌이민으로의 접합 및 망간의 로딩
1-카복실메틸-O,O,O,O-테트라메틸프로필렌-1,3-디포스포네이트(100㎎), 폴리에틸렌이민(15㎎, 평균 Mw 30,000) 및 설포 N-하이드록시숙신이미드를 물(5㎖)에 첨가한 다음, 10분 동안 음파 처리하였다. 여기에 0.1M NaOH를 첨가하여 pH를 6.6으로 만들었다. 여기에 EDC를 첨가하고 나서, 용액을 19시간 동안 진탕기에 넣어두었다. 20kDa 컷-오프 스핀 필터 상에서 크기가 작은 분자 물질을 제거하였다. 상기 필터에서 잔류물을 세정하였다(4회). 나노구조체가 150mM NaCl 중에 용해되었을 때 상기 나노구조체의 직경은 7.5㎚인 것으로 측정되었다. 상기 용액 1㎖에 MnCl2 .4 H2O 21㎎을 첨가하였다. 여기에 수성 NaOH를 첨가하여 pH를 7.3으로 만들었다. 상기 샘플을 10kDa 공칭 컷-오프 스핀필터 상에서 물로 3회 세정하였다. 샘플을 Mn에 대해 분석한 결과, Mn이 2.4mM 존재하는 것으로 확인되었다. 60MHz에서의 이완율은 18.5/mM/s인 것으로 확인되었다. 실시예 14에 따라서 안정성을 측정하였다: 0.2%.
실시예 23. 나노구조체의 전도도 적정 실험
전도도 적정 실험을 통하여 나노구조체 상에 흡착될 수 있는 Ca2+ 및 Mg2+의 양을 측정할 수 있었다. CaCl2 및 MgCl2의 혼합물을 함유하는 용액의 양을 점차 늘려가면서 첨가한 후 나노구조체 수용액의 전도도를 모니터링하였다. Ca2+ 및 Mg2+ 가 입자 상에 흡착되는 동안 이 용액의 전도도(mS/㎝)는 임의의 비율(적정 곡선의 기울기)로 증가하였다. 나노구조체를 Ca2+ 및 Mg2+로 포화시켰을 때, 전도도는 다른 비율로 증가하였다. 종말점(나노구조체가 Ca 및 Mg로 포화되는 때)을 더욱 분명하게 가시화하기 위해, 나노구조체 존재 하에서의 전도도를, Ca/Mg 용액을, 그 양을 상기된 바와 동일하게 늘려가면서 물에 첨가하였을 때 얻어진 전도도로부터 공제하였다.
실시예 10c로부터 얻은 물질 샘플 200㎕([Mn = 0; [P] = 138mM)를 물 2300㎕와 혼합하였다. 6.55mM MgCl2 및 9.67mM CaCl2를 함유하는 수용액을 50㎕씩 그 양을 늘려가면서 첨가한 후 전도도를 측정하였다. ([Ca]/[Mg] 비율은 혈액의 [Ca]/[Mg] 비율과 거의 동일한 것으로 확인됨). 도 3의 “Samp.”를 참조한다. 전도도 초기 수치(Mg/Ca 용액 첨가 전의 전도도)를 “Samp.”로부터 공제하여, “Korr Samp.”를 구하였다(도 3a 참조). Mg/Ca를, 그 양을 동일하게 늘려가면서 물에 첨가한 후 전도도를 측정하여, “블랭크(Blank)”를 구하였다(도 3a). 마지막으로, “Korr Samp.”의 전도도를 “블랭크” 전도도로부터 공제하여, “Diff(블랭크-Korr Samp.)”를 구하였다(도 3a).
“Diff(블랭크 - Korr Samp)”곡선을 도 3b에 확대하여 제시하였는데, 여기서 직선 2개는 곡선의 2 부분들과 겹쳐진다. 적정물 474㎕를 나타내는 표시 ‘X’가 점유하고 있는 선 2개는 각각 [P]/[Mg] = 8.89, [P]/[Ca] = 6.02 및 [P]/[Me]tot = 3.59에 해당하는 경우이다.
상기 나노구조체의 동일한 회분을 10kD 필터상에서 추가로 농축하였다(용적은 약 5분의 1로 감소됨). 물 2460과 혼합된 용액 40㎕를 사용하여 적정을 수행하였다(상기된 바와 같이 동일하게 보정). 종말점은 422㎕로 정하였다. [P]/[Me] 흡착비가 전술된 적정의 경우와 동일한 것으로 가정하면, [P] = 422/474 × 138 × 0.200/0.040 = 613mM이 성립할 것이다. 도 3c를 참조한다.
적정의 주 목적은, 나노구조체를 90% 포화시키기 위해 첨가되어야 하는 Ca/Mg 용액의 양을 추정하기 위한 것이었다.
그러므로, 400mM MgCl2 및 600mM CaCl2 용액 506㎕를 샘플 용액 14.5㎖에 첨가하였다([P] = 138mM).
