BR112013023015B1 - Conjugado de amatoxina e seu uso, composição farmacêutica e seu uso, molécula de conjugação de amatoxina, método para a síntese de um conjugado de amatoxina - Google Patents
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Abstract
CONJUGADO DE AMATOXINA E SEU USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E SEU USO, MOLÉCULA DE CONJUGAÇÃO DE AMATOXINA, MÉTODO PARA A SÍNTESE DE UM CONJUGADO DE AMATOXINA. A invenção refere-se à terapia de tumores. Em um aspecto, a presente invenção refere-se a conjugados de uma amatoxina e uma porção de ligação alvo, por exemplo, um anticorpo, ligados por certas ligações, que são úteis no tratamento de câncer. Num outro aspecto, a invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo tais conjugados.
Description
[0001] A invenção refere-se a terapia de tumores. Num aspecto, a presente invenção refere-se a conjugados de uma amatoxina e uma porção de ligação ao alvo, por exemplo, um anticorpo, ligados por certas ligações, que são úteis no tratamento do câncer. Num outro aspecto, a invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo tais conjugados.
[0002] Amatoxinas são peptídeos cíclicos compostos de 8 aminoácidos. Elas podem ser isoladas a partir de cogumelos Amanita phalloides ou preparados sinteticamente. Amatoxinas inibem especificamente a RNA polimerase II dependente de DNA de células de mamíferos, e, assim, também a transcrição e a biossíntese de proteínas das células afetadas. Inibição da transcrição numa célula provoca parada do crescimento e proliferação. Embora não ligado covalentemente, o complexo entre amanitina e RNA-polimerase II é muito firme (KD = 3 nM). A dissociação de amanitina a partir de enzima é um processo muito lento, tornando assim a recuperação de uma célula afetada improvável. Quando a inibição da transcrição dura muito tempo, a célula vai sofrer morte celular programada (apoptose).
[0003] A utilização de amatoxinas como porções citotóxicas para terapia de tumor já foi explorada em 1981 por ligação de um anticorpo anti-Thy 1,2 a α-amanitina usando um ligante ligado ao anel de indol de Trp (aminoácido 4, ver Figura 1) por meio de diazotação (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). Davis & Preston identificaram o sítio de ligação como a posição 7'. Morris & Venton demonstraram como a substituição na posição 7' resulta num derivado, que mantém a atividade citotóxica (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 21 419430).
[0004] O pedido de patente EP 1 859 811 A1 (publicado em 28 de novembro de 2007) descreve conjugados, em que o átomo C y do aminoácido de amatoxina 1 de β-amanitina foi ligado diretamente, ou seja, sem uma estrutura ligante, a albumina ou ao anticorpo monoclonal HEA125, OKT3, ou PA-1. Além disso, o efeito inibitório destes conjugados sobre a proliferação de células de câncer de mama (MCF-7), células de linfoma de Burkitt (Raji), e células de linfoma T (Jurkat) foi mostrado. Sugeriu-se a utilização de ligantes, incluindo ligantes que compreendem elementos, tais como amida, éster, éter, tioéter, dissulfeto, ureia, tioureia, porções de hidrocarboneto e semelhantes, mas estes constructos não foram mostrados, e mais detalhes, tais como sítios de ligação nas amatoxinas, não foram fornecidos.
[0005] Os pedidos de patente WO 2010/115629 e WO 2010/115630 (ambos publicados em 14 de outubro de 2010) descrevem conjugados, onde os anticorpos, tais como anticorpos anti-EpCAM como anticorpo humanizado huHEA125, são acoplados a amatoxinas via (i) o átomo C y do aminoácido amatoxina 1, (ii) o átomo C 6’ do aminoácido amatoxina 4, ou (iii) através do átomo C δ do aminoácido amatoxina 3, em cada caso, quer diretamente quer através de um ligante entre o anticorpo e as amatoxinas. Os ligantes sugeridos compreendem elementos tais como amida, éster, éter, tioéter, dissulfureto, ureia, tioureia, porções de hidrocarboneto e semelhantes. Além disso, os efeitos inibidores destes conjugados sobre a proliferação de células do câncer de mama (linhagem celular MCF-7), carcinoma pancreático (linhagem celular Capan-1), câncer de cólon (linhagem celular Colo205), e colangiocarcinoma (linhagem celular OZ) foram mostrados.
[0006] Sabe-se que amatoxinas são relativamente não-tóxicas quando acopladas a grandes biomoléculas transportadoras, tais como moléculas de anticorpos, e que exercem a sua atividade citotóxica apenas após a biomolécula transportadora ser clivada. Em função da toxicidade das amatoxinas, particularmente para as células do fígado, é da maior importância que os conjugados da amatoxina para a terapia de tumores alvo permaneçam altamente estáveis no plasma após a administração, e que a liberação da amatoxina ocorra após interiorização nas células-alvo. Neste contexto, pequenas melhorias da estabilidade do conjugado podem ter consequências drásticas para a janela terapêutica e para a segurança dos conjugados de amatoxina para abordagens terapêuticas.
[0007] Assim, houve uma grande necessidade na arte anterior para a porção de ligação alvo dos conjugados de amatoxina que são estáveis no plasma, de modo que os efeitos secundários nocivos para as células não alvo sejam minimizados.
[0008] A presente invenção baseia-se na observação inesperada de que as porções alvo podem ser ligadas às amatoxinas através de ligantes nos sítios de ligação adicionais sobre o aminoácido triptofano 4, ou seja, as posições 1'-N, sem interferência com a interação de tais amatoxinas com o seu alvo, a RNA polimerase II dependente de DNA de células de mamíferos.
[0009] Assim, a presente invenção refere-se a um conjugado que compreende uma porção de ligação alvo ligada através de um ligante L a uma amatoxina, ou um análogo de uma amatoxina, caracterizado por o ligante L ser ligado à amatoxina através do átomo 1’-N do aminoácido 4.
[0010] Num aspecto, a presente invenção refere-se a um conjugado de amatoxina de Fórmula I
em que: R1 = H ou OH; R2 = H ou OH; R3 = NH2 ou OH; R4 = OH ou OC1-6-alquila; e R5 = LT, em que L representa um ligante, e T é uma porção de ligação alvo.
[0011] Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende o conjugado de acordo com a presente invenção.
[0012] Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de conjugação de amatoxina de Fórmula I, em que R1 a R4 são como definidos acima, e em que R5 = L-X; em que L representa um ligante, e X é um grupo de saída que pode ser substituído por um grupo nucleofílico de uma porção de ligação alvo, em particular uma amina primária.
[0013] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a síntese de um conjugado da presente invenção, compreendendo a etapa de reação de uma molécula de conjugação de amatoxina da presente invenção com uma porção de ligação alvo compreendendo um grupo nucleofílico, em particular uma amina primária.
[0014] A Fig. 1 mostra as fórmulas estruturais de diferentes amatoxinas. Os números em negrito (1 a 8) designam a numeração padrão dos oito aminoácidos que formam a amatoxina. As designações padrão dos átomos nos aminoácidos 1, 3 e 4 também são mostradas (letras gregas α a Y, letras gregas α a δ, e números de 1' a 7', respectivamente).
[0015] A Fig. 2 mostra a atividade citotóxica de Her-DSC-30,0378 [2,8] em uma linhagem de células de tumor positivo HER2 in vitro num ensaio BrdU após incubação durante 72 h.
[0016] Antes de a presente invenção ser descrita em detalhe abaixo, é para ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia em particular, protocolos e reagentes descritos aqui uma vez que estes podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares, e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que vulgarmente entendidos por um técnico na arte.
[0017] Preferencialmente, os termos aqui utilizados são definidos conforme descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, HGW, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiça).
[0018] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", serão entendidas como implicando a inclusão de um inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas.
[0019] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos aqui citados (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, submissões de sequência de Número de Acesso do GenBank, etc), quer supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade, na medida do possível sob a respectiva lei de patentes. Nada contido aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não tem direito a antedatar tal divulgação em virtude de invenção anterior.
[0020] A presente invenção será agora mais descrita. Nas passagens seguintes os diferentes aspectos da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos, a menos que expressamente indicado o contrário. Em particular, qualquer característica indicada como sendo preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferidas ou vantajosas.
[0021] Assim, a presente invenção refere-se a um conjugado que compreende uma porção de ligação alvo ligada através de um ligante L a uma amatoxina, ou um análogo de uma amatoxina, caracterizado por o ligante L ser ligado à amatoxina através do átomo N 1' do aminoácido 4.
