KR20140059163A - 개선된 연결을 갖는 아마톡신-접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 치료에 대한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 아마톡신과 타깃-결합 부분, 예를 들어 항체의 특정 연결기에 의하여 연결된 접합체에 대한 것으로서, 이는 암치료에 유용하다. 다른 측면에서, 본 발명에서 그런 접합체를 포함하는 약학 조성물에 대한 것이다.

Description

개선된 연결을 갖는 아마톡신-접합체{AMATOXIN-CONJUGATES WITH IMPROVED LINKAGES}
[001] 본 발명은 종양 치료에 대한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 소정 결합에 의하여 연결된, 아마톡신 및 타깃-결합 부분, 예를 들어 항체의 접합체에 대한 것으로서, 이는 암 치료에 유용하다. 본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 상기 접합체를 포함하는 약학 조성물에 대한 것이다.
[002] 아마톡신(Amatoxins)은 8개의 아미노산으로 구성된 환형 펩티드이다. 그것은 알광대버섯(Amanita phalloides)으로부터 분리되거나 합성적으로 준비될 수 있다. 아마톡신은 특히 포유동물 세포의 DNA-의존적 RNA 폴리머라아제 II를 저해하여, 상기 영향을 받는 세포의 전사 및 단백질 생합성을 저해하게 된다. 세포에 있어서의 전사 저해는 성장 및 증식의 중단을 야기시킨다. 비록 공유적으로 결합되지 않더라도, 상기 아마니틴(amanitin) 및 RNA-폴리머라아제 II 사이의 복합체는 매우 타이트하다 (KD = 3 nM). 상기 효소로부터 아마니틴의 분리는 매우 느린 과정으로서, 상기 영향을 받는 세포의 회복이 불가능하게 만든다. 전사 저해가 너무 오랫동안 지속되면, 상기 세포는 예정세포사(세포자살, apoptosis)를 겪게 될 것이다.
[003] 종양 치료를 위하여 세포독성 부분으로서 아마톡신을 이용하는 것은 이미 1981년에 항-Thy 1.2 항체를 Trp의 인돌 링(indole ring, 도 1의 아미노산 4 참조)에 디아조반응(diazotation)을 통하여 접합된 연결기(linker)를 이용하여 아마니틴에 결합시키는 것이 연구되었다 (Davis & Preston, Science 1981 , 213, 1385-1388). 데이비스 및 프레스톤은 접착의 위치를 7' 위치로 동정하였다. 모리스 및 벤톤은 또한 T 위치에서의 치환이 유도체를 유도하고 이것이 세포독성 활성을 유지한다는 것을 증명하였다 (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 21 419-430).
[004] 유럽 특허출원번호 EP 1 859 811 A1 (2007.11.28 공개)은 접합체를 개시하고 있는데, 여기에서는 β-아마니틴의 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자가 직접적으로, 예를 들어 연결기 구조 없이, 알부민 또는 모노클로날 항체 HEA125, OKT3, 또는 PA-1에 결합시키는 것이 개시하고 있다. 게다가, 유방암 세포(MCF-7), 버킷트 림프종 세포(Raji), 및 T-림프종 세포(Jurkat)의 증식에서 이들 접합체들의 억제효과가 보여진다. 아미드(amide), 에스테르(ester), 에테르(ether), 티오에테르(thioether), 이황화물(disulfide), 요소(urea), 티오요소(thiourea), 탄화수소 부분(hydrocarbon moieties) 등과 같은 연결기의 이용이 제안되었으나, 그러한 구조들이 실질적으로 보여지지 않았고, 아마톡신에 대한 접합 위치와 같은 더 상세한 연구들이 제공되지 않았다.
[005] 국제특허출원 공개번호 WO 2010/115629 및 WO 2010/115630 (모두 2010.10.14 공개)는 접합체를 개시하는데, 인간화 항체 huHEA125와 같은 항-EpCAM 항체들과 같은 항체들이 (i) 아마톡신 아미노산 1의 γ C-원자, (ii) 아마톡신 아미노산 4의 6' C-원자, 또는 (iii) 아마톡신 아미노산 3의 δ C-원자를 통하여 아마톡신에 결합되는데, 경우에 따라서 직접적으로 또는 상기 항체와 상기 아마톡신 사이의 연결기를 통하여 결합되는 것을 개시하고 있다. 상기 제안된 연결기들은 아미드(amide), 에스테르(ester), 에테르(ether), 티오에테르(thioether), 이황화물(disulfide), 요소(urea), 티오요소(thiourea), 탄화수소 부분(hydrocarbon moieties) 등을 포함한다. 게다가, 유방암 세포(세포주 MCF-7), 췌장암(세포주 Capan-1), 대장암(세포주 Colo205), 및 담관암(세포주 OZ)의 증식에 이들 접합체들의 억제효과가 보여지고 있다.
[006] 아마톡신은 항체 분자와 같이 큰 생체분자 캐리어에 결합되면 상대적으로 비-독성이 되고, 상기 생체분자 캐리어가 분리된 후에 그 세포독성 활성을 나타내는 것은 이미 알려져 있다. 특히 간세포에 대한 아마톡신의 독성의 측면에서, 타깃 종양 치료를 위한 아마톡신 접합체가 혈장으로 투여된 후 상당히 안정적으로 유지되는 것과 상기 타깃 세포에서 내재화(internalization) 된 후에 아마톡신 유리가 일어나는 것이 가장 중요하다. 본문에서, 상기 접합체 안정성의 사소한 개선이 치료범위 및 치료 접근을 위한 아마톡신 접합체의 안정성에 급격한 결과를 초래할 수 있다.
그러므로, 종래 기술에 있어서 혈장에서 안정한 타깃-결합 부분 아마톡신 접합체에 대한 요구가 컸으며, 이는 비-타깃 세포에에 대한 해로운 부작용을 최소화할 수 있다.
[008] 본 발명은 타깃 부분이 트립토판 아미노산 4의 추가적인 접합 위치, 즉 포유동물 세포의 DNA-의존 RNA 폴리머라아제 II와 같은 타깃과 그 아마톡신의 상호작용에 간섭을 주지 않은 위치 1'-N에서 연결기(linkers)를 통하여 아마톡신에 접합될 수 있다는 뜻밖의 발견에 기초한다.
[009] 그러므로, 본 발명은 연결기 L을 통하여 아마톡신, 또는 아마톡신의 유사체에 연결된 타깃-결합 부분을 포함하는 접합체에 대한 것으로서, 여기에서 상기 연결기 L은 아미노산 4의 1'-N원자를 통하여 상기 아마톡신에 연결된다.
[0010] 한 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 아마톡신 접합체에 대한 것이다:
Figure pct00001
[화학식 1]
여기에서:
R1 = H 또는 OH;
R2 = H 또는 OH;
R3 = NH2 또는 OH;
R4 = OH 또는 OC1 -6-알킬; 및
R5 = L-T; 여기에서 L은 연결기이고; T는 타깃 결합 부분이다.
[0011] 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 접합체를 포함하는 약학 조성물에 대한 것이다.
[0012] 또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 1의 아마톡신-접합체 분자에 대한 것으로서, 여기에서 R1 내지 R4는 상기와 같이 정의되고; 여기에서 R5=L-X로서 L은 연결기이고, X는 타깃-결합 부분의 친핵 그룹(nucleophilic group), 특히 일차 아민(primary amine)으로 대체될 수 있는 탈리기이다.
[0013] 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 접합체의 합성 방법에 대한 것으로서, 본 발명의 아마톡신-접합체 분자를 친핵 그룹, 특히 일차 아민을 포함하는 타깃-결합 부분과 반응시키는 단계를 포함한다.
[0014] 도 1은 다양한 아마톡신의 구조적 화학식들을 도시한다. 상기 볼드체 숫자들 (1 내지 8)은 아마톡신을 형성하는 8개의 아미노산의 표준 넘버링을 지칭한다. 아미노산 1, 3 및 4에서 원자의 표준 지정이 또한 도시되고 있다(그리스 문자 α 내지 γ, 그리스 문자 α 내지 δ, 및 숫자들 1' 내지 7' 각각).
[0015] 도 2는 72시간 배양 후 BrdU 어세이에서 생체외(in vitro )에서 HER2-양성 종양 세포에 대한 Her-DSC-30.0378 [2.8]의 세포독성활성을 도시하고 있다.
[0016] 본 발명을 하기에서 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 여기에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약은 다양하게 응용가능하기에 여기에 한정되지 않는 것으로 이해된다. 여기에 사용된 용어는 오직 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 사용되고 하기 첨부된 청구항에 의하여 제한될 본 발명의 범위를 제한하는 목적으로는 사용되지 않는 것으로 이해된다. 다르게 정의되지 않는 한, 여기에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미로 사용된다.
[0017] 바람직하게, 여기에서 사용된 용어는 "생물공학 용어의 다중언어 용어사전: (lUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에서 기재된 것처럼 정의된다.
[0018] 다음에서 기재될 본 명세서 및 청구항을 통하여, 본문에서 다른 것을 요구하지 않는 한 "포함한다"란 표현과 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 정해진 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하나, 다른 정수 또는 단계 도는 정수 또는 단계의 그룹의 배제는 포함하지 않는 것으로 이해될 것이다.
[0019] 본 명세서의 문맥을 통하여 몇몇 문헌들이 인용된다. 여기에서 위에 또는 뒤에 인용되는 문헌들의 각각 (모든 특허공보들, 특허공개공보들, 과학 논문들, 제조사의 사용설명서들, 정보들, GenBank Accession Number 서열 제출 등을 포함)는 각 특허법 하에서 가능한 정도로 그것의 전부로 인용문헌으로 통합된다. 여기에 없는 것은 본 발명이 이전 발명으로 인한 개시에 선행하지 않는 것으로서 이해된다.