그 다음, 이 용액을 전술된 바와 같이 10kD 필터를 사용하여 추가로 농축하였으며, 거의 동량의 용액으로 적정하되, 다만, 대부분의 위치들은 금속이 차지하도록 만들었다. 그 결과를 도 3d에 보였다.
실시예 24. 제형: Ca 및 Mg 이온으로 포화한 후 만니톨 첨가(회분 SI055C-PE120208)
실시예 10c를 통해 제조된 물질 용액 샘플 2.5㎖([Mn] = 38mM, [P] = 508mM 및 Os 내지 200mOs/kg; 회분명: PE 120130)의 pH를 처음에 생리학적 pH인 7.4로 만들었다. Ca 및 Mg를 사용하여 나노구조체를 포화시킨 다음(90%) 다음과 같은 단계들을 수행하였다. 실시예 23(“나노구조체의 전도도 적정 실험”)에 기술된 방법에 따라서 Ca 및 Mg 용액([Ca]/[Mg] = 1.48)을 사용하여 용액 100㎕를 대상으로 하는 전도도 적정 실험을 수행하고, [Ca]/[Mn] = 1.59 또는 [Mg]/[Mn] = 1.08이 될 때를 종말점으로 결정하였다.
Mn2+ 중 일부는 특히 적정 종말점에서의 pH가 5.5일 때 Ca2+ 및 Mg2+로 치환될 수 있었다는 견해도 때때로 있었다. 그러므로, 적정후 용액을 10kD 필터로 여과한 후, 이 여과물 중 Mn의 양을 측정한 결과, 샘플 중에 존재하던 전체 Mn 중 약 15%가 남아있음이 확인되었다. 나노구조체로부터 Mn이 제거되었음은 적어도 부분적으로 적정의 종말점에서 pH가 낮았다는 것으로 설명될 수 있었다.
Ca 및 Mg가 로딩된 입자를 제조하기 위해서, 만니톨 용액 500㎕(Os = 280mOs/㎏)를 우선 농축 Ca/Mg 용액([Ca] = 600mM, [Mg] = 400mM) 21.5㎕와 혼합하였다. 그 다음, 이 용액을 회분 PE 120130 580㎕와 혼합하고 나서, 1M NaOH 약 8㎕를 사용하여 pH를 6.01에서 7.40으로 만들었으며, 삼투압을 측정한 결과, 270mOs/㎏이었다.
실시예 25. 면역원성 테스트
방법
토끼에, 실시예 24에 따라서 제조된 나노구조체(마그네슘과 칼슘으로 제형)(2 × 0.5㎖)를 5회 주사하였다(나노구조체 농도 = Mn 10㎎/㎖). 주사는 뒷다리 1개에 피하 주사의 형태로 행하여졌다. 나노구조체를 다음과 같은 방식으로 애쥬반트와 혼합하였다:
1) 프로인드(Freund) 완전 애쥬반트(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))(총 1㎖ 주사)(1차 면역화용) 및 프로인드 불완전 애쥬반트(보강 주사용)와 1:1(v/v)로 혼합.
2) 수산화알루미늄 40㎎/㎖(피어스(Pierce))(총 1㎖ 주사)(1차 면역화 및 보강 주사용)와 1:1(v/v)로 혼합.
주사 프로토콜 및 혈청 수집:
* 제0일: 예비 면역 혈청(20㎖) 수집
* 제0일: 1차 면역화
* 제14일: 1차 보강 주사
* 제28일: 2차 보강 주사
* 제49일: 3차 보강 주사
* 제70일: 4차 보강 주사
* 제84일: 면역 혈청 수집(60㎖)
분석:
1. 단백질 G 크로마토그래피(GE 헬쓰케어)에 의해 예비 면역 혈청 및 면역 혈청으로부터 면역 글로불린 분획들이 정제되었다.
2. 수지상 알데히드 기들과 IgG 분자상에 존재하는 1차 아민 기들 사이의 환원적 아미드화에 의해 IgG 분획 2㎎이 아가로스 컬럼(2㎖)(피어스)에 접합되었다. IgG-접합된 컬럼은, 세정된 후 0.9% NaCl로 평형이 맞추어 졌다.
3. 실시예 24에 따라서 제조된 나노구조체 용액 100㎕(망간 1.35mM에 해당)(Si 약 21㎍과 Mn 7㎍ 함유)가 각각의 컬럼에 가하여졌다.
4. 통과액: 컬럼은 0.9% NaCl 분획으로 세정되었으며(4 ×1㎖), 이후 다시 세정되었다(2 ×2㎖)(분획 1 내지 6).
5. 용출액: 결합된 SI055는 1M NaCl와 함께 용출되었다(4 × 1㎖)(분획 7 내지 10).
6. ICP-AES로써 통과액과 용출액 분획들이 Mn 및 Si 함량에 대해 분석되었다.
결과
예비 면역 컬럼 및 면역 컬럼 둘 다에 있어서, 실질적으로는 SI055 전부가 통과액 중에서 검출되었다. 용출액 중 검출된 나노구조체의 양은 컬럼마다 차이가 없었다.