[0022] No contexto da presente invenção, o termo "conjugado" refere-se a uma molécula que compreende pelo menos duas moléculas diferentes ligadas por uma ligação covalente.
[0023] O termo "porção de ligação alvo", como aqui utilizado, refere-se a qualquer molécula ou parte de uma molécula que pode se ligar especificamente a uma molécula alvo ou epítopo alvo. Porções de ligação alvo preferidas no contexto do presente pedido de patente são (i) anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos; (ii) proteínas do tipo anticorpo; e (iii) aptâmeros de ácidos nucleicos. "Porções de ligação alvo" adequadas para utilização na presente invenção tipicamente têm uma massa molecular de 40000 Da (40 kDa) ou mais.
[0024] Como aqui utilizado, um primeiro composto (por exemplo, um anticorpo) é considerado como "ligado especificamente" a um segundo composto (por exemplo, um antígeno, tal como uma proteína alvo), se ele tem uma constante de dissociação KD para o referido segundo composto de 100 μM ou menos, preferivelmente de 50 μM ou menos, preferivelmente de 30 μM ou menos, de preferência 20 μM ou menos, de preferência 10 μM ou menos, de preferência 5 μM ou menos, mais preferivelmente 1 μM ou menos, mais preferivelmente 900 μM ou menos, mais preferivelmente 800 μM ou menos, mais preferivelmente 700 μM ou menos, com maior preferência de 600 μM ou inferior, com maior preferência de 500 μM ou menos, mais preferivelmente 400 μM ou menos, mais preferivelmente 300 μM ou menos, com maior preferência de 200 μM ou menos, ainda mais preferencialmente 100 μM ou menos, ainda mais de preferência de 90 μM ou menos, ainda mais de preferência de 80 μM ou menos, ainda mais de preferência de 70 μM ou menos, ainda mais de preferência de 60 μM ou menos, ainda mais de preferência de 50 μM ou menos, ainda mais de preferência de 40 μM ou menos, mesmo mais de preferência 30 μM ou menos, mesmo mais de preferência 20 μM ou menos, e ainda mais de preferência 10 μM ou menos.
[0025] No contexto do presente pedido o termo "molécula alvo" e "epítopo alvo", respectivamente, refere-se a um antígeno e um epítopo de um antígeno, respectivamente, que está especificamente ligado por uma porção de ligação alvo. De preferência, a molécula alvo é um antígeno associado a tumor, em particular, um antígeno ou um epítopo que está presente na superfície de um ou mais tipos de células de tumor em uma concentração aumentada e / ou com uma configuração estérica diferente em relação à superfície de células não tumorais. De preferência, o referido antígeno ou epítopo está presente na superfície de um ou mais tipos de células tumorais, mas não sobre a superfície de células não tumorais. Em determinadas concretizações, a porção de ligação ao alvo se liga especificamente a um epítopo de HER-2/neu ou moléculas de adesão de células epiteliais (EpCAM). Em outras formas de realização, o referido antígeno ou epítopo é preferencialmente expresso em células envolvidas em doenças auto-imunes. Em particular, nestas formas de realização, a porção de ligação alvo se liga especificamente a um epítopo do receptor IL-6 (IL-6R).
[0026] O termo "anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo", tal como é aqui utilizado, refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno imunoespecificamente. Também são compostos de proteínas do tipo imunoglobulina que são selecionadas por meio de técnicas, incluindo, por exemplo, apresentação de fagos para se ligar especificamente a uma molécula alvo, por exemplo, à proteína alvo Her-2/neu ou EpCAM. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina. "Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos" adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados (em particular, enxertados com CDR), deimunizados, ou anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv), fragmentos Fab, fragmentos F (ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, ou diacorpos ou tetracorpos (Holliger, P. et al., 1993), nanocorpos, anti-idiotípicos (anti- Id), anticorpos (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos da presente invenção), e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos citados acima.
[0027] Em algumas formas de realização os fragmentos de ligação ao antígeno são fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno humano da presente invenção e incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia simples (scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligados por dissulfureto (dsFv) e fragmentos compreendendo um ou outro domínio VL ou VH. Os fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos de cadeia simples, podem compreender o domínio(s) variável isoladamente ou em combinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região de dobra, domínios CL, CH1, CH2 e CH3. Também estão incluídos na invenção fragmentos de ligação ao antígeno, também compreendendo qualquer combinação de domínio(s) variável com uma região de dobra, domínios CL, CH1, CH2 e CH3.
[0028] Anticorpos utilizáveis na presente invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. De preferência, os anticorpos são de humanos, roedores (por exemplo, camundongo, rato, porquinho da índia, ou coelho), frango, porco, ovelha, cabra, camelo, vaca, cavalo, burro, gato, ou de origem canina. É particularmente preferido que os anticorpos sejam de origem humana ou murina. Tal como aqui utilizado, “anticorpos humanos” incluem anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, por exemplo, na Patente dos EUA No. 5.939.598 por Kucherlapati e Jakobovits.
[0029] O termo "proteína tipo anticorpo" refere-se a uma proteína que tem sido preparada (por exemplo, por mutagênese de laços) que se liga especificamente a uma molécula alvo. Tipicamente, uma proteína tipo anticorpo compreende pelo menos um laço de peptídeo variável ligado em ambas as extremidades a um esqueleto de proteína. Esta dupla limitação estrutural aumenta a afinidade de ligação do anticorpo tipo proteína a níveis comparáveis aos de um anticorpo. O comprimento do laço de peptídeo variável consiste tipicamente de 10 a 20 aminoácidos O esqueleto de proteína pode ser qualquer proteína tendo boas propriedades de solubilidade. De preferência, o esqueleto de proteína é uma pequena proteína globular. Proteínas tipo anticorpos incluem, sem limitação, corpos afins, anticalinas e proteínas de repetição de anquirina projetadas (para revisão ver: Binz et al. 2005). Proteínas tipo anticorpos podem ser derivadas de grandes bibliotecas de mutantes, por exemplo, serem deslocadas de grandes bibliotecas de exibição de fagos e podem ser isoladas de um modo análogo aos anticorpos regulares. Além disso, proteínas de ligação tipo anticorpo podem ser obtidas por mutagênese combinatória de resíduos expostos de superfície nas proteínas globulares.
[0030] O termo "aptâmero de ácido nucleico" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi projetada através de ciclos repetidos de seleção in vitro ou SELEX (evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial) para se ligar a uma molécula alvo (para uma revisão ver: Brody e Gold , 2000). O aptâmero de ácido nucleico pode ser uma molécula de DNA ou RNA. Os aptâmeros podem conter modificações, por exemplo, nucleotídeos modificados tais como 2'-flúor-pirimidinas substituídas.
[0031] Tal como aqui utilizado, um "análogo" de um composto é estruturalmente relacionado, mas não idêntico ao composto e apresenta pelo menos uma atividade do composto. O composto em que o análogo é comparado é conhecido como o composto "parental". As atividades mencionadas antes incluem, sem limitação: atividade de ligação a outro composto, atividade inibidora, por exemplo, atividade inibidora da enzima; efeitos tóxicos; atividade de ativação, por exemplo, atividade de ativação da enzima. Não é necessário que o análogo apresente tal atividade para a mesma extensão que o composto parental. Um composto é considerado como um análogo, no contexto do presente pedido, se ele exibe a atividade relevante para um grau de pelo menos 1% (mais preferivelmente pelo menos 5%, mais preferencialmente pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30%, mais preferencialmente pelo menos 40%, e mais preferencialmente pelo menos 50%) da atividade do composto parental. Assim, um "análogo de uma amatoxina", como é aqui utilizado, refere-se a um composto que é estruturalmente relacionado com qualquer uma das α-amanitina, β-amanitina, y- amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, e ácido amanulínico como mostrado na FIG. 1, e que apresenta pelo menos 1% (mais preferivelmente pelo menos 5%, mais preferencialmente pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, e mais preferencialmente pelo menos 50 %) da atividade inibidora contra a RNA polimerase II de mamífero, em comparação com pelo menos uma das α-amanitina, β-amanitina, Y-amanitina, ε- amanitina, amanina, amaninamida, amanulina e ácido amanulínico.Um "análogo de uma amatoxina" adequado para utilização na presente invenção pode ainda apresentar uma maior atividade inibidora contra a RNA polimerase II de mamífero de qualquer uma das α-amanitina, β-amanitina, Y—amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina ou ácido amanulínico. A atividade inibidora pode ser medida por determinação da concentração a qual ocorre 50% de inibição (valor de IC 50). A atividade inibidora contra a RNA polimerase II de mamífero pode ser determinada indiretamente por medição da atividade inibitória sobre a proliferação celular. Um ensaio adequado para a medição da inibição da proliferação de células é descrito nos exemplos.