[0020] 본 발명은 하기에서 상세히 기재될 것이다. 하기에서 본 발명의 서로 다른 측면들이 더욱 상세히 정의된다. 그렇게 정의되는 각 측면은 명백히 반대를 의미하지 않는 한 다른 측면 또는 측면들과 결합될 수 있다. 특히, 바람직하게 또는 이로운 것으로서 지시되는 어떤 특징이 바람직하게 또는 이로운 것으로 지시되는 다른 특징 또는 특징들과 결합될 수 있다.
[0021] 그러므로, 본 발명은 연결기 L을 통하여 아마톡신 또는 아마톡신 유사체에 결합된 타깃-결합 부분을 포함하는 접합체에 대한 것으로서, 여기에서 상기 L은 아미노산 4의 1'-N 원자를 통하여 상기 아마톡신에 연결된다.
[0022] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "접합체(conjugate)"는 공유결합에 의하여 연결되는 적어도 두 개의 다른 분자들을 포함하는 분자를 의미한다.
[0023] 상기 용어 "타깃-결합 부분"은, 여기에서 사용되는 바와 같이, 타깃 분자 또는 타깃 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 어떤 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 본 발명의 문맥에서 바람직한 타깃-결합 부분은 (i) 항체 또는 그들의 항원-결합 단편; (ii) 항체-유사 단백질; 및 (iii) 핵산 압타머(nucleic acid aptamers)이다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 "타깃-결합 부분"은 전형적으로 40,000 Da (40 kDa) 또는 그 이상의 분자량을 가진다.
[0024] 여기에서 사용된 것과 같이, 제1화합물(예를 들어 항체)는 제2화합물(예를 들어 타깃 단백질과 같은 항원)에 "특이적으로 결합"하는 것으로 고려되는데, 이는 상기 제2화합물에 대한 해리상수 KD가 100 μΜ 또는 그 이하, 바람직하게는 50μΜ 또는 그 이하, 바람직하게는 30μΜ 또는 그 이하, 바람직하게는 20μΜ 또는 그 이하, 바람직하게 10μΜ 또는 그 이하, 바람직하게 5μΜ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 1μΜ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 900nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 800nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 700nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 600nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 500nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 400nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 300nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 200nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 100nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 90nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 80nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 70nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 60nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 50nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 40nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 30nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 20nM 또는 그 이하, 더욱 바람직하게 10nM 또는 그 이하인 경우에 그러하다.
[0025] 본 발명의 문맥에서, 용어 "타깃 분자" 및 "타깃 에피토프" 각각은 타깃-결합 부분에 의하여 특이적으로 결합되는 항원 및 항원의 에피토프 각각을 의미한다. 바람직하게, 상기 타깃 분자는 종양-관련 항원이고, 특히 비종양 세포의 표면과 비교하였을 때 증가된 농도 및/또는 다른 입체 배치(different steric configuration)에서 하나 이상의 종양 세포 타입의 표면에 존재하는 항원 또는 에피토프이다. 바람직하게 상기 항원 또는 에피토프는 하나 이상의 종양 세포 타입의 표면 상에 존재하지만, 비-종양 세포의 표면 상에는 존재하지 않는다. 특정 실시예에서, 상기 타깃-결합 부분은 HER-2/neu 또는 상피세포 부착분자 (EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 항원 또는 에피토프는 자가면역질환에 관련된 세포 상에 우선적으로 발현된다. 특히 그러한 실시예에서, 상기 타깃-결합 부분은 IL-6 수용체(IL-6R)의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
[0026] 여기에서 사용되는, 용어 "항체 또는 그것의 항원 결합 단편"은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자, 예를 들어 면역특이적으로 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 분자의 면역학적으로 활성 부분을 의미한다. 또한 타깃 분자, 예를 들어 타깃 단백질 Her-2/neu 또는 EpCAM에 특이적으로 결합하는 파지 디스플레이법을 포함하는 기술을 통하여 선택되는 면역글로불린-유사 단백질을 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 어떤 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1 , IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스가 될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 "항체 및 그것의 항원-결합 단편"은 여기에 제한되지 않으나 폴리클로날, 모노클로날, 1가 항체(monovalent), 이특이성(bispecific), 헤테로컨쥬케이트(heteroconjugate), 다중특이성(multispecific), 인간, 인간화 (특히 CDR-이식), 탈면역(deimmunized), 또는 키메릭(chimeric) 항체, 단일 사슬 항체(single chain antibodies, 예를 들어 scFv), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의하여 생산된 단편, 다이어바디(diabodies) 또는 테트라바디(tetrabodies) (Holliger P. et al., 1993), 나노바디(nanobodies), 항-유전자형 항체(anti-Id antibodies, 예를 들어 본 발명의 항체에 대한 항-유전자형 항체를 포함), 및 상기 기재한 것 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편을 포함한다.
[0027] 몇몇 실시예에서, 상기 항원-결합 단편은 본 발명의 인간 항원-결합 항체 단편이며, 여기에 제한되지 않으나, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fvs (scFv), 단일-사슬 항체, 이황화-결합된 Fvs (dsFv) 및 VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편을 포함한다. 단일-사슬 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 도메인 단독 또는 다음의 전부 또는 부분과의 조합을 포함할 수 있다: 힌지 영역(hinge region), CL, CH1 , CH2, 및 CH3 도메인. 또한 본 발명에서는 힌지 영역(hinge region), CL, CH1 , CH2, 및 CH3 도메인과 가변 도메인의 어떠한 조합을 포함하는 항원-결합 단편을 포함한다.
[0028] 본 발명에 이용될 수 있는 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 어떠한 동물 기원을 포함한다. 바람직하게, 상기 항체는 인간, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 기니피그, 또는 토끼), 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 기원을 포함한다. 특히 바람직하게는 상기 항체는 인간 또는 쥐과 동물 기원이다. 여기에서 사용되는 바와 같이, "인간 항체"는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린을 위하여 형질전환되고 내생 면역글로불린을 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체(예를 들어 Kucherlapati & Jakobovits에 의한 미국특허번호 5,939,598에 예로서 기재)를 포함한다.
[0029] 용어 "항체-유사 단백질"은 타깃 분자에 특이적으로 결합하도록 설계된(예를 들어 루프의 돌연변이유발에 의함) 단백질을 의미한다. 특히, 그러한 항체-유사 단백질은 단백질 골격(protein scaffold) 양 말단에 접착된 적어도 하나의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이 이중 구조 통제는 항체의 그것과 비교할 만한 수준에서 항체-유사 단백질의 결합 친화성을 크게 증가시킨다. 상기 가변 펩티드 루프의 길이는 통상적으로 10 내지 20개의 아미노산을 구성한다. 상기 골격 단백질은 좋은 용해 성능을 갖는 어떠한 단백질일 수 있다. 바람직하게, 상기 골격 단백질은 작은 구상 단백질(globular protein)이다. 항체-유사 단백질은 제한 없이, 어피바디(affibodies), 안티칼린(anticalins), 및 설계된 안키린 반복 단백질(참조: Binz et al. 2005)을 포함한다. 항체-유사 단백질은 큰 돌연변이 라이브러리로부터 유래될 수 있고, 예를 들어 큰 파지 디스플레이 라이브러리(phage display libraries)로부터 패닝(panned)될 수 있고, 정규 항체에 대한 유사체로 분리될 수 있다. 또한, 항체-유사 단백질은 구상 단백질에서 표면-노출 잔기의 조합 돌연변이유발(combinatorial mutagenesis)에 의하여 획득될 수 있다.
[0030] 용어 "핵산 압타머"는 생체 외(in vitro) 선별 또는 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)의 반복 수행을 통하여 조작되어 타깃 분자에 결합하는 핵산 분자를 의미한다(참조: Brody and Gold, 2000). 상기 핵산 압토머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 상기 압토머는 예를 들어, 2'-플루오린-치환 피리미딘과 같은 변형된 뉴클레오티드와 같은 변형을 포함할 수 있다.
[0031] 여기에서 사용되는 바와 같이, 화합물의 "유사체"는 상기 화합물과 동일하지는 않으나 구조적으로 관련되고 상기 화합물의 적어도 하나의 활성을 나타낸다. 상기 유사체와 비교되는 화합물은 "모화합물(parent compound)"로 알려져 있다. 상기 언급된 활성은, 여기에 제한되지 않으나 다음을 포함한다: 다른 화합물에 대한 결합활성; 효소 억제 활성과 같은 억제 활성; 독성 효과; 효소-활성화 활성과 같은 활성화 활성. 상기 유사체가 상기 모화합물과 동일한 정도의 그런 활성을 나타낼 필요는 없다. 화합물은 본 발명의 문맥 내에서 유사체로 간주되는데, 이는 그것이 관련 활성을 모화합물의 활성의 적어도 1% 정도(더욱 바람직하게 적어도 5%, 더욱 바람직하게 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 30%, 더욱 바람직하게 적어도 40%, 및 더욱 바람직하게 적어도 50%)를 나타내는 경우에 그러하다. 그러므로, 여기에 사용되는 것과 같이 "아마톡신의 유사체"는 도 1에서 도시된 바와 같이 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌(amanin), 아마닌아마이드(amaninamide), 아마눌린(amanullin), 및 아마눌린산(amanullinic acid) 중 어느 하나와 구조적으로 관련을 가지고 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아마이드, 아마눌린, 및 아마눌린산 중 적어도 어느 하나와 비교할 때 포유동물 RNA 폴리머라아제 II에 대한 억제 활성의 적어도 1%(더욱 바람직하게 적어도 5%, 더욱 바람직하게 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 더욱 바람직하게 적어도 30%, 더욱 바람직하게 적어도 40%, 및 더욱 바람직하게 적어도 50%)를 나타낸다. 본 발명에서 사용되기에 적절한 "아마톡신 유사체"는 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아마이드, 아마눌린, 또는 아마눌린산 중 어느 하나보다 포유동물 RNA 폴리머라아제 II에 대한 억제활성이 더 크게 나타날 수도 있다. 상기 억제 활성은 50% 억제가 나타나는 농도(IC50 수치)를 결정함으로써 측정될 수 있다. 포유동물 RNA 폴리머라아제 II에 대한 억제 활성은 세포 증식에 대한 억제 활성을 측정함으로써 간적접적으로 결정될 수 있다. 세포 증식의 억제 측정을 위한 적절한 분석법은 실시예에서 설명된다.
