BR112014006683B1

BR112014006683B1 - nanoestrutura que compreende íons de manganês; composição farmacêutica; uso de uma nanopartícula; método para obter nanoestrutura; e nanoestrutura

Info

Publication number: BR112014006683B1
Application number: BR112014006683-3A
Authority: BR
Inventors: Oskar Axelsson; Rodrigo M. Petoral Jr.; Fredrik Ek; Petter Lauritzson
Original assignee: Spago Nanomedical Ab
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2021-02-09
Also published as: JP6103605B2; RU2014111802A; CA2847804A1; KR101965017B1; DK2750716T3; WO2013041623A1; JP2014534277A; EP2750716B1; US20140350193A1; ES2774777T3; BR112014006683A2; CN103930136B; CN103930136A; ZA201402759B; KR20140064990A; EP2572736A1; AU2012311522B2; CA2847804C; RU2638535C2; AU2012311522A1

Abstract

NANOESTRUTURA QUE COMPREENDE ÍONS DE MANGANÊS; COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA; USO DE UMA NANOPARTÍCULA; E NANOESTRUTURA. São reveladas na presente invenção nanoestruturas que compreendem uma armação polimérica que compreende pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado, em que os grupos de bisfosfonato geminado independentemente um do outro são incorporados como -R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2, em que R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H, alquila e arila, e em que pelo menos um dentre R3 e R4 é um grupo conectado à armação polimérica com a condição de que quando apenas um dentre R3 e R4 é tal grupo conectado, o outro dentre R3 e R4 é um grupo com capacidade conexão com a armação polimérica ou o resíduo de tal grupo ou selecionado do grupo que consiste em H, OH, OR5 e R5, em que R5 é um alquila inferior. A armação polimérica pode compreender íons de manganês. São também revelados métodos para produzir tais nanoestruturas que contêm manganês, composições que compreendem tais nanoestruturas que contêm manganês e uso de tais nanoestruturas que contêm manganês, isto é, como agentes de contraste de MRI.

Description

CAMPO DA TÉCNICA DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a nanoestruturas poliméricas quelantes que incorporam íons de manganês paramagnéticos (II), bem como métodos para preparar as ditas nanoestruturas bem como o uso das nanoestruturas para visualização ou formação de imagem de material biológico.

ANTECEDENTES

[0002] A Formação de Imagem por Ressonância Magnética, MRI, é uma modalidade de formação de imagem médica em que os tecidos moles do corpo são visualizados através da utilização da magnetização de núcleos atômicos. Existem muitas aplicações clínicas da técnica tal como formação de imagem do sistema nervoso, do sistema vascular e formação de imagem tumoral.

[0003] Normalmente, os núcleos de hidrogênio abundantes das moléculas de água do corpo são imageados. A intensidade do sinal de MRI depende da natureza do núcleo, de sua abundância e de seu ambiente magnético local. Esses fatores afetam os tempos de relaxamento longitudinal (T1, constante de tempo de remagnetização) e transversal (T2, constante de tempo com queda de sinal) , que, por sua vez, afeta a intensidade de sinal. Dessa forma, a fonte de contraste em MRI é uma combinação da concentração local de núcleos e seu ambiente magnético. Vários recursos morfológicos podem ser enfatizados através da ênfase ao contraste T1 ou T2. O ambiente magnético local pode ser modificado pela presença de agentes de contraste e, dependendo de suas propriedades magnéticas, o sinal pode ser aumentado (contraste positivo) ou diminuído (contraste negativo). Os agentes de contraste positivo são muitas vezes preferenciais, devido ao fato de que a interpretação das imagens se torna mais simples quando mais brilho indica a presença de mais agente de contraste. O princípio dos agentes de contraste positivo é um encurtamento do tempo de relaxamento longitudinal, T1, que descreve quão rápido as moléculas de água remagnetizam após cada varredura. Na presença de um agente de contraste positivo, mais sinal pode ser coletado em um determinado período de tempo.

[0004] Adicionalmente, o efeito de um composto no T1 é dado como a capacidade de relaxamento, então, uma capacidade de relaxamento alta gera uma intensificação de sinal mais forte. A capacidade de relaxamento (r) é dependente de frequência em uma estrutura dependente do grau de complicação da comparação de dados da literatura de diferentes fontes. Os scanners de MRI clínicos usualmente têm um campo magnético de 1,5 ou 3 Tesla, então, foram medidas as capacidades de relaxamento como 1,91 T, correspondente a uma frequência de ressonância de próton de 81,3 MHz, como um acordo razoável. As medições também podem ser feitas em outras frequências, tal como 60 MHz. A capacidade de relaxamento para os agentes de contraste à base de gadolínio comercialmente disponíveis está próxima de 4 /mMGd/s nos campos clinicamente relevantes.

[0005] O mercado está atualmente dominado por quelatos de gadolínio solúveis em água. Por causa de seu tamanho físico pequeno (< 1 nm) , os mesmos se distribuem rapidamente no espaço extracelular (o sangue mais o espaço interstício entre as células dos tecidos) que limita de alguma forma o efeito de contraste. Um problema com o uso in vivo de íons metálicos paramagnéticos, tal como gadolínio, é sua toxicidade e os quelatos nos agentes de contraste atualmente comercializados, de preferência, abordam isso com sucesso. Entretanto, recentemente foi concluído que os quelatos liberam pequenas quantidades de gadolínio, o que se torna problemático em pacientes com não existência de função renal muito deficiente, onde um efeito colateral sério chamado de Fibrose Sistêmica Nefrogênica, NSF, foi descoberto (Grobner et al. Nephrology, Dialysis and Transplantation 2006, 21, 1104; Sieber et al. Invest. Radiol. 2008, 43, 65).

[0006] O problema de NSF traz à tona a questão do uso de algo além do gadolínio como um agente de contraste de encurtamento de T1; Mangafodipir é um quelato de manganês (II) que tem sido usado como um agente de contraste (Elizondo, G. et al. Radiology, 178, 73, 1991) . Isso tem uma estabilidade moderada in vivo e a maior parte do manganês é liberada como íons após a injeção e se acumula no fígado, gerando um bom contraste entre tecido saudável e canceroso. A liberação de quantidades moderadas de manganês não é um problema principal, uma vez que é um elemento-traço essencial para organismos vivos e existem mecanismos para lidar com manganês. Mangafodipir está agora fora do mercado devido ao volume de vendas baixo. Os íons de manganês são menos magnéticos que gadolínio e a maior partes dos compostos de manganês tem baixas capacidades de relaxamento, com alguns exemplos notáveis (Pan, D. et al. WIREs Nanomed Nanobiotechnol, 3, 162, 2011) que mostram o potencial de agentes de contraste à base de manganês. Se as propriedades benéficas pudessem ser incorporadas em uma estrutura mais quimicamente accessível, adequadamente conformada e mais bioinerte, isso seria uma vantagem distinta. Na presente invenção é revelado um grupo de materiais onde isso é alcançado.

[0007] Existem inúmeros agentes de contraste à base de nanopartícula conhecidos na técnica. Alguns deles, com base em óxido de ferro, foram usados como agentes de contraste específicos de fígado, mas não estão mais no mercado devido aos baixos volumes de vendas. Uma literatura imensa a respeito de uso experimental dessas partículas está disponível, (por exemplo, Bulte, J. W. M. e Modo, M. M. J. Eds. " Nanoparticles in Biomedical Imaging" Springer, 2008). Embora a presente invenção trate de estruturas nanodimensionadas, as mesmas não são do tipo núcleo-carcaça que é usualmente implicado pelo termo, mas, de preferência, com base em um polímero altamente reticulado.

[0008] Há uma literatura imensa sobre os materiais poliméricos que portam grupos quelantes e íons metálicos paramagnéticos para uso em MRI. Em geral, um aumento robusto em capacidade de relaxamento é alcançado, embora não tão alto quanto descrito na presente invenção. Ao melhor do que se tem conhecimento, nenhuma dentre a dita literatura revela armações poliméricas que portam os bisfosfonatos da presente invenção.

[0009] Os seguintes exemplos de literatura são exemplos de publicações anteriores relevantes, que de forma alguma devem ser interpretados como estando dentro do escopo da presente invenção.

[0010] Em Rongved P. Carbohydr Res 214, 315 (1991) é descrita uma série de materiais poliméricos com uma cadeia principal de carboidrato e grupos quelantes fixados. Os materiais mais próximos à presente invenção são fosfato de gadolínio(III)-dextrano, que tem uma capacidade de relaxamento de 16/mMGd/s a 20 MHz. Substancialmente inferior aos materiais revelados na presente invenção. Esse material é de estabilidade desconhecida. O fósforo é incorporado em grupos de fosfato ligados como ésteres de fosfato em oposição aos fosfonatos da presente invenção. O material é, dessa forma, excluído do escopo da presente invenção.

[0011] Rongved também revela um conjugado de manganês (II)-EDTA-sacarose-epicloroidrina com uma capacidade de relaxamento de 1,92/mMMn/s e um conjugado de manganês (II)-EDTA-aminoetildextran com uma capacidade de relaxamento de 12,8/mMMn/s. Ambos os valores são substancialmente inferiores aos dos materiais da presente invenção, especialmente, uma vez que foram medidos na frequência baixa de 20 MHz.

[0012] Os materiais não se enquadram no escopo da presente invenção. No documento WO2010135167, é descrito um material de bisfosfonato à base de poliestireno. Não há tentativa de produzir nanoestruturas, mas, de preferência, materiais a granel.

[0013] A literatura que descreve o uso de dendrímeros com estrutura química específica (em oposição às estruturas à base de polímero da presente invenção) e o peso molecular é muito grande.

[0014] O exemplo mais bem conhecido de um dendrímero usado como um agente de contraste de MR é Gadomer 17 (Turetschek, K. et al. J. Magn. Reson. Imaging 20, 138 (2004)) que, entretanto, nunca alcançou a prática clínica. Essa abordagem de estruturas nanodimensionadas sofre de síntese química muito dispendiosa. Em parte devido às muitas etapas químicas e em parte à dificuldade de purificação e identificação das muitas impurezas possíveis. Ademais, as capacidades de relaxamento tão altas quanto as encontradas pelos inventores da presente invenção, de acordo com o presente conhecimento, nunca foram relatadas nesse campo.

[0015] O argumento por trás dos bons resultados de uso de agentes macromoleculares como agentes de contraste de MRI com alta sensibilidade e seletividade para diagnóstico tumoral é o efeito de Permeação e Retenção Intensificadas (EPR), também chamado de alvejamento de tumor passivo. Isso é baseado no fato de que as capilaridades de tecidos saudáveis são virtualmente impermeáveis a moléculas maiores que 3 a 4 nm enquanto que as capilaridades de tecido tumoral de crescimento rápido são muito mais vazadas. Embora de forma alguma certa ou limitante, é concebível que o efeito de EPR seja a base das propriedades favoráveis de formação de imagem de tumor da presente invenção.

[0016] Existem inúmeros quelatos monoméricos que contêm fosfonato de gadolínio conhecidos na técnica enquanto as combinações de manganês-fósforo são menos comuns, mas não desconhecidas (Pan, D. et al. WIREs Nanomed Nanobiotechnol 3, 162, 2011). Os mesmos não são de forma alguma extraordinários em suas propriedades de MRI e as capacidades de relaxamento relatadas são moderadas. Um exemplo de um que porta um bisfosfonato é encontrado em Vitha, T. et al. Dalton Transactions 3204 (2009).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] O primeiro aspecto da presente revelação se refere a nanoestruturas que compreendem estruturas nanodimensionadas com base em uma armação ou estruturação polimérica que compreende ou adornado com pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado -P=O(OR1) (OR2), que, no contexto da presente invenção, é igual a - R4R3C(P=O(OR1) (OR2))2, em que R1 e R2 são independentemente selecionados a partir de uma carga negativa, H, alquila e arila.

[0018] O segundo aspecto da presente revelação se refere a nanoestruturas que compreendem íons de manganês paramagnéticos, incorporados em estruturas nanodimensionadas com base em uma armação ou estruturação polimérica que compreende ou adornada com pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado -P=O(OR1) (OR2), que, no contexto da presente invenção é igual a -R4R3C(P=O(OR1) (OR2))2, conforme mencionado acima, em que R1 e R2 são independentemente selecionados a partir de uma carga negativa, H, alquila e arila.

[0019] Embora o termo “nanodimensionado” seja geralmente interpretado para abranger algo menor que 100 nm, o foco da presente invenção é as entidades de estruturas altamente ramificadas ou reticuladas de um formato aproximadamente globular e um tamanho médio (diâmetro hidrodinâmico) de 1 a 100 nm ou em algumas modalidades 2 a 50 nm, 3 a 10 nm ou 3 a 7 nm.

[0020] O segundo aspecto da presente revelação se refere aos métodos para produzir tais nanoestruturas, em que ambas compreendem íons de manganês e não compreendem tais íons .

[0021] O terceiro aspecto da presente revelação se refere a composições, tais como as composições farmacêuticas, que compreendem tais nanoestruturas, em particular, as nanoestruturas que compreendem íons de manganês paramagnéticos, e também ao uso de tais nanoestruturas, em particular, as que compreendem íons de manganês paramagnéticos, como agentes de contraste de utilidade clínica, em particular, uso como agentes de contraste para MRI.

[0022] Algumas vantagens das nanoestruturas reveladas no presente documento em comparação com a técnica anterior são a combinação de uma capacidade de relaxamento em uma ordem de magnitude mais que os materiais atualmente disponíveis no mercado, combinada com um tamanho adequado para acúmulo seletivo em tecido tumoral e uma boa biotolerância. Isso torna as nanoestruturas da presente invenção, em particular as nanoestruturas que compreendem íons de manganês paramagnéticos, adequadas para uso como um agente de contraste para MRI e, em particular, para formação de imagem de tumor.

[0023] Adicionalmente, o uso de manganês em vez de gadolínio como o componente paramagnético exclui os problemas de toxicidade relacionados ao gadolínio.

[0024] O uso de manganês abundante em vez do gadolínio relativamente raro também apresenta as vantagens de custo na produção do material.

MODALIDADES ESPECÍFICAS

[0025] Uma nanoestrutura que compreende íons de manganês incorporados em uma armação polimérica que compreende pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado, em que os grupos de bisfosfonato geminado independentemente um do outro são incorporados como:

[0026] -R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2

[0027] (que é igual a -R4R3C(P=O(OR1) (OR2)) 2) em que R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H, alquila e arila, e em que pelo menos um dentre R3 e R4 é um grupo conectado à armação polimérica com a condição de que quando apenas um dentre R3 e R4 é tal grupo conectado, o outro dentre R3 e R4 é um grupo com capacidade conexão com a armação polimérica ou o resíduo de tal grupo ou selecionado do grupo que consiste em H, OH, OR5 e R5, em que R5 é um alquila inferior.

[0028] 2. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 1, em que os íons de manganês são íons de manganês (II) .

[0029] 3. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H, alquila e metil.

[0030] 4. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 3, em que o grupo conectado à armação polimérica e/ou o grupo com capacidade conexão com a armação polimérica ou o resíduo de tal grupo é selecionado do grupo que consiste em:

[0031] (CH2)n Si(Rx)3 em que Rx independentemente é um alquila inferior, OH, O- ou O-, em que - denota uma ligação com a armação polimérica, e em que n é 1 a 5, (CH2)nCORy em que Ry é O-, NH2, NHRz, NRz2 ou uma ligação com a armação polimérica, em que Rz é um alquila inferior e em que n é 1 a 5 e - denota uma ligação com a armação polimérica, e

[0032] (CH2)nSO2Ry em que Ry, é O-, NH2, NHRz, NRz2 ou uma ligação com a armação polimérica, Rz é um alquila inferior e n é 1 a 5 e - denota uma ligação com a armação polimérica.

[0033] 5. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 4, que compreende átomos de silício.

[0034] 6. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 5, em que R3 e/ou R4 são/é selecionado(s) do grupo que consiste em -(CH2)n-Si(Rx)3, em que Rx independentemente é um alquila inferior, OH, O- ou O-, em que - denota uma ligação com a armação polimérica e em que n é 1 a 5.

[0035] 7. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 6, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 2 a 50 nm.

[0036] 8. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 7, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 3 a 10 nm.

[0037] 9. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 8, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 3 a 7 nm.

[0038] 10. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 7, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 10 a 50 nm.

[0039] 11. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 7 ou 10, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 10 a 20 nm.

[0040] 12. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 11, em que a armação polimérica compreende resíduos de monômero que contêm um grupo de bisfosfonato geminado e dois grupos de organo- oxissilano.

[0041] 13. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 11, em que a armação polimérica é derivada de polietilenoimina.

[0042] 14. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 13, em que a razão molar P/N é 0,1 a 3.

[0043] 15. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 14, em que a razão molar P/Mn é 7 a 20.

[0044] 16. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 5 ou 6 a 12 ou 14 a 15 quando dependentes da modalidade 5, em que a razão molar Si/Mn é 5 a 20.

[0045] 17. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 5 ou 6 a 16 quando dependentes da modalidade 5, em que a razão molar Si/P é 0,7 a 1,3.

[0046] 18. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que os íons de manganês são coordenados para os grupos de fosfonato.

[0047] 19. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 18, em que a dita nanoestrutura compreende adicionalmente grupos hidrofílicos fixados às partes externas.

[0048] 20. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 19, em que os grupos hidrofílicos compreendem porções químicas de -(CH2CH2O)nCH3 em que n = 4 a 50.

[0049] 21. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 20, em que a armação polimérica compreende resíduos de monômero da estrutura genérica

[0050] {(X7aO)(X7bO)PO}2- (C) { (CH2) nSi (OX7c) (OX7d) (OX7e) } { (CH2)OSÍ (OX7c) (OX7d) (OX7e) }

[0051] em que

[0052] X7a, X7b, X7c, X7d, X7e são independentemente selecionados a partir de H, alquila CI a C8 e benzila; e

[0053] n e o são independentemente selecionados a partir de 1 a 5.

[0054] 22. Uma composição que compreende uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 21.

[0055] 23. Uma composição farmacêutica que compreende uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 21.

[0056] 24. Uso de uma nanopartícula de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 21 ou composição de acordo com a modalidade 22 ou 23 como um agente de contraste de MRI.

[0057] 25. Um método para obter nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 1 a 21 que compreende:

[0058] obter nanoestruturas de uma armação polimérica que compreende bisfosfonatos geminados e

[0059] colocar em contato as ditas nanoestruturas com íons de manganês.

[0060] 26. Um método de acordo com modalidade 25 que compreende adicionalmente uma etapa em que as nanoestruturas são purificadas por ultrafiltração.

[0061] 27. Um método para obter uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 13 ou 14 a 21 quando dependentes da modalidade 13, em que um bisfosfonato geminado é enxertado em uma armação polimérica derivada de polietilenoimina que subsequentemente é carregado com íons de manganês.

[0062] 28. Um método para obter uma nanopartícula de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 12 ou 13 a 21 quando dependentes da modalidade 12, em que os ditos silanos são fornecidos em uma mistura de solvente que contém água e um ou mais outros solventes que são miscíveis com água.

[0063] 29. Um produto obtenível por um método de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 25 a 28.

[0064] 30. Uma nanoestrutura que compreende uma armação polimérica que compreende pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado, em que os grupos de bisfosfonato geminado independentemente um do outro são incorporados como

[0065] -R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2

[0066] (que é igual a -R4R3C(P=O(OR1) (OR2))2)

[0067] em que R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H, alquila e arila, e em que pelo menos um dentre R3 e R4 é um grupo conectado à armação polimérica com a condição de que quando apenas um dentre R3 e R4 é tal grupo conectado, o outro dentre R3 e R4 é um grupo com capacidade conexão com a armação polimérica ou o resíduo de tal grupo ou selecionado do grupo que consiste em H, OH, OR5 e R5, em que R5 é um alquila inferior.