[0032] Um "análogo semissintético" refere-se a um análogo que foi obtido por síntese química, utilizando compostos de fontes naturais (por exemplo, materiais de plantas, culturas bacterianas, ou culturas de células) como material de partida. Tipicamente, um "análogo semissintético" da presente invenção tem sido sintetizado a partir de um composto isolado de um cogumelo da família Amanita. Em contraste, um "análogo sintético" refere-se a um análogo sintetizado pela chamada síntese total a partir de pequenos blocos de construção (tipicamente petroquímicos). Normalmente, esta síntese total é levada a cabo sem a ajuda de processos biológicos.
[0033] Tal como aqui utilizado, um "conjugado de aptâmero" refere-se a um conjugado da toxina da porção de ligação alvo em que a porção de ligação alvo é um aptâmero de ácido nucleico de acordo com a alternativa (iii) acima.
[0034] Um "ligante", no contexto da presente invenção, refere- se a uma molécula que é a ligação entre dois componentes, sendo cada um deles ligado a uma das extremidades do ligante, e que aumenta a distância entre os dois componentes e alivia a interferência estérica entre esses componentes, tal como no presente caso entre a porção de ligação alvo e a amatoxina. Na ausência de um agente de ligação, uma ligação direta de amatoxina à porção de ligação alvo pode diminuir a capacidade da amatoxina para interagir com a RNA polimerase II. Em concretizações particulares, um ligante tem cadeias contínuas de entre 1 e 30 átomos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 átomos, sendo assim, no contexto da presente invenção, o termo "entre" é utilizado de modo que as fronteiras mencionadas estão incluídas), no seu esqueleto, ou seja, o comprimento do ligante é definido como a ligação mais curta, como medida pelo número de átomos ou ligações entre a porção de amatoxina e a porção de ligação alvo, em que um lado do esqueleto do ligante tem sido reagido com a amatoxina e, do outro lado, com uma porção de ligação alvo. No contexto da presente invenção, um ligante é de preferência um alquileno C1-20, heteroalquileno C1-20, alcenileno C2-20, heteroalcenileno C220, alcinileno C2-20, heteroalcinileno C2-20, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, ou um grupo heteroaralquileno, opcionalmente substituído. O ligante pode conter um ou mais elementos estruturais, tais como carboxamida, éster, éter, dissulfeto, tioéter, ureia, tioureia, radicais de hidrocarbonetos e semelhantes. O ligante também pode conter combinações de dois ou mais destes elementos estruturais. Cada um destes elementos estruturais pode estar presente no ligante mais do que uma vez, por exemplo, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou seis vezes. Em algumas concretizações, o ligante pode compreender uma ligação de dissulfeto. Entende-se que o ligante tem de ser fixado num único passo ou em dois ou mais passos subsequentes a amatoxina e a porção de ligação alvo. Para esse efeito, o ligante irá levar dois grupos, de preferência a uma extremidade proximal e distal, que pode (i) formar uma ligação covalente com um grupo presente num dos componentes a ser ligado, de preferência, um grupo atirado em uma amatoxina ou peptídeo de ligação alvo ou (ii) que é, ou pode ser ativado para formar uma ligação covalente com um grupo em uma amatoxina. Por conseguinte, é preferível que os grupos químicos estejam na extremidade distal e proximal do ligante, que são o resultado de uma tal reação de acoplamento, por exemplo, um éster, um éter, um uretano, uma ligação peptídica, etc.
[0035] No contexto da presente invenção, o termo "amatoxina" inclui todos os peptídeos cíclicos constituídos por oito aminoácidos, isolados do gênero Amanita descrito em Wieland, T. e Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit. Rev. Biochem. dezembro de 1978, 5 (3): 185-260), e, além disso, inclui todos os derivados químicos da mesma; todos os outros análogos semi- sintéticos da mesma; igualmente todos os análogos sintéticos da mesma construídos a partir de blocos de construção de acordo com a estrutura mestre dos compostos naturais (cíclico, 8 aminoácidos), todos os outros análogos sintéticos ou semi- sintéticos que contêm aminoácidos não hidroxilados em vez dos aminoácidos hidroxilados, todos os novos análogos sintéticos ou semi-sintéticos, em que a porção sulfóxido tioéter é substituída por um sulfureto, sulfona, ou por átomos diferentes de enxofre, por exemplo, um átomo de carbono como em um carbo análogo de amanitina, em cada caso em que esse derivado ou análogo é funcionalmente ativo, inibindo RNA polimerase II de mamíferos.
[0036] Funcionalmente, amatoxinas são definidas como peptídeos ou depsipeptídeos que inibem RNA polimerase II de mamíferos. Amatoxinas preferidas são aquelas com um grupo funcional (por exemplo, um grupo carboxílico, um grupo amino, um grupo hidroxila, um tiol ou um grupo tiol de captura) que pode ser reagido com moléculas de ligação de ligantes ou porções de ligação alvo tal como definidas acima. Amatoxinas que são particularmente adequadas para os conjugados da presente invenção são α-amanitina, β-amanitina, Y—amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina e ácido amanulínico como mostrado na FIG. 1, bem como sais, derivados químicos, análogos semi-sintéticos, e análogos sintéticos destes. Amatoxinas particularmente preferidas para utilização na presente invenção são α-amanitina, β-amanitina e amaninamida.
[0037] Tal como aqui utilizado, um "derivado químico" (ou curto: um "derivado") de um composto refere-se a uma espécie possuindo uma estrutura química que é semelhante a do composto, mas contendo pelo menos um grupo químico não presente no composto e / ou deficiente de pelo menos um grupo químico que está presente no composto. O composto ao qual o derivado é comparado é conhecido como o composto "parental". Tipicamente, um "derivado" pode ser produzido a partir do composto parental em uma ou mais etapas de reação química.
[0038] Em concretizações particulares da presente invenção, a amatoxina é selecionada de α-amanitina, β-amanitina, Y-amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ou ácido amanulínico, ou a partir dos sais ou seus análogos.
[0039] Num aspecto, a presente invenção refere-se a um conjugado de amatoxina de Fórmula I
em que: R1 = H ou OH; R2 = H ou OH; R3 = NH2 ou OH; R4 = OH ou OC1-6-alquila; e R5 = LT, em que L representa um ligante, e T é uma porção de ligação alvo.
[0040] Numa concretização particular, o conjugado de amatoxina de Fórmula I é um derivado de α-amanitina (R1 = OH, R2 = OH e R3 = NH2).
[0041] Numa concretização particular, R4 é O-Me.
[0042] Numa concretização particular, o ligante é ligado a uma porção de ligação alvo através de uma porção de ureia.
[0043] No contexto da presente invenção, o termo "ligado a uma porção de ligação alvo através de uma porção de ureia" refere-se a uma conexão entre o ligante e a porção de ligação alvo, em que a porção de ligação alvo está ligada diretamente ao ligante através de uma -NH-C(O)-NH-.
[0044] Em concretizações particulares da presente invenção, a porção de ligação alvo está ligada ao ligante L através de um grupo amino presente na porção de ligação alvo, em que o referido grupo amino faz parte da referida porção de ureia.
[0045] Em concretizações particulares, o ligante tem um comprimento de entre 1 e 8 átomos, em particular entre 1 e 6, mais particularmente entre 1 e 4, e mais particularmente entre 2 e 4 átomos. Assim, um ligante de etileno tem um comprimento de ligante de 2 átomos, um ligante de 3 átomos de propileno, e um ligante butileno de quatro átomos
[0046] Em concretizações particulares da presente invenção, o ligante L compreende um ou mais grupos, em especial um, dois ou três grupos, selecionados a partir da lista de: alquileno, alcenileno, alcinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalcenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, e um grupo heteroaralquileno, em que cada grupo pode opcionalmente ser independentemente substituído.