[0032] "반합성 유사체(semisynthetic analogue)"는 출발 물질로서 자연적 원료 (예를 들어 식물 물질, 박테리아 배양물 또는 세포 배양물)로부터의 화합물을 이용한 화학적 합성에 의하여 획득되는 것을 의미한다. 통상적으로, 본 발명의 "반합성 유사체"는 아마니타 과(the Amanita family)의 버섯으로부터 분리된 화합물을 출발물질로 합성된 것이다. 반대로 "합성 유사체"는 작은 (통상적으로 석유화학적) 빌딩 블럭으로부터 소위 전체 합성에 의하여 합성된 유사체를 의미한다. 일반적으로, 이러한 전체 합성은 생물학적 과정의 도움없이 수행된다.
[0033] 여기에서 사용된 바와 같이, "압타머 접합체(aptamer conjugate)"는 타깃-결합 부분 독소 접합체를 의미하는 것으로서, 상기 타깃-결합 부분은 상기 대체 (iii)에 따라 핵산 압타머이다.
[0034] 본 발명의 문맥에서 "연결기(linker)"는 두 성분을 연결하는 분자를 의미하는 것으로, 상기 두 성분 각각이 상기 연결기의 한 쪽 말단에 접착되어 있어 , 본 발명에서 상기 타깃-결합 부분과 상기 아마톡신 사이와 같이 두 성분 사이의 거리가 증가하고 이들 두 성분 사이의 입체 간섭이 완화된다. 연결기의 결여에 있어서, 아마톡신의 상기 타깃-결합 부분에의 직접적 연결은 RNA 폴리머라아제 II와의 상호작용하는 상기 아마톡신의 능력을 감소시킬 수 있다. 특정 실시예에 있어서, 연결기는 그것의 백본에서 1 및 30 원자 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 원자; 그러므로 본 발명의 문맥에서 "사이" 용어가 사용되어 언급된 경계가 포함된다) 사이의 연속 사슬을 가지는데, 예를 들어 상기 연결기의 길이는 상기 아마톡신 부분과 상기 타깃-결합 부분 사이의 원자 또는 결합의 개수에 의하여 측정되는 것과 같이 가장 짧은 연결로 정의되고, 여기에서 상기 연결기 백본의 한 측면은 상기 아마톡신과 반응하고, 다른 측면은 타깃-결합 부분과 반응하게 된다. 본 발명의 문맥에서, 연결기는 바람직하게 C1 -20-알킬렌(C1 -20-alkylene), C1-20-헤테로알킬렌(C1 -20-heteroalkylene), C2 -20-알케닐렌(C2 -20-alkenylene), C2 -20-헤테로알케닐렌(C2 -20-heteroalkenylene), C2 -20-알키닐렌(C2 -20-alkynylene), C2 -20-헤테로알키닐렌(C2 -20-heteroalkynylene), 시클로알킬렌(cycloalkylene), 헤테로시클로알킬렌(heterocycloalkylene), 아릴렌(arylene), 헤테로아릴렌(heteroarylene), 아랄킬렌(aralkylene) 또는 선택적으로 치환된 헤테로아랄킬렌기(heteroaralkylene group)를 포함한다. 상기 연결기는 하나 이상의 구조적 성분을 포함할 수 있는데 예를 들어 카복스아마이드(carboxamide), 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화물, 요소(urea), 티오요소(thiourea), 탄화수소 부분 등을 포함할 수 있다. 상기 연결기는 또한 이러한 구조적 성분의 두 개 이상의 조합을 포함할 수도 있다. 상기 구조적 성분들의 각각은 한번 이상, 예를 들어 두번, 세번, 네번, 다섯번 또는 여섯번 상기 연결기에 존재할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 연결기는 이황화 결합(disulfide bond)을 포함할 수 있다. 상기 연결기는 단일 단계 또는 두 번 이상의 연속 단계에서 상기 아마톡신 및 상기 타깃-결합 부분에 접촉되는 것으로 이해된다. 두 기를 수반할 상기 연결기의 말단, 바람직하게는 전단부 및 후단부에서, i) 바람직하게 아마톡신 또는 상기 타깃 결합-펩티드 상의 활성화된 기(group)에 연결되는 성분들 중 어느 하나에 존재하는 기와 공유결합을 형성하거나 (ii) 아마톡신 상의 기와 공유결합을 형성하기 위하여 활성화되거나 활성화될 수 있다. 따라서, 화학기는 상기 연결기의 말단부 및 전단부에 존재하여 커플링 반응, 예를 들어 에스테르, 에테르, 우레탄, 펩티드 결합 등의 결과가 되는 것이 바람직하다.
[0035] 본 발명의 문맥에서, "아마톡신" 용어는 아마티나 속으로부터 분리된, Wieland, T. 및 Faulstich H.에서 설명된(Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec;5(3): 185-260) 8개 아미노산으로 이루어진 모든 환형 펩티드를 포함하고, 게다가 그것의 모든 화학적 유도체들; 게다가 그것의 모든 반합성 유사체들; 게다가 천연 화합물의 마스터 구조(환형, 8개 아미노산)에 따른 빌딩 블럭으로부터 만들어진 그것의 모든 합성 유사체들; 게다가 수산기를 갖는 아미노산 대신에 비-수산기 아미노산을 함유하는 모든 합성 또는 반합성 유사체들; 게다가 티오에테르 술폭시화물 부분(thioether sulfoxide moiety)이 황화물(sulfide), 술폰(sulfone)에 의해 치환되거나 황(sulfur)가 아닌 원자, 예를 들어 아마니틴의 칼바아날로그(carbaanalogue)에서와 같은 탄소 원자로 치환되는 모든 합성 또는 반합성 유사체들을 포함하고, 각 경우에 있어서 그런 어느 유도체 또는 유사체는 포유동물의 RNA 폴리머라아제 II를 억제함으로써 기능적으로 활성화된다.
[0036] 기능적으로, 아마톡신은 포유동물 RNA 폴리머라아제 II를 억제하는 펩티드 또는 뎁시펩티드로 정의된다. 바람직한 아마톡신은 상기 정의된 바와 같이 연결기 분자 또는 타깃-결합 부분과 반응할 수 있는 기능기(예를 들어, 카르복실기, 아미노기, 수산기, 티올(thiol) 또는 티올-포획기(thiol-capturing group))를 갖는 것이다. 본 발명의 접합체로 특히 적절한 아마톡신은 도 1에 도시된 α-아마니틴(α-amanitin), β-아마니틴(β-amanitin), γ-아마니틴(γ-amanitin), ε-아마니틴(ε-amanitin), 아마닌(amanin), 아마닌아마이드(amaninamide), 아마눌린(amanullin), 아마눌린산(amanullinic acid)뿐만 아니라 그의 염, 화학적 유도체, 반합성 유사체, 합성 유사체를 포함한다. 본 발명의 사용에서 특히 바람직한 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴 및 아마닌아마이드이다.
[0037] 여기에서 사용된 바와 같이, 화합물의 "화학적 유도체" (또는 짧게는 "유도체"는 상기 화합물과 유사한 화학적 구조를 갖는 종을 의미하고, 상기 화합물에 나타나지 않는 적어도 하나의 화학기를 포함하고/포함하거나 상기 화합물에 나타나는 적어도 하나의 화학기가 결여된 종을 의미한다. 상기 유도체가 비교되는 상기 화합물은 "모(parent)" 화합물로 알려져 있다. 통상적으로 "유도체"는 하나 이상의 화학 반응 단계에서 상기 모화합물로부터 생산될 수 있다.
[0038] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 아마톡신은 α-아마니틴, β-아마니틴, γ-아마니틴, ε-아마니틴, 아마닌, 아마닌아마이드, 아마눌린, 또는 아마눌린산, 또는 그들의 염 또는 유사체로부터 선택된다.
[0039] 한 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 아마톡신 접합체에 대한 것이다:
Figure pct00002
[화학식 I]
여기에서:
R1 = H 또는 OH;
R2 = H 또는 OH;
R3 = NH2 또는 OH;
R4 = OH 또는 OC1 -6-알킬; 및
R5 = L-T; 여기에서 L은 연결기이고; T는 타깃 결합 부분이다.
[0040] 특정 실시예에서, 상기 화학식 I의 아마톡신 접합체(amatoxin conjugate)는 α-아마니틴의 유도체(R1 = OH; R2 = OH; 및 R3 = NH2)이다.
[0041] 특정 실시예에서, R4는 O-Me이다..
[0042] 특정 실시예에서, 상기 연결기는 요소(urea) 부분을 통하여 상기 타깃-결합 부분에 연결된다.
[0043] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "요소(urea) 부분을 통하여 상기 타깃-결합 부분에 연결"은 상기 연결기와 상기 타깃-결합 부분 사이의 연결을 의미하는 것으로서, 상기 타깃-결합 부분은 -NH-C(O)-NH- 기를 통하여 상기 연결기에 직접적으로 접촉되는 것이다.
[0044] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 타깃-결합 부분은 상기 타깃-결합 부분에 나타나는 아미노기를 통하여 상기 연결기 L에 연결되고, 여기에서 상기 아미노기는 상기 요소(urea) 부분의 일부를 형성한다.
[0045] 특정 실시예에서, 상기 연결기는 1 내지 8개 원자 사이의 길이를, 바람직하게는 1 내지 6개 원자 사이의 길이를, 더욱 바람직하게 1 내지 4개 원자 사이의 길이를, 가장 바람직하게는 2 내지 4개 원자 사이의 길이를 가진다. 그러므로, 에틸렌 연결기는 2개 원자 길이의 연결기를 가지고, 프로필렌 연결기는 3개 원자, 부틸렌 연결기는 4개 원자의 길이를 가진다.