[0068] 31. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 30, em que R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H, alquila e metil.

[0069] 32. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 30 ou 31, em que o grupo conectado à armação polimérica e/ou o grupo com capacidade conexão com a armação polimérica ou o resíduo de tal grupo é selecionado do grupo que consiste em:

[0070] (CH2)n Si(Rx)3 em que Rx independentemente é um alquila inferior, OH, O- ou O-, em que - denota uma ligação com a armação polimérica, e em que n é 1 a 5, (CH2)nCORy em que Ry é O-, NH2, NHRz, NRz2 ou uma ligação com a armação polimérica, Rz é um alquila inferior e n é 1 a 5, e - denota uma ligação com a armação polimérica, e

[0071] (CH2)nSO2Ry em que Ry é O-, NH2, NHRz, NRz2 ou uma ligação com a armação polimérica, Rz é um alquila inferior e n é 1 a 5 e - denota uma ligação com a armação polimérica.

[0072] 33. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 32 que compreende átomos de silício.

[0073] 34. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 33, em que R3 e/ou R4 são/é selecionado(s) do grupo que consiste em- (CH2)n-Si (Rx)3, em que Rx independentemente é um alquila inferior, OH, O- ou O-, em que - denota uma ligação com a armação polimérica, e em que n é 1 a 5.

[0074] 35. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 34, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 2 a 50 nm.

[0075] 36. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 35, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 3 a 10 nm.

[0076] 37. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 36, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 3 a 7 nm.

[0077] 38. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 35, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 10 a 50 nm.

[0078] 39. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 35 ou 38, em que o diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura é 10 a 20 nm.

[0079] 40. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 39, em que a armação polimérica compreende resíduos de monômero que contêm um grupo de bisfosfonato geminado e dois grupos de organo- oxissilano.

[0080] 41. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 40, em que a armação polimérica é derivada de polietilenoimina.

[0081] 42. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 41, em que a razão molar P/N é 0,1 a 3.

[0082] 43. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 33 ou 34 a 42 quando dependentes da modalidade 33, em que a razão molar Si/P é 0,7 a 1,3.

[0083] 44. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 43, em que a dita nanoestrutura compreende adicionalmente grupos hidrofílicos fixados às partes externas.

[0084] 45. Uma nanoestrutura de acordo com a modalidade 44, em que os grupos hidrofílicos compreendem porções químicas de -(CH2CH2O)nCH3 em que n = 4 a 50.

[0085] 46. Uma nanoestrutura de acordo com qualquer uma dentre as modalidades 30 a 45, em que a armação polimérica compreende resíduos de monômero da estrutura genérica

[0086] {(X7aO)(X7bO)PO}2- (C) { (CH2) nSi (OX7c) (OX7d) (OX7e) } { (CH2)oSi (OX7c) (OX7d) (OX7e) }

[0087] em que X7a, X7b, X7c, X7d,X7e são independentemente selecionados a partir de H, alquila Ci a C8 e benzila; e

[0088] n e o são independentemente selecionados a partir de 1 a 5.

DEFINIÇÕES DE TERMOS

[0089] O termo "nanoestrutura" conforme usado na presente invenção se refere a uma entidade com um diâmetro total de 1 a 100 nm de formato essencialmente globular, isto é, que exclui flocos, bastões, tubos e fitas. Conforme usado na presente invenção, o termo exclui as estruturas muitas vezes chamadas de “nanopartículas de núcleo-carcaça” ou somente “nanopartículas” que têm um núcleo mineral ou metálico e um revestimento orgânico.

[0090] O termo "armação polimérica" conforme usado na presente invenção se refere a um grupo covalentemente ligado de átomos que formam uma árvore com múltiplas ramificações como a estrutura ou uma estrutura em rede com múltiplas reticulações. As armações poliméricas são formadas a partir da ligação de monômeros e/ou oligômeros e/ou reticuladores através de ligações covalentes. Os monômeros típicos podem ser encontrados e manuais de química polimérica tal como J. R. Fried, “Polymer Science and Technology” Prentice Hall 1995. Alguns exemplos de monômeros são estireno, propileno, etileno, tetrafluoroetileno, trifluoroetileno, difluoroetileno, acrilato de metila, acrilato de etila, acrilato de hidroxietila, acrilamida, metacrilato de metila, metacrilato de etila, metacrilato de hidroxietila, H2N-(CH2)n—COOH, onde n é 1 a 10, ácido 3- aminobenzoico, ácido 4-aminobenzoico, N-vinil pirolidona e precursores de silicone como (CH3COO)2Si(CH3)2. Alguns exemplos de polímeros são os polímeros formados a partir de pares correspondentes de monômeros como ácido tereftálico + 1,4 diamino benzeno, ácido tereftálico + etileno glicol, e HCOO-(CH2)nCOOH + H2N-(CH2)m-NH2, onde n e m independentemente são 1 a 10. Os oligômeros com 2 a 10 unidades de monômero ligadas podem ser usados como precursores. Alguns exemplos de oligômeros diferentes de grupos ligados dos monômeros acima são silanos cíclicos ou policíclicos tal como hexametilciclotrisiloxano, 2,4,6,8- tetrametilciclotetrasiloxano e decametilciclopentasiloxano. Os reticuladores típicos podem ser encontrados em manuais de química de polímero tal como J. R. Fried, “Polymer Science and Technology” Prentice Hall 1995. Alguns exemplos de reticuladores são N,N'-metilenobis(acrilamida), epicloroidrina, divinilbenzeno, 1,3- diviniltetrametildisiloxano, 1,3-fenilenodiisocianato, dianidreto de ácido 3,3’-bifeniltetracarboxílico, 1,4-butanodioldiviniléter, tetraetoxisilano, oligossilicatos tais como metassilicato ou silsequioxanos, organossilanos tais como bis(trietoxisilil)metano, bis(trietoxisilil)etano, bis(trietoxisilil)propano, bis(trietoxisilil)butano, metil trietoxisilano, etil trietoxisilano e propil trietoxisilano.

[0091] Essa armação polimérica constitui o esqueleto da nanoestrutura. O elemento versado entende que a natureza aleatória do processo de polimerização faz com que os materiais sejam misturas de muitos padrões de ramificação, posição de reticulação e peso molecular similares, mas não idênticos.

[0092] O termo “grupo de bisfosfonato geminado” se refere a dois grupos de fosfonato separados por um átomo de carbono, isto é, os grupos de fosfonato são ligados ao mesmo carbono. Os compostos que compreendem tal grupo de bisfosfonato geminado são muitas vezes chamados de 1, 1- bisfosfonatos (ou 1,1-difosfonatos). Os grupos de fosfonato no grupo de bisfosfonato geminado podem ser substituídos. Em algumas modalidades, os grupos de fosfonato têm a fórmula - P=O(OR1) (OR2) em que R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H, alquila e arila.

[0093] O termo “grupo conectado à armação polimérica” se refere a um grupo químico em que uma ligação covalente substitui formalmente um átomo de hidrogênio da armação polimérica. Os grupos químicos abrangidos por essa definição são resíduos lineares geralmente curtos de hidrocarbonetos, éteres, amidas ou ésteres. Alguns exemplos típicos são -(CH2)n-, -(CH2)nCO-, -(CH2)nCOO-, -(CH2)nCONH- e - (CH2)nSi(O-)3. Nesse contexto, a palavra “curto” significa que n é 1 a 8.

[0094] O termo “grupo que constitui parte da armação polimérica" se refere a uma situação em que os dois grupos de fosfonato estão assentados no mesmo átomo de carbono da armação polimérica.

[0095] O termo “grupo com capacidade conexão com a armação polimérica” se refere a precursores dos grupos acima chamados conectados à armação polimérica. Alguns exemplos são -(CH2)nOH, -(CH2)nBr, -(CH2)nCOCI- -(CH2)nCOCH3, - (CH2)nCOCH2CH3,-(CH2)nCOO-,-(CH2)nCONH2 e (CH2)nSi(OEt)3.

[0096] O termo “bioinerte” conforme usado na presente invenção se refere a um material que é biocompatível, isto é, inofensivo para um organismo vivo e ao mesmo tempo estável para degradação in vivo.

[0097] O termo “DLS” conforme usado na presente invenção é um acrônimo para dispersão de luz dinâmica, um método de dimensionamento de partícula e também pode ser chamado de Espectroscopia de Correlação de Fóton ou Dispersão de Luz Quase Elástica. Os tamanhos de DLS dados como estabelecidos no texto e nas reivindicações, se nada mais for especificado, se referem à posição do máximo do pico médio de volume para uma amostra medido a 25 °C em solução aquosa neutra com uma intensidade iônica correspondente a 150 mM de NaCl.

[0098] O termo “globular” conforme usado na presente invenção significa descreve nanoestruturas com um formato de tal modo que o eixo geométrico menor seja não mais que metade do eixo geométrico maior, isto é, o eixo geométrico mais longo através do centro (ponto de peso) da estrutura não é maior que duas vezes o comprimento do eixo geométrico mais curto através do mesmo ponto.

[0099] O termo “resíduo orgânico hidrofílico” conforme usado na presente invenção se refere a um resíduo orgânico que promove solubilidade em solventes aquosos e na presente invenção é implícito que os mesmos são bioinertes, o que exclui polipeptídeos e carboidratos complexos. Os exemplos de resíduos orgânicos hidrofílicos adequados são qualquer grupo que contém carbono com uma composição molecular (aO+bN)/(cC+dS+eSi+fP) > 0,3, onde a, b, c, d, e e f são a porcentagem em mol de oxigênio (O) , nitrogênio (N) , carbono (C), enxofre (S), silício (Si) e fósforo (P), respectivamente.

[0100] O termo “silano ativado” conforme usado na presente invenção se refere a um silano do seguinte tipo RnSi(X)4-n, onde X é um grupo alcóxi, grupo arilóxi, um halogênio, um grupo dialquilamino, um nitrogênio que contém heterociclo ou um grupo acilóxi.

[0101] O termo "oxisilano" conforme usado na presente invenção se refere a quaisquer compostos orgânicos com um ou mais átomos de oxigênio fixados ao átomo de silício. Os exemplos não limitantes do mesmo são:

[0102] O termo “organosilano” conforme usado na presente invenção se refere a compostos orgânicos que contêm um ou mais ligações de carbono-silício.

[0103] O termo “organo-oxisilano” conforme usado na presente invenção se refere a compostos orgânicos que contêm um ou mais átomos de carbono e um ou mais átomos de oxigênio fixados ao átomo de silício. Os exemplos não limitantes do mesmo são:

[0104] Os termos “hidrocarboneto” e “cadeia de hidrocarboneto” são usados na presente invenção para denotar um resíduo orgânico que consiste em hidrogênio e carbono. O hidrocarboneto pode ser completamente saturado ou pode compreender uma ou mais insaturações. O hidrocarboneto pode conter qualquer número de átomos de carbono entre 1 e 50.

[0105] O termo "alquila" conforme usado na presente invenção se refere a um grupo de hidrocarboneto completamente saturado de cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificado (sem ligações duplas ou triplas). O grupo alquila pode, no presente texto, ter 1 a 15 átomos de carbono. O grupo alquila dos compostos pode ser designado como “alquila C1-15” ou designações similares. Os grupos alquila típicos incluem, mas não são de forma alguma limitados a, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciária, pentila, hexila e similares.

[0106] O termo “alquila inferior” conforme usado na presente invenção se refere a um alquila que tem 1 a 8 átomos de carbono.

[0107] O termo “álcool inferior” conforme usado na presente invenção se refere a um álcool que tem 1 a 8 átomos de carbono.

[0108] Quando for usada na presente invenção, salvo se estabelecido de outro modo, uma faixa numérica tal como “1 a 8” ou “1-8” se refere a cada número inteiro na determinada faixa; por exemplo, “1 a 8 átomos de carbono” significa que o grupo alquila pode consistir em 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., até e incluindo 8 átomos de carbono. Existem, entretanto, algumas exceções que são claras para os elementos versados. Em particular, quando uma faixa é dada na presente invenção para uma razão molar, tal como a razão molar P/N ou a razão molar Si/P nas nanoestruturas, para um diâmetro ou tamanho, para um pH, para um período de tempo, para uma concentração, para uma osmolaridade ou para uma temperatura, a faixa inclui também todos os números decimais que se enquadram na faixa.

[0109] Conforme usado na presente invenção, o termo “alcóxi” se refere à fórmula -OU em que R é a alquila C1 a Cs, por exemplo, metóxi, etóxi, n-propóxi, 1-metil etóxi (isopropóxi), n-butóxi, iso-butóxi, sec-butóxi, terc-butóxi, amilóxi, isoamilóxi e similares. Um alcóxi pode ser opcionalmente substituído.

[0110] Conforme usado na presente invenção, o termo “arilóxi” se refere a RO- em que R é um arila, em que “arila” se refere a um anel carbocíclico (todo carbono) ou dois ou mais anéis fundidos (antes que compartilham dois átomos de carbono adjacentes) que têm um sistema de elétron pi deslocado. O anel de arila pode ser um anel de 4 a 20 membros. Os exemplos de grupos arila incluem, mas não são limitados a, benzeno, naftaleno e azuleno. Um grupo arila pode ser opcionalmente substituído, por exemplo, fenóxi, naftlenilóxi, azulenilóxi, antracenilóxi, naftaleniltio, feniltio e similares. Um arilóxi pode ser opcionalmente substituído.

[0111]Conforme usado na presente invenção o termo “acila” se refere a um grupo carbonila, isto é, -C(=O)-

[0112] Conforme usado na presente invenção, o termo “acilóxi” se refere a um átomo de oxigênio conectado através de um grupo carbonila, isto é, -C(=O)-O-.

[0113] Conforme usado na presente invenção, o termo "heterociclo" se refere a um anel estável de 3 a 18 membros que consiste em átomos de carbono e de um a cinco heteroátomos selecionados do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre. O heterociclo pode ser monocíclico, bicíclico ou tricíclico.

[0114] O termo “base forte” conforme usado na presente invenção se refere no presente contexto a bases que mais fortes que hidróxido e não compatíveis com ambientes aquosos.

[0115] O termo "diâmetro hidrodinâmico" conforme usado na presente invenção se refere ao diâmetro da esfera rígida hipotética que difunde na mesma velocidade que a partícula. A hidratação e o formato são incluídos no comportamento da esfera. O termo é também conhecido como “diâmetro de Stokes” “diâmetro de Stokes-Einstein”.

[0116] O termo “conjugado” conforme usado na presente invenção se refere a uma entidade molecular que é um marcador de fluorescência, corante, spin-label, marcador radioativo, ligante para um receptor biológico, quelato, inibidor de enzima, substrato de enzima, anticorpo ou estrutura relacionada a anticorpo. Consulte, por exemplo, “Bioconjugate Techniques”, Greg T. Hermanson, segunda edição, Elsevier 2008, ISBN 978-0-12-370501-3 para antecedentes do assunto.

[0117] Os termos “manipulação para conjugação” e “ponto de fixação” se referem a uma molécula bifuncional que pode se ligar a ou ser incorporada na rede polimérica, mas deixa um grupo reativo que pode ser ligado a um conjugado, conforme definido acima. Um exemplo típico, mas não exclusivo, seria:

[0118] (EtO)3SiCH2CH2CH2NH2.

[0119] O acrônimo TEOS significa tetraetoxisilano.

[0120] O acrônimo DCM significa diclorometano.

[0121] A abreviação “bisbis” significa 1,1-bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano, o produto do exemplo 1b.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0122] Em um primeiro aspecto, a presente invenção lida com íons de manganês paramagnéticos incorporados em estruturas nanodimensionadas (nanoestruturas) com base em uma armação ou estruturação polimérica que compreende ou é adornada com uma pluralidade de grupos de fosfonato -P=O(OR1) (OR2) onde R1 e R2 são independentemente selecionados a partir de uma carga negativa, H, alquila ou arila. Quando pelo menos um dentre R1 ou R2 é H, o ácido fosfônico resultante é ionizado para uma extensão dependente de pH.

[0123] Conforme mencionado acima, o termo “nanoestrutura” se refere a uma estrutura com um diâmetro total de 1 a 100 nm.

[0124] Em algumas modalidades da invenção R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H e metil.

[0125] No átomo de carbono que separa os grupos de bisfosfonato, isto é, o átomo de carbono intercalado, uma ou mais ligações com a armação polimérica está/estão presente. Dessa forma, o átomo de carbono intercalado pode ser parte de ou fixado à armação polimérica. De particular interesse são as estruturas do tipo (R3R4C(P=O(OR1) (OR2))2 onde R1 e R2 são independentemente selecionados a partir de H ou alquila ou arila e pelo menos um dentre R3 e R4 é um grupo com capacidade de ser conectado à armação polimérica do material. No caso em que apenas um dentre R3 e R4 é tal grupo, o grupo remanescente é selecionado do grupo que consiste em H, OH, OR5 (com R5 sendo alquila inferior) e alquilas inferiores.

[0126] Em algumas modalidades da presente invenção, R3 e/ou R4 são/é selecionado(s) do grupo que consiste em -(CH2)n-Si(Rx)3, em que Rx independentemente é um alquila inferior, OH, O- ou O-, em que - denota uma ligação com a armação polimérica, e em que n é 1 a 5.

[0127] Em algumas modalidades da presente invenção, R3 é -(CH2)nCO- (com o grupo carbonila formando a ligação com a armação polimérica) e R4 é H e n=1-5. Em algumas dessas modalidades, n=1.

[0128] Em algumas modalidades da presente invenção, R3 e R4 são independentemente -(CH2)n-SiO3, onde n = 1 a 5 e o silano é parte da armação polimérica através da formação de ligações Si-O-Si conforme expandido logo após no texto.

[0129] Em algumas modalidades da presente invenção, R3 e R4 são -(CH2)n-SiO3, em que n = 3 e o silano é parte da dita armação polimérica da maneira supracitada.

[0130] Também é concebível usar amidas, cloretos ou fluoretos fosfônicos em vez de ésteres ou ácidos fosfônicos como componentes ou materiais de partida dos compostos descritos aqui. Os fosfonatos podem estar presentes em sua forma livre ou como ésteres ou como amidas ou qualquer mistura dos mesmos.

[0131] Em algumas modalidades da invenção, os fosfonatos são uma mistura de fosfonatos livres e os ésteres de metila do dito fosfonato.

[0132] A armação polimérica, à qual os ditos grupos de fosfonato são ligados, pode ser construída a partir de um número grande de monômeros bem conhecidos conforme pode ser encontrado em qualquer livro sobre química de polímero (por exemplo, J. R. Fried, “Polymer Science and Technology” Prentice Hall 1995). Alguns exemplos não limitantes são poliacrilatos, polimetacrilatos, poliamidas, poliestireno, polidimetilsiloxanos (silicones), poliorganosilanos, poliaminas tal como polietilenoimina ou carboidratos; especialmente estruturas altamente ramificadas ou reticuladas.

[0133] As nanoestruturas de acordo com a presente revelação são, conforme mencionado acima, estruturas com um globular aproximadamente formato e um tamanho médio (diâmetro hidrodinâmico) de 1 a 100 nm; em algumas modalidades, o tamanho médio pode ser 2 a 50 nm, em outras modalidades, o tamanho médio pode ser 3 a 10 nm ou 3 a 7 nm ou 10 a 50 nm ou 10 a 20 nm.