[0047] O termo "alquileno" refere-se a grupos hidrocarbonetos saturados bivalentes de cadeia linear possuindo de 1 a 20 átomos de carbono, incluindo os grupos com 1 a 10 átomos de carbono. Em certas concretizações, os grupos de alquileno podem ser grupos de alquileno de baixo peso molecular. O termo "alquileno de baixo peso molecular" refere-se a grupos de alquileno com 1 a 6 átomos de carbono, e em certas formas de realização de 1 a 5 ou 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos de alquileno incluem, mas não estão limitados a, metileno (-CH2-), etileno (-CH2-CH2-), n- propileno, n-butileno, n-pentileno e n-hexileno.
[0048] O termo "alcenileno" refere-se a grupos bivalentes de cadeia linear com 2 a 20 átomos de carbono, em que pelo menos uma das ligações carbono-carbono é uma ligação dupla, ao passo que outras ligações podem ser ligações simples ou mais ligações duplas. O termo "alcinileno" refere-se a grupos que têm 2 a 20 átomos de carbono, em que pelo menos uma das ligações carbono- carbono é uma ligação tripla, enquanto que outras ligações podem ser ligações simples, duplas ou triplas. Exemplos de grupos alcenileno incluem etenileno (-CH = CH-), 1-propenileno, 2- propenileno, 1-butenileno, 2-butenileno, 3-butenileno, e semelhantes. Exemplos de grupos alcinileno incluem etinileno, 1- propinileno, 2-propinileno, e assim por diante.
[0049] Tal como aqui utilizado, "cicloalquileno" pretende referir-se a um anel bivalente sendo parte de qualquer sistema monocíclico estável ou policíclico, em que tal anel possui entre 3 e 12 átomos de carbono, mas nenhum heteroátomo, e quando esse anel é totalmente saturado, e o termo "cicloalquenileno" pretende referir-se a um anel bivalente sendo parte de qualquer sistema monocíclico estável ou policíclico, em que tal anel possui entre 3 e 12 átomos de carbono, mas nenhum heteroátomo, e quando esse anel é, pelo menos parcialmente insaturado (mas excluindo qualquer anel arileno). Exemplos de cicloalquilenos incluem, mas não estão limitados a, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno e cicloheptileno. Exemplos de cicloalcenilenos incluem, mas não estão limitados a, ciclopentenileno e ciclohexenileno.
[0050] Tal como aqui utilizado, os termos "heterocicloalquileno" e "heterocicloalquenileno" destinam-se a referir a um anel bivalente sendo parte de qualquer sistema monocíclico estável ou de anel policíclico, em que tal anel tem entre 3 e cerca de 12 átomos, e em que tal anel consiste em átomos de carbono e, pelo menos, um heteroátomo, em particular, pelo menos, um heteroátomo independentemente selecionado do grupo que consiste em N, O e S, com heterocicloalquileno referindo-se a um anel que é totalmente saturado, e heterocicloalquenileno referindo-se a um anel que é, pelo menos, parcialmente insaturado (mas excluindo qualquer arileno ou anel heteroarileno).
[0051] O termo "arileno" é destinado a significar um anel bivalente ou sistema de anel sendo parte de qualquer sistema monocíclico estável ou policíclico, em que tal anel ou sistema de anel tem entre 3 e 20 átomos de carbono, mas não tem nenhum heteroátomo, o qual o sistema de anel ou anel consiste de uma porção aromática, tal como definido pela regra de elétrons π "4n +2", incluindo fenileno.
[0052] Tal como é usado aqui, o termo "heteroarileno" refere-se a um anel bivalente ou sistema de anel sendo parte de qualquer sistema mono- ou policíclico estável, em que tal anel ou sistema de anel tem entre 3 e 20 átomos, cujo anel ou sistema de anel consiste numa porção aromática, tal como definido pela regra de elétrons π "4n +2" e contém átomos de carbono e um ou mais nitrogênios, enxofre e / ou heteroátomos de oxigênio.
[0053] No contexto da presente invenção, o termo "substituído" pretende indicar que um ou mais átomos de hidrogênio presentes no esqueleto de um ligante é substituído com uma seleção do grupo(s) indicado, desde que a valência normal do átomo indicado, ou do átomo apropriado do grupo que é substituído, não seja excedida e que a substituição resulte em um composto estável. O termo "opcionalmente substituído" pretende significar que o ligante é não substituído ou substituído, tal como aqui definido anteriormente, com um ou mais substituintes, como aqui definido. Quando um substituinte é um grupo ceto (ou oxo, ou seja, = O), um grupo tio ou imino ou semelhante, então dois átomos de hidrogênio no átomo do esqueleto ligante são substituídos. Exemplos de substituintes incluem, por exemplo, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, heterocicloalquil, aril, heteroaril, aralquil, heteroaralquil, acil, aroil, heteroaroil, carboxil, alcoxi, ariloxi, aciloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alcoxicarbonil, halogênio, (tio) éster, ciano, fosforil, amino, imino (tio) amido, sulfidril, alquiltio, aciltio, sulfonil, um sulfato, um sulfonato, um sulfamoil, uma sulfonamida, nitro, azido, haloalquil, incluindo perfluoroalquil (como trifluorometil), haloalcoxi, alquilsulfanil, alquilsulfinil, alquilsulfonil, alquilsulfonilamino, arilsulfonoamino, fosforil, fosfato, fosfonato, fosfinato, alquilcarboxi, alquilcarboxiamida, oxo, hidroxi, mercapto, amino (opcionalmente mono- or di-substituído, por exemplo, por alquil, aril, ou heteroaril), imino, carboxamida, carbamoil (opcionalmente monoou di-substituído, por exemplo, por alquil, aril, ou heteroaril), amidina, aminosulfonil, acilamino, aroilamino, (tio)ureida, ariltio)ureida, alquil(tio)ureida, cicloalquil(tio)ureida, ariloxi, aralcoxi, ou -O(CH2)n-OH, - O(CH2)n-NH2, -O(CH2)nCOOH, -(CH2)nCOOH, -C(O)O(CH2)nR, - (CH2)nN(H)C(O)OR, ou -N(R)S(O)2R em que n é 1-4 e R é independentemente selecionado de hidrogênio, -alquil, -alquenil, -alquinil, -cicloalquil, -cicloalquenil, -(C-ligado- heterocicloalquil), -(C-ligado-heterocicloalquenil), -aril, e - heteroaril, com múltiplos graus de substituição sendo concedidos. Será entendido pelos técnicos na arte que os substituintes, tais como heterocicloalquil, aril, heteroaril, alquil, etc, ou grupos funcionais tais como -OH, -NHR, etc, podem eles próprios ser substituídos, se for o caso. Será também entendido pelos técnicos na arte que os próprios radicais substituídos podem ser substituídos também quando apropriado.
[0054] Em concretizações particulares da presente invenção, em que o ligante L compreende grupos selecionados a partir da lista de: alquileno, alcenileno, alcinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalcenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, e um grupo heteroaralquileno, em que cada grupo pode opcionalmente ser substituído, independentemente, o ligante compreende ainda uma porção n independentemente selecionada a partir de um dos seguintes radicais: um dissulfeto (-SS-), um éter (-O-), um tioéter (-S-), uma amina (- NH-), um éster (-O-C(= O) - ou -C (= O)-O-), uma carboxamida (-NH-C (= O) - ou-C (= O)-NH-), um uretano (-NH-C (= O)-O- ou -OC (= O)-NH-), e uma porção de ureia (-NH-C (= O)-NH-), em que m = n + 1. Em concretizações particulares m é 2 e n é 1, ou m é 3 e n é 2. Em concretizações particulares, o ligante compreende 2 ou 3 grupos alquileno não substituídos, e 1 ou 2, respectivamente, dissulfureto, tioéter, éter, amina, éster, carboxamida, uretano ou porções de ureia que ligam os grupos alquileno não substituídos.
[0055] Em concretizações particulares da presente invenção, a porção de ligação alvo se liga especificamente a um epítopo que está presente numa célula de tumor.
[0056] Em concretizações particulares da presente invenção, a porção de ligação alvo se liga especificamente a um epítopo Her- 2/neu ou molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM).
[0057] Em concretizações particulares da presente invenção, a porção de ligação alvo é selecionada a partir do grupo consistindo em: anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; proteínas do tipo anticorpo; e aptâmero de ácido nucleico.
[0058] Em concretizações particulares da presente invenção, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno deste é selecionado a partir de um diacorpo, um tetracorpo, um nanocorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo deimunizado, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano.
[0059] Em concretizações particulares da presente invenção, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado dentre o grupo consistindo em Fab, F (ab')2, Fd, Fv, Fv de cadeia simples, e Fvs ligados por dissulfureto (dsFv).