[0046] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 연결기 L은 다음 목록에서 선택되는 하나 이상의 기, 특히 하나, 둘 또는 세 개의 기를 포함한다: 알킬렌(alkylene), 알케닐렌(alkenylene), 알키닐렌(alkynylene), 시클로알킬렌(cycloalkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 헤테로알케닐렌(heteroalkenylene), 헤테로알키닐렌(heteroalkynylene), 헤테로시클로알킬렌(heterocycloalkylene), 아릴렌(arylene), 헤테로아릴렌(heteroarylene), 아랄킬렌(aralkylene) 및 헤테로아랄킬렌(heteroaralkylene) 기, 여기에서 각 기는 선택적으로 독립적으로 치환될 수 있다.
[0047] 상기 용어 "알킬렌(alkylene)"은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 기를 포함하는, 1 내지 20개의 탄소원자를 갖는 탄화수소기가 포화된 2가 직쇄(bivalent straight chain)를 의미한다. 특정 실시예에서, 알킬렌기는 저급 알킬렌기일 수 있다. 상기 용어 "저급 알킬렌"은 1 내지 6개 탄소원자를 갖는 알킬렌기를 의미하고, 특정 실시예에서는 1 내지 5개 또는 1 내지 4개 탄소원자를 갖는 알킬렌기를 의미한다. 알킬렌기의 예시는, 여기에 제한되지 않으나, 메틸렌(-CH2-), 에틸렌(-CH2-CH2-), n-프로필렌, n-부틸렌, n-펜틸렌, 및 n-헥실렌을 포함한다.
[0048] 상기 용어 "알케닐렌렌(alkenylene)"은 2 내지 20개의 탄소원자를 갖는 2가 직쇄 기를 의미하고, 여기에서 상기 탄소-탄소 결합의 적어도 어느 하나는 이중 결합인 반면 다른 결합들은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다. 상기 용어 "알키닐렌(alkynylene)"은 2 내지 20개 탄소원자를 갖는 기를 의미하는 것으로서, 여기에서 탄소-탄소 결합의 적어도 어느 하나는 삼중 결합인 반면 다른 결합들은 단일, 이중 또는 삼중 결합일 수 있다. 알케닐렌기의 예시는 에테닐렌(ethenylene, -CH=CH-), 1-프로페닐렌(1-propenylene), 2-프로페닐렌(2-propenylene), 1-부테닐렌(1-butenylene), 2-부테닐렌(2-butenylene), 3-부테닐렌(3-butenylene) 및 기타 유사한 것을 포함한다. 알키닐렌기의 예시는 에티닐렌(ethynylene), 1-프로피닐렌(1-propynylene), 2-프로피닐렌(2-propynylene) 등을 포함한다.
[0049] 여기에서 사용된 바와 같이, "시클로알킬렌(cycloalkylene)"은 어느 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 시스템의 부분이 되는 2가 링(ring)을 의미하는 것으로 의도되고, 여기에서 상기 링은 3 내지 12개 탄소 원자를 가지나 헤테로원자는 아니고, 여기에서 상기 링은 충분히 포화되고, 상기 용어 "시클로알케닐렌(cycloalkenylene)"은 어느 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 시스텐의 일부가 되는 2가 링을 의미하는 것으로 의도되고, 여기에서 상기 링은 3 내지 12개 탄소 원자를 갖고 헤테로원자는 아니고, 여기에서 상기 링은 적어도 부분적으로 불포화된 것이다(그러나 어느 아릴렌 링은 배제). 시클로알킬렌의 예시는, 여기에 제한되지 않으나, 시클로프로필렌(cyclopropylene), 시클로부틸렌(cyclobutylene), 시클로펜틸렌(cyclopentylene), 시클로헥실렌(cyclohexylene), 및 시클로헵틸렌(cycloheptylene)을 포함한다. 시클로알케닐렌의 예시는, 여기에 제한되지 않으나, 시클로펜테닐렌(cyclopentenylene) 및 시클로헥센닐렌(cyclohexenylene)을 포함한다.
[0050] 여기에 사용된 바와 같이, "헤테로시클로알킬렌(heterocycloalkylene)" 및 "헤테로시클로알케닐렌(heterocycloalkenylene)" 은 어느 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 링 시스템의 일부분이 되는 2가 링을 의미하는 것으로 의도되고, 여기에서 상기 링(ring)은 3 내지 약 12개 원자를 가지고, 여기에서 상기 링은 탄소 원자 및 적어도 하나의 헤테로원자, 특히 N, O 및 S로 구성되는 군에서 독립적으로 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자로 구성되고, 상기 링을 의미하는 헤테로시클로알킬렌은 완전히 포화되고, 링을 으미하는 헤테로시클로알케닐렌은 적어도 부분적으로 불포화된다(그러나 어떤 아릴렌 또는 헤테로아릴렌 링은 제외).
[0051] 상기 용어 "아릴렌(arylene)"은 어느 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 시스템의 일부가 되는 2가 링 또는 링 시스템(ring system)를 의미하는 것으로 의도되고, 상기 그러한 링 또는 링 시스템은 3 내지 20개 탄소원자를 가지나 헤테로원자는 가지지 않고, 상기 링 또는 링 시스템은 "4n+2" π 전자규칙에 의하여 정의되는 방향족 부분으로 구성되고, 페닐렌(phenylene)을 포함한다.
[0052] 여기에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "헤테로아릴렌(heteroarylene)"은 어느 안정한 모노- 또는 폴리시클릭 시스템의 일부가 되는 2가 링 또는 링 시스템을 의미하고, 여기에서 상기 링 또는 링 시스템은 3 내지 20개 사이의 원자를 가지고, 상기 링 또는 링 시스템은 "4n+2" π 전자규칙에 의하여 정의되는 방향족 부분으로 구성되고 탄소원자 및 하나 이상의 질소, 황, 및/또는 산소 헤테로원자를 포함한다.
[0053] 본 발명의 문맥에서, 상기 용어 "치환된"은 연결기의 백본에 존재하는 하나 이상의 수소가 상기 지시된 원자의 정상 원자가가 제공되거나 치환되는 기의 적절한 원자가 초과되지 않으면 상기 지시된 기(들)로부터 선택되는 것으로 대체되는 것을 지시하는 것으로 의도된다. 상기 용어 "선택적으로 치환된"은 상기 연결기가 여기에서 정의된 바와 같이 하나 이상의 치환기로 여기에서 정의된 바와 같이 치환되거나 치환되지 않은 것을 의미하는 것으로 의도된다. 치환기가 케토(또는 옥소, 예를 들어 =O)기, 티오(thio) 또는 이미노(imino)기 또는 그와 유사한 것이면, 상기 연결기 백본 원자 상의 두 개의 수소가 대체된다. 예시적인 치환기는, 예를 들어, 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 시클로알킬(cycloalkyl), 헤테로시클로알킬(heterocycloalkyl), 아릴(aryl), 헤테로아릴(heteroaryl), 아랄킬(aralkyl), 헤테로아랄킬(heteroaralkyl), 아실(acyl), 아로일(aroyl), 헤테로아로일(heteroaroyl), 카르복실(carboxyl), 알콕시(alkoxy), 아릴옥시(aryloxy), 아실옥시(acyloxy), 아로일옥시(aroyloxy), 헤테로아로일옥시(heteroaroyloxy), 알콕시카르보닐(alkoxycarbonyl), 할로겐(halogen), (티오)에스테르((thio)ester), 시아노(cyano), 포스포릴(phosphoryl), 아미노(amino), 이미노(imino), (티오)아미도((thio)amido), 설프히드릴(sulfhydryl), 알킬티오(alkylthio), 아실티오(acylthio), 술포닐(sulfonyl), 황산염(sulfate),술폰산염(sulfonate), 술파모일(sulfamoyl), 술폰아미도(sulfonamido), 니트로(nitro), 아지도(azido), 퍼플루오로알킬(perfluoroalkyl) (예를 들어, 트리플루오로메틸)을 포함하는 할로알킬(haloalkyl), 할로알콕시(haloalkoxy), 알킬술판일(alkylsulfanyl), 알킬술피닐(alkylsulfinyl), 알킬술포닐(alkylsulfonyl), 알킬술포닐아미노(alkylsulfonylamino), 아릴술포노아미노(arylsulfonoamino), 포스포릴(phosphoryl), 인산염(phosphate), 포스포네이트(phosphonate), 포스피네이트(phosphinate), 알킬카르복시(alkylcarboxy), 알킬카르복시아미드(alkylcarboxyamide), 옥소(oxo), 히드록시(hydroxy), 메르캅토(mercapto), (선택적으로 예를 들어 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의해 모노- 또는 디-치환된) 아미노 , 이미노, 카르복스아마이드(carboxamide), (선택적으로 예를 들어 알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴에 의해 모노- 또는 디-치환된) 카르바모일(carbamoyl), 아미디노(amidino), 아미노술포닐(aminosulfonyl), 아실아미노(acylamino), 아로일아미노(aroylamino), (티오)우레이도((thio)ureido), (아릴티오)우레이도((arylthio)ureido), 알킬(티오)우레이도(alkyl(thio)ureido), 시클로알킬(티오)우레이도(cycloalkyl(thio)ureido), 아릴옥시(aryloxy), 아르알콕시(aralkoxy), 또는 -0(CH2)n-OH, -O(CH2)n-NH2, -0(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(0)0(CH2)nR, -(CH2)nN(H)C(0)OR, 또는 -N(R)S(0)2R 으로 여기에서 n은 1-4이고 R은 수소, -알킬, -알케닐, -알키닐, -시클로알킬, -시클로알케닐, -(C-연결된-헤테로시클로알킬), -(C-연결된-헤테로시클로알케닐), -아릴, 및 -헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되며 다중 치환이 허용되는 것을 포함한다. 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬 등, 또는 -OH, -NHR 등과 같은 기능기와 같은 치환기는 적절한 경우 그들 스스로도 치환될 수 있음은 당업자에 의하여 이해될 것이다. 또한 그들 스스로 치환된 부분은 적절할 때 치환될 수 있음이 당업자에 의하여 이해될 것이다.