[0134] Em algumas modalidades da invenção, um exemplo não limitante é o uso como um agente de contraste intravenoso, cujo diâmetro hidrodinâmico médio das nanoestruturas é 3 a 7 nm.

[0135] Em algumas modalidades, por exemplo, modalidades em que o material é usado para formação de imagem de nó de linfa, da invenção, o diâmetro hidrodinâmico médio das nanoestruturas é 10 a 50 nm ou 10 a 20 nm.

[0136] O diâmetro hidrodinâmico é o diâmetro da esfera rígida equivalente conforme calculado a partir do coeficiente de difusão, de acordo com a equação Stokes- Einstein. O coeficiente de difusão é, por sua vez, calculado a partir dos dados de dispersão de luz dependentes de tempo obtidos pela técnica de Dispersão de luz dinâmica (DLS). Como uma comparação, a albumina sérica bovina é medida para ter um diâmetro hidrodinâmico de 6, 5 nm por DLS em solução aquosa, muito mais de acordo com a estrutura de cristal. Dependendo se a média numérica, a média volumétrica ou a média de intensidade dispersa for usada, os valores podem ser um tanto quanto diferentes. A média volumétrica é geralmente a mais útil, uma vez que mostra qual tamanho de partícula o volume do material tem. Os diâmetros médios referenciados neste texto se referem a médias volumétricas.

[0137] É favorável usar estruturas com uma estrutura similar à rede ou ramificada para formar as estruturas globulares desejadas na presente invenção. Uma maneira estabelecida de alcançar uma estrutura em rede é através da introdução de reticulações através da incorporação de uma fração de monômeros bifuncionais no processo de polimerização. Um exemplo bem conhecido é a reticulação de poliestireno com divinil benzeno.

[0138] As estruturas de ramificação podem ser formadas por terem mais de uma posição reativa nos monômeros (“The architecture and surface behavior of highly branched molecules” Peleshanko, S., Tsukruk, V. V., Prog. Polim. Sci. 33, 523 (2008) ) . Um exemplo bem conhecido é a formação da polietilenoimina altamente ramificada através da polimerização de aziridina. A polietilenoimina contém uma mistura de grupos amino primários, secundários e terciários e tem uma estrutura aleatória de ramificação conforme indicado no esquema abaixo. A estrutura exata é apenas para ser interpretada como típica e de forma alguma limitante para a presente invenção. Os bisfosfonatos cruciais para a presente invenção podem ser fixados aos grupos amino primários e/ou secundários.

[0139] Em algumas modalidades da invenção, a armação polimérica é polietilenoimina. Abaixo, é mostrado um fragmento estrutural de polietilenoimina típico. As ligações tracejadas indicam que a rede polimérica continua.

[0140] Mediante a incorporação do bisfosfonato em uma armação de poliacrilato, é concebível fixar o bisfosfonato ao nitrogênio de amida através de um ligador curto. Um exemplo típico, mas não limitante, de um fragmento estrutural de tal material seria a estrutura abaixo com R1 e R2 conforme definido anteriormente no texto, n de 1 a 5 e as ligações tracejadas indicando que o fragmento pertence a um polímero. Também é concebível fixar o bisfosfonato diretamente no esqueleto de carbono.

[0141] As armações com base em poliaromáticos como poliestireno ou polivinilpiridina também podem ser antevistas. O bisfosfonato é, então, fixado ao sistema aromático. As poliamidas como polivinilpirrolidinona são também concebíveis.

[0142] Um grau adequado de reticulação é requerido para formar as nanoestruturas globulares da presente invenção. A incorporação de 1 a 100 % de um agente de reticulação di, tri ou tetrafuncional é preferencial. Uma lista não limitante de agentes de reticulação típicos é N,N'-metilenobis(acrilamida), epicloroidrina, divinilbenzeno, 1,3-diviniltetrametildisiloxano, 1,3-fenilenodiisocianato, dianidreto de ácido 3,3’-bifeniltetracarboxílico, 1,4-butanodioldiviniléter, tetraetoxisilano, oligossilicatos tais como metassilicato ou silsequioxanos, organosilanos tais como bis(trietoxisilil)metano, bis(trietoxisilil)etano, bis(trietoxisilil)propano, bis(trietoxisilil)butano, metiltrietoxisilano, etil trietoxisilano e propil trietoxisilano.

[0143] O grau de polimerização é ajustado para produzir produtos do tamanho desejado através da manipulação dos parâmetros de processo conforme conhecido na técnica. O tamanho desejado pode não apenas ser expresso como diâmetro hidrodinâmico, mas também como o grau de polimerização (número médio de monômeros) . Isso também é menos útil que o diâmetro hidrodinâmico, mas é uma outra maneira de conceituar as estruturas e incluídas, não como limitantes, mais como referência. Por exemplo, para um polímero com uma densidade próxima a 1 g/ml, a faixa de tamanho preferencial é de 25 a 3.000.000 ou 25 a 375.000 ou 80 a 3.000 ou 80 a 1.000 monômeros.

[0144] É concebível misturar todas as ditas armações de polímero em qualquer combinação quimicamente compatível, através da mistura dos monômeros antes da polimerização ou através do enxerto de um segundo polímero em um primeiro polímero.

[0145] Uma armação particularmente vantajosa é formada através da polimerização por condensação de trialcoxiorganossilanos R5-Si(OR6)3, com R5 sendo H ou um resíduo orgânico e R6 independentemente sendo um alquila inferior ou arila. Tal armação tem a propriedade de ser altamente polar, por conseguinte, compatível com água e o grau de reticulação pode ser controlado pelos parâmetros do processo durante a produção. É vantajoso usar monômeros com mais de um grupo trialcoxisilil presente.

[0146] Em algumas modalidades da invenção, existem dois grupos alcoxisilano presentes no monômero.

[0147] Em algumas modalidades da invenção, os ditos alcoxisilanos são separados por 1 a 10 átomos de carbono ou 3 a 9 átomos de carbono.

[0148] Em algumas modalidades da invenção, os ditos alcoxisilanos são separados por 7 átomos de carbono.

[0149] Em algumas modalidades da invenção, os ditos alcoxisilanos são separados por três ou cinco átomos de carbono.

[0150] Em algumas modalidades da invenção, os dois grupos de fosfonato são parte do grupo R5.

[0151] Em algumas modalidades da invenção, os ditos dois silanos são separados por 7 átomos de carbono e os dois grupos de fosfonato são parte do grupo R5.

[0152] Em algumas modalidades da invenção, os ditos silanos têm a estrutura genérica:

[0153] {(X7aO)(X7bO)PO}2- (C) { (CH2) nSi (OX7c) (OX7d) (OX7e) } { (CH2) 0Si (OX7c) (OX7d) (OX7e) }

[0154] em que

[0155] X7a, X7b, X7c, X7d, X7e são independentemente selecionados a partir de H, alquila CI a Cs e benzila; e

[0156] n e o são independentemente selecionados a partir de 1 a 5.

[0157] Em algumas modalidades, um segundo silano tal como um disilano é enxertado sobre a armação polimérica formada pelo primeiro disilano.

[0158] A reatividade dos trialcoxisilanos para a polimerização varia com a identidade dos grupos R6. Isso foi concluído como um fator crítico no controle de tamanho molecular durante a produção e concluído que o metila e etila, em particular o último, são adequados para produzir as estruturas da presente invenção, embora seja concebível usar qualquer outro grupo de alquila inferior, arila, silil amida, acila, sililfluoreto ou sililcloreto.

[0159] Em algumas modalidades da invenção, R6 é um grupo etila.

[0160] Existem muitas maneiras nas quais os trialcoxisilanos podem se ligar através das ligações Si-O-Si. Os elementos estruturais diméricos bem como lineares, ramificados e cíclicos são conhecidos (R.J. Fessenden, J. S. Fessenden, “Trends in Organosilicon Biological Research” in Advances in Organometallic Chemistry vol. 18 página 275) . Ademais, as estruturas em gaiola de silício-oxigênio de vários tamanhos são bem conhecidas na literatura (Hanssen, R. J. M. et al. Eur. J. Inorg. Chem 675 (2004)) e os grupos alcóxi residuais ou grupos silanol livres também podem estar presentes em diferentes graus. Também é concebível que os íons metálicos paramagnéticos cruciais para a presente invenção em algum ponto sejam coordenados por grupos Si-O-. Alguns elementos estruturais, de forma alguma interpretados como limitantes, que podem estar presentes em tais estruturas são mostrados no esquema 1.

[0161] Esquema 1: Ilustração de algumas estruturas Si-O-Si que podem ser usadas na presente invenção; R é qualquer resíduo orgânico

[0162]A estrutura bisfosfonato geminado de R3R4C(P=O(OR1) (OR2))2 que está no núcleo da presente invenção é bem conhecida por ligar cátions multivalentes como cálcio fortemente. Uma vantagem dos materiais da presente invenção é que os mesmos mostram uma preferência de manganês sobre cálcio e magnésio em concentrações fisiológicas (isso é adicionalmente ilustrado abaixo no Exemplo 15).

[0163] Os grupos de fosfonato podem ser completamente presentes em sua forma de éster, completa ou parcialmente hidrolisados para sua forma ácida e subsequentemente ionizados em algum ponto de parcial para completo de acordo com o valor de pH do meio circundante ou qualquer mistura dos mesmos. É ideal carregar os íons de manganês no polímero em um pH básico ou neutro. Em qualquer lugar, um pH 12 a 6 ou pH 11 a 8 ou de preferência 10,5 a 9,5 é útil. Isso indica que isso é, pelo menos em parte ou algumas vezes ou ainda completamente, a forma aniônica do fosfonato hidrolisado, que desempenha uma parte importante na ligação dos íons metálicos. Não apenas os ésteres ou ácidos de fosfonato, mas também as amidas fosfônicas podem ser contempladas como parte do material ou ser usadas como material de partida.

[0164] Foi concluído que quando a estrutura de bisfosfonato é incorporada em uma armação polimérica, de preferência, hidrofílica e permite-se a ligação de manganês (II), um aumento espetacular em capacidade de relaxamento é alcançado. O quelato de manganês do ácido zoledrônico de bisfosfonato monomérico tem uma capacidade de relaxamento de 2,3 /mM Mn/s (conforme mostrado no exemplo 17) e manganês mais o ácido metilenodifosfônico de bisfosfonato monomérico tem uma capacidade de relaxamento de 1 /mM Mn/s. As capacidades de relaxamento dos materiais carregados com manganês polimérico da presente invenção se situam na faixa de 24 a 48 /mM Mn/s.

[0165] Especificamente, quando a polietilenoimina é derivada com um éster ativado de um bisfosfonato geminado conforme descrito no exemplo 9 e, subsequentemente, carregada com íons de manganês (II), um material com uma capacidade de relaxamento de 24/mM Mn/s é obtido. Isso é substancialmente maior que a capacidade de relaxamento anteriormente mencionada do complexo de ácido zoledrônico, mostrando dessa forma a vantagem de incorporação do bisfosfonato em uma armação polimérica. A razão molar de fósforo para nitrogênio em tais materiais pode se situar na faixa de 0,1 a 3 e é de preferência entre 0,2 e 0,8.

[0166] Para mostrar adicionalmente que a capacidade de relaxamento se origina da combinação de bisfosfonato geminados com um polímero, os polímeros “brutos” correspondentes foram também testados. A polietilenoimina sem quaisquer aditivos liga o manganês muito deficientemente e a capacidade de relaxamento desse pouco que é ligado ao polímero é muito baixa (0,8/mM/s). Ademais, o poliorganosilano formado a partir de (EtO)2P=O-CH2-CH2- Si(OEt)3 gera a capacidade de relaxamento não expressiva de 3,0 /mM Mn/s após o carregamento com manganês. Diante disso, isso prova que a capacidade de relaxamento surpreendentemente alta inerente nos materiais da presente invenção surge da combinação de todos os recursos de serem poliméricos, portanto bisfosfonatos geminados e incorporando metal paramagnético tal como manganês.

[0167] No exemplo 22 é descrito como um 1,3- bisfosfonato ligado à armação polimérica de polietilenoimina, que fica fora do escopo da presente invenção, tem uma capacidade de relaxamento inferior (18,5/mM/s) que os bisfosfonatos geminados da presente invenção (^ 24/mM/s). Isso também tem uma estabilidade deficiente no teste de troca de íon que foi usado. Dessa forma, é razoável esperar que os 1,2-bisfosfonatos, bem como quaisquer 1,n-bisfosfonatos onde n >2 sejam menos desejáveis que os bisfosfonatos geminados da presente invenção.

[0168] Os íons metálicos paramagnéticos são, presumidamente, mas de forma alguma limitantes para a presente invenção, quelados para os grupos de fosfonato e uma razão de fósforo para manganês de 10 a 15 parece ser o melhor acordo entre a capacidade de relaxamento e a estabilidade, mas onde entre 7 e 20 for concebível. Na tabela 1 do exemplo 11, o efeito de variação da razão de fósforo para manganês é descrita em detalhes.

[0169] A razão preferencial de silício para manganês estará, então, na faixa de 5 a 20 e a razão de fósforo para silício deve estar em torno de 1 tal como entre 0,7 e 1,3.

[0170] Opcionalmente, um material hidrofílico e bioinerte pode ser enxertado sobre as partes externas das nanoestruturas da presente invenção. As ditas partes externas são aquelas partes da nanoestrutura que são acessíveis para reações químicas com reagentes de derivação. Isso pode ser vantajoso para a biocompatibilidade do material e muitos materiais hidrofílicos tais como carboidratos ou polímeros artificiais hidrofílicos, podem ser considerado. De particular interesse são compostos de poliéter e especialmente derivados de polietilenoglicol (PEG). Embora não limitante, os derivados de PEG terminados com metóxi são preferenciais (m-PEG). Os mesmos podem ser enxertados de qualquer maneira quimicamente aceitável na armação de polímero tal como a átomos de oxigênio, nitrogênio ou carbono tais como em ácido fosfônico residual ou grupos silanol após a quelação de metal ou, alternativamente, de forma direta ao polímero livre de metal. Os comprimentos de cadeia adequados de derivados de PEG lineares são de 4 a 50 unidades de - CH2CH2O. As mais desejáveis são misturas que compreendem de 5 a 20 unidades e com média em torno de 10 ou 11. Os reagentes que são mais convenientemente acoplados às nanoestruturas são terminados com amino e podem ser acoplados aos grupos de fosfonato residuais. Os derivados de PEG ramificados são também de interesse e especialmente estruturas como aquelas do exemplo 8, que são mais compactas e melhores na proteção da superfície que derivados de PEG lineares de peso molecular similar.

[0171] O número de grupos de polímero bioinerte em cada entidade de nanoestrutura pode se situar na faixa de 10 a 1.000 ou de 10 a 100 ou de 10 a 50.

[0172] Em algumas modalidades, as nanoestruturas poliméricas de bisfosfonato carregadas com manganês da presente invenção compreendem grupos de m-PEG lineares com um comprimento de cadeia de 5 a 20 resíduos de monômero acoplados a uma fração dos grupos de fosfonato através de ligações de amida.

[0173] Em algumas modalidades, as nanoestruturas poliméricas de bisfosfonato carregadas com manganês da presente invenção compreende grupos PEG ramificados da estrutura X1 (exemplo 8h) acoplados a uma fração dos grupos de fosfonato através de ligações de amida.

[0174] É concebível introduzir manipulações para a conjugação das nanoestruturas da presente invenção em várias entidades moleculares ativas tais como biomarcadores ou entidades-repórter. Uma lista não limitante de exemplos típicos seria peptídeos, peptoides, proteínas, anticorpos, fragmentos de DNA, fragmentos de RNA, PNA, fragmentos, fluoróforos, quelatos ou ligantes farmacológicos de molécula pequena.

[0175] O segundo aspecto principal da presente invenção é um processo para produzir as ditas nanoestruturas. Em seu sentido mais amplo, isso envolve primeiro a formação de entidades poliméricas globulares e nanodimensionadas que compreendem uma pluralidade de grupos de bisfosfonato seguido por uma etapa em que o produto da primeira etapa é colocado em contato com íons de manganês (II) . Opcionalmente, as duas etapas, embora quimicamente distintas, podem ser executadas simultaneamente no mesmo vaso de reação. Os principais recursos do processo são esboçados na Figura 1. Em um ou mais casos do processo, uma etapa de seleção de tamanho ou etapa de purificação por ultrafiltração é incorporada.

[0176] Um glóbulo polimérico nanodimensionado que compreende uma pluralidade de bisfosfonatos é obtido através do enxerto (002) em um glóbulo polimérico existente (obtido por uma etapa de polimerização 001) ou por polimerização de uma mistura de monômero que compreende bisfosfonatos (003) . Dependendo de qual armação polimérica é desejada, muitos iniciadores de polimerização diferentes podem ser contemplados. Para monômeros insaturados como estirenos e acrilatos, vários iniciadores de radical, tal como peróxido de benzoila ou azobisisobutironitrila, são preferenciais. Para os monômeros à base de trialcoxisilano de uma dentre as modalidades preferenciais da presente invenção, é possível usar hidrólise e condensação espontâneas para efetuar a polimerização ou usar catálise ácida ou básica. Também fico comprovado como vantajoso algumas vezes usar uma adição de um sal estabilizante de pH como um bicarbonato, em particular, bicarbonato de sódio ou um carboxilato como acetato de sódio, formato de sódio ou tetrametil amônio formato à mistura de reação para otimizar a produtividade do produto na faixa de tamanho de 3 a 10 nm.

[0177] Muitas vezes, um solvente é desejável para a etapa 003 e, embora muitos diferentes possam ser antevistos por um elemento versado na técnica, é desejável evitar solventes tóxicos, então, água e álcoois inferiores tais como propanol, butanol, etileno glicol ou 1,3- propanodiol são preferenciais. Muitas vezes é desejável otimizar a produtividade e a qualidade do produto através do uso de misturas de solventes.

[0178] Em algumas modalidades do processo, uma mistura de 5 a 25% de água em um álcool inferior é usada na etapa 003.

[0179] Em algumas modalidades do processo, uma mistura de 5 a 25% de água em etanol, 1- ou 2-propanol, etilenoglicol ou 1,2- ou 1,3-propanodiol é usada na etapa 003.

[0180] Foi concluído como vantajoso usar temperaturas maiores que a temperatura ambiente para a etapa 003, tais como temperaturas de 40 a 130 °C ou 80 a 120 °C ou 100 a 120 °C. Quando os álcoois inferiores são usados, é necessário trabalhar com recipientes fechados e resistentes à pressão para alcançar a temperatura de reação desejada.

[0181] A duração da etapa 003 depende da armação polimérica e do modo de iniciação e pode se situar na faixa de segundos a dias ou semanas. Para os trialcoxisilanos em algumas das modalidades preferenciais da presente invenção, é comprovado como vantajoso usar tempos de 6 a 200 horas ou 6 a 48 horas ou 12 a 36 horas ou aproximadamente 24 horas na etapa 003.

[0182] Em algumas modalidades da invenção, as condições da etapa 003 são uma temperatura de 105 a 115 °C e uma duração de 20 a 30 horas.

[0183] Em algumas modalidades da invenção, as condições da etapa 003 são uma temperatura de 105 a 115 °C e uma duração de 30 a 60 horas.

[0184] Em algumas modalidades da invenção, as condições da etapa 003 são uma temperatura primeiro de 90 a 100 °C por 40 a 50 horas e, então, 105 a 115 °C por outras 20 a 30 horas.