면역화 프로토콜 과정이 진행되는 중 토끼에서는 염증 징후나 다른 문제가 발생되지는 않았다.
예비 면역 컬럼과 면역 컬럼으로부터 유래되는 통과액과 용출액 중 나노구조체 회수율은 표 4에 보였다.
예비 면역 컬럼과 면역 컬럼으로부터 유래되는 분획 1 내지 10 중 SI055 회수율은 각각 도 4a 및 4b에 보였다.
Figure pct00039
결론
본 실시예는, 면역 프로토콜이 매우 철저하게 진행되었음에도 불구, 토끼 체내에서는 나노구조체에 대한 면역 반응이 일어나지 않았음을 나타내었다. 이와 같은 결과는, 나노구조체가 생체 불활성임을 입증하여 주는 것이다.

Claims (16)

  1. 같은 자리 비스포스포네이트 기를 5개 이상 포함하는 고분자 골격체에 망간 이온들이 혼입 포함되어 있는 나노구조체로서, 상기 같은 자리 비스포스포네이트 기들은 서로 독립적으로
    -R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2
    (식 중, R1 및 R2는 음 전하, H, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R3 및 R4 중 1개 이상은 고분자 골격체에 연결되거나 고분자 골격체의 일부를 이루는 기이되, 다만 R3 및 R4 중 하나만이 이와 같이 연결된 기이고, R3 및 R4 중 다른 하나는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기이거나, 또는 이러한 기의 잔기이거나, 또는 H, OH, OR5 및 R5로 이루어진 군으로부터 선택되며, R5는 저급 알킬임)
    의 형태로서 혼입되어 있는 나노구조체.
  2. 제1항에 있어서, 고분자 골격체에 연결된 기 및/또는 상기 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기, 또는 이러한 기의 잔기는
    (CH2)n Si(Rx)3(식 중, Rx는 독립적으로 저급 알킬, OH, O- 또는 O-이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타내며, n은 1 내지 5임),
    (CH2)nCORy(식 중, Ry는 O-, NH2, NHRz, NRz 2 또는 고분자 골격체에 대한 결합이고, Rz는 저급 알킬이며, n은 1 내지 5이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타냄) 및
    (CH2)nSO2Ry(식 중, Ry는 O-, NH2, NHRz, NRz 2 또는 고분자 골격체에 대한 결합이고, Rz는 저급 알킬이며, n은 1 내지 5이고, “-”는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타냄)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 나노구조체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 실리콘 원자들을 포함하는 나노구조체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, R3 및/또는 R4는 -(CH2)n-Si(Rx)3(식 중, Rx는 독립적으로 저급 알킬, OH, O- 또는 O-이고, "-"는 고분자 골격체에 대한 결합을 나타내며, n은 1 내지 5임)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 나노구조체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 나노구조체의 수력학적 직경은 3㎚ 내지 7㎚인 나노구조체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 나노구조체의 수력학적 직경은 10㎚ 내지 20㎚인 나노구조체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고분자 골격체는 같은 자리 비스포스포네이트기 1개와 유기 옥시실란기 2개를 함유하는 단량체 잔기들을 포함하는 나노구조체.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고분자 골격체는 폴리에틸렌이민으로부터 유래되는 나노구조체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, P/Mn 몰비가 7 내지 20인 나노구조체.
  10. 제3항, 또는 제3항에 종속될 때 제4항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, Si/Mn 몰비가 5 내지 20인 나노구조체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노구조체의 외곽 부에 결합된 친수성 기들을 추가로 포함하는 나노구조체.
  12. 제11항에 있어서, 친수성 기들은 -(CH2CH2O)nCH3 부(식 중, n은 4 내지 50임)들을 포함하는 나노구조체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 의한 나노구조체를 포함하는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 의한 나노입자 또는 제13항에 의한 약학 조성물의 MRI 콘트라스트 제제로서의 용도.
  15. 같은 자리 비스포스포네이트를 포함하는 고분자 골격체의 나노구조체를 얻는 단계 및
    상기 나노구조체를 망간 이온과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 의한 나노구조체를 얻는 방법.
  16. 같은 자리 비스포스포네이트 기들을 5개 이상 포함하는 고분자 골격체를 포함하는 나노구조체로서, 상기 같은 자리 비스포스포네이트 기는 서로 독립적으로
    -R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2
    (식 중, R1 및 R2는 음 전하, H, 알킬 및 아릴로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R3 및 R4 중 1개 이상은 고분자 골격체에 연결되거나 고분자 골격체의 일부를 이루는 기이되, 다만 R3 및 R4 중 하나만이 이와 같이 연결된 기이고, R3 및 R4 중 다른 하나는 고분자 골격체에 연결될 수 있는 기이거나, 또는 이러한 기의 잔기이거나, 또는 H, OH, OR5 및 R5로 이루어진 군으로부터 선택되며, R5는 저급 알킬임)
    의 형태로서 혼입되어 있는 나노구조체.
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