[0054] 본 발명의 특정 실시예에 있어서, 상기 연결기 L이 다음 목록으로부터 선택된 m 기를 포함하고: 알킬렌(alkylene), 알케닐렌(alkenylene), 알키닐렌(alkynylene), 시클로알킬렌(cycloalkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 헤테로알케닐렌(heteroalkenylene), 헤테로알키닐렌(heteroalkynylene), 헤테로시클로알킬렌(heterocycloalkylene), 아릴렌(arylene), 헤테로아릴렌(heteroarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 및 헤테로아랄킬렌기(heteroaralkylene group), 여기에서 각 기는 선택적으로 독립적으로 치환될 수 있고, 상기 연결기는 다음 부분 중 어느 하나로부터 선택되는 n 부분을 독립적으로 더 포함하고: 이황화물(-S-S-), 에테르(-0-), 티오에테르(-S-), 아민 (-NH-), 에스테르 (-0-C(=0)- or -C(=0)-0-), 카르복사미드 (-NH-C(=0)- 또는 -C(=0)-NH-), 우레탄 (-NH-C(=0)-0- or -0-C(=0)-NH-), 및 요소(urea) 부분 (-NH-C(=0)-NH-), 여기에서 n m = n+1이다. 특정 실시예에서, m은 2이고 n은 1이거나, m이 3이고 n이 2이다. 특정 실시예에서, 상기 연결기는 2 또는 3 비치환 알킬렌기, 및 각각 비치환된 알킬렌기를 연결하는 1 또는 2 이황화물, 에테르, 티오에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄 또는 요소 부분을 포함한다.
[0055] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 타깃-결합 부분인 특이적으로 종양 세포에 존재하는 에피토프에 결합한다.
[0056] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 타깃-결합 부분은 특이적으로 Her-2/neu 또는 상피세포 부착분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)의 에피토프에 결합한다.
[0057] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 타깃-결합 부분은 다음으로 구성되는 군에서 선택된다: 항체 또는 그것의 항원-결합 단편; 항체-유사 단백질; 및 핵산 압토머.
[0058] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 항체 또는 상기 그것의 항원-결합 단편은 디아바디(diabody), 테트라바디(tetrabody), 나노바디(nanobody), 키메라 항체(chimeric antibody), 탈면역 항체(deimmunized antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 또는 인간 항체(human antibody)로부터 선택된다.
[0059] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일-사슬 Fv 및 이황화물-연결 Fvs(dsFv)로 구성된 군에서 선택된다.
[0060] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 항체는 허세틴(herceptin) 또는 HEA125, 또는 허세틴 또는 HEA125의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 단편이다.
[0061] 본 발명의 특정 실시예에서, 하나 이상의 아마톡신 분자는 하나의 타깃-결합 부분에 결합된다. 접합체 당 아마톡신의 수의 증가는 독성을 증가시킬 것이다. 따라서, 특정 실시예에서, 타깃-결합 부분의 아마톡신에 대한 비율은 1 타깃-결합 부분에 대해 2 내지 15 아마톡신 분자이고, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 또는 15 아마톡신 분자이다. IgGs와 같은 항체 다이머의 경우 상기 비율 계산 목적의 경우, 상기 다이머는 하나의 타깃-결합 부분으로 고려된다.
[0062] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 접합체는 의약의 용도를 갖는다.
[0063] 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 접합체는 암환자 치료용으로서, 상기 암은 췌장암, 담관암(cholangiocarcinoma), 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종(malignant melanoma), 백혈병, 및 악성 림프종으로 구성되는 군에서 선택된다.
[0064] 다른 측면에서, 본 발명은 암환자 치료용 방법에 대한 것으로서, 상기 암은 췌장암, 담관암(cholangiocarcinoma), 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종(malignant melanoma), 백혈병, 및 악성 림프종으로 구성되는 군에서 선택되고, 필요에 따라 환자에게 본 발명의 접합체 투여 단계를 포함한다.
[0065] 여기에서 사용되는 바와 같이, "환자"는 여기에서 설명한 타깃-결합 부분 독소 접합체의 치료에 의하여 이득을 볼 수 있는 어떤 포유동물 또는 조류를 의미한다. 바람직하게, "환자"는 실험용 동물(예를 들어 쥐(mouse) 또는 생쥐(rat)), 가축(예를 들어, 기니피그, 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개), 또는 인간을 포함한 영장류를 포함한다. 특히 바람직하게는 "환자"는 인간이다.
[0066] 여기에서 사용되는 바와 같이, 질병 또는 장애의 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"의 의미는 하나 이상의 다음 단계를 성취하는 것이다: (a) 상기 장애의 심각성의 감소; (b) 치료될 장애의 증상의 특징 발전을 제한 또는 억제; (c) 치료될 장애의 증상의 특징의 악화 억제; (d) 상기 장애를 이전에 앓았던 환자에 있어서 상기 장애의 재발을 제한 또는 억제; 및 (e) 상기 장애의 증상을 이전에 보인 환자에 있어서 증상의 재발을 제한 또는 억제.
[0067] 여기에서 사용되는 바와 같이, 치료는 환자에게 본 발명에 따른 접합체 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기에서 "투여"는 생체 내 투여(in vivo administration)뿐만 아니라 정맥 이식편과 같이 생체 외(ex vivo)로 조직에 직접적인 투여를 포함한다.
[0068] 특정 실시예에서, 본 발명의 접합체의 치료적으로 효과적인 양이 사용된다.
[0069] "치료적으로 효과적인 양"은 의도된 목적을 성취하기에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 주어진 치료제의 효과적인 양은 상기 치료제의 성질, 투여 경로, 상기 치료제를 투여받는 동물의 크기 및 종, 투여 목적과 같은 여러 요인에 의하여 다양할 것이다. 상기 각 개별 케이스에서 효과적인 양은 당 업계에서 이미 성립된 방법에 따라 당업자에 의하여 경험적으로 결정될 수 있다.
[0070] 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 접합체를 포함하는 약학적 조성물에 대한 것으로서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 캐리어, 첨가제, 필러, 바인더, 윤활제, 활주제(glidants), 정제 분해물질(disintegrants), 흡착제 및/또는 보존제를 더 포함한다.
[0071] "약학적으로 허용가능한"의 의미는 동물, 연방 또는 주정부의 관리기관에 승인되거나 또는 US 약전에 기재된, 또는 동물 더욱 바람직하게는 인간에 사용되기 위하여 약전으로 일반적으로 인식된 다른 약전에 기재된 것을 의미한다.
[0072] 특정 실시예에서, 상기 약학 조성물은 전신에 투여되는 의약의 형태로 이용된다. 이는 다른 주사 가능 물질 및 인퓨전(infusion)을 포함하는 비경구 형태를 포함한다. 주사가능물질은 앰플의 형태 또는 소위 즉시 사용 가능한 주사가능물질, 예를 들어 즉시 사용 가능한 주사기 또는 일회용 주사기에 사용되는 형태로 제형되고, 이 이외에는 특히 다중 철회를 위한 구멍뚤릴 수 있는 플라스크에서 사용되는 형태로 제형된다. 상기 주사가능물질의 투약은 피하(s.c), 근육 내(i.m.), 정맥(i.v.) 또는 피내(i.e.) 적용의 형태가 될 수 있다. 특히, 크리스탈 현탁액, 용액, 나노파티클, 또는 하이드로졸과 같은 콜로이드 분산계와 같이 각각 적용가능한 주사 제형을 생산하는 것이 가능하다.
[0073] 주사가능한 제형은 농축물로서 생산될 수도 있어 수용성 등장성 희석제에 용해 또는 분산될 수 있다. 상기 인퓨젼(infusion)은 등장성 용액, 지방성 에멀젼, 리포솜 제형 및 마이크로-에멀젼의 형태로 제조될 수 있다. 주사가능물질과 유사하게, 인퓨젼 제형은 희석을 위한 농축제의 형태로 제조될 수 있다. 주사 가능 물질 제형은 또한 환자 및 거동 가능한 치료, 예를 들어 미니-펌프의 방법으로 영구적인 인퓨전의 형태로 적용될 수 있다.
[0074] 비경구 약 제형에 예를 들어, 알부민, 플라스마, 익스펜더, 표면-활성 물질, 유기 희석제, pH-영향 물질, 복합 물질 또는 폴리머 물질을 추가하는 것이 가능하고, 특히 본 발명의 타깃-결합 부분 독소 접합체의 단백질 또는 폴리머에의 흡착에 영향을 미치는 물질을 추가하는 것이 가능하고, 또는 본 발명의 타깃-결합 부분 독소 접합체의 주사 기구 또는 패키지-물질, 예를 들어 플라스틱 또는 유리와 같은 물질에의 흡착을 감소시킬 목적을 위하여 첨가될 수도 있다.