[0060] Em concretizações particulares, o anticorpo é Herceptin ou HEA125, ou um fragmento de anticorpo compreendendo o fragmento de ligação de antígeno de herceptina ou HEA125.
[0061] Em concretizações particulares, mais do que uma molécula de amatoxina é ligada a uma porção de ligação alvo. Um aumento do número de amatoxinas por conjugado também vai aumentar a toxicidade. Por conseguinte, numa forma de realização especial, a relação da porção de ligação alvo para amatoxina é entre uma porção de ligação alvo, entre 2 e 15 moléculas de amatoxina, particularmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 ou 15. Para efeitos de cálculo da relação, no caso de anticorpos, tais como dímeros de IgG, o dímero é considerado como uma porção de ligação alvo.
[0062] Em concretizações particulares da presente invenção, o conjugado é para utilização como um medicamento.
[0063] Em concretizações particulares da presente invenção, o conjugado é para utilização no tratamento de câncer em um paciente, em que o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo de câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer da mama, câncer coloretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia e linfoma maligno.
[0064] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de câncer em um paciente, em que o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo de câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer de mama, câncer coloretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia e linfoma maligno, que compreende a etapa de administração de um conjugado da presente invenção a um paciente com necessidade da mesma.
[0065] Tal como aqui utilizado, um "paciente" significa qualquer mamífero ou ave, que pode beneficiar-se de um tratamento com os conjugados de toxina da porção de ligação alvo aqui descritos. De preferência, um "paciente" é selecionado a partir do grupo consistindo em animais de laboratório (por exemplo, camundongo ou rato), animais domésticos (incluindo, p.ex., cobaia, coelho, galinha, porco, ovelha, cabra, camelo, vaca, cavalo, burro, gato, ou cão), ou primatas, incluindo seres humanos. É particularmente preferido que o "paciente" seja um ser humano.
[0066] Tal como aqui utilizado, "tratar", "tratando" ou "tratamento" de uma doença ou distúrbio significa realizar uma ou mais das seguintes características: (a) reduzir a gravidade da desordem, (b) limitar ou prevenir o desenvolvimento de sintomas característicos do distúrbio (s) a ser tratado, (c) inibir o agravamento dos sintomas característicos da doença (s) a ser tratada, (d) limitar ou prevenir a recorrência da doença (s) em pacientes que tenham tido a doença (s); e (e) limitar ou prevenir a recorrência dos sintomas em pacientes que antes eram sintomáticos para a doença (s).
[0067] Tal como aqui utilizado, o tratamento pode compreender a administração de um conjugado ou de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção a um paciente, em que "administração" inclui a administração in vivo, bem como a administração direta ao tecido ex vivo, tais como enxertos de veias.
[0068] Em determinadas concretizações, uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado da presente invenção é utilizada.
[0069] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade de um agente terapêutico suficiente para atingir o objetivo pretendido. A quantidade eficaz de um determinado agente terapêutico irá variar de acordo com fatores tais como a natureza do agente, a via de administração, o tamanho e espécie do animal a receber o agente terapêutico, e o objetivo da administração. A quantidade eficaz em cada caso individual pode ser determinada empiricamente por um técnico na arte de acordo com os métodos estabelecidos na arte.
[0070] Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende o conjugado de acordo com a presente invenção, que compreende ainda um ou mais diluentes farmaceuticamente aceitáveis, transportadores, excipientes, enchimentos, ligantes, lubrificantes, deslizantes, desintegrantes, adsorventes e / ou conservantes.
[0071] "Farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora Federal ou do governo estadual ou listados na Farmacopéia dos EUA ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos.
[0072] Em concretizações particulares, a composição farmacêutica é utilizada sob a forma de um medicamento administrado sistemicamente. Isto inclui parenterais que compreendem, entre outros, injetáveis e infusões. Injetáveis são formulados sob a forma de ampolas ou como os chamados injetáveis prontos-para- uso, por exemplo, seringas prontas-para-uso ou seringas de uso único e afora isso em frascos puncionáveis para retirada múltipla. A administração de injetáveis pode ser na forma de administração subcutânea (sc), intramuscular (im), intravenosa (iv) ou de aplicação intracutânea (ic). Em particular, é possível produzir respectivamente as formulações de injeção capazes como uma suspensão de cristais, soluções ou sistemas nanoparticular ou um tipo colóide disperso como, por exemplo, hidrossóis.
[0073] Formulações injetáveis podem ainda ser produzidas como concentrados que podem ser dissolvidos ou dispersos com diluentes isotônicos aquosos. A infusão pode também ser preparada na forma de soluções isotônicas, emulsões gordas, formulações de lipossomas e micro-emulsões. Semelhantes a injetáveis, formulações de infusão podem também ser preparadas na forma de concentrados para diluição. Formulações injetáveis também podem ser aplicadas na forma de infusões permanentes tanto na terapia do paciente e em regime ambulatório, por exemplo, por meio de mini-bombas.
[0074] É possível adicionar a formulações farmacêuticas parenterais, por exemplo, albumina, plasma, expansor, substâncias tensioativas, diluentes orgânicos, substâncias que influenciam o pH, substâncias complexantes ou substâncias poliméricas, em especial como substâncias para influenciar a adsorção dos conjugados da toxina da porção de ligação alvo da invenção de proteínas ou polímeros ou também podem ser adicionadas com o objetivo de reduzir a adsorção dos conjugados da toxina da porção de ligação alvo da invenção de materiais como instrumentos de injeção ou materiais de embalagem como, por exemplo, plástico ou vidro.
[0075] Os conjugados da toxina da porção de ligação alvo da invenção podem ser ligados a microtransportadores ou nanopartículas em parenterais, como, por exemplo, a partículas dispersas finamente baseadas em poli(met)acrilatos, polilactatos, poliglicolatos, poliaminoácidos ou poliéter- uretanos. Formulações parenterais também podem ser modificadas como preparações de depósito, por exemplo, com base no “princípio de unidades múltiplas”, se os conjugados da toxina da porção de ligação alvo da invenção são introduzidos em formas finamente dispersas, dispersas e suspensas, respectivamente, ou como uma suspensão de cristais em que o medicamento, ou em função do "princípio da unidade única" se os conjugados da toxina da porção de ligação alvo da invenção estão incluídos numa formulação, por exemplo, em um comprimido ou uma haste que é subsequentemente implantada. Estes implantes ou medicamentos de depósito em uma única unidade e formulações de unidades múltiplas consistem frequentemente dos chamados polímeros biodegradáveis, como por exemplo, poliésteres de ácido lático e ácido glicólico, poliéter-uretanos, poliaminoácidos, poli(met)acrilatos ou polissacarídeos.
[0076] Adjuvantes e transportadores acrescentados durante a produção das composições farmacêuticas da presente invenção formulados como parenterais são de preferência do aqua sterilisata (esterilizados em água), substâncias que influenciam o valor de pH, como, por exemplo, ácidos ou bases orgânicas ou inorgânicas, bem como os seus sais, substâncias de tamponamento para ajustar os valores de pH, substâncias para isotonização como, por exemplo, cloreto de sódio, hidrogeno carbonato de sódio, glicose e frutose, agentes tensoativos e surfactantes, respectivamente, e emulsionantes como, por exemplo, ésteres parciais de ácidos graxos de sorbitanos de polioxietileno (por exemplo, Tween®) ou , por exemplo, ésteres de ácidos graxos de polioxietilenos (por exemplo, Cremophor®), óleos gordos, como, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja ou óleo de rícino, ésteres sintéticos de ácidos graxos, como, por exemplo, oleato de etil, miristato de isopropil e óleo neutro (por exemplo, Miglyol®), bem como adjuvantes poliméricos, como, por exemplo, gelatina, dextrano, polivinilpirrolidona, aditivos que aumentam a solubilidade dos solventes orgânicos como, por exemplo, propileno glicol, etanol, N,N-dimetilacetamida, propilenoglicol ou substâncias formadoras de complexos como, por exemplo citratos e ureia, conservantes como, por exemplo, éster hidroxipropil do ácido benzoico e metil éster, álcool benzil, antioxidantes, como por exemplo sulfito de sódio e estabilizantes, como por exemplo, EDTA.