[0185] A concentração de monômeros na etapa 003 depende de qual armação polimérica é desejada e pode se situar na faixa de uma concentração molar a condições livres de solvente. Entretanto, para os trialcoxisilanos em uma dentre as modalidades preferenciais da presente invenção, foi comprovado como vantajoso trabalhar com 10 a 500 mM ou 20 a 100 mM e em particular 40 a 80 mM de concentração de monômero.

[0186] Em algumas modalidades da invenção, as condições da etapa 003 são primeiro uma temperatura de 90 a 100 °C por 20 a 50 horas seguidas por 105 a 125 °C por 20 a 30 horas e uma concentração de monômero de 40 a 60 mM.

[0187] Na etapa 002 que envolve o enxerto de um reagente de bisfosfonato a uma armação polimérica, as condições são um tanto quanto diferentes. Especialmente, as demandas de temperatura e concentração são mais relaxadas. Foi concluído que o início com uma solução de polietilenoimina em água opcionalmente com a mistura por adição de um cossolvente, a uma temperatura compatível com água líquida, tal como temperatura ambiente e do contato disso com um bisfosfonato com capacidade de reação com a dita polietilenoimina, tal como ácido 3,3-bis(dimetoxifosforil)- propanoico, na presença de um composto com capacidade de formar um intermediário de éster reativo, tal como sal de sódio de N-hidroxisulfosuccinimida na presença de um agente de acoplamento, tal como N-(dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodi-imida a uma temperatura, tal como temperatura ambiente por um período de tempo de 1 a 48 horas, tais como 20 a 24 horas, produzem um material com bisfosfonatos enxertados na armação polimérica.

[0188] Uma etapa de seleção de tamanho (004) é executada na solução de precursores de nanoestrutura (X) para remover entidades indesejavelmente grandes ou pequenas. Os materiais de partida e os resíduos de solvente da mistura de reação são também removidos nesse estágio. A ultrafiltração é um método preferencial de purificação, especialmente quando usada na forma que é usualmente identificada como filtração de fluxo laminar ou diafiltração. É preferencial remover nanoestruturas e/ou agregados indesejavelmente grandes através da passagem da solução através de um filtro com poros de preferência grandes, etapa 004a. Os valores de corte nominais preferenciais para tais filtros são 300 kDa ou 100 kDa ou 50 kDa. Em uma etapa 004b, o material desejado é coletado em um filtro com tamanho de poro menor. Os tamanhos de poro preferenciais para a etapa 004b têm valores de corte nominais a 50 kDa, 30 kDa ou 10 kDa.

[0189] A etapa de seleção de tamanho (004) pode não ser requerida se o material de partida tiver uma distribuição de tamanho estreita.

[0190] Em algumas modalidades da invenção, uma solução obtida a partir da etapa de processo 002 ou 003 é passada, primeiro através de um filtro de 100 kDa (etapa 004a) e, subsequentemente, coletada em um filtro de 30 kDa (etapa 004b).

[0191] Em algumas modalidades da invenção, uma solução obtida a partir da etapa de processo 002 ou 003 é passada primeiro através de um filtro de 300 kDa (etapa 004a) e subsequentemente coletada em um filtro de 100 kDa (etapa 004b).

[0192] Em algumas modalidades da invenção, uma solução obtida a partir da etapa de processo 002 ou 003 é passada primeiro através de um 50 kDa filtro (etapa 004a) e subsequentemente coletada em um filtro de 30 kDa (etapa 004b).

[0193] Em algumas modalidades da invenção, uma solução obtida a partir da etapa de processo 002 ou 003 é passada primeiro através de um filtro de 100 kDa (etapa 004a) e subsequentemente coletada em um filtro de 10 kDa (etapa 004b).

[0194] É vantajoso lavar o material com várias porções de água após a etapa 004b para remover adicionalmente os monômeros ou resíduos de solvente da etapa 001, 002 ou 003.

[0195] Outros métodos de ultrafiltração tais como filtros de rotação ou diálise também podem ser usados, embora sejam menos escaláveis.

[0196] As partículas da faixa de tamanho desejada também podem ser selecionadas por cromatografia por exclusão de tamanho (também chamada de filtração por gel).

[0197] A etapa, 005, em que o dito polímero é carregado com manganês (II) envolve submeter uma solução do dito polímero a íons de manganês (II) . Os ditos íons podem ser adicionados à mistura de reação na forma de um sólido ou como uma solução. Os sais solúveis de manganês (II) como o fluoreto, cloreto, brometo, acetato, nitrato ou sulfato são preferenciais. É concebível usar também fontes menos solúveis de manganês, como MnO. As concentrações úteis de íons de manganês são de 0, 1 mM-5 M tal como 0,1 a 600 mM ou 0,1 a 10 mM dependendo da concentração de polímero. Conforme discutido anteriormente, a razão de fósforo para manganês é importante. É ideal carregar os íons de manganês no polímero em um pH básico ou neutro. Em qualquer parte, o pH de 12 a 6 ou pH 11 a 8 ou de preferência 10,5 a 9,5 é útil. A adição do manganês deve ocorrer após tal período de tempo em que o pH foi estabilizado no valor desejado. Foi concluído que tempos de 10 minutos a 24 horas tal como de meia a duas horas são suficientes. Após o carregamento das nanoestruturas com manganês, o pH é ajustado para neutro (entre 8 e 6 ou entre 7,7 e 7). A temperatura para o carregamento pode ser qualquer uma a partir do ponto de congelamento até o ponto de ebulição do solvente ou mistura de solvente em questão e da temperatura ambiente para 60 graus é preferencial.

[0198] Em uma etapa opcional 006, as partículas da faixa de tamanho desejada são separadas de espécies indesejavelmente grandes ou pequenas. Muitas vezes, isso não é necessário, uma vez que as nanoestruturas apenas se alteram marginalmente em tamanho quando o manganês é adicionado. A etapa 006 pode ter várias subetapas 006a, 006b etc. ou uma subetapa em nenhuma ordem particular, 006x.

[0199] A ultrafiltração é um método preferencial de uma etapa de seleção de tamanho 006x, especialmente, quando usada na forma em que é usualmente identificada como filtração de fluxo laminar ou diafiltração. É preferencial remover nanoestruturas e/ou agregados indesejavelmente grandes através da passagem da solução através de um filtro com poros preferencialmente grandes, etapa 006a. Os valores de corte nominais para tais filtros são 300 kDa ou 100 kDa ou 50 kDa. Em uma etapa 006b, o material desejado é coletado em um filtro com tamanho de poro menor. Os tamanhos de poro preferenciais para a etapa 006b têm valores de corte nominais em 50 kDa, 30 kDa ou 10 kDa.

[0200] Em algumas modalidades da invenção, uma solução obtida a partir da etapa de processo 005 é passada, primeiro, através de um filtro de 100 kDa (etapa 006a) e, subsequentemente, coletada em um filtro de 30 kDa (etapa 006b).

[0201] Em algumas modalidades da invenção, uma solução obtida a partir da etapa de processo 005 é passada primeiro através de um filtro de 300 kDa (etapa 006a) e subsequentemente coletada em um filtro de 100 kDa (etapa 006b).

[0202] Em algumas modalidades da invenção, uma solução obtida a partir da etapa de processo 005 é passada primeiro através de um filtro de 50 kDa (etapa 006a) e subsequentemente coletada em um filtro de 30 kDa (etapa 006b).

[0203] É vantajoso lavar o material com várias porções de água após a etapa 006b para remover adicionalmente íons metálicos residuais, monômeros ou resíduos de solvente da etapa 005.

[0204] Outros métodos de ultrafiltração tais como filtros de rotação ou diálise também podem ser usados na etapa 006x.

[0205] As partículas da faixa de tamanho desejada podem também ser selecionadas por cromatografia por exclusão de tamanho (também chamada de filtração por gel) na etapa 006x.

[0206] Opcionalmente, o dito produto de fosfonato polimérico rico em manganês pode ser purificado em uma etapa 007. A etapa 007 pode ter várias subetapas 007a, 007b etc. para uma subetapa em nenhuma ordem particular, 007x.

[0207] Um método preferencial de uma etapa de purificação 007x é o tratamento com uma quantidade pequena de trocador de cátion, tal como poliestireno sulfonado, para remover o excesso de manganês ou o manganês fracamente ligado. As resinas de troca de íon comercialmente disponíveis muitas vezes tem uma capacidade de 1 a 2 mmol/g de resina e tipicamente o material bruto da etapa b) que contém 1 mol de manganês seria tratado com 1 a 100 g da forma sódio ou potássio de uma resina de troca de íon.

[0208] Em algumas modalidades da invenção, a etapa 007x envolve ainda uma outra diafiltração que coleta o material em um filtro de 30 kDa.

[0209] Em algumas modalidades da invenção, a etapa do processo 007x envolve o tratamento do produto da etapa 006 com a forma de sódio de uma resina de troca de íon do tipo sulfonato de poliestireno.

[0210] As etapas de purificação subsequentes 007x para remover impurezas lipofílicas tais como traços de endotoxinas (resíduos de bactérias mortas) também podem ser adicionados.

[0211] Em algumas modalidades do processo, o produto da etapa 006 é tratado com carvão ativado.

[0212] Em algumas modalidades do processo, o produto da etapa 006 é passado através de um filtro de polietileno ou polipropileno ou PVDF.

[0213] Em algumas modalidades do processo, o produto da etapa 006 é tratado com polimixina imobilizada B.

[0214] Opcionalmente, uma etapa 009 pode ser inserida conforme indicado na Figura 1, em que um modificador de superfície bioinerte é enxertado nas partes acessíveis da nanoestrutura.

[0215] Opcionalmente, a reticulação (etapa 010) pode ser efetuada através da incorporação de agentes de reticulação em muitos locais no processo conforme indicado na Figura 1. A reticulação através da mistura no agente de reticulação na etapa 001 é um procedimento padrão. O monômero também pode ser inerentemente propenso à reticulação como os trialcoxisilanos em uma dentre as modalidades preferenciais da presente invenção de modo que o material formado na etapa 002 já seja reticulado.

[0216] No terceiro aspecto principal da presente invenção, o material é usado como um agente de contraste para procedimentos de diagnóstico e, em particular, para formação de imagem por ressonância magnética (MRI). O material da presente invenção tem as propriedades de baixa toxicidade e alta capacidade de relaxamento o que o torna útil como um agente de contraste em exames de MRI de um organismo, em particular, de um corpo humano.

[0217] A combinação das propriedades de alta capacidade de relaxamento e de tamanho adequado para essas modalidades da invenção em que o diâmetro hidrodinâmico é maior que 3 nm ou maior que 4 nm ou maior que 5 nm torna as composições que compreendem as nanoestruturas da presente invenção adequadas para formação de imagem de tumores, em particular, tumores sólidos por MRI. Também é concebível usar as ditas composições da presente invenção como um agente de contraste para formação de imagem anatômica geral, por exemplo, angiografia; em particular, angiografia das artérias coronárias finas do coração ou angiografia das artérias carótidas ou das artérias renais ou da aorta, é permitida pela alta capacidade de relaxamento e contraste da presente invenção. A formação de imagem de estruturas na cabeça, órgãos internos ou extremidades também são de interesse. Dos órgãos internos, fígado, pâncreas e intestinos são de interesse particular. A formação de imagem do cólon pode ser alcançada por administração intravenosa ou administração como um enema. Para formação de imagem do estômago, fígado e do aparelho digestivo superior, é concebível administrar o agente de contraste oralmente.

[0218] Por causa da baixa toxicidade e da alta capacidade de relaxamento dos materiais da presente invenção, os mesmos são úteis como agentes de identificação celular. As células, como as células-tronco ou macrófagos para uso diagnóstico ou terapêutico em um paciente são carregadas com nanoestruturas da presente invenção ex vivo e subsequentemente administradas no dito paciente e sua distribuição no corpo pode ser visualizada com MRI.

[0219] Em algumas modalidades da invenção, uma solução das nanoestruturas é injetada no tecido, muitas vezes, mas não se limitando a, intradérmica ou subcutaneamente e, subsequentemente, usada para visualizar as estruturas linfáticas de um paciente por MRI. De particular interesse é a formação de imagem de nós de linfa que são um local comum de tumores metastáticos. Particularmente uteis para este propósito são as nanoestruturas com tamanhos em torno de 10 nm, tal como 7 a 50 nm ou 7 a 25 nm ou 7 a 15 nm.

[0220] Em algumas modalidades da presente invenção, uma formulação das nanoestruturas da presente invenção com um diâmetro hidrodinâmico médio na faixa de 8 a 15 nm é administrada a um paciente intradermicamente e os nós de linfa do dito paciente são visualizados por um procedimento de MRI.

[0221] Uma vez que as nanoestruturas da presente invenção têm as propriedades de alta capacidade de relaxamento e baixa toxicidade, é concebível usar o material para identificação celular. Nesse caso, as células, por exemplo, células-tronco ou macrófagos são carregadas com nanoestruturas externamente a um corpo do mamífero, por exemplo, um corpo humano e, então, inseridas no dito mamífero e uma imagem é gerada por varredura de MRI. Então, é possível seguir as células conforme são transportadas através do organismo.

[0222] O uso in vivo das nanopartículas desta invenção requer que as mesmas sejam formuladas de uma maneira farmacologicamente aceitável de acordo com a melhor prática bem conhecida por aqueles elementos versados na técnica. O modo preferencial de administração é parenteral, em particular, é a via intravenosa vantajosa, mas a intraarterial pode ter vantagens sob certas circunstâncias. A administração parenteral muitas vezes requer uma formulação líquida. A água é um solvente preferencial para colocar as nanoestruturas da presente invenção em solução, mas um ou mais cossolventes ou aditivos podem ser adicionados em 0,1 a 10% para aprimorar a estabilidade em solução. Os cossolventes aceitáveis são álcoois como etanol ou glicerol, polímeros biocompatíveis como etilenoglicol ou álcool polivinílico, sulfóxido de dimetila ou N-metil pirrolidinona. Também pode ser vantajosos adicionar um ou mais osmorreguladores como manitol, sorbitol, lactose, glicose ou outros açúcares ou álcoois de açúcar. É desejável que a formulação seja iso- osmótica com os fluidos corporais. De preferência, a solução para uso intravenoso tem uma osmolaridade de 270 a 2.000 mOsm ou 280 a 1.000 mOsm ou 280 a 500 mOsm ou em particular de 280 a 300 mOsm. Muitos dos ditos aditivos também podem desempenhar a função de crioprotetores, intensificar a eficiência de reconstituição após secagem por congelamento. Também pode ser vantajoso adicionar eletrólitos para diminuir os efeitos fisiológicos da solução injetada. Os eletrólitos preferenciais seriam uma combinação de sais não tóxicos de sódio, cálcio e/ou magnésio. A regulação do pH da solução injetável é preferencial e qualquer tampão adequado para injeção pode ser contemplada, mas de preferência é Tris-HCl. Os sequestrantes de íon metálico também podem ser contemplados como um aditivo. Alguns exemplos típicos seriam EDTA (ácido etilendiaminatetra-acético), DTPA (ácido dietilenotriaminapenta-acético) e DOTA (1,4,7,10-tetra-aza- ciclododecano-N,N',N",N"'-tetra-acético) ou fodipir. O uso de resinas sequestrantes de íon em fase sólida adicionadas à garrafa de armazenamento também pode ser contemplado.

[0223] A concentração de nanoestruturas pode ser descrita de muitas maneiras diferentes, mas as duas mais relevantes são concentração de massa dada como g/l d e solução e concentração de manganês em mmol/l de solução. As faixas de concentração de manganês em formulações que são adequadas para administração como um agente de contraste se situam na faixa de 1 a 500 mM ou 10 a 300 mM ou 10 a 200 mM ou 50 a 2 00 mM ou 100 a 200 mM. Quando dadas como uma concentração de massa e considerando que razão de fósforo para manganês é em torno de 6, as concentrações de massa que são adequadas para formulação de agente de contraste se situam na faixa de 0,5 a 300 g/l ou 5 a 200 g/l ou 5 a 250 g/l ou 5 a 100 g/l ou 100 a 250 g/l. As concentrações em massa correspondem aproximadamente às concentrações dados em mM de manganês, mas a correspondência irá variar dependendo da armação de polímero, do grau de reticulação e da presença de uma camada de revestimento bioinerte.

[0224] Uma modalidade da presente invenção constitui uma formulação farmaceuticamente aceitável para administração intravenosa com uma concentração de manganês de 100 a 300 mM e uma razão de fósforo para manganês de 7 a 20.

[0225] Algumas modalidades da presente invenção se referem a formulações farmaceuticamente aceitáveis para administração intravenosa com uma concentração de manganês de 10 a 300 mM e uma razão de fósforo para manganês de 7 a 20.

[0226] Uma modalidade alternativa da invenção é uma nanoestrutura que compreende uma armação polimérica que compreende pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado, em que os grupos de bisfosfonato geminado independentemente um do outro são incorporados como

[0227] -R3R4C(P=O(OR1)(OR2))2

[0228] (que é idêntico a -R4R3C(P=O(OR1) (OR2))2) em que R1 e R2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em uma carga negativa, H, alquila e arila, e em que pelo menos um dentre R3 e R4 é um grupo conectado à armação polimérica com a condição de que quando apenas um dentre R3 e R4 é tal grupo conectado, o outro dentre R3 e R4 é um grupo com capacidade conexão com a armação polimérica ou o resíduo de tal grupo ou selecionado do grupo que consiste em H, OH, OR5 e R5, em que R5 é um alquila inferior, isto é, uma nanoestrutura conforme discutido acima, mas que não contém quaisquer íons de manganês. Tal nanoestrutura é útil como um intermediário na produção de nanoestruturas de acordo com as modalidades anteriormente discutidas. Tal estrutura pode ligar outros cátions além de manganês e ser útil nessa capacidade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0229] Nos exemplos abaixo, faz-se referência aos desenhos anexos, nos quais:

[0230] A Figura 1 é uma vista esquemática de um método para obter as nanopartículas de acordo com a invenção, e

[0231] A Figura 2 ilustra a intensificação de contraste 5 h após a injeção em um camundongo com um tumor.

[0232] As Figuras 3a, 3b e 3c são curvas relacionadas a experimentos de titulação condutométrica descritos no exemplo 23.