[0075] 본 발명의 타깃-결합 부분 독소 접합체는 비경구로 마이크로캐리어 또는 나노파티클에 결합될 수 있으며, 예를 들어 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리락테이트(polylactates), 폴리글리콜레이트(polyglycolates), 폴리아미노산 또는 폴리에테르 우레탄에 기초한 미세 분산 입자에 결합될 수 있다. 비경구 제형은, 본 발명의 타깃-결합 부분 독소 접합체가 각각 미세 분산, 분산 및 현탁 형태로 도입되면, 예를 들어 "다중 유닛 원리(multiple unit principle)"에 기초한 저장 제제(depot preparation)로 변형될 수 있거나, 본 발명의 타깃-결합 부분 독소 접합체가 예를 들어 타블릿 또는 연속으로 이식된 로드와 같은 제형으로 동봉되면 의약에 있어서 또는 "싱글 유닛 원리"에 기초한 크리스탈의 현탁으로 변형될 수 있다. 이러한 싱글 유닛 및 다중 유닛 제형에서의 이식 또는 저장 의약은 종종 소위 생분해성 폴리머, 예를 들어 젖산 및 글리콜산의 폴리에스테르, 폴리에테르 우레탄, 폴리아미노산, 폴리(메트)아크릴레이트 또는 폴리사카라이드로 구성된다.
[0076] 비경구로 제형되는 본 발명의 약학 조성물의 제조 동안 첨가되는 어쥬번트 및 캐리어는 바람직하게 바람직하게 아쿠아 스터릴리사타(멸균수), 무기 또는 유기 산 또는 염기뿐만 아니라 그들의 염과 같은 pH 수치 영향 물질, pH 수치 조정을 위한 완충 물질, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 글루코스 및 프록토오스, 텐사이드(tensides) 및 계면활성제(surfactants), 각각과 같은 등장용 물질, 폴리옥시에틸렌 솔비탄의 지방산의 에스테르 부분(예를 들어, Tween®), 또는 폴리옥시에틸렌의 지방산 에스테르(예를 들어, Cremophor®), 땅콩오일, 대두 오일 또는 캐스터 오일과 같은 지방유, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트 및 중성오일 (예를 들어, Miglyol®)과 같은 지방산의 합성 에스테르 뿐만 아니라, 겔라틴, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머 어쥬번트, 프로필렌 글리콜, 에탄올, N,N-디메틸아세트아미드, 프로필렌 글리콜과 같은 유기용제의 용해성을 증가시키는 첨가제, 구연산염 및 요소와 같은 복합체 형성 물질, 벤조산, 하이드록시프로필 에스테르 및 메틸 에스테르, 벤질 알코올과 같은 보존제, 아황산나트륨과 같은 항산화제, EDTA와 같은 안정화제를 포함한다.
[0077] 바라직한 실시예에서 본 발명의 약학 조성물을 현탁액으로 제형화할 때, 본 발명의 타깃-결합 부분 독소 접합체의 세팅을 방지하는 농후제(thickening agents) 또는, 침전물의 재현탁성을 담보하는 텐시드(tenside) 및 고분자전해질(polyelectrolytes) 및/또는 예를 들어 EDTA와 같은 복합체 형성제가 첨가된다. 또한 다양한 폴리머로 활성 성분의 복합체를 형성하는 것이 가능하다. 상기 폴리머의 예시는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리스타이롤, 카르복시메틸 셀룰로오스, 플루오닉스® 또는 폴리에틸렌 글리콜 솔비트 지방산 에스테르이다. 본 발명의 타깃-결합 부분 독소 접합체는 또한 예를 들어 시클로덱스트린과 봉입 화합물의 형태로 액체 제형으로 통합될 수 있다. 특정 실시예에 있어서, 분산제가 어쥬번트에 더해 첨가될 수 있다. 동결건조물의 생산을 위하여, 만닛트(mannite), 덱스트란, 사카로스, 인간 알부민, 락토스, PVP 또는 겔라틴 변형체와 같은 스캐폴딩 제제가 이용될 수 있다.
[0078] 다른 측면에서, 본 발명은 필요에 따라 환자의 췌장암, 담관암(cholangiocarcinoma), 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종(malignant melanoma), 백혈병, 또는 악성 림프종의 치료방법에 대한 것으로서, 본 발명의 접합체 또는 약학 조성물의 효과적인 양을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
[0079] 다른 측면에서, 본 발명은 아마톡신에 연결된 연결기 L에 부착된 이탈기 X, 또는 아마톡신의 유사체를 포함하는 아마톡신-접합 분자에 대한 것으로서, 여기에서 상기 연결기 L는 아마노산 4의 T-N 원자를 통해 상기 아마톡신에 연결된다.
[0080] 특정 실시예에서, 본 발명은 화학식 I의 아마톡신-접합 분자에 대한 것이다:
Figure pct00003
[화학식 I]
여기에서:
R1 = H 또는 OH;
R2 = H 또는 OH;
R3 = NH2 또는 OH;
R4 = OH 또는 OC1 -6-알킬; 및
R5 = L-X; 여기에서 L은 연결기이고; X는 타깃-결합 부분의 친핵성 그룹에 의해 치환될 수 있는 이탈기이다.
[0081] 특정 실시예에서, 상기 친핵성 그룹은 일차 아민이다.
[0082] 특정 실시예에서, 상기 화학식 I의 아마톡신-접합체 분자는 α-아마니틴의 유도체 (R1 = OH; R2 = OH; 및 R3 = NH2)이다.
[0083] 특정 실시예에서, R4 는 O-Me이다.
[0084] 특정 실시예에서, 상기 연결기는 1 내지 8개 원자의 길이, 특히 1 내지 6개 원자의 길이, 더욱 특히 1 내지 4개 원자의 길이, 가장 특히 2 내지 4개 원자의 길이를 갖는다.
[0085] 특정 실시예에서, 상기 연결기 L은 알킬렌, 헤테로알킬렌, 알케닐렌, 헤테로알케닐렌, 알키닐렌, 헤테로알키닐렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 아랄킬렌, 또는 선택적으로 치환된, 헤테로아랄킬렌 기이다.
[0086] 특정 실시예에서, 상기 연결기 L은 다음 부분 중 어느 하나로부터 서택된 부분을 포함한다: 이황화물, 에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄 및 요소 부분.
[0087] 특정 실시예에서, 상기 기능기 X는 다음으로부터 선택된다: t부틱옥시, 숙신이미딜옥시(succinimidyloxy), 1-0-숙신이미딜옥시-3-술포네이트 (Sulfo-NHS), 0-(4-니트로페닐옥시), O-(3-니트로페닐옥시), 0-(2,4-디니트로페닐옥시), 0-(2,4-디클로로-6-니트로페닐옥시), 펜타플루오로페닐옥시, 펜타클로로페닐옥시, 0-(2,4,5-트리클로로페닐옥시), 0-(3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1 ,2,3-벤조트리아진-3-일), 0-(엔도-1 -하이드록시-5-노르보넨-2,3-디카르복시미드-1-일), 1-프탈이미돌옥시(1-phthalimidoyloxy), 1-벤조트리아졸릴옥시(1-benzotriazolyloxy), 1 -(7-아자-벤조트리아졸릴)옥시 및 N-이미다졸릴(N-imidazolyl).
[0088] 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아마톡신 접합체의 합성방법에 대한 것으로서, 본 발명의 아마톡신-접합체 분자를 친핵성 그룹, 특히 일차 아민을 포함하는 타깃-결합 부분과 반응시키는 단계를 포함한다.
[0089] 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아마톡신-접합체 분자의 합성방법에 대한 것으로서, (i) 아마톡신을 연결기 분자 Y-L-X와 반응시키는 단계를 포함하는 것으로서, 여기에서 Y는 상기 아마톡신의 아마노산 4의 1'-N 원자와 반응할 수 있는 부분이고, 여기에서 X는 타깃-결합 부분의 친핵성 그룹, 특히 일차 아민에 의해 대체될 수 있는 이탈기이다.
[0090] 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 아마톡신-접합체 분자의 합성방법에 대한 것으로서, (i) 아마톡신을 연결기 분자 Y-L-Z와 반응시키는 단계를 포함하는 것으로서, 여기에서 Y는 상기 아마톡신의 아마노산 4의 1'-N 원자와 반응할 수 있는 부분이고, 여기에서 Z는 이탈기 X로 전환될 수 있는 부분으로서 타깃-결합 부분의 친핵성 그룹, 특히 일차 아민에 의하여 대체될 수 있다.
[0091] 특정 실시예에서, 상기 아마톡신은 연결기 분자 Y- L-X, 또는 Y-L-Z와 각각 반응하고, 여기에서 Y는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다: O-Tos (O-Tos = 토실레이트); I; Br, 및 O-Tf (O-Tf = 트리플레이트). 특정 실시예에서, 상기 아마톡신은 Y-L-X, 또는 Y-L-Z 각각으로, 염기 특히 KOtBu, LiOH 또는 NaH,의 존재에서, 용매 특히 극성, 비양자성 용매, 예를 들어 DMF, DSO 또는 NMP에서 처리된다.
[0092] 특정 실시예에서, 상기 Z기는 보호된 일차 아미노기, 특히 NH-C(=0)OtBu 이다. 특정 실시예에서, 상기 보호된 일차 아미노는 처음으로 탈보호되고 탄산 유도체, 예를 들어 DSC(dihydroxysuccinimido carbonate)에 의하여 활성화된다.
[0093] 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 아마톡신-연결기 분자에 대한 것으로서, 여기에서 R1 내지 R4는 상기에서 정의된 봐와 같고; 여기에서 R5=L-Z이고; 여기에서 L은 연결기이고; 여기에서 Z는 이탈기 X로 전환될 수 있고, 타깃-결합 부분의 친핵성 그룹, 특히 일차 아민에 의하여 대체될 수 있는 부분이다.
실시예
하기에서, 본 발명은 비제한적인 실시예들에 의하여 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1
N1' 연결기 아마니틴의 합성
1.1 N1' -6- 아미노헥실 -6'-0- 메틸 -α- 아마니틴 ( HDP 30.0378)의 제조
Figure pct00004

[0094] 4.86 mg (5.21 pmol) 0-메틸-α-아마니틴은 500㎕ 건조 DMSO에 용해시켰다. 아르곤 하에서, 11.68mg (41.67 μmol) Boc-아미노헥실 프로마이드 및 DMSO에서 52.1mM 포타슘 t-부타놀레이트 용액 100㎕가 첨가되었다. 추가적으로 5.21mM 스톡 용액(stock solution)의 포타슘 t-부타놀레이트가 첨가되었다: 1.5h에 50㎕; 4h에 50㎕, 6h에 50㎕. 19h 후에, 100㎕ 포타슘 t-부타놀레이트 및 11.96mg (41.67μmol) Boc-아미노헥실 프로마이드가 첨가되었다. 21h 후에, 상기 반응 혼합물이 DMSO에 100mM 아세트산 용액 104㎕로 켄칭(quenched)되었다.