[0077] Ao formular as composições farmacêuticas da presente invenção, tal como suspensões, em uma realização preferida, agentes de espessamento para evitar a fixação dos conjugados da toxina da porção de ligação alvo da invenção ou, tensoativos e polieletrólitos para assegurar a resuspensabilidade de sedimentos e / ou agentes de formação de complexo como, por exemplo, EDTA são adicionados. É também possível alcançar os complexos do ingrediente ativo com vários polímeros. Exemplos de tais polímeros são polietileno glicol, polistirol, carboximetilcelulose, Pluronics® ou éster de ácido graxo de sorbito polietilenoglicol. Os conjugados da toxina da porção de ligação alvo da invenção podem também ser incorporados em formulações líquidas sob a forma de compostos de inclusão como, por exemplo, com ciclodextrinas. Em concretizações particulares agentes dispersantes podem ser adicionados como adjuvantes adicionais. Para a produção de agentes de esqueletos liofilizados como manitol, dextrano, sacarose, albumina humana, lactose, PVP ou variedades de gelatina podem ser utilizados.
[0078] Num outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de tratamento de câncer do pâncreas, colangiocarcinoma, câncer de mama, câncer coloretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia, ou linfoma maligno num paciente que dele necessite, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um conjugado ou composição farmacêutica da presente invenção.
[0079] Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de conjugação de amatoxina compreendendo um grupo X ligado a um ligante L ligado a uma amatoxina, ou um análogo de uma amatoxina, em que o ligante L é ligado a amatoxina via átomo 1'-N do aminoácido 4.
[0080] Em certas formas de realização de tais aspectos, a presente invenção refere-se a uma molécula de conjugação de amatoxina de Fórmula I
em que: R1 = H ou OH; R2 = H ou OH; R3 = NH2 ou OH; R4 = OH ou OC1-6-alquil; e R5 = L-X, em que L representa um ligante, e X é um grupo de saída que pode ser substituído por um grupo nucleofílico de uma porção de ligação alvo.
[0081] Numa concretização particular, o grupo nucleofílico é uma amina primária.
[0082] Numa concretização particular, a molécula de conjugação de amatoxina de Fórmula I é um derivado de α-amanitina (R1 = OH, R2 = OH e R3 = NH2).
[0083] Numa concretização particular, R4 é O-Me.
[0084] Em concretizações particulares, o ligante tem um comprimento entre 1 e 8 átomos, particularmente entre 1 e 6, mais particularmente entre 1 e 4, e mais particularmente entre 2 e 4 átomos.
[0085] Em certas concretizações, o ligante L é um grupo alquileno, heteroalquileno, alcenileno, heteroalcenileno, alcinileno, heteroalcinileno, cicloalquileno, heterocicloalcileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, ou um grupo heteroaralcileno, opcionalmente substituído.
[0086] Em certas concretizações, o ligante L compreende uma porção selecionada a partir de um dos seguintes radicais: um dissulfeto, um éter, uma amina, um éster, uma carboxamida, um uretano, e uma porção de ureia.
[0087] Em certas concretizações, o grupo funcional X é selecionado a partir de: t-butiloxi, succinimidiloxi, 1-O- succinimidiloxi-3-sulfonato (sulfo-NHS), S-(4-nitrofeniloxi), O-(3-nitrofeniloxi), O-(2,4-dinitrofeniloxi), O-(2,4-dicloro-6- nitrofeniloxi), pentafluorofeniloxi, pentaclorofeniloxi, O- (2,4,5-triclorofeniloxi), O-(3,4-di-hidro-3-hidroxi-4-oxo- 1,2,3-benzotriazina-3-il), O-(endo-1-hidroxi-5-norborneno-2,3- dicarboximida-1-il), 1-ftalimidoiloxi, 1-benzotriazoliloxi, 1- (7-aza-benzotriazolil) oxi, e N-imidazolil.
[0088] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a síntese de um conjugado de amatoxina da presente invenção, compreendendo a etapa de reação de uma molécula de conjugação de amatoxina da presente invenção com uma porção de ligação alvo compreendendo um grupo nucleofílico, particularmente uma amina primária.
[0089] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para sintetizar uma molécula de conjugação de amatoxina da presente invenção, compreendendo a etapa de (i) reagir uma amatoxina com uma molécula ligante Y-L-X, em que Y é uma porção que pode reagir com um átomo 1'-N do aminoácido 4 da amatoxina, e em que X é um grupo de saída que pode ser substituído por um grupo nucleofílico de uma porção de ligação alvo, em particular por uma amina primária.
[0090] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para sintetizar uma molécula de conjugação de amatoxina da presente invenção, compreendendo a etapa de (i) reagir uma amatoxina com uma molécula ligante Y-L-Z, em que Y é uma porção que pode reagir com um átomo 1'-N do aminoácido 4 da amatoxina, e em que Z é um radical que pode ser convertido num grupo de saída X, que pode ser substituído por um grupo nucleofílico de uma porção de ligação alvo, em particular por uma amina primária.
[0091] Em certas concretizações, a amatoxina é reagida com uma molécula ligante Y-L-X ou Y-L-Z, respectivamente, em que Y é selecionado dentre o grupo constituído por: O-Tos (O-Tos = tosilato); I; Br; e O-Tf (O-Tf = triflato). Em algumas dessas formas de realização, a amatoxina é tratada com Y-L-X, ou Y-L- Z, respectivamente, na presença de uma base, particularmente KOtBu, LiOH ou NaH, num solvente, especialmente num solvente polar, aprótico tal como DMF, DMSO, ou NMP.
[0092] Em certas concretizações, o grupo Z é um grupo amino primário protegido, em particular NH-C(= O)OtBu. Em particular estas formas de realização, a amina primária protegida é primeiro desprotegida e, em seguida, ativada por um derivado de ácido carbônico, tal como dihidroxisuccinimida carbonato (DSC).
[0093] Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de amatoxina ligante de Fórmula I, em que R1 a R4 são como definidos acima, e em que R5 = LZ, onde L é um ligante, e em que Z é um radical que pode ser convertido em um grupo X de saída, que pode ser substituído por um grupo nucleofílico de uma porção de ligação alvo, particularmente por uma amina primária.
[0094] Em seguida, a invenção é explicada em mais detalhes por meio de exemplos não limitativos: Exemplo 1 Síntese do ligante de amanitina N1' 1.1 Preparação de N1'-6-amino-hexil-6'-O-metil-α-amanitina (HDP 30,0378)
[0095] 4,86 mg (5,21 μmol) de O-metil-α-amanitina foram dissolvidos em 500 μl de DMSO seco. Sob árgon, adicionaram-se 11,68 mg (41,67 μmol) de brometo de Boc-aminohexilo e 100 μl de uma solução de 52,1 mM de t-butanolato de potássio em DMSO. Foram adicionadas porções de potássio t-butanolato adicionais da solução de estoque de 5,21 mM: 50 μl a 1,5 horas, 50 μl às 4 h, e 50 μl às 6 h. Após 19 h, 100 μl de potássio t-butanolato e 11,96 mg (41,67 μmol) de brometo de Boc-aminohexil foram adicionados. Após 21 h, a mistura de reação foi resfriada com 104 μl de uma solução de ácido acético a 100 mM em DMSO. O produto bruto foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250 x 20 mm, com metanol / água (0,05% de TFA), caudal: 26,0 ml / min, detecção a À = 295 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol, com 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 10% de água: 90% de metanol, com 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0-5 min de 100% de A, 5-20 min de 0% de A; 20-25 min de 0% de A; 25-27 min de 100% de A; 27-35 min de 100% de A, a fração com o tempo de retenção de 19,2-20,9 min foi recolhida e os solventes foram evaporados para um sólido.
[0096] 4.81mg (81%) HDP 30,0368, MS: 1133 (M + H +).
[0097] 4,75 mg (4,19 μmol) de HDP 30,0368 foram dissolvidos em 200 μl de ácido trifluoroacético e agitado durante 2 min. A mistura de reação foi evaporada até à secura à temperatura ambiente e co-evaporada com 1000 μL de tolueno e 10000 μl de acetonitrilo. O produto bruto foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250 x 20 mm, com metanol / água (0,05% de TFA), caudal: 26,0 ml / min, detecção a À = 295 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol, com 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 10% de água: 90% de metanol, com 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0-5 min de 100% de A, 5-20 min de 0% de A; 20-25 min de 0% de A; 25-27 min de 100% de A; 27-35 min de 100% de A, a fração com o tempo de retenção de 14,9-15.5 min foi recolhida e os solventes foram evaporados e liofilizados para um pó.