[0233] As Figuras 4a e 4b ilustram a recuperação de SI055 em frações 1 a 10 das colunas pré-imunes (Figura 4A) e imunes (Figura 4B). EXEMPLOS

[0234] Exemplo 1: Síntese de 1,1- bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano

[0235] 1a: 1,1-dialil-1,1- bis(dimetilfosfonato)metano

[0236] Um reator de 2 l equipado com um agitador mecânico foi seco a 130 °C sob vácuo e, então, foi permitido o resfriamento sob uma pressão de nitrogênio positiva. O reator foi carregado com THF seco (1 l) (Aldrich dry, 99,9 % com 250 ppm de BHT) por transferência de tubo sob gás inerte. Tetrametilmetilenodi(fosfonato) (97,4 g, 420 mmol) e brometo de alila (183 ml, 255 g, 2,11 mol) foram adicionados (sem envolvimento de calor, sem gás ácido detectado). A temperatura de camisa foi definida como 0 °C e a uma temperatura interna de 6 °C, foi adicionado (dividido em 6 porções) t-butóxido de potássio (140,3 g no total, 1,25 mol). A temperatura elevou para cerca de 12 °C após cada adição e foi permitida sua volta para 6 °C (ou menos) antes da próxima adição. Uma última adição de brometo de alila (9,4 ml, 0,11 mol) e t-butóxido (7,3 g, 65 mmol) foi executada para converter as últimas poucas porcentagens de produto monoalilado (sem exotermia detectada). A temperatura na camisa foi definida como 15 °C por cerca de 2 h e, então, a mistura de reação branca e espessa foi agitada de um dia para o outro com uma temperatura de camisa de 0 °C. A reação foi arrefecida com 50 ml de NH4Cl saturado (aquoso) (temperatura elevada de 2 para 5 °C) e, então, tolueno (1 l) foi adicionado e 1 l foi removido por destilação para conduzir para fora THF e o excesso de brometo de alila. Coletado de 63 a 73 °C com uma temperatura de camisa de 70 a 100 graus por 2 h. Ao resíduo foi adicionado gel de sílica (100 g) e carvão ativado (15 g). A mistura de reação foi agitada por poucos minutos e o líquido foi removido por sifão com um bastão de frita-filtro (ou filtrado através de um filtro de fibra de vidro Whatman normal). A torta residual foi lavada com tolueno (3 x 100 ml) . O filtrado combinado foi filtrado através de um Filtro de fibra de vidro Whatman para remover os últimos traços de carvão ativado (indicado por uma cor esverdeada) e concentrado no evaporador giratório (temperatura de banho 40 °C) para produzir o composto de titulação como um líquido amarelo claro. O produto bruto foi reintroduzido no reator limpo e dissolvido em uma mistura de tolueno (50 ml) e heptano (380 ml). A cristalização pode ser induzida a uma temperatura interna de 12 a 9 °C por semeadura. A temperatura de camisa foi diminuída para -25 °C por um período de 2 h e mantida naquela temperatura por mais duas horas para concluir a cristalização. O licor-mãe foi removido por um bastão de filtro dotado de frita e a pasta aquosa de cristal foi lavada com duas porções de heptano pré- resfriado (40 ml). Os cristais foram dissolvidos em EtOAc e a solução lavada através da válvula de fundo. O solvente foi removido em pressão reduzida para gerar 70,0 g 224 mmol, 53% do produto como um sólido com um ponto de fusão logo acima da temperatura ambiente.

[0237] 1H-NMR (CDCI3); 6,35 (m, 2H), 5,20 (m, 4H), 3,68 (d, 12H), 3,00 (abx, 4H).

[0238] Também foi possível destilar o produto em um aparelho de destilação de filme fino de trajetória curta.

[0239] 1b: 1,1-bis(trietoxisililpropil)-1,1- bis(dimetilfosfonato)

[0240] Um reator de 2 l com camisa de controle de temperatura, termômetro interno e um agitado mecânico foi carregado com tolueno (330 ml, Aldrich dry, tampa com vedação garantida), tetrametil-1,1-bis alil-metilenobis(fosfonato) (70 g, 224 mmol) e trietoxisilano (123 ml, 655 mmol) . A mistura de reação foi desoxigenada por três ciclos de vácuo- nitrogênio, foi tomado cuidado para manter os ciclos de vácuo curtos para evitar perda de tolueno e silano. O oxigênio é crítico para remoção. A temperatura de camisa foi definida como 30 °C. O catalisador de Karstedt (4,5 ml, 2% em tolueno 0,053 mmol) foi injetado por seringa como porções de 0,5 ml com 30 minutos entre isso (4,5 h total) . Após as adições de catalisador terem sido concluídas, a camisa de controle de temperatura foi definida como 30 °C e a mistura foi deixada em agitação de um dia para o outro. Na manhã seguinte, a temperatura de camisa foi definida como 40 graus, uma cabeça de destilação adicionada e o tolueno e o excesso de silano removido por destilação a uma pressão de 6 kPa a 1 kPa (62 a 13 mbar) . Duração 2 h. O etanol (800 ml) e o carvão ativado (15 g) foram adicionados e a pasta aquosa foi agitada por 10 min. e a mistura foi absorvida através da válvula de fundo e filtrada através de um filtro de fibra de vidro Whatman. O solvente foi removido em pressão reduzida em um evaporador giratório até o peso constante (temperatura de banho 45 °C) para gerar 138 g (215 mmol, 96%) do produto como um óleo marrom claro.

[0241] 1H-NMR (CDCI3); 3,95 (q, 12 H), 3,77 (d, 12H), 2,37 (m, 4H), 2,12 (m, 4H), 1,32 (t, 18H) , 0,88 (t, 4H) .

[0242] Também foi possível destilar o produto em um aparelho de destilação de filme fino de trajetória curta a 170 °C e 30 Pa (0,3 mbar).

[0243] Exemplo 2: Síntese de 1,1-bis(2- trimetoxisililetil)—1,1-bis(dimetilfosfonato)metano

[0244] 2a: 1,1-bis(2-t-butoxietil)-1,1- bis(dimetilfosfonato)metano

[0245] A uma solução resfriada por gelo de 1,1-bis(dimetilfosfonato)metano (50 g, 215 mmol) em THF seco (500 ml) sob nitrogênio é adicionado hidreto de sódio (18,9 g, 60% em óleo mineral, 474 mmol) em três porções, por 30 minutos. A mistura é agitada por 3 horas e, então, 1-bromo-2-t-butoxietano (90,5 g, 500 mmol) é adicionado em porções de 5 ml. O banho de gelo é removido após três horas e a agitação é continuada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura de reação é resfriada com um banho de gelo novamente e arrefecida através da adição de 50 ml de cloreto de amônio aquoso saturado. Os voláteis são removidos a vácuo e os orgânicos são dissolvidos em diclorometano (300 ml) . A sílica (100 g) é agitada e a pasta aquosa é filtrada e a torta de filtro é lavada com 3 x 200 ml de diclorometano. O produto é obtido após a remoção dos solventes.

[0246] 2b: 1,1-bis(2-hydroxietil)-1,1- bis(dimetilfosfonato) metano

[0247] Ácido trifluoroacético (TFA, 50 ml) e diclorometano (DCM, 50 ml) são adicionados a 2 g de 1,1- bis(2-t-butoxietil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano (exemplo 2a) . A mistura é agitada à temperatura ambiente por 1 h e os voláteis são removidos em pressão reduzida para gerar o produto.

[0248] 2c: Síntese de 1,1-bis(2-mesiloxietil)- 1,1-bis(dimetil- fosfonato)metano

[0249] O produto do exemplo 2b (1,1-bis(2- hidroxietil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano) (10 mmol) é dissolvido em diclorometano resfriado por gelo (10 ml) . A piridina (40 mmol, 3,24 ml) e metanosulfonilcloreto (3,44 g, 30 mmol) são adicionados, o último enquanto é mantida a temperatura interna < 5 °C. Após três horas, éter (30 ml) e água (7 ml) são adicionados. Após a separação de fase, a camada orgânica é lavada com 2 M HCl, carbonato de hidrogênio e sódio aquoso a 5 % e água. A secagem sobre sulfato de magnésio é seguida pela evaporação dos voláteis para produzir o produto.

[0250] 2d: 1,1-divinil-1,1- bis(dimetilfosfonato)metano

[0251] A uma solução resfriada por gelo de 1,1- bis(2-mesiloxietil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano (50 g, 104 mmol) em THF seco (500 ml) sob nitrogênio é adicionado dietilisopropilhilamina (300 mmol). O banho de gelo é removido após 30 minutos e a agitação é continuada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Os voláteis são removidos a vácuo e os orgânicos são dissolvidos com éter (300 ml) . A sílica (100 g) e o carvão ativado (15) são agitados e a pasta aquosa é filtrada e a torta de filtro é lavada com 3 x 200 ml de éter. O produto é obtido após a remoção do solvente.

[0252] 2e: 1,1-bis(2-trimetoxisililetil)—1,1- bis(dimetilfosfonato)-metano

[0253] A uma solução de 1,1-divinil-1,1- bis(dimetilfosfonato)metano (Exemplo 2d) (2,0 mmol) em tolueno seco (20 ml) é adicionado 80 μl de uma solução de catalisador de Karstedt em tolueno (2% Pt) e trietoxisilano (6,0 mmol, 4,1 ml) . A solução é deixada em temperatura ambiente por 2 dias. Os voláteis são removidos a vácuo e o silano residual é removido por dois ciclos adicionais de adição-de-tolueno-vácuo. O resíduo é absorvido tolueno, tratado com uma pequena quantidade de carvão ativado, passado através de um filtro de PTFE de 5 μm e purificado por cromatografia rápida em uma coluna de sílica com diclorometano + 0 a 10% de metanol como o eluente para produzir o produto desejado.

[0254] Exemplo 3: Síntese de 1,1- bis(trimetoxisililmetil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano

[0255] A uma solução resfriada por gelo de 1,1- bis(dimetilfosfonato)metano (50 g, 215 mmol) em THF seco (500 ml) sob nitrogênio é adicionado hidreto de sódio (18,9 g, 60% em óleo mineral, 474 mmol) em três porções, por 30 minutos. A mistura é agitada por 3 horas e, então, clorometiltrietoxisilano (500 mmol) é adicionado em porções, mantendo a temperatura interna abaixo de 5 °C. O banho de gelo é removido após três horas e a agitação é continuada à temperatura ambiente for de um dia para o outro. A mistura de reação é resfriada com um banho de gelo novamente e arrefecida através da adição de 50 ml de cloreto de amônio aquoso saturado. Os voláteis são removidos a vácuo e os orgânicos são dissolvidos em diclorometano (300 ml). A sílica (100 g) é agitada e a pasta aquosa é filtrada e a torta de filtro é lavada com 3 x 200 ml de diclorometano. O produto é obtido após a remoção dos solventes.

[0256] Exemplo 4: Síntese de 1,1-bis(3- trimetoxisililpropil)-1,1-bis(dietilfosfonato)metano.

[0257] 4a: 1,1-dialil-1,1- bis(dietilfosfonato)metano

[0258] A uma solução resfriada por gelo de 1,1- bis(dietilfosfonato)metano (4,97 ml, 20 mmol) em THF seco (50 ml) sob nitrogênio foi adicionado brometo de alila (8,7 ml, 100 mmol). Por um período de duas horas foi adicionado terc-butóxido de potássio (6,8 g, 60 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, então, arrefecida através da adição de 50 ml de cloreto de amônio aquoso saturado. Os voláteis foram removidos a vácuo e os orgânicos foram dissolvidos com diclorometano. A Cromatografia rápida em sílica em diclorometano + metanol (0 a 10% de gradiente) gerou produto essencialmente puro (NMR).

[0259] 4b: 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1- bis(dietilfosfonato)metano

[0260] A uma solução de 1,1-dialil-1,1- bis(dietilfosfonato)metano (Exemplo 2a) (4,4 g, 14,2 mmol) em tolueno seco (25 ml) foi adicionado 212 μl de uma solução de catalisador de Karstedt em tolueno (2% Pt) e trietoxisilano (42,7 mmol, 7,8 ml) . A solução foi deixada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Os voláteis foram removidos a vácuo e o silano residual foi removido por dois ciclos adicionais de adição-de-tolueno-vácuo. O resíduo foi absorvido em tolueno, tratado com uma pequena quantidade de carvão ativado, passado através de um filtro de PTFE de 5 μm e purificado por cromatografia rápida em uma coluna de sílica com diclorometano + 0-10% metanol como o eluente. Produtividade: 6,9 g de material com pureza NMR de 90%.

[0261] Exemplo 5: Síntese de 1,1-bis(3- trimetoxisililpropil)-1,1-bis(diisopropilfosfonato)metano

[0262] 5a: 1,1-dialil-1,1- bis(diisopropilfosfonato)metano O O

[0263] A uma solução resfriada por gelo de 1,1- bis(diisopropil)fosfonato)metano (6,44 ml, 20 mmol) em THF seco (50 ml) sob nitrogênio foi adicionado brometo de alila (8,7 ml, 100 mmol). Por um período de duas horas foi adicionado terc-butóxido de potássio (6,8 g, 60 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, então, arrefecida através da adição de 50 ml cloreto de amônio aquoso saturado. Os voláteis foram removidos a vácuo e os orgânicos foram dissolvidos com diclorometano. A cromatografia rápida em sílica em diclorometano + metanol (0 a 10% de gradiente) gerou 6,5 g de produto essencialmente puro (NMR).

[0264] 5b: 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1- bis(diisopropilfosfonato)- metano

[0265] A uma solução de 1,1-dialil-1,1- bis(diisopropilfosfonato)metano (Exemplo 2a) (0,736 g, 2,0 mmol) em tolueno seco (20 ml) foi adicionado 80 μl de uma solução de catalisador de Karstedt em tolueno (2% Pt) e trietoxisilano (6,0 mmol, 4,1 ml) . A solução foi deixada à temperatura ambiente por 2 dias. Os voláteis foram removidos a vácuo e o silano residual foi removido por dois ciclos adicionais de adição-de-tolueno-vácuo. O resíduo foi absorvido em tolueno, tratado com uma pequena quantidade de carvão ativado, passado através de um filtro de PTFE de 5 μm e purificado por cromatografia rápida em uma coluna de sílica com diclorometano + 0 a 10% de metanol como o eluente. Produtividade: 1,0 g de material com pureza NMR de 90%.

[0266] Exemplo 6: Síntese de 1,1-bis(3- trimetoxisililpropil)-1,1-bis(di-(3- metoxifenilil)fosfonato)metano

[0267] 6a: 1,1-bis(di-(3- metoxifenilil)fosfonato)metano

[0268] A uma solução resfriada por gelo de bis(diclorofosfonato)metano em diclorometano seco (50 ml) foi adicionado 3-metoxifenol (1,76 ml, 16 mmol). Uma solução de trietilamina (4,91 ml, 32 mmol) foi adicionada por um período de 1 h. A mistura de reação foi, então, agitada à temperatura ambiente por quatro horas onde foi derramada em água em gelo (150 ml) . O diclorometano foi adicionado e as fases foram separadas (lentamente) . A fase aquosa foi extraída uma vez mais com diclorometano e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio. Após a evaporação, o produto bruto foi purificado por cromatografia rápida em sílica (altura de coluna 10 cm, diâmetro 3 cm). O produto foi obtido como um óleo marrom claro e Espectroscopia de NMR indicou pureza alta. Produtividade 0,93 g.

[0269] 6b: 1,1-dialil-1,1-bis(di-(3- metoxifenilil)fosfonato)metano

[0270] Hidreto de sódio (0, 683 g 60% em óleo mineral, 17,1 mmol) foi suspenso em THF seco (150 ml) e resfriado para -30 °C. Uma solução de 1,1-bis(di-(3- metoxifenilil)fosfonato)metano (exemplo 4a, 2,92 g, 4,87 mmol) em THF seco foi adicionado por 30 minutos enquanto se manteve a temperatura em -30 °C. Brometo de alila (48,8 mmol, 4,21 ml) foi adicionado e a mistura de reação foi mantida a - 15 °C por uma hora, então, aquecida para 40 °C por 5 dias. Os conteúdos foram adicionados a 75 ml de cloreto de amônio aquoso saturado. Os voláteis foram evaporados em pressão reduzida e os sólidos foram titulados com diclorometano para extrair os orgânicos. Após a secagem sobre sulfato de sódio e evaporação do solvente, o produto bruto foi purificado por cromatografia rápida em sílica com heptano:acetato de etila 6:4 como o eluente. Produtividade 1,28 g.

[0271] 6c: 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1- bis(di-(3-metoxifenilil)- fosfonato) metano. CH3

[0272] A uma solução de 1,1-dialil-1,1-bis(di- (3-metoxifenilil)fosfonato)metano (Exemplo 4b) (0,794 g, 1,16 mmol) em tolueno seco (20 ml) foram adicionados 50 μl de uma solução de catalisador de Karstedt em tolueno (2% Pt) e trietoxisilano (1,16 mmol, 0,459 ml). A solução foi deixada à temperatura ambiente por 4 dias e a cada dia uma adição de ainda 0,7 g do silano e 25 μl do catalisador foi feita. Os voláteis foram removidos a vácuo e o silano residual foi removido por dois ciclos adicionais de adição de tolueno- vácuo. O resíduo foi absorvido em tolueno, tratado com uma pequena quantidade de carvão ativado, passado através de um filtro de PTFE de 5 μm e purificado por cromatografia rápida em uma coluna de sílica com acetato de etila:tolueno 1:1 como o eluente. Produtividade 150 mg.

[0273] Exemplo 7: Síntese de 1,1-bis(3- trimetoxisililpropil)-1,1-bis(di- ciclopropilmetil)fosfonato)metano.

[0274] 7a: 1,1-bis(di- ciclopropilmetil)fosfonato)metano

[0275] A uma solução resfriada por gelo de bis(diclorofosfonato)metano (1,00 g) em diclorometano seco (50 ml) foi adicionado ciclopropil metanol (1,15 g, 16 mmol). Uma solução de trietilamina (4,91 ml, 32 mmol) foi adicionada por um período de 1 h. A mistura de reação foi, então, agitada à temperatura ambiente por quatro horas onde foi derramada em água em gelo (150 ml). Diclorometano foi adicionado e as fases foram separadas (lentamente). A fase aquosa foi extraída uma vez mais com diclorometano e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio. Após a evaporação, o produto bruto foi purificado por cromatografia rápida em sílica (altura de coluna 10 cm, diâmetro 3 cm). O produto foi obtido como um óleo sem cor e a espectroscopia de NMR indicou pureza alta. Produtividade 1,04 g, 66 %.

[0276] 7b: 1,1-dialil-1,1-bis(di- (ciclopropilmetil)fosfonato)metano

[0277] A uma solução resfriada por gelo de 1,1- bis(di-ciclopropilmetil)fosfonato)metano (Exemplo 5a) (0,794 g, 1,16 mmol) em THF seco (20 ml) sob nitrogênio foi adicionado brometo de alila (0,864 ml, 10 mmol). Por um período de duas horas foi adicionado terc-butóxido de potássio (0,66 g). A solução foi agitada à temperatura ambiente por 4 h e, então, arrefecida através da adição de 3 ml de cloreto de amônio aquoso saturado. Os voláteis foram removidos a vácuo e os orgânicos foram dissolvidos com diclorometano. A cromatografia rápida em sílica em heptano:acetato de etila 3:7 gerou 0,4 de produto puro. 64%.

[0278] 7c: 1,1-bis(3-trietoxisililpropil)-1,1- bis(di-ciclopropilmetil)-fosfonato)metano

[0279] A uma solução de 1,1-dialil-1,1-bis(di- (ciclopropilmetil)fosfonato)metano (Exemplo 5b) (0,373 g, 0,76 mmol) em tolueno seco (20 ml) foram adicionados 30 μl de uma solução de catalisador de Karstedt em tolueno (2% Pt) e trietoxisilano (1,59 mmol, 0,299 ml). A solução foi deixada à temperatura ambiente por 4 dias e a cada dia uma adição de ainda 0,15 ml do silano e 15 μl do catalisador foi feita. Os voláteis foram removidos a vácuo e o silano residual foi removido por dois ciclos adicionais de adição de tolueno- vácuo. O resíduo foi absorvido em tolueno, tratado com uma pequena quantidade de carvão ativado, passado através de um filtro de PTFE 5 e purificado por cromatografia rápida em uma coluna de sílica com diclorometano + 5% metanol como o eluente. Produtividade 376 mg.