상기 조생성물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼: 크로마실 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물(0.05% TFA), 유속: 26.0 ml/min, λ = 295 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물: 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 경사: 0-5 분 100% A; 5-20 분 0% A; 20-25 분 0% A; 25-27 분 100% A; 27-35 분 100% A; 머무름 시간 19.2-20.9분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 고체로 증발되었다.
[0095] 4.81 mg (81 %) HDP 30.0368; MS: 1133 (M+H+).
Figure pct00005

[0096] 4.75 mg (4.19 μmol) HDP 30.0368 가 200㎕ 트리플루오로아세트산에서 용해되어 2분동안 교반되었다. 상기 반응 혼합물이 주변온도에서 건조로 증발되었고, 1000㎕ 톨루엔 및 10000㎕ 아세토니트릴로 상호-증발되었다. 상기 조생성물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼: 크로마실 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물 (0.05% TFA), 유속: 26.0 ml/min, λ = 295 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물: 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 경사: 0-5 분 100% A; 5-20 분 0% A; 20-25 분 0% A; 25-27 분 100% A; 27-35 분 100% A; 머무름 시간 14.9-15.5 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 증발되어 분말로 동결건조되었다.
[0097] 1.54mg (32%) HDP 30.0378; MS: 1033 (M+H+).
1.2 N1' -8- 아미노옥틸aminooctyl -6'-0- 메틸 -α- 아마니틴 ( HDP 30.0516)의 제조
Figure pct00006

[0098] 12.43 mg (13.32 μmol) O-메틸-α-메틸아마니틴은 750㎕ 건조 DMSO에서 용해하였다. 40.00 mg (129.76 μmol) N-Boc-8-aminobromoactane 및 DMSO/물 1:1에서의 0.1M LiOH 용액 120㎕가 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 아르곤 하에서 실온에서 교반되었다. 18h 후에, 추가적인 80㎕ LiOH가 첨가되고, 36h후에 40㎕, 39h 후에 50㎕, 44h 후에 80㎕가 첨가되었다. DMSO 및 물은 높은 진공에서 제거되었고, 잔여물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼: 크로마실 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물 (0.05% TFA), 유속: 10.0 ml/min, λ = 230 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물: 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A; 27-35 분 100% A; 머무름 시간 37.0 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었다.
[0099] 흰 분말로서 3.96 mg (26%) HDP 30.0496. MS: 1160 (M+H+).
Figure pct00007
[00100] 3.96 mg (3.41 μmol) HDP 30.0496 가 300㎕ 트리플루오로아세트산에 용해되었고 실온에서 2.5분 동안 교반되었다. 상기 반응 혼합물은 1000㎕ 톨루엔으로 희석되었고 주변 온도에서 증발시켜 건조하였다. 잔여물은 동일 부피의 톨루엔로 2회 상호-증발시켰다. 잔여물은 LaPrep-HPLC상에서 정제되었다: 컬럼: 크로마실 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물 (0.05% TFA), 유속: 10.0 ml/min, λ = 230 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물: 90% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A; 머무름 시간 21.0 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었다.
[00101] 흰 분말로서 2.66mg (74%) HDP 30.0516. MS: 1060 (M+H+); 1083 (M+Na+).
1.3 N1' -6- 아미노부틸 -6'-0- 메틸 -α- 아마니틴 HDP 30.0592의 제조
Figure pct00008
[00102] 1 1.88 mg (12.74 μmol) O-메틸-α-아마니틴이 500㎕ 건조 DMSO에 용해시켰다. 아르곤 하에서, 20.00 mg (79.32 pmol) Boc-아미노부틸 브로마이드 및 포타슘 t-부타놀레이트의 0.25mM의 83.4㎕가 첨가되었다. 20.00 mg (79.32 pmol) Boc-아미노부틸 브로마이드 및 83.4㎕ 포타슘 t-부타놀레이트의 부가적인 부분이 상기 반응 기간 동안 각 시간에 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 8h 후에 아세트산 100㎕로 퀀칭되었다. 상기 조생성물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물, 유속: 15.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 100% 물. 용매 B: 100% 메탄올. 경사: 0분 95% A; 0-5 분 50% A; 5-10 분 30% A; 10-20 분 20% A; 20-45분 5% A. 머무름 시간 16.5분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 증발되었다.
[00103] 5.10 mg (36%) HDP 30.0587; MS: 1104.5 (M+H+).
Figure pct00009

[00104] 5.10 mg (4.61 μmol) HDP 30.0587 가 1000㎕ 트리플루오로아세트산에 용해시켜 2분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물이 주변 온도에서 증발시켜 진공에서 건조시켰다. 조생성물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물, 유속: 15.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 5% 물: 95% 메탄올, 0.05% 트리플루오로아세트산. 경사: 0분 100% A; 0-5 분 50% A; 5-10 분 30% A; 10-20 분 20% A; 20-45분 0% A. 머무름 시간 10.0분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 증발되었다.
[00105] 3.48 mg (75%) HDP 30.0592 흰 분말 MS: 1004.4 (M+H+).
1.4 Nl' -6- 아미노펜틸 -6'-O- 메틸 -α- 아마니틴 HDP 30.0644의 제조
Figure pct00010

[00106] 8.40 mg (9.00 μmol) O-메틸-α-메틸아마니틴이 400㎕ 건조 DMSO에서 용해시켰다. 29.00 mg (108.94 μmol) N-Boc-5-아미노브로모펜탄 및 물에서의 1M LiOH 용액 14.20 ㎕이 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 아르곤 하에서 실온에서 교반되었다. 4h 후에, 추가적인 7.10 ㎕ LiOH가 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 6h 후에 100㎕ 아세트산으로 퀀칭되었고, DMSO 및 물이 높은 진공에서 제거되었다. 잔여물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼; 크로마실 (Kromasil) 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물, 유속: 10.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물: 95% 메탄올. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A. 머무름 시간 30 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었다.
[00107] HDP 30.0636가 흰 분말로 획득되었다. MS: 1 118.5 (M+H+). 생성물은 다음 단계를 위하여 사용되었다.
Figure pct00011

[00108] HDP 30.0636 는 400㎕ 트리플루오로아세트산에 용해시켜 실온에서 5분 동안 교반되었다. 상기 반응 혼합물은 1000㎕ 톨루엔으로 희석하여 주변 온도에서 건조되게 증발시켰다. 고체 잔여물은 동일 부피 톨루엔으로 2회 상호-증발시켰고, LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼; 크로마실 (Kromasil) 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물 (0.05% TFA), 유속: 10.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올; 0.05 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물: 90% 메탄올; 0.05 트리플루오로아세트산. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A. 머무름 시간 18.0 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었다.
[00109] 0.51 mg 흰 분말 (6%, 총괄 수득율) HDP 30.0644. MS: 1018.4 (M+H+).
1.5 N1 -t- 부틸프로피오닐 -6-0- 메틸 -α- 아마니틴 HDP 30. 0678 의 제조
Figure pct00012

[00110] 7.04 mg (7.55 μmol) O-메틸-α-메틸아마니틴을 500㎕ 건조 DMSO에 용해시켰다. 물에서의 1 M LiOH 용액 14.10 ㎕이 첨가되었다. 상기 반응 혼합물을 5분 동안 아르곤 하에서 실온에서 교반하였고, 20㎕ 1-클로로프로피온산-t-부틸에스테르가 첨가되었다. 1h 후에 20.00㎕ LiOH 및 20.00㎕ 1-클로로프로피온산-t-부틸에스테르가 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 2h 후에 100㎕ 아세트산으로 퀀칭되었다. DMSO 및 물이 높은 진공에서 제거되었고, 잔여물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼; 크로마실 (Kromasil) 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물, 유속: 10.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물: 95% 메탄올. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A. 머무름 시간 26.0 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었다.
[00111] HDP 30.0677 은 흰 고체로 획득되었다. MS: 1047.4 (M+H+). 잔여물은 다음 단계에서 사용되었다.
Figure pct00013
[00112] HDP 30.0677 은 500㎕ 트리플루오로아세트산에 용해시켜 실온에서 4분 동안 교반되었다. 상기 반응 혼합물은 주변 온도에서 건조되도록 증발시켰다. 잔여물은 5 ml 톨루엔으로 2회 상호 증발시켰다. 상기 흰 잔여물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼; 크로마실 (Kromasil) 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물(0.05% TFA), 유속: 10.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올; 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물: 90% 메탄올; 0.05% 트리플루오로아세트산. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A. 머무름 시간 18.0 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었다.
[00113] 1.90mg (25%) HDP 30.0678 흰 분말. MS: 991.3 (M+H+).
1.6 N1' -4- Boc - 아미노메틸벤질 -6'-O- 메틸 -α- 아마니틴 HDP 30.0683의 제조
Figure pct00014
[00114] 8.90 mg (9.54 μmol) O-메틸-α-메틸아마니틴은 500㎕ 건조 DMSO 에서 용해시켰다. 물에서의 1M LiOH 용액 21.4㎕가 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 아르곤 하에서 10분 동안 교반되었고, 20.0 mg (78.40 μmol) 4-Boc-아미노벤질 클로라이드가 한번에 첨가되었다. 18h 후에, 상기 반응 혼합물은 100㎕ 아세트산으로 퀀칭되었다. DMSO 및 물은 높은 진공에서 제거되었고, 잔여물은 LaPrep-HPLC 상에서 정제되었다: 컬럼; 크로마실 (Kromasil) 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물, 유속: 10.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올. 용매 B: 5% 물: 95% 메탄올. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A. 머무름 시간 34.0 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었고, 이에 의하여 흰 잔여물로서 HDP 30.0680가 획득되었다. MS: 1152.5 (M+H+). 상기 생성물은 다음 단계를 위하여 사용되었다.