[0098] 1,54 Mg (32%) HDP 30,0378, MS: 1033 (M + H +).1.2 Preparação de N1'-8-amino-octil-6'-O-metil-α-amanitina (HDP 30,0516)
[0099] 12,43 mg (13,32 mmol) de O-metil-α-metilamanitina foram dissolvidos em 750 μl de DMSO seco. 40,00 mg (129,76 μmol) de N- Boc-8 — aminobromoactano e 120 μl de uma solução de LiOH a 0,1 M em DMSO / água 01:01 foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob árgon. Após 18h 80 μl de LiOH adicionais foram adicionados seguidos por 40 μl a 36 h, 50 μl a 39 h e 80 ul a 44 h após. DMSO e água foram removidos em alto vácuo e o resíduo foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250 x 20 mm, com metanol / água (0,05% de ATF), caudal: 10,0 ml / min, detecção a À = 230 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol, com 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 10% de água: 90% de metanol, com 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de 20% de A, a fração com o tempo de retenção de 37,0 min foi recolhida e os solventes foram evaporados em vácuo.
[0100] 3,96 mg (26%) HDP 30,0496 na forma de um pó branco. MS: 1160 (M + H +).
[0101] 3,96 mg (3,41 μmol) HDP 30,0496 foram dissolvidos em 300 μl de ácido trifluoroacético e agitado durante 2,5 minutos à temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com 1000 μL de tolueno e evaporada até à secura à temperatura ambiente. O resíduo foi co-evaporado duas vezes com o mesmo volume de tolueno. O resíduo foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250 x 20 mm, com metanol / água (0,05% de ATF), caudal: 10,0 ml / min, detecção a À = 230 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol, 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 10% de água: 90% de metanol, com 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de a fração com o tempo de retenção de 21,0 min foi recolhida e os solventes foram evaporados em vácuo.
[0102] 2.66mg (74%) HDP 30,0516 na forma de um pó branco MS: 1060 (M+H+): 1083 (M+Na+).1.3 Preparação de N1’-6-aminobutil-6'-O-metil-α-amanitina HDP 30,0592
[0103] 11,88 mg (12,74 µmol) de O-metil-α-amanitina foram dissolvidos em 500 µl de DMSO seco. Sob árgon, adicionaram-se 20,00 mg (79,32 μmol) de Boc-aminobutil brometo e 83,4 μl de uma solução de 0,25 mM de t-butanolato de potássio. Porções adicionais de 20,00 mg (79,32 μmol) de Boc-aminobutil brometo de potássio e 83,4 μl de t-butanolato foram adicionados a cada hora, durante o período de reação. A mistura de reação foi temperada com 100 μL de ácido acético após 8 h. O produto bruto foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Phenomenex Luna C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água, caudal: 15,0 ml / min, detecção a À = 290 nm. Solvente A: 100% de água. Solvente B: 100% de metanol. Gradiente: 0 min de 95% de A; 0-5 min de 50% de A; 510 min de 30% de A; 10-20 min de 20% de A; 20-45 min de 5% de A. min 95% de A; 0-5 min 50% de A, 5-10 min 30% de A; 10-20 min 20% de A, 5 min 20-45% A. A fração com o tempo de retenção de 16,5 minutos foi recolhida e os solventes evaporados.
[0104] 5,10 mg (36%) de HDP 30,0587, MS: 1104,5 (M+H+).
[0105] 5,10 mg (4,61 μmol) de HDP 30,0587 foram dissolvidos em 1000 μL de ácido trifluoroacético e agitado durante 2 min. A mistura de reação foi evaporada até à secura à temperatura ambiente e seca à vácuo. O produto bruto foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: coluna: Phenomenex Luna C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água, caudal: 15,0 ml / min, detecção a À = 290 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol de 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 5% de água: 95% de metanol e 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0 min de 100% de A, 0-5 min de 50% de A, 5-10 min de 30% de A; 10-20 min de 20% de A; 20-45 min de 0% de A. A fração com o tempo de retenção de 10,0 min foi recolhida e os solventes foram evaporados.
[0106] 3,48 mg (75%) de pó branco HDP 30,0592 MS: 1004,4 (M+H+). 1.4 Preparação de N1'-6-aminopentil-6'-O-metil-α-amanitina HDP 30,0644
[0107] 8,40 mg (9,00 μmol) de O-metil-α-metilamanitina foram dissolvidos em 400 μl de DMSO seco. 29,00 mg (108,94 μmol) de N- Boc-5-aminobromopentano e 14,20 μL de uma solução de 1 M de LiOH em água foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob árgon. Depois de 4 horas adicionais foram adicionados 7,10 μl de LiOH. A mistura de reação foi temperada com 100 μl de ácido acético, depois de 6 h, e DMSO e água foram removidos sob alto vácuo. O resíduo foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água Kromasil 100-C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água, caudal: 10,0 ml / min, detecção a À = 290 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol. Solvente B: 5% de água: 95% de metanol. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de 20% A. A fração com o tempo de retenção de 30 min foi recolhida e os solventes foram evaporados em vácuo.
[0108] HDP 30,0636 foi obtido como um pó branco. MS: 1118,5 (M+H+). O produto foi utilizado para a etapa seguinte.
[0109] HDP 30, 0636 foi dissolvido em 400 μL de ácido trifluoroacético e agitado durante 5 min à temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com 1000 μL de tolueno e evaporada até à secura em temperatura ambiente. O resíduo sólido foi co-evaporado com o mesmo volume de tolueno (2x) e purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água (0,05% de ATF), caudal: 10,0 ml / min, detecção a À = 290 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol e 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 10% de água: 90% de metanol e 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de 20% de A. A fração com o tempo de retenção de 18,0 min foi recolhida e os solventes foram evaporados à vácuo.
[0110] 0.51mg de pó branco (6%, o rendimento total) HDP 30,0644.MS: 1018,4 (M + H +). 1.5 Preparação de N1-t-butilpropionil-6-O-metil-α-amanitina HDP 30,0678
[0111] 7,04 mg (7,55 μmol) de O-metil-α-metilamanitina foram dissolvidos em 500 μl de DMSO seco. 14,10 μl de uma solução de LiOH 1 M em água foram adicionados. A mistura de íons reagida foi agitada à temperatura ambiente sob árgon durante 5 min e 20 μl de acido 1-cloropropiônico-t-butílico foram adicionados. Após 1h adicional de 20,00 μL de LiOH e 20,00 μL de acido 1-il cloropropionico-t-butílico foram adicionados. A mistura de reação foi temperada com 100 μL de ácido acético, após 2 h. DMSO e água foram removidos em alto vácuo e o resíduo foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 um, 250x20 mm, com metanol / água, caudal: 10,0 ml / min, detecção a 290 nm = À. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol. Solvente B: 5% de água: 95% de metanol. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de 20% de A. A fração com o tempo de retenção de 26,0 min foi recolhida e os solventes foram evaporados à vácuo.
[0112] HDP 30,0677 foi obtido como um sólido branco. MS: 1047.4 (M+H +). O resíduo foi utilizado para a próxima etapa.
[0113] HDP 30, 0677 foi dissolvido em 500 μL de ácido trifluoroacético e agitado durante 4 minutos à temperatura ambiente. A mistura de reação foi evaporada até à secura à temperatura ambiente. O resíduo foi co-evaporado duas vezes com 5 ml de tolueno. O resíduo branco foi purificado numa LaPrep- HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água (0,0 5% de ATF), caudal: 10,0 ml / min, detecção a À = 290 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol e 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 10% de água: 90% de metanol e 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de 20% de A. A fração com o tempo de retenção de 18,0 min foi recolhida e os solventes foram evaporados à vácuo.
[0114] 1.90mg (25%) HDP 30,0678 pó branco. MS: 991,3 (M+H+).1.6 Preparação de N1'-4-Boc-aminometilbenzil-6'-O-metil-α- amanitina HDP 30,0683
[0115] 8,90 mg (9,54 μmol) de O-metil-α-metilamanitina foram dissolvidos em 500 μl de DMSO seco. 21,4 μl de uma solução de LiOH 1 M em água foram adicionados. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob árgon durante 10 min e 20,0 mg (78,40 μmol) de cloreto de 4-Bocaminobenzil foram adicionados de uma vez. Após 18 h, a mistura de reação foi temperada com 100 μL de ácido acético. DMSO e água foram removidos em alto vácuo e o resíduo foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água Kromasil 100-C18, 10 um, 250x20 mm, com metanol / água, caudal: 10,0 ml / min, detecção a À = 290 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol. Solvente B: 5% de água: 95% de metanol. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de 20% de A. A fração com o tempo de retenção de 34,0 min foi recolhida e os solventes evaporados à vácuo, o que deu HDP 30,0680 na forma de um resíduo branco. MS: 1152,5 (M+H+). O produto foi utilizado para a etapa seguinte.