[0280] Exemplo 8: Síntese de uma nanoestrutura Y1 conjugada para N-(2-aminoetil)-16,16-di-2,5,8,11,14- pentaoxapentadecil-2,5,8,11,14,18-hexaoxaicosan-20-oico amida

[0281] Exemplo 8a: 3-(3-bromo-2,2- bis(bromometil)propoxi)prop-1-eno

[0282] Hidreto de sódio (1,67 g, 42 mmol) foi adicionado cuidadosamente a 3-bromo-2,2- bis(bromometil)propanol (9,75 g, 30 mmol) e brometo de alila (12,9 ml, 150 mmol) em DMF desgaseificado e seco (40 ml) sob nitrogênio a 0 °C. A temperatura foi, então, aumentada para temperatura ambiente (22 °C) e a mistura de reação foi agitada por outras 3h. A mistura de reação foi, então, cuidadosamente adicionada a um NH4Cl aquoso saturado (50 ml). A fase de H2O foi, então, extraída com éter dietílico (2 x 50 ml) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com H2O (5 x 50 ml) e, então, salmoura (50 ml). A fase orgânica foi seca com Na2SO4 seguida por filtração. Os materiais voláteis foram removidos em pressão reduzida para gerar um óleo amarelo claro (9,7 g) . A cromatografia de coluna em sílica (heptano:EtOAc 9:1) gerou 6,6 g (62%) do produto como um óleo claro. 1H-NMR (CDCI3); 5,93 (m, 1 H), 5,28 (m, 2H), 4,05 (d, 2H) , 3, 58 (s, 6H), 3,52 (5, 2H) .

[0283] Exemplo 8b: 16-(aliloximetil)-16- 2,5,8,11,14-pentaoxapentadecil-2,5,8, 11, 14, 18,21,24, 27,30- decaoxaentriacontano

[0284] Éter de tetraetilenoglicol monometila (1,91 ml, 9 mmol) dissolvido em DMF desgaseificado e seco (3,5 ml, seco por 24 h, 4A MS) foi adicionado cuidadosamente a hidreto de sódio (365 mg, 9 mmol) em DMF desgaseificado e seco (15 ml, seco por 24 h, 4A MS) sob nitrogênio a 0 °C com o uso de uma seringa. A temperatura foi, então, elevada para temperatura ambiente e a mistura de reação foi agitada por outros 30 min. 3-(3-bromo-2,2-bis(bromometil)propoxi)prop-1- eno (730 mg, 2,0 mmol) foi, então, adicionado e a temperatura foi elevada para 100 °C. Após 14 h, a reação foi concluída (HPLC-ELSD-C18, 95:5 a 5:95 H2O/ACN em 25 min., produto com tempo de reação = 19,5 min.), a temperatura foi diminuída para temperatura ambiente e a mistura de reação foi cuidadosamente adicionada a H2O (150 ml) e a fase de H2O foi lavada com éter dietílico (2 x 50 ml) . Cloreto de sódio foi, então, adicionado à fase de H2O até a saturação. A fase de H2O foi extraída com EtOAc (4 x 50 ml) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (2 x 30 ml). Sulfato de sódio e carvão ativado foram adicionados à fase orgânica. A fase orgânica clara foi filtrada e o material volátil foi removido em pressão reduzida (8 mm Hg, 40 °C, então, 0,1 mm Hg (bomba de óleo) e 40 °C para remover DMF residual) . A cromatografia de coluna (EtOAc:MeOH 9:1) gerou 1,05 g (70%) do produto. 1H-NMR (CDCI3); 5,90 (m, 1 H), 5,20 (m, 2H), 3,94 (dt, 2H), 3, 70-3, 55 (m, 48H), 3,45 (s, 6H), 3,43 (s, 2H), 3,40 (s, 9H).

[0285] Exemplo 8c: 16, 16-di-2,5,8,11,14- pentaoxapentadecil-2,5,8,11,14-penta-oxaheptadecan-17-ol(4)

[0286] Terc-butóxido de potássio (74 mg, 0,66 mmol) foi adicionado a 2 (500 mg, 0,66 mmol) em DMSO (3 ml). A mistura de reação foi agitada a 100 °C por 15 min. A análise de HPLC (HPLC-ELSD-C18, 95:5 a 5:95 H2O/ACN em 25 min.) indicou conversão completa para o produto. A salmoura (20 ml) foi adicionada à temperatura ambiente e a fase aquosa foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml) . As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (3 x 20 ml) e secas com sulfato de sódio. A filtração e a remoção de material volátil em pressão reduzida geraram 16-2,5,8,11,14- pentaoxapentadecil-16-((prop-1-eniloxi)metil)- 2,5,8,11,14,18,21,24,27,30-decaoxaentriacontano como um óleo claro. HCl (0,1 M) foi, então, adicionado ao óleo dissolvido em acetona (4 ml) e a mistura foi agitada a 55 °C por 30 min. O material volátil foi, então, removido em pressão reduzida, o que gerou 420 mg (89%) de 4 como um óleo claro. 1H-NMR (CDCI3); 3,66 a 3,52 (m, 48H), 3,47 (s, 6H), 3,37 (s, 9H).

[0287] Exemplo 8d: terc-butil 16,16-di- 2,5,8,11,14-pentaoxapentadecil- 2,5,8, 11, 14,18- hexaoxaicosan-20-oate (5)

[0288] Terc-butóxido de potássio (32 mg, 0,28 mmol) foi adicionado a 4 (100 mg, 0,14 mmol) e acetato de terc-butil-2-bromo (105 mg, 0,54 mmol) em THF seco (3 ml). A mistura de reação foi agitada por 30 min. Éter dietílico (10 ml e salmoura (5 ml) foram adicionados e a fase aquosa foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e, então, secas com sulfato de sódio. O material volátil foi removido em pressão reduzida e o produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna (acetato de etila/metanol 9:1), o que gerou 60 mg (52%) de 5. 1H-NMR (CDCI3); 3,91 (s, 2H), 3, 66-3, 52 (m, 48H), 3,51 (s, 2H), 3,45 (s, 6H), 3,37 (s, 9H), 1,46 (s, 9H).

[0289] Exemplo 8e: Ácido 16,16-di-2,5,8,11,14- pentaoxapentadecil-2,5,8,11,14,18-hexaoxaicosan-20-oico (6)

[0290] Ácido trifluoroacético (TFA, 0,5 ml) e diclorometano (0,5 ml) foram adicionados a 20 mg de 5. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 1 h e os materiais voláteis foram, então, removidos em pressão reduzida para gerar 18 mg de 6 como um óleo amarelo.

[0291] Exemplo 8f: N-(2-t- butoxicarbonilamidoetil)-16,16-di-2,5,8, 11, 14- pentaoxapentadecil-2,5,8,11,14,18-hexaoxaicosan-20-oicamida

[0292] Hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol 1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (95 mg, 0,25 mmol) foi adicionado a ácido 16,16-di-2,5,8,11,14-pentaoxa-pentadecil- 2,5,8,11,14,18-hexaoxaicosan-20-oico (Exemplo 8e) (153 mg, 0,2 mmol), N-BOC-etilenodiamina (40 mg, 0,25 mmol) e diisopropiletilamina (87 μl, 0,5 mmol) em DMF (1 ml, seco 4 A MS e desgaseificado) à temperatura ambiente sob nitrogênio. A mistura de reação foi agitada por 20 h. Éter dietílico foi adicionado à mistura de reação e a mistura foi extraída 3 vezes com H2O. As fases aquosas combinadas foram saturadas com NaCl (s) e, então, extraídas 4 vezes com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas com Na2SO4, filtradas e o solvente foi removido em pressão reduzida para gerar 190 mg (quantidade) do produto como um óleo amarelo claro. A análise de HPLC (HPLC-ELSD-C18, 90:10 a 5:95 TFA 0,1 % em H2O/ACN em 20 min.) exibiu um único pico a 14,5 min.

[0293] Exemplo 8g: N-(2-aminoetil)-16,16-di- 2,5,8,11,14-pentaoxapentadecil-2,5,8,11,14,18-hexaoxaicosan- 20-oico amida

[0294] TFA (2 ml) foi adicionado a N-(2-t- butoxicarbonilamidoetil)-16, 16-di-2, 5, 8, 11, 14- pentaoxapentadecil-2,5,8,11,14,18-hexaoxaicosan-20-oico amida (exemplo 8f, 160 mg, 0,18 mmol) em diclorometano (2 ml) . A mistura foi agitada por 1 h à temperatura ambiente. Os componentes voláteis foram removidos em pressão reduzida e o resíduo foi coevaporado duas vezes com tolueno seco (Al2O3) e, então, seco com o uso de uma bomba de óleo. Isso gerou 130 mg do produto. A análise de HPLC (HPLC-ELSD-C18, 90:10 a 5:95 TFA 0,1 % em H2O/MeCN em 20 min.) exibiu um pico único a 10,7 min. MS (ESP+) [M]: 807,5.

[0295] Exemplo 8h: Conjugação

[0296] A nanoestrutura X1 (exemplo 10c, 100 mg, 0,4 mmol P eq.) foi dissolvida em H2O (2 ml) por sonicação. O pH foi ajustado de 1,9 para 10.4 com o uso de 6 e 1 M NaOH (aquoso). Cloreto de manganês (12,5 mg, 0,065 mmol) dissolvido em H2O (2 ml) foi, então, adicionado. A mistura foi agitada por 30 min. a 30 °C. O pH foi ajustado de 8,5 para 7,1 com o uso de 0,1 HCl (aquoso) e o material do exemplo 8g (37 mg, 0,04 mmol) e sal de N- hidroxisulfosuccinimida de sódio (9 mg, 0,04 mmol) foram adicionados e dissolvidos em H2O (2 ml) . Hidrocloreto de N- (3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodi-imida (24 mg, 0,12 mmol) foi, então, adicionado. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 21 h. e, então, filtrada (filtro de tubo 5 μm) . O filtrado foi filtrado por rotação (10k de corte, 3.000 G por 30 min.) e o concentrado (4 ml) foi diluído para 15 ml com o uso de H2O. Esse procedimento foi repetido 4 vezes. O pH do concentrado (4 ml) foi ajustado de 4,7 para 7,1 com o uso de 0,1 M de NaOH (aquoso). O filtrado foi filtrado por rotação (10k de corte, 3.000 G por 15 min.) e o concentrado (0,5 ml) foi diluído para 4 ml com o uso de H2O. Esse procedimento foi repetido 4 vezes. O concentrado final foi filtrado (filtro de seringa 0,2 μm) e diluído para 2 ml com o uso de H2O. Distribuição de volume de tamanho de partícula = 4 a 5 nm. Análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,3 min.

[0297] Exemplo 9: Síntese de Polietilenoimina- bisfosfonato nanoestrutura Z.

[0298] Exemplo 9a: Éster de t-butila de ácido 3,3-bis(dimetoxifosforil)propanoico

[0299] A uma solução resfriada por gelo de bis(dimetoxifosforil)metano (4,64 g, 20 mmol) e bromoacetato de terc-butila (7,35 ml, 50 mmol) em THF seco (40 ml) sob nitrogênio foi adicionado terc-butóxido de potássio (5,8 g, 43 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, então, arrefecida com 4 ml de cloreto de amônio saturado. Os voláteis foram removidos a vácuo e por dois ciclos de adição de tolueno e evaporação. A cromatografia rápida em diclorometano:metanol, 95:5 gerou o produto como um óleo. Produtividade 4,0 g.

[0300] Exemplo 9b: Ácido 3,3- Bis(dimetoxifosforil)propanoico

[0301] A uma solução de éster de t-butila de ácido 3,3-bis(dimetoxifosforil)propanoico (2,5 g) em diclorometano (10 ml) foi adicionado ácido trifluoroacético. A agitação à temperatura ambiente foi seguida pela evaporação dos voláteis a vácuo. Três ciclos de evaporação a vácuo de porções de 5 ml de tolueno geraram 2,2 g de produto.

[0302] Exemplo 9c: Síntese de nanoestrutura de polietilenoimina-bisfosfonato Z

[0303] A polietilenoimina ramificada com um peso molecular médio de 25 kDa (100 mg, 2,5 mmol de grupos amino primários), ácido 3,3-bis(dimetoxifosforil)propanoico (1,1 g, 3,87mmol) e sal de N-hidroxisulfosuccinimida de sódio (100 mg, 0,46 mmol) foram dissolvidos em H2O (10 ml) por sonicação (10 min.). O pH foi ajustado de 1,8 para 6,5 com o uso de 1 M de NaOH onde hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N’- etilcarbodi-imida (1,0 g, 5,2 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 23 h e, então, filtrada (filtro de seringa de 5 μm) . O filtrado foi filtrado por rotação (10k de corte, 3.000G por 30 min.) e o retentado (2 ml) foi diluído para 10 ml com o uso de H2O. Esse procedimento foi repetido 4 vezes. O retentado final (2 ml) foi diluído para 6 ml com o uso de H2O. Distribuição de tamanho de partícula de média volumétrica de acordo com DLS: 4 a 5 nm. Análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 9,1 min.

[0304] Exemplo 10: Polimerização de 1,1- bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano para produzir nanoestruturas X

[0305] 1,1-Bis(trietoxisililpropil)-1, 1- bis(dimetilfosfonato)metano (x g, y mmol, vide Tabela 1 abaixo) foi dissolvido em 200 ml de 1-propanol aquoso a 80% em um vaso de pressão. A mistura de reação foi agitada por 48 h a 95 °C e, então, por 24 h a 110 °C. Após permitir que a solução clara resfriasse para temperatura ambiente, a mesma foi diluída com H2O MilliQ (800 ml) e, então, diafiltrada com o uso de coluna de tamanho de poro de (NMWC) de Corte de Peso Molecular Nominal de 300 k (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-300-C-3MA). Os permeados coletados (~980 ml) foram, então, coletados em uma coluna de diafiltro com um tamanho de poro de 100k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-100-C-3MA) para concentrar a solução de nanoestrutura. Alternativamente, os filtros da Pall Life Sciences também foram usados, especificamente cassetes Centramate T-Series OS0100T02 (cassetes com tamanho de poro de 100 k NMWC) . A adição repetida de água MilliQ e a filtração do retentado coletado foram feitas. O volume final do retentado (X1) coletado foi cerca de 50 ml.

[0306] Adicionalmente, o permeado que passou através da coluna de diafiltro de 100 k foi coletado e, então, filtrado com o uso de um cartucho de filtro com tamanho de poro de 30 k NMWC (cartucho de ultraf iltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-30-C-3MA). A adição repetida (2x) de água MilliQ e a filtração do retentado coletado foram feitas. O volume final do retentado (X2) coletado foi cerca de 50 ml.

[0307] Exemplo 10a: Polimerização de 100 mM de 1,1-bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano

[0308] X1a. Quantidades: x = 12,8 g, y = 20 mmol. Recuperação após diafiltração = 26% (com base em recuperação P); pH final ~2; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 9,2 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Si = 0,9.

[0309] X2a. Quantidades: x = 12,8 g, y = 20 mmol. Recuperação após diafiltração = 17% (com base em recuperação P); pH final ~2; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,3 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Si = 0,9.

[0310] Exemplo 10b: Polimerização de 80 mM de 1,1-bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano

[0311] X1b. Quantidades: x = 10,4 g, y = 16 mmol. Recuperação após diafiltração = 31 % (com base em recuperação P); pH final ~2; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 9,2 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Si =1,1.

[0312] X2b. Quantidades: x = 10,4 g, y = 16 mmol. Recuperação após diafiltração = 19% (com base em recuperação P); pH final ~2; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,4 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Si = 1,1.

[0313] Exemplo 10c: Polimerização de 50 mM de 1,1-bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano

[0314] X1c. Quantidades: x = 6,4 g, y = 10 mmol. Recuperação após diafiltração = 21 % (com base em recuperação P); pH final ~2; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 9,7 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Si =0,9.

[0315] X2c. Quantidades: x = 6,4 g, y = 10 mmol. Recuperação após diafiltração = 25% (com base em recuperação P); pH final ~2; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,5 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Si = 0,9;

[0316] Exemplo 10d: Polimerização de 1,1- bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato) metano para produzir nanoestruturas X em diferentes solventes

[0317] 1,1-Bis(trietoxisililpropil)-1, 1- bis(dimetilfosfonato)metano (3,2 g, 5 mmol) foi dissolvido em etileno glicol aquoso a 80% (100 ml). A mistura de reação foi agitada por 21 h a 116 °C. A polimerização também pode ser usada conforme supracitado, mas em 1,2-propanodiol a 80% aquoso agitada por 24 h a 111 °C e, então, por 4 h a 114 °C ou em dietileno glicol a 80% aquoso agitada por 20 h a 108 °C e, então, por 2 h a 114 °C ou em trietileno glicol a 80% aquoso agitada por 22 h a 115 °C ou em éter de di(etileno glicol)metila a 80% aquoso agitada por 18 h a 106 °C e, então, por 18 h a 111 °C ou em éter de dietileno glicol monoetil a 80% aquoso agitada por 35 h a 107 °C ou em glicerol a 80% aquoso agitada por 19 h a 114 °C.

[0318] Exemplo 10e: Sequestro de Pt de 1,1- bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano

[0319] SIR-200 (100 g, resina quelante, tiol, forma H) fornecido pela Resintech foi agitado por duas vezes com solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5% (500 ml) e, então, agitado duas vezes com água MilliQ. A água foi filtrada e o tolueno seco (100 ml) foi adicionado a SIR-200. Os voláteis foram removidos a vácuo e a água residual foi removida por dois ciclos adicionais de adição-de-tolueno- vácuo. 1,1-Bis(trietoxisililpropil)-1,1- bis(dimetilfosfonato)metano (30 g, teor de platina: 39 ppm) foi dissolvido em tolueno seco (300 ml) em um vaso. SIR-200 (10 g, tratado conforme supracitado) foi adicionado e, então, agitado de um dia para o outro. SIR-200 foi filtrado e os voláteis foram removidos a vácuo para produzir um material com um teor de platina de 0,38 ppm.

[0320] Exemplo 11. Carregamento de manganês de nanoestrutura X e purificação por filtração de fluxo tangencial para produzir nanoestruturas Y.

[0321] O pH de uma solução de nanoestrutura X (Exemplo 13) foi ajustado de pH 2 para pH 10,4 com o uso de 6 M e 1 M de NaOH (aquoso) e deixado permanecer por 2 h. O tetraidrato de cloreto de manganês (II) (xx mg, yy mmol) foi, então, adicionado e dissolvido. A mistura foi agitada por 1 h a 30 °C. O pH da mistura após a reação foi cerca de pH 7,6 e adicionalmente ajustado para pH 7,4 com o uso de 1 M de HCl (aquoso) . A mistura reagida foi diluída para 50 ml com H2O MilliQ e, então, submetida à diafiltração com o uso de coluna de tamanho de poro 10 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Healthcare modelo: UFP-10-C-3MA) para remover os íons de Mn livres. Alternativamente, o filtro da Pall Life Sciences também é usado, especificamente, os cassetes Centramate T-Series OS010T02 (cassete de tamanho de poro 10 k NMWC). O retentado foi coletado e os procedimentos de diluição e diafiltração foram feitos repetidamente por três vezes.

[0322] Y1a. Nanoestrutura X usada: Exemplo X1 a, 15 ml, 3,2 mmol P. MnCl2 4H2O usado: xx = 106,7 mg, yy - 0,54 mmol. pH final 7,4; tamanho de partícula volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 5,6 nm; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 9,5 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 5,7, P/Si = 0,9, Si/Mn = 6,2; estabilidade de troca de íon com pH 5,5 = 45% e com pH 7 = 62%.