Figure pct00015

[00115] HDP 30.0680는 500㎕ 트리플루오로아세트산에서 용해시켜 실온에서 10분 동안 교반하여 주변 온도에서 건조되도록 증발시켰다. 상기 잔여물은 4ml 톨루엔으로 2회 상호-증발시켰다. 상기 흰 분말은 LaPrep-HPLC 상에서 정제하였다: 컬럼; 크로마실 (Kromasil) 100-C18, 10 ㎛, 250 x 20 mm, 메탄올/물(0.05% TFA), 유속: 10.0 ml/min, λ = 290 nm에서 측정. 용매 A: 95% 물: 5% 메탄올; 0.05% 트리플루오로아세트산. 용매 B: 10% 물: 90% 메탄올; 0.05% 트리플루오로아세트산. 경사: 0-5 분 80% A; 5-10 분 50% A; 10-20 분 30% A; 20-50 분 20% A. 머무름 시간 18.4 분을 갖는 분획이 수집되고 상기 용매는 진공에서 증발되었다.
[00116] 3.15 mg (31%) HDP 30.0683 흰 분말. MS: 1052.4 (M+H+).
실시예 2
아마톡신 접합체 합성
HDP 30.0378 접합체 Her - DSC -30.0378 [2.8]의 합성
Figure pct00016
[00117] 1.0 mg HDP 30.0378 는 100㎕ 건조 DMF(dimethylformamide)에서 용해시켰다. 아르곤 하에서 실온에서 교반하고, DMF에서의 디하이드록시숙신이미도 카르보네이트 (DSC) 용액 10.4㎕ (100㎕ DMF에서 2.56mg) 및 2.1㎕ 트리에틸아민을 한번에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 교반되었다. 12h 후에, 30ml 차가운 디에틸에테르가 첨가되었다. 상기 침전물을 수집하여 디에틸에테르로 수회 세척하여 진공에서 건조하였다. 잔존 고체는 200㎕ DMF = 용액 A에서 획득되었다. 12.0 mg 허셉틴(Herceptin)이 4.0 ml PBS (phosphate buffered saline, pH = 7.4) = 용액 B에서 용해시켰다. 용액 A 및 용액 B를 결합시켰다. 허셉틴 아마니틴-연결기 용액은 14h 동안 4℃에서 흔들었고, 세파덱스 G-25 겔여과 크로마토그래피(XK-16 column; 2 ml/min)에 의하여 분리되었다. 상기 G-25 컬럼은 500 ml PBS 용액, pH = 7.4로 미리-세척되었다. 상기 Her-DSC-30.0378 접합체 분획은 UV 흡수에 의하여 측정되었다. 단백질 농도는 RotiQuant-Assay (Carl Roth; Germany)에 의하여 결정되었다. 허셉틴의 아마니틴 페이로드는 A = 280 nm 및 A = 310 nm에서 UV 흡수의 측정으로 결정되었다. 각 허셉틴 분자를 위한 2.8 아마니틴 분자의 독소 페이로드가 계산되었다.
실시예 3
인 비트로(in vitro)에서 HER2 -양성 종양 세포주에 대한 Her - DSC -30.0378 [2.8] 의 세포독성
[00118] Her-DSC-30.0378 [2.8]의 세포독성 활성은 HER2-양성 종양 세포주 SK-OV-3 (난소) 및 인 비트로에서 화학발광 BrdU 결합 분석 (Roche Diagnostics)으로 평가되었다. 세포 생존율은 37℃ 및 5% C02에서 Her-DSC-30.0378 [2.8]의 서로 다른 농도로 인큐베이션 72h 후에 BMG 랩테크 옵티마 마이크로플레이트 리더에서 항-BrdU-HRP 항체로 고정 및 투과성이 된 세포의 측정을 통하여 측정되었다. 투여량-반응 곡선의 EC50 수치는 그래프패드 프리즘 4.0 소프트웨어 (Graphpad Prism 4.0 software)에 의하여 계산되었다. SK-OV-3 세포에 대한 Her-DSC-30.0378 [2.8]를 위한 EC50는 4.1x10-11 M이다 (도 2 참조).

Claims (20)

  1. 화학식 I의 아마니틴 접합체:
    Figure pct00017

    [화학식 I]
    여기에서
    R1 = H 또는 OH;
    R2 = H 또는 OH;
    R3 = NH2 또는 OH;
    R4 = OH 또는 OC1 -6-알킬; 및
    R5 = L-T; 여기에서 L은 연결기이고; T는 타깃 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서,
    여기에서 상기 연결기는 요소(urea) 부분을 통하여 타깃-결합 부분에 연결되는 것인 아마톡신 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 타깃-결합 부분은 상기 타깃-결합 부분에 존재하는 아미노 기를 통하여 상기 연결기 L에 연결되고,
    여기에서 상기 아미노기는 상기 요소 부분의 일부를 형성하는 것인 아마톡신 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연결기는 1 내지 8개 원자의 길이, 바람직하게는 1 내지 6개의 원자의 길이, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 원자의 길이, 가장 바람지가게는 2 내지 4개의 원자의 길이를 갖는 것인 아마톡신 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연결기 L은 알킬렌(alkylene), 헤테로알킬렌(heteroalkylene), 알케닐렌(alkenylene), 헤테로알케닐렌(heteroalkenylene), 알키닐렌(alkynylene), 헤테로알키닐렌(heteroalkynylene), 시클로알킬렌(cycloalkylene), 헤테로시클로알킬렌(heterocycloalkylene), 아릴렌(arylene), 헤테로아릴렌(heteroarylene), 아랄킬렌(aralkylene), 또는 선택적으로 치환된 헤테로아랄킬렌기(heteroaralkylene group)인 아마톡신 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기에서 상기 연결기 L은 다음 부분 중 어느 하나로부터 선택된 부분을 포함하는 것인 아마톡신 접합체: 이황화물, 에테르, 아민, 에스테르, 카르복사미드, 우레탄, 및 요소 부분.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 타깃-결합 부분은 종양 세포에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하고,
    특히 상기 타깃-결합 부분은 상피세포 부착분자 (epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 아마톡신 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기에서 상기 타깃-결합 부분은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 것인 아마톡신 접합체:
    (i) 항체 또는 그들의 항원-결합 단편;
    (ii) 항체-유사 단백질; 및
    (iii) 핵산 압토머.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 타깃-결합 부분은 다음으로부터 선택되는 항체 또는 그들의 항원-결합 단편인 것인 아마톡신 접합체: 디아바디(diabody), 테트라바디(tetrabody), 나노바디(nanobody), 키메라 항체, 탈면역화된 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fd, Fv, 단일-사슬 Fv, 및 이황화물-연결 Fvs (dsFv)로 구성된 군에서 선택되는 것인 아마톡신 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 아마신 접합체의 의약 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 아마신 접합체의 환자의 암 치료 용도로서,
    상기 암은 췌장암, 담관암(cholangiocarcinoma), 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종(malignant melanoma), 백혈병, 및 악성 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 것인 용도.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 아마신 접합체를 포함하는 약학 조성물로서,
    하나 이상의 약학적 허용가능한 희석제, 캐리어, 첨가제, 필러, 바인더, 윤활제, 활주제(glidants), 정제 분해물질(disintegrants), 흡착제 및/또는 보존제를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
  14. 화학식 I의 아마톡신-접합체 분자로서,
    여기에서 R1 내지 R4는 제1항에서 정의된 것이고;
    여기에서 R5= L-X이고; 여기에서 L은 연결기이고; X는 타깃-결합 부분의 친핵성 그룹에 의하여 대체될 수 있는 이탈기인 것인 아마톡신-접합체 분자.
  15. 제14항에 있어서,
    여기에서 X는 일차 아민에 의하여 대체될 수 있는 이탈기인 것인 아마톡신-접합체 분자.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    여기에서 X는 다음에서 선택되는 것인 아마톡신-접합체 분자:
    -t부틸옥시, -숙신이미딜옥시(-succinimidyloxy), -l-O-숙신이미딜옥시-3-설포네이트 (-Sulfo-NHS), -0-(4-니트로페닐옥시), -0-(3-니트로페닐옥시), -0-(2,4-디니트로페닐옥시), -0-(2,4-디클로로- 6-니트로페닐옥시), -펜타플루오로페닐옥시(-pentafluorophenyloxy), -펜타클로로페닐옥시( -pentachlorophenyloxy), -0-(2,4,5- 트리클로로페닐옥시), -O-(3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥시-1,2,3-벤조트리아진-3-일), -O-(엔도-1-하이드록시-5-노보넨-2,3-디카르복시미드-1-일), -1-프탈리미도일옥시(-1 -phthalimidoyloxy), -1벤조트리아졸릴옥시(-1-benzotriazolyloxy), -1-(7-아자-벤조트리아졸릴)옥시), 및 -N-이미다졸릴(-N-imidazolyl).
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 아마톡신 접합체 합성 방법에 있어서,
    제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 아마톡신-접합체 분자를 친핵성 그룹을 포함하는 타깃-결합 부분과 반응시키는 단계를 포함하는 것인 합성 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 친핵성 그룹은 일차 아민인 것인 합성 방법.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 아마톡신 접합체 또는 제13항의 약학 조성물을 환자에게 투여 단계를 포함하는 환자에서의 암 치료 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 담관암(cholangiocarcinoma), 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 난소암, 위암, 신장암, 악성 흑색종(malignant melanoma), 백혈병, 및 악성 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
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