[0116] HDP 30, 0680 foi dissolvido em 500 μL de ácido trifluoroacético e agitado durante 10 minutos à temperatura ambiente e evapororado até à secura à temperatura ambiente. O resíduo foi co-evaporado duas vezes com 4 ml de tolueno. O pó branco foi purificado numa LaPrep-HPLC: Coluna: Kromasil 100 C18, 10 μm, 250x20 mm, com metanol / água (0,05% de ATF), caudal: 10,0 ml / min, detecção a À = 290 nm. Solvente A: 95% de água: 5% de metanol e 0,05% de ácido trifluoroacético. Solvente B: 10% de água: 90% de metanol e 0,05% de ácido trifluoroacético. Gradiente: 0-5 min de 80% de A, 5-10 min de 50% de A; 10-20 min de 30% de A; 20-50 min de 20% de A. A fração com o tempo de retenção de 18,4 min foi recolhida e os solventes foram evaporados à vácuo.
[0117] 3,15mg (31%) HDP 30,0683 na forma de um pó branco. MS: 1052,4 (M+H+). Exemplo 2 Síntese do Conjugado de amatoxina Síntese de conjugado de HDP 30,0378 Her-DSC-30,0378 [2,8]
[0118] 1,0 mg de HDP 30, 0378 foi dissolvido em 100 μl de dimetilformamida seca (DMF). Sob atmosfera de árgon e com agitação à temperatura ambiente, 10,4 μL de uma solução de carbonato de dihidroxisuccinimida (DSC) em DMF (2,56 mg em 100 μL de DMF) e 2,1 μL de trietilamina foram adicionados de uma vez. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente. Após 12 h, 30 ml de éter dietílico frio foram adicionados. O precipitado foi recolhido e lavado várias vezes com éter dietílico e seco em vácuo. O sólido remanescente foi retomado em 200 μL de DMF = solução A. 12,0 mg de Herceptin foi dissolvido em 4,0 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,4) = solução B. A solução A e a solução B foram combinadas. A solução de ligante de amanitina e Herceptin foi agitada a 4 ° C durante 14 horas, e separada por cromatografia de filtração em gel Sephadex G-25 (coluna XK-16, 2 ml / min.) A coluna G-25 foi pré-lavada com 500 ml de soluções de PBS, pH = 7,4. A fração de conjugado Her-DSC-30,0378 foi detectada por absorção de UV. A concentração de proteína foi determinada por Ensaio RotiQuant (Carl Roth, Alemanha). Carga de amanitina de Herceptin foi determinada por determinação da absorção no UV a = 280 nm e A = 310 nm. Calculou-se uma carga de 2,8 moléculas de toxina amanitina para cada molécula de Herceptin. Exemplo 3 Citotoxicidade de Her-DSC-30,0378 [2,8] em uma linhagem de células de tumor HER2-positivos in vitro
[0119] A atividade citotóxica de Her-DSC-30,0378 [2,8] foi avaliada com a linhagem de células de tumor HER2-positivos SK- OV-3 (ovar) e um ensaio de incorporação de BrdU quimioluminescente (Roche Diagnostics) in vitro. A viabilidade celular foi determinada após 72 h de incubação com diferentes concentrações de Her-DSC-30,0378 [2,8] a 37° C e 5% de CO2 através da medição das células fixas e permealizadas com um anticorpo anti-BrdU-HRP em um leitor de microplacas da Labtech Optima BMG. O valor de EC 50 da curva de dose-resposta foi calculada pelo software GraphPad Prism 4.0. A EC 50 para Her- DSC-30,0378 [2,8] com células SK-OV-3 foi 4.1x10-11 M. (ver Figura 2).
Claims (24)
1. Conjugado de amatoxina caracterizado por ser de Fórmula I
em que: R1 = H ou OH; R2 = H ou OH; R3 = NH2 ou OH; R4 = OH ou OC1-6-alquil; e R5 = L-T, em que L representa um ligante, e T é uma porção de ligação alvo.
2. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ligante estar ligado à porção de ligação alvo através de uma porção de ureia.
3. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a porção de ligação alvo estar ligada ao ligante L através de um grupo amino presente na porção de ligação alvo, em que o referido grupo amino faz parte da referida porção de ureia.
4. Conjugado de amatoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o ligante ter um comprimento entre 1 e 8 átomos.
5. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido ligante ter um comprimento entre 1 e 6 átomos.
6. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido ligante ter um comprimento entre 1 e 4 átomos.
7. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido ligante ter um comprimento entre 2 e 4 átomos.
8. Conjugado de amatoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o ligante L ser um grupo alquileno, heteroalquileno, alcenileno, heteroalcenileno, alcinileno, heteroalcinileno, cicloalquileno, heterocicloalcileno, arileno, heteroarileno, aralquileno, ou um grupo heteroaralcileno.
9. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido ligante ser substituído.
10. Conjugado de amatoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o ligante L compreender uma porção selecionada a partir de um dos seguintes radicais: um dissulfeto, um éter, uma amina, um éster, uma carboxamida, um uretano, e uma porção de ureia.
11. Conjugado de amatoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por a porção de ligação alvo se ligar especificamente a um epítopo que está presente em uma célula de tumor.
12. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a porção de ligação alvo se ligar especificamente a um epítopo da molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM).
13. Conjugado de amatoxina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por a porção de ligação alvo ser selecionada a partir do grupo consistindo de: (1) anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; (ii) proteína semelhante a anticorpo, e (iii) aptâmero de ácido nucleico.
14. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a porção de ligação alvo ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo selecionado a partir de: um diacorpo, um tetracorpo, um nanocorpo, um anticorpo quimérico, um anticorpo deimunizado, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano.
15. Conjugado de amatoxina de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por a porção de ligação alvo ser um fragmento de ligação ao antígeno selecionado a partir do grupo consistindo de Fab, F(ab')2, Fd, Fv, Fv de cadeia simples, e Fvs ligados por dissulfeto (dsFv).
16. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um conjugado de amatoxina conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e compreender ainda um ou mais diluentes farmaceuticamente aceitáveis, transportadores, excipientes, enchimentos, ligantes, lubrificantes, deslizantes, adsorventes, desintegrantes e/ou conservantes.
17. Molécula de conjugação de amatoxina de Fórmula I, caracterizada por R1 a R4 serem conforme definidos na reivindicação 1, e em que R5 = L-X, em que L representa um ligante, e X é um grupo de saída que pode ser substituído por um grupo nucleofílico de uma porção de ligação alvo.
18. Molécula de conjugação de amatoxina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por X ser um grupo de saída, que pode ser substituído por uma amina primária.
19. Molécula de conjugação de amatoxina de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada por X ser selecionado a partir de: t-butiloxi, -succinimidiloxi, -1-O-succinimidiloxi-3-sulfonato (Sulfo NHS), -O-(4-nitrofeniloxi), -O-(3-nitrofeniloxi), -O-(2,4-dinitrofeniloxi), -O-(2,4-dicloro-6- nitrofeniloxi), -pentafluorofeniloxi, -pentaclorofeniloxi, -O-(2,4,5-triclorofeniloxi), -O-(3,4-diidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina-3-il), -O-(endo-1-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida-1-il), -1-ftalimidoiloxi, -1-benzotriazoliloxi, -1-(7-aza- benzotriazolil)oxi e -N-imidazolil.
20. Método para a síntese de um conjugado de amatoxina conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender a etapa de reação de uma molécula de conjugação de amatoxina conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 19 com uma porção de ligação alvo compreendendo um grupo nucleofílico.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o referido grupo nucleofílico ser uma amina primária.
22. Uso de um conjugado de amatoxina conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado por dito uso ser para preparar um medicamento para tratamento de câncer em um paciente.
23. Uso de uma composição farmacêutica de amatoxina conforme definida na reivindicação 16, caracterizado por dito uso ser para preparar um medicamento para tratamento de câncer em um paciente.
24. Uso de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado por o referido câncer ser selecionado a partir do grupo consistindo de câncer de pâncreas, colangiocarcinoma, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer de rim, melanoma maligno, leucemia e linfoma maligno.
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