[0323] Y1b. Nanoestrutura X usada: Exemplo X1 a, 15 ml, 3,2 mmol P. MnCl2 4H2O usado: xx =107 mg, yy = 0,54 mmol. pH final 7,4; tamanho de partícula volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 6,5 nm; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,1 min. e suporte em 9 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 5,4, P/Si = 0,9, Si/Mn = 6; estabilidade de troca de íon com pH 5,5 = 47% e com pH 7 = 66%.

[0324] Y2a. Nanoestrutura X usada: Exemplo X2a, 15 ml, 2 mmol P. MnCl2 4H2O usado: xx =71 mg, yy = 0,36 mmol. pH final 7,4; tamanho de partícula volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 4,1 nm; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,5 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 6,6, P/Si = 0,9, Si/Mn = 7,3; estabilidade de troca de íon com pH 5,5 = 43% e com pH 7 = 60%; r1 em 81,33 MHz, 25°C = 41 mM-1 Mn s-1.

[0325] Y2b. Nanoestrutura X usada: Exemplo X2a, 15 ml, 2mmol P. MnCl2 4H2O usado: xx =71 mg, yy = 0,36 mmol. pH final 7,4; tamanho de partícula volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 5,6 nm; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,1 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 5,6, P/Si = 0,9, Si/Mn = 6,2; estabilidade de troca de íon com pH 5,5 = 44% e com pH 7 = 63%.

[0326] Exemplo 11a: Polimerização de 1,1- bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano para produzir nanoestruturas X

[0327] 11a':

[0328] 1,1-Bis(trietoxisililpropil)-1, 1- bis(dimetilfosfonato)metano (0,64 g, 1 mmol) foi dissolvido em etileno glicol aquoso a 80% (12 ml) . Formato de sódio faixa de 28 mg (0,42 mmol) ou 140 mg (2,1 mmol) e tetraidrato de cloreto de manganês (II) (33 mg, 0,17 mmol) foram dissolvidos em etileno glicol aquoso a 80% (4 ml) e subsequentemente adicionados à mistura de reação que foi agitada por 22 h a 114 °C.

[0329] 11a":

[0330] 1,1-Bis(trietoxisililpropil)-1, 1- bis(dimetilfosfonato)metano (0,64 g, 1 mmol) foi dissolvido em etileno glicol aquoso a 80% (12 ml) . Formato de potássio (52 mg, 0,62 mmol) e tetraidrato de cloreto de manganês (II) (33 mg, 0,17 mmol) foram dissolvidos em etileno glicol aquoso a 80% (4 ml) e subsequentemente adicionados à mistura de reação que foi agitada por 21 h a 116 °C.

[0331] 11a'":

[0332] 1,1-Bis(trietoxisililpropil)-1, 1- bis(dimetilfosfonato)metano (0,64 g, 1 mmol) foi dissolvido em etileno glicol aquoso a 80% (16 ml) . Formato de tetrametilamônio (30% em peso de solução em água, 0, 245 ml, 0,62 mmol) e tetraidrato de cloreto de manganês (II) (33 mg, 0,17 mmol) dissolvidos em etileno glicol aquoso a 80% (4 ml) foram subsequentemente adicionados à mistura de reação que foi agitada por 21 h a 116 °C.

[0333] Exemplo 11b. Carregamento de manganês de Nanoestrutura X, “endurecimento” com adição de Silanos e Purificação por diafiltração para produzir nanoestruturas Z

[0334] A uma solução de 2 ml de nanoestrutura X (Exemplo 10f) foi adicionado um x ml de tetraidrato de cloreto de manganês (II) desgaseificado (dissolvido em etileno glicol aquoso a 80%; 100 mM) satisfazendo a razão molar de fósforo-manganês de 12. Y ml de formato de sódio desgaseificado (100 mM) dissolvido em etileno glicol aquoso a 80% é adicionado à solução de nanoestrutura carregada com Mn satisfazendo a razão molar de formato de sódio-manganês de 5 ou 3. O pH final é verificado e ajustado para cerca de pH 5 ou 3, se necessário, através da adição de NaOH (aquoso) ou HCl (aquoso). A mistura foi agitada por 12 ou 18 h a 100 °C. A adição de z ml de ortossilicato de tetraetila (TEOS) dissolvido em etanol (120 mM) é adicionada à mistura e agitada adicionalmente por 18 ou 24h a 100 °C. (Uma alternativa para a pós-adição de TEOS após a primeira etapa de aquecimento é a incorporação de solução de TEOS diretamente na solução de nanoestrutura carregada com Mn que contém formato de sódio e agitação por 12 ou 18 h a 100 °C.)

[0335] Após o aquecimento e a agitação, o pH foi ajustado para pH 7,0 ± 0,5 através da adição de NaOH (aquoso) , seguido pela ultrafiltração (UF) com o uso de um filtro centrífugo com 100 kDa de 4 ml (Centriprep® da Millipore). A solução foi primeiro diluída com Milli-Q para cerca de 4 ml e girada por 10 a 15 min. (3.000 x g). O filtrado foi coletado e transferido para um filtro centrífugo com 10 kDa de 4 ml (Centriprep® da Millipore) , diluído para até 4 ml com água Milli-Q, misturado completamente e filtrado por rotação (3.000 x g, 10 min.), posteriormente, cerca de 500 μl de retentado foram coletados. O procedimento de diluição e diafiltração foi repetido três vezes. Os 500 μl finais coletados de retentado foram diluídos para 1 ml com água MilliQ. Isso foi seguido de determinação da concentração de Mn, teste de estabilidade compleximétrica avaliado por relaxometria (Exemplo 14b), análise GPC e análise de composição (medição de ICP).

[0336] Z1a. 3% de TEOS relativo a bisbis. Nanoestrutura X usada: 2 ml, 0,2 mmol P; x = 167 μl; razão de formato de Na-Mn: 5; y = 835 μl; z = 25 μl pH final antes do aquecimento: pH 5 ; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 12,6 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 11,61, P/Si = 1,01, Si/Mn = 10,51 ; Estabilidade compleximétrica com pH 7 = 24%

[0337] Z1b. 5% de TEOS relativo a bisbis. Nanoestrutura X usada: 2 ml, 0,2 mmol P; x = 167 μl; razão de formato de Na-Mn: 5; y = 835 μl; z = 41,7 μl pH final antes do aquecimento: pH 5 ; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 12,6 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 12,05, P/Si = 1,02, Si/Mn = 11,77; Estabilidade compleximétrica com pH 7 = 23%

[0338] Z1c. 3% de TEOS relativo a bisbis. Nanoestrutura X usada: 2 ml, 0,2 mmol P; x = 167 μl; razão de formato de Na-Mn: 5; y = 835 μl; z = 25 μl pH final antes do aquecimento: pH 3,5 ; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 12,6 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 13,03, P/Si = 0,93, Si/Mn = 13,96; Estabilidade compleximétrica com pH 7 = 27%

[0339] Z1d. 5% de TEOS relativo a Bisbis. Nanoestrutura X usada: PL04064, 2 ml, 0,2 mmol P; x = 167 μl; razão de formato de Na-Mn: 5; y = 835 μl; z = 41,7 μl pH final antes do aquecimento: pH 3,5 ; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 12,6 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 13,31, P/Si = 0,92, Si/Mn = 14,53; Estabilidade compleximétrica com pH 7 = 26%.

[0340] Tabela 1: Mais exemplos de nanoestruturas carregadas com Mn Y:

[0341] Exemplo 12. Nanoestrutura carregada com Mn formulada e seca por congelamento

[0342] 1,1-Bis(trietoxisililpropil)-1, 1- bis(dimetilfosfonato)metano (6,4 g, 0,01 mmol) foi dissolvido em 200 ml de 1-propanol aquoso a 80% em um vaso de pressão. A mistura de reação foi agitada por 48 h a 95°C e, então, 24 h a 110 °C. A temperatura foi diminuída para temperatura ambiente e a solução clara e sem cor foi coletada. A solução coletada foi diluída com H2O MilliQ (800 ml) e, então, filtrada com o uso de coluna de tamanho de poro 300 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Healthcare modelo: UFP-300-C-3MA). Os permeados coletados (~980 ml) foram, então, filtrados com o uso de uma coluna de diafiltro de tamanho de poro 100 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-100-C- 3MA) para concentrar a solução de polímero. A adição repetida de água MilliQ e a filtração do retentado coletado foram feitas. O volume final do retentado coletado foi cerca de 50 ml. Composição (ICP, razão molar): P/Si = 0,84.

[0343] Adicionalmente, o permeado que passa através da coluna de diafiltro de 100 k foi coletado e, então, filtrado com o uso de uma coluna de diafiltro de tamanho de poro 30 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-30-C-3MA). A adição repetida (2 x) de água MilliQ e a filtração do retentado coletado foram feitas. O volume final do retentado coletado foi cerca de 50 ml. Composição (ICP, razão molar): P/Si = 0,88.

[0344] O pH da nanoestrutura que passa através de diafiltração de 100 k (25 ml, 2,1 mmol) foi ajustado de pH 2,2 para pH 10,5 com o uso de 6 M e 1 M de NaOH (aquoso) e foi permitida a permanência por 2h. O tetraidrato de cloreto de manganês (II) (45,4 mg, 0,23 mmol) foi, então, adicionado. A mistura foi agitada por 16 h a 30 °C. O pH da mistura após a reação foi 9,3, e, então, ajustado para pH 7,4 com o uso de 1 M de HCl (aquoso). A mistura foi diluída para 50 ml com H2O MilliQ e, então, submetida à diafiltração com o uso de coluna de tamanho de poro 10 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-10-C-3MA). O retentado foi coletado e o procedimento de diluição e diafiltração foi repetido por três vezes. A O volume de solução final coletada foi 10 ml.

[0345] A 8,1 ml da solução coletada, manitol (0,36 g, 2,0 mmol) foi adicionado para alcançar uma concentração de 250 mM. Isso foi seguido por congelamento a seco por 16 h, coleta de 0,5 g de pó branco macio. Uma solução aquosa de 20 mg/ml do material seco por congelamento foi preparada e analisada. Tamanho de partícula, volume ponderado (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 4,8m nm; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.) tempo de reação = 10,3 min.; Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 9,8, P/Si = 0,9, Si/Mn = 10,7; estabilidade de troca de íon com pH 5,5 = 72% e com pH 7 = 89%; n a 60 MHz, 37°C = 39 mM-1 Mn s-1.

[0346] Exemplo 13. Purificação adicional de nanoestrutura de Y com o uso de resina de troca de íon

[0347] Para remover adicionalmente o excesso ou os íons de Mn deficientemente ligados, a amostra Y1 foi tratada com um trocador de cátion (poliestireno sulfonado): ~10 ml de uma nanoestrutura carregada com Mn (~ 10 mM de Mn) foi misturada com 1 g de Dowex 50WX4 (forma de Na, pré- enxaguado com água) e o pH foi ajustado para 7,0 com 0,1 M de NaOH. A mistura foi moderadamente girada por 16 h e, então, centrifugada a 3.000 rpm.

[0348] Exemplo 14. Medição de estabilidade para nanoestruturas que contêm manganês (também chamada de "estabilidade de troca de íon").

[0349] Primeiro, a concentração de manganês da solução de nanoestrutura foi determinada e, então, diluída com água para uma concentração de manganês de 1,5 mM e para um volume final de 2,2 ml. A 2 x 1, 000 ml da solução de amostra diluída foram adicionados 2 x 100 mg de Dowex 50WX4 (forma de Na, pré-enxaguado com água). O pH foi ajustado para 7,0 e 5,5 nas duas soluções respectivamente com 0,1 M de NaOH ou 0,1 M de HCl (usualmente apenas poucos microlitros são necessários). A mistura foi bem misturada por 16 h através da rotação lenta do frasco. Permitiu-se que as partículas de IEX se assentassem e uma cota de 100 μl do sobrenadante retirada foi analisada ( [Mn] IEX) . Para a determinação da concentração inicial de manganês na amostra, a solução remanescente acima foi usada para determinar [Mn]start. A estabilidade foi calculada como : [Mn] IEX/ [Mn] start* 100 (%)

[0350] Exemplo 14b. Teste de estabilidade compleximétrica para nanoestruturas que contêm manganês avaliada por relaxometria

[0351] Medir a capacidade de relaxamento longitudinal de uma solução de nanoestrutura (ri(ns)) que tem uma concentração de 1 mM de Mn. Preparar uma outra solução de nanoestrutura que contém 1 mM de Mn e adicionar uma quantidade molar equivalente de EDTA. O pH dessa solução precisa ser ajustado para pH 7±0,5, caso seja necessário. Medir a capacidade de relaxamento longitudinal dessa solução de nanoestrutura com EDTA adicionado (r1(ns)+EDTA). Como um material de referência, 1 mM de solução com o uso de um Padrão de Manganês para AAS (Fluka 77036) é preparado, adicionado uma quantidade equimolar de EDTA e pH ajustado para pH 7±0,5. A capacidade de relaxamento longitudinal é medida (r1<Mn>+EDTA) e resultou em um valor de 1,6 mM-1s-1. Para calcular o % de Mn liberado da nanoestrutura após a adição de EDTA equivalente:

[0352] Nota: Relaxamento (T1, em segundos) é medido com o uso do analisador de NMR Minispec mq60 (60 MHz) a 37 °C e capacidade de relaxamento n é calculada com o uso de:

[0353] onde T1 H2O = 0,32 s; C1 = 1 mM.

[0354] Exemplo 15. Transmetalação com cálcio e manganês.

[0355] Um tampão que imita grosseiramente os componentes inorgânicos de sangue, mas sem cálcio foi misturado a partir de NaCl (7,14 g), NaHCO3 (1,4 g), KHCO3 (0,43 g), NaH2PO4 (0,165 g), Mg(OAc)2 (0,17 g), diluído para 1,00 l de volume. Doravante designado como "tampão sanguíneo". Duas amostras de nanoestruturas foram testadas A, (Y1, cortada entre filtros de 300 kDa e 100 kDa) e B (Y2, cortada entre filtros de 100 kDa e 30 kDa). Os tubos de teste foram preparado de acordo com:

[0356] Amostra 1: 900 μl de água 100 μl de amostra A

[0357] Amostra 2 : 900 μl de água 100 μl de amostra B

[0358] Amostra 3: 900 μl de tampão sanguíneo 100 μl de amostra A

[0359] Amostra 4 : 900 μl de tampão sanguíneo 100 μl de amostra B

[0360] Amostra 5: 900 μl de tampão sanguíneo + 1,3 mM de CaCl2 100 μl de amostra A

[0361] Amostra 6: 900 μl de tampão sanguíneo + 1,3 mM de CaCl2 100 μl de amostra B

[0362] As amostras misturadas com A analisadas em relação a uma concentração de Mn total de 1,3 mM e as de B 1,5 mM. As soluções foram incubadas à temperatura ambiente por uma hora e subsequentemente passadas através de um filtro de rotação com corte de 10 kDa. Os filtrados foram analisados em relação a manganês. Os resultados são mostrados na Tabela 2 .

[0363] Tabela 2:

[0364] Exemplo 16. Polímero de dimetil-2- (trietoxisilil)etilfosfonato carregado com Mn.

[0365] Dimetil-2-(trietoxisilil)etilfosfonato (DTEP, 0,9 g, 3,0 mmol) foi dissolvido em 30 ml de 1-propanol aquoso a 80% em um vaso de pressão. A mistura de reação foi agitada por 48 h a 95 °C e, então, por 24 h a 120 °C. A temperatura foi diminuída para temperatura ambiente e a solução clara e sem cor foi coletada. A solução coletada foi diluída com H2O MilliQ (470 ml) e, então, filtrada com o uso de coluna de tamanho de poro de 100 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Healthcare modelo: UFP-100-C- 3MA). Os permeados coletados (480 ml) foram, então, filtrados com o uso de uma coluna de diafiltro de tamanho de poro 30 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-30-C-3MA) para concentrar a solução de polímero. A adição repetida de água MilliQ e a filtração do retentado coletado foram feitas. O volume final do retentado coletado foi cerca de 7,5 ml. Composição (ICP, razão molar) : P/Si = 0,5 .

[0366] O pH de 7,5 ml de solução de polímero de DTEP (0,4 mmol de P) foi ajustado de pH 2,6 para pH 10,4 com o uso de 6 M e 1 M de NaOH (aquoso) e permitiu-se a permanência por 2h. Tetraidrato de cloreto de manganês (II) (5,9 mg, 0,3 mmol) foi, então, adicionado. A mistura foi agitada por 1 h a 30 °C. O pH da mistura após a reação foi em torno de pH 9,4, e, então, ajustado para pH 7,4 com o uso de 1 M de HCl (aquoso). A mistura reagida foi diluída para 50 ml com H2O MilliQ e, então, submetida à diafiltração com o uso de coluna de tamanho de poro de 10 k NMWC (cartucho de ultrafiltração Midgee da GE Heathcare modelo: UFP-10-C-3MA) para remover os íons de Mn livres. O retentado foi coletado e o procedimento de diluição e diafiltração foi repetido por três vezes. Tamanho de partícula de volume ponderado (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 5,6 nm; análise GPC (Superose 12 10/300 GL, 100 mM de NH4CO3, pH = 7,4, fluxo 1 ml/min.); Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 2,7, P/Si = 0,5, Si/Mn = 5,7; estabilidade de troca de íon com pH 5,5 = 21 % e com pH 7 = 24%; n a 81,3 MHz, 25°C = 3 mM-1 Mn s-1

[0367] Exemplo 17. Ácido zoledrônico carregado com Mn.

[0368] Ácido zoledrônico (27 mg, 0,01 mmol) foi dissolvido em 10 ml de H2O MilliQ. 100 mM de solução aquosa de tetraidrato de cloreto de manganês (II) foram preparados. 10 μl de solução de Mn foram misturados com 408 μl da solução de ácido zoledrônico e 582 μl de H2O MilliQ. O pH foi ajustado para 7,4 com o uso de 6 M de NaOH (aquoso) . Composição (ICP, razão molar) : P/Mn = 5,26. n a 81,3 MHz, 2 5°C = 2,3 mM-1 Mn s-1

[0369] Exemplo 18. Ácido metilenodifosfônico carregado com Mn.

[0370] Ácido metilenodifosfônico (9,2 mg, 0,05 mmol) foi dissolvido em 5 ml de H2O MilliQ. 28 mM de solução aquosa de tetraidrato de cloreto de manganês (II) foram preparados. 35 μl de solução de Mn são misturados com 286 μl da solução de ácido metilenodifosfônico e 679 μl de H2O MilliQ. O pH foi ajustado para 7,1 com o uso de 6 M de NaOH (aquoso). Composição (ICP, razão molar): P/Mn = 4,6. n a 81,3 MHz, 25°C = 1 mM-1 Mn s-1.

[0371] Exemplo 19. Outros íons metálicos carregados na nanoestrutura X.

[0372] O pH da nanoestrutura X2a foi ajustado de 2 para 10,4 com o uso de 6 M e 1 M de NaOH (aquoso) e foi permitida a permanência por 2 h. Os sais metálicos (xx mg, yy mmol, vide Tabela 3 abaixo) tal como hidrato de cloreto de Fe (II), hidrato de cloreto de Fe (III), hidrato de cloreto de Er (II) ou hidrato de cloreto de Dy (III) foram, então, adicionados. A mistura foi agitada por 1 h a 30 °C. O pH da mistura após a reação variou de 4,7 para 7,2 para diferentes amostras e foi, então, ajustado para pH 7,4 com o uso de 1 M de HCl (aquoso) . A mistura foi filtrada por rotação (10k MWCO, 3000 x g por 15 min.) e o concentrado (0,5 ml) foi diluído para 4 ml com o uso de H2O MilliQ. Esse procedimento foi repetido 4 vezes. O concentrado final foi diluído para 4 ml com o uso de H2O MilliQ.

[0373] a: Precursor X2a, 4 ml, 0,11 mmol P. FeCl2 4H2O usado: xx = 7,2 mg, yy = 0,04 mmol. pH final 7,4; tamanho de partícula volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 8,7 nm; Composição (ICP, razão molar): P/Fe = 4,2, P/Si = 0,9, Si/Fe = 4,5; n a 81,33 MHz, 25°C = 3,1 mM-1 Fe s- 1 .

[0374] b: Precursor X2a, 4 ml, 0,11 mmol P. FeCl3 6H2O usado: xx = 9 mg, yy = 0,03 mmol. pH final 7,4; Tamanho de partícula ponderado volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 8,7 nm; Composição (ICP, razão molar) : P/Fe = 6,5, P/Si = 0,9, Si/Fe = 7,2; n a 81,33 MHz, 25°C = 8,5 mM-1 Fe s-1.

[0375] c: Precursor X2a, 4 ml, 0,11 mmol P. ErCl3 6H2O usado: xx = 12,7 mg, yy = 0,03 mmol. pH final 7,4; Tamanho de partícula ponderado volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 50 nm; Composição (ICP, razão molar) : P/Er = 5,3, P/Si = 0,9, Si/Er = 5,7; n a 81,33 MHz, 25°C = 0,4 mM-1 Er s-1.

[0376] d: Precursor X2a, 4 ml, 0,11 mmol P. DyCl3 6H2O usado: xx = 13,6 mg, yy = 0,04 mmol. pH final 7,4; Tamanho de partícula ponderado volumétrico (DLS em 150 mM de NaCl) máximo = 10,1 nm; Composição (ICP, razão molar): P/Dy = 4,4, P/Si = 0,9, Si/Dy = 4,7; n a 81,33 MHz, 25°C = 0,6 mM-1 Dy s-1.

[0377] Exemplo 20. Capacidade de relaxamento para materiais carregados com Mn

[0378] A capacidade de relaxamento para alguns materiais carregados com Mn é mostrada na Tabela 3.

[0379] Tabela 3:

[0380] Exemplo 21: Formação de imagem in vivo

[0381] A qualidade e o contraste da imagem de MR foram investigados in vivo em camundongos que portam o linfoma de camundongos EL-4 com crescimento agressivo. A linhagem celular de linfoma de murina EL-4 foi estabelecida a partir de um linfoma induzido em camundongo C57BL/6. As células de linfoblasto crescem prontamente em suspensão in vitro e como aloenxertos em camundongos C57BL/6.

[0382] As células EL-4 (ECACC 85023105) foram usadas para desenvolver tumores aloenxertados em camundongos C57BL/6. Uma suspensão celular foi injetada subcutaneamente e os tumores desenvolvidos por alguns dias. Entre 6 e 10 dias após a injeção, os tumores foram usados para formação de imagem.

[0383] O protocolo de MR foi otimizado e testado em dois animais. As imagens de MR foram adquiridas em 7 animais portadores do tumor EL-4; 4 camundongos receberam 3mM/175 μl de Y2, 3 camundongos receberam 17 mM/175 μl de Magnevist, ambos injetados durante um período de 6 segundos

[0384] Uma imagem GE com peso T1 foi adquirida. O camundongo foi removido do ímã e o cateter que contém o agente de contraste foi conectado. Um ponto crítico foi, então, injetar o agente de contraste rapidamente, para evitar a difusão no animal através do cateter. As imagens com peso T1 de pré-contraste foram adquiridas e imediatamente após isso, o agente de contraste foi injetado, enquanto imagens rápidas dinâmicas foram adquiridas continuamente (2 pré- injeção, 14 pós-injeção, 8 segundos por imagem).

[0385] Nos experimentos identificados como A, B, E (vide abaixo), 10 lâminas com um campo de visão de 50x50 mm foram adquiridas após a injeção de Y2 ou Magnevist. As imagens adquiridas com 8 lâminas, um campo de visão de 50x50 mm, tamanho de matriz 2 5 6x256 e um tempo de varredura total de um pouco mais de 10 minutos por conjunto de dados. As imagens pós-contraste foram adquiridas a cada 15 minutos. A partir de todos os conjuntos de dados adquiridos após a injeção do agente de contraste, 1 lâmina de 10 foi escolhida para ser representativa da intensificação, vide Figura 2.

[0386] Exemplo 22: Síntese de nanoestruturas à base de polietilenoimina com um 1,3-bisfosfonato carregado com manganês

[0387] 22a: Ácido propileno-1,3-difosfônico

[0388] Brometo de trimetil silil (16,84 ml, 25,3 mmol) e tetraetilpropileno-1,3-difosfonato (10,08 g, 31,6 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de diclorometano resfriado por gelo. Após 10 min., o banho de resfriamento foi removido e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 16 horas. Os voláteis foram removidos em um evaporador giratório. Ao resíduo, 50 ml de água foram adicionado com agitação e resfriamento por gelo. Após 20 minutos, a água foi removida em um evaporador giratório e a umidade residual foi removida primeiro por dois ciclos de adição de tolueno-evaporação e, então, vácuo de bomba de óleo de um dia para o outro. 1H-NMR mostrou que os grupos etila evadiram e os grupos metileno ainda estavam presentes.

[0389] 22b: Tetrametilpropileno-1,3-difosfonato

[0390] Ácido propileno-1,3-difosfônico (600 mg) foi suspenso em ortoformato de trimetila (20 ml) e refluxado por 6 h onde 10 ml do líquido foram removidos por destilação e o restante deixado de um dia para o outro. Os voláteis foram removidos a vácuo para produzir o produto como um óleo.

[0391] 22c: 1-t-Butoxicarbonilmetil,-O,O,O,O- tetrametilpropileno-1,3-difosfonato

[0392] Tetrametilpropileno-1,3-difosfonato (206 mg, 0,79 mmol) foi dissolvido em THF seco (5 ml) sob atmosfera de nitrogênio e a solução foi resfriada em um banho de acetona-gelo seco. t-BuLi (2,17 M em heptano, 1,66 mmol) foi injetado por seringa e após 10 minutos bromoacetato de t- butila (0,23 ml, 1,66 mmol) foi adicionado. Após 30 minutos, permitiu-se a elevação da temperatura para -15 °C durante 30 minutos. A mistura de reação foi arrefecida através da adição a cloreto de amônio aquoso saturado. A extração com éter (2 x 25 ml), secagem sobre MgSO4 e evaporação geraram um resíduo oleoso. Cromatografia rápida em sílica com diclorometano + 3% metanol gerou 134 mg do produto desejado.

[0393] 22d: 1-Carboxilmetil,-O,O,O,O- tetrametilpropileno-1,3-difosfonato

[0394] 1-t-Butoxicarbonilmetil,-O, O, O, O- tetrametilpropileno-1,3-difosfonato (150 mg) foi dissolvido em diclorometano (10 ml) e ácido trifluroacético (0,5 ml) foi adicionado. A mistura de reação foi deixada de um dia para o outro e os voláteis foram removidos. O ácido trifluoroacético residual foi removido por três ciclos de adição de tolueno- evaporação. Produtividade 132 mg.

[0395] 22e: Conjugação de 1-Carboxilmetil,- O,O,O,O-tetrametilpropileno-1,3-difosfonato para polietilenoimina e carregamento com manganês

[0396] 1-Carboxilmetil,-O,O,O,O- tetrametilpropileno-1,3-difosfonato (100 mg), polietilenoimina (15 mg, Peso molecular médio 30.000) e sulfo N-hidroxi succinimida foram adicionados à água (5 ml) e sonicados por 10 min. O pH foi ajustado para 6,6 através da adição de 0,1 M de NaOH. EDC foi adicionado e a solução foi colocada em um agitador por 19 h. O material molecular pequeno foi removido em um filtro de rotação com corte de 20 kDa. O resíduo foi lavada 4 vezes no mesmo filtro. As nanoestruturas mediram 7,5 nm de diâmetro quando dissolvidas em 150 mM de NaCl. A 1 ml da solução acima foram adicionados 21 mg de MnCl24 H2O. O pH foi ajustado para 7,3 através da adição de NaOH aquoso. A amostra foi lavada com água 3 vezes em um filtro de rotação com corte nominal de 10 kDa. A amostra foi analisada em relação a Mn e concluída como sendo 2,4 mM. A capacidade de relaxamento foi concluída como 18,5/mM/s a 60 MHz. A estabilidade medida de acordo com o exemplo 14: 0,2 %.

[0397] Exemplo 23. Titulação condutométrica de Nanoestruturas

[0398] A titulação condutométrica pode ser usada para a determinação da quantidade de Ca2+ e Mg2+ que pode ser adsorvida em nanoestruturas. A condutividade de uma solução de nanoestruturas é monitorada após a adição de incrementos de uma solução que contém uma mistura de CaCl2 e MgCl2. A condutividade (mS/cm) da solução irá aumentar a uma certa taxa (coeficiente angular da curva de titulação) desde que Ca2+ e Mg2+ adsorvam nas partículas. Quando as nanoestruturas são saturadas com Ca2+ e Mg2+, a condutividade aumentará em uma outra taxa. Para uma visualização mais clara do ponto final (onde as nanoestruturas são saturadas com Ca e Mg) , as condutividades na presença das nanoestruturas foram subtraídas das condutividades obtidas através da adição dos mesmos incrementos da solução de Ca/Mg a uma água.

[0399] Uma amostra de 200 μl de material do exemplo 10c ([Mn = 0; [P] = 138 mM) foi misturada com 2300 μl de água. A condutividade foi medida após a adição de incrementos de 50 μl de uma solução de água que contém 6, 55 mM de MgCl2 e 9,67 mM de CaCl2. (Essa razão [Ca]/[Mg] é quase igual à encontrada no sangue. Vide “Amostra” na Figura 3a. O valor inicial de condutividade (sem adição de solução de Mg/Ca) foi subtraído da “Amostra” para obter “Amostra Korr” na Figura 3a. A condutividade também foi medida após a adição dos mesmos incrementos da Mg/Ca em água para obter “Produto em bruto” na Figura 3a. Finalmente, as condutividades da “Amostra Korr” foi subtraída do “Produto em bruto” para obter “Diferença (Produto em bruto-Amostra Korr)” na Figura 3a. A curva de “Diferença (Produto em bruto-Amostra Korr)” foi ampliada na Figura 3b e duas linhas retas foram encaixadas em diferentes partes da curva. As duas linhas cruzaram a 474 μl do composto de titulação, o que gerou um [P]/[Mg] = 8,89, [P]/[Ca] = 6,02 e [P]/[Me] tot — 3,59.

[0400] A mesma batelada de nanoestruturas conforme supracitado foi adicionalmente concentrada em um filtro de 10 kD (volume foi reduzido para cerca de um quinto).

[0401] A titulação foi executada com as mesmas correções conforme supracitado com 40 μl de solução misturados com 2.460 de água. O ponto final foi determinado em 422 μl. Considerando a mesma razão de adsorção [P]/[Me] que a titulação anterior, isso gerará um [P] — 422/474 x 138 x 0,200/0,040 — 613 mM. Vide Figura 3c.

[0402] O proposito principal da titulação foi estimar a quantidade de solução de Ca/Mg que deve ser adicionada para 90 % de saturação das nanoestruturas.

[0403] Portanto, 506 μl de uma solução de 400 mM de MgCl2 e 600 mM de CaCl2 foram adicionados a 14,5 ml de solução de amostra ([P] — 138 mM).

[0404] Essa solução foi, então, adicionalmente concentrada com um filtro de 10 kD conforme supracitado e aproximadamente a mesma quantidade foi titulada, mas dessa vez, a maioria dos locais deve ser ocupada por metais. Os resultados são mostrados na Figura 3d.

[0405] Exemplo 24. Formulação: Saturação com íons de Ca e Mg seguidos por adição de manitol (Batelada SI055C-PE120208)

[0406] Uma amostra de 2,5 ml de uma solução de material do exemplo 10c ( [Mn] — 38 mM, [P] — 508 mM e Os ~ 200 mOs/kg; Batelada PE 120130) foi primeiro ajustada para pH fisiológico 7,4. A saturação (90%) com Ca e Mg foi seguida pela execução das seguintes etapas. 100 μl da solução foram titulados por condutometria com uma solução de Ca e Mg ([Ca]/[Mg] = 1,48) de acordo com o método descrito no Exemplo 23("Titulação Condutométrica de Nanoestruturas") e o ponto final foi determinado quando [Ca]/[Mn] = 1,59 ou [Mg]/[Mn] = 1,08.

[0407] Houve alguma preocupação de que algum Mn2+ pudesse ser deslocado por Ca2+ e Mg2+ especialmente como o pH no fim da titulação foi 5,5. Portanto, a solução após a titulação foi filtrada com um filtro de 10 kD e a quantidade de Mn no filtrado foi determinada para conter ~ 15 % do Mn total na amostra. A perda de Mn da nanoestrutura poderia pelo menos parcialmente ser explicada pelo pH baixo no fim da titulação.

[0408] Para a preparação das partículas carregadas com Ca e Mg correspondentes, 500 μl de solução de manitol (Os = 280 mOs/kg) foram primeiro misturados com 21,5 μl de uma solução de Ca/Mg concentrada ([Ca] = 600 mM, [Mg] = 400 mM) . Essa solução foi, então, misturada com 580 μl de batelada PE 120130, o pH foi ajustado de 6,01 para 7,40 com ~ 8 μl de 1 M NaOH e osmolaridade determinada como 270 mOs/kg.

[0409] Exemplo 25. Teste de imunogenicidade

[0410] Métodos

[0411] Um coelho foi injetado 5 vezes com 2 x 0,5 ml de nanoestruturas de acordo com o exemplo 24 (formulado com magnésio e cálcio) a uma concentração de nanoestrutura correspondente a 10 mg de Mn/ml. As injeções foram dadas subcutaneamente, uma em cada uma das pernas traseiras. As nanoestruturas foram misturadas com adjuvante da seguinte maneira:

[0412] 1) 1:1 v/v com Adjuvante Completo de Freund (Sigma-Aldrich) (1 ml injetado no total) para imunização primária e com Adjuvante Incompleto de Freund para injeções de intensificação

[0413] 2) 1:1 (v/v) com 40 mg/ml de hidróxido de alumínio (Pierce) (1 ml injetado no total) tanto para imunização primária quanto para injeções de intensificação

[0414] Protocolo para injeções e coleta de soro:

[0415] • Dia 0: Coleta de soro pré-imune (20 ml)

[0416] • Dia 0: Imunização primária

[0417] • Dia 14: Primeiro intensificador

[0418] • Dia 28: Segundo intensificador

[0419] • Dia 49: Terceiro intensificador

[0420] • Dia 70: Quarto intensificador

[0421] • Dia 84: Coleta de soro imune (60 ml)

[0422] Análise

[0423] 1. As frações de imunoglobulina foram purificadas a partir dos soros pré-imune e imune pela cromatografia de Proteína G (GE Healthcare).

[0424] 2. 2 mg da fração de IgG foram conjugados para uma coluna de agarose de 2 ml (Pierce) através da amidação redutiva entre os grupos aldeídos na resina e os grupos de amina primária presentes nas moléculas de IgG. As colunas conjugadas com IgG foram lavadas e equilibradas com NaCl a 0,9%.

[0425] 3. 100 μl de uma solução de nanoestruturas de acordo com exemplo 24 correspondente a 1,35 mM de manganês (que contém aproximadamente 21 μg de Si e 7 μg de Mn) foram aplicados a cada uma das colunas.

[0426] 4. Vazão de fluxo: As colunas foram lavadas com NaCl a 0, 9% em frações de 4 x 1 ml seguido por 2 x 2 ml (frações 1 a 6).

[0427] 5. Eluato: Bound SI055 foi eluído com 4 x 1 ml de 1 M de NaCl (frações 7 a 10) .

[0428] 6. A vazão de fluxo e as frações de eluato foram analisadas em relação a teor de Mn e Si por ICP- AES. RESULTADOS

[0429] Tanto com a coluna pré-imune quanto com a coluna imune, virtualmente qualquer SI055 foi detectado na vazão de fluxo. No eluato, não houve diferença entre as colunas na quantidade de nanoestruturas detectadas.

[0430] Não houve sinais de irritação ou outros problemas com o coelho durante o curso do protocolo de imunização.

[0431] A recuperação de nanoestruturas em vazão de fluxo e eluato de colunas pré-imune e imune são mostrados na Tabela 4.

[0432] A recuperação de SI055 em frações 1 a 10 de colunas pré-imune e imune é mostrada nas Figuras 4a e 4b, respectivamente.

[0433] Tabela 4:

CONCLUSÕES

[0434] Esse exemplo mostrou que não houve reação imune nas nanoestruturas em coelhos, apesar de um protocolo de imunização muito robusto. Esse resultado demonstra o fato de que as nanoestruturas são bioinertes.

Claims

1. NANOESTRUTURA QUE COMPREENDE ÍONS DE MANGANÊS, incorporados em uma armação polimérica, caracterizada por compreender pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado, em que a armação polimérica compreende resíduos de monômero contendo um grupo bifosfonato geminal e dois grupos organo- oxissilano, e em que os resíduos de monômero são derivados de um monômero escolhido do grupo que consiste em: 1,1-bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano; 1,1-bis(2-trimetoxisililetil)-1,1-bis(dimetilfosfonato) metano; 1,1-bis(trimetoxisililmetil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano; 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(dietilfosfonato) metano; 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(diisopropilfosfonato) metano; 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(di-(3-metoxifenilil) fosfonato)metano; e 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(di-ciclopropilmetil) fosfonato)metano.

2. NANOESTRUTURA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo diâmetro hidrodinâmico das nanoestruturas ser 3 a 7 nm.

3. NANOESTRUTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo diâmetro hidrodinâmico da nanoestrutura ser 10 a 20 nm.

4. NANOESTRUTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela razão molar P/Mn ser 7 a 20.

5. NANOESTRUTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela razão molar Si/Mn ser 5 a 20.

6. NANOESTRUTURA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pela dita nanoestrutura compreender adicionalmente grupos hidrofílicos fixados às partes externas.

7. NANOESTRUTURA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelos grupos hidrofílicos compreenderem porções químicas de -(CH2CH2O)nCH3, em que n = 4 a 50.

8. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a nanoestrutura, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. USO DE UMA NANOPARTÍCULA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou uma composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 8, caracterizado por ser como um agente de contraste de MRI.

10. MÉTODO PARA OBTER NANOESTRUTURA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender: obter nanoestruturas de uma armação polimérica que compreende bisfosfonatos geminados, e colocar em contato as ditas nanoestruturas com os íons de manganês.

11. NANOESTRUTURA, que compreende uma armação polimérica que compreende pelo menos cinco grupos de bisfosfonato geminado, caracterizada pela armação polimérica compreender resíduos de monômero contendo um grupo bifosfonato geminal e dois grupos organo-oxissilano, e em que os resíduos de monômero são derivados de um monômero escolhido do grupo que consiste em: 1,1-bis(trietoxisililpropil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano; 1,1-bis(2-trimetoxisililetil)-1,1-bis(dimetilfosfonato) metano; 1,1-bis(trimetoxisililmetil)-1,1-bis(dimetilfosfonato)metano; 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(dietilfosfonato) metano; 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(diisopropilfosfonato) metano; 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(di-(3-metoxifenilil) fosfonato)metano; e 1,1-bis(3-trimetoxisililpropil)-1,1-bis(di-ciclopropilmetil) fosfonato)metano.