KR20140041264A - 넓미역 추출물을 이용한 항염증용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 NO, PGE2, 염증성 사이토카인 등의 생성 억제 활성을 가지고 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 가지는 넓미역 추출물을을 이용한 항염증용 조성물을 개시한다.
Description
본 발명은 넓미역(Undariopsis peterseniana) 추출물을 이용한 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증은 외부의 물리·화학적 자극, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 생체의 방어 반응이다.
염증 반응은 선천성 면역 반응의 일부이며, 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역 반응은 대식세포가 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 통해 비자기(non-self)로 인식하고 공격함으로써 시작된다. 염증 반응 시에는 염증 부위에 혈장이 축적되어 세균이 분비한 독성을 희석시키며, 혈류가 증가하고, 홍반, 통증, 부종, 발열 등의 증상이 수반되게 된다.
이러한 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하는데, 특히 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)와 다양한 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생합성과 관련되는 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)가 염증 반응의 중요한 매개체로 알려져 있다.
NOS는 세 가지 이성질체가 존재하는데, 칼슘이나 카모듈린 의존성인 eNOS(내피성 NOS)와 nNOS(신경성 NOS), 그리고 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 세균의 내독소나 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12과 같은 여러 염증성 사이토카인에 의해 유도되는 iNOS(유도성 NOS)가 있으며, L-아르기닌(L-arginine)으로부터 산화질소(NO)를 생성한다.
eNOS나 nNOS에 의해 생성되는 NO는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하지만, iNOS에 의해 생성되는 NO는 관절염, 패혈증, 조직이식거부반응, 자가면역질환, 신경세포의 사멸 등 다양한 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moncade S. et al, Pharmacol. Rev., 1991, 43, 109; Nature Medicine, 2001, 7, 1138; Mu, M. M., J. Endotoxic Res. 7, p341, 2001).
COX 효소는 COX의 기능과 함께 하이드로퍼옥시다제(hydroperoxidase, HOX) 활성을 가지고 아라키돈산으로부터 중간체인 PGG2와 PGH2를 합성하며, 이들 화합물로 PGE2, PGF2, PGD2, 프로스타시클린 및 트롬복신A2(thromboxane A2, TxA2)를 만든다. COX의 기능 중 PGH 합성효소의 기능은 PGE2의 합성을 통해 통증과 염증 반응에 관여한다.
COX에는 두 가지 아형이 있고 COX-1은 대부분의 조직에 항시 발현되는데 비해, COX-2는 염증성 사이토카인에 의해 신속히 발현이 유도되어 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.
따라서 NO, PGE2, 염증성 사이토카인 등의 억제제나 iNOS 억제제 그리고 COX-2 억제제는 염증질환 치료제로서 활용될 수 있다.
본 발명은 NO, PGE2, 염증성 사이토카인 등의 생성 억제 활성을 가지고 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 가지는 넓미역 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 개시한다.
본 발명의 목적은 항염증용 조성물을 개시하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명은 아래의 실시예에서 제조된 넓미역의 70% 에탄올 추출물과 이 추출물을 증류수에 현탁하여 헥산(n-hexane), 디클로로메탄(CH2Cl2), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(BuOH)로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물이 NO 생성 억제 활성과 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 및 PGE2의 생성 억제 활성을 가짐과 함께 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 가짐을 확인함으로써 완성된 것이다.
전술하였듯이, NO 생성 억제 활성, iNOS 및 COX-2 억제 활성, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 생성 억제 활성, 및/또는 PGE2의 생성 억제 활성을 가지는 물질은 항염증 용도로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항염증용 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 항염증용 조성물은 넓미역 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 명세서에서 "넓미역 추출물"은 추출 대상인 넓미역을 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤, 에틸아세테이트, 부탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 물(증류수), 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 조추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 용매로 분획하여 얻어진 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 여기서 추출 방법은 추출 대상인 넓미역을 추출 용매에 침지시키는 방법과 추출 대상을 추출 용매로 증류시키는 방법을 포함한다. 또한 침지를 통한 추출 방법에는 냉침, 가온, 초음파, 환류 등 임의의 방식이 적용될 수 있다. 그럼에도 상기 "추출물"은 바람직하게는 그 추출 대상을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매, 특히 60% 내지 90%의 에탄올 수용액으로 추출(침지 또는 증류)하여 얻어진 것을 의미한다. 더 바람직하게는 상기 60% 내지 90%의 에탄올 수용액 추출물을 물에 현탁시키고 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻어지는 어느 한 분획 용매층의 분획물을 의미한다. 가장 바람직하게는 상기 순차적 분획물 중 아래의 실험예에서 높은 항염증 활성을 보이는 것으로 확인된 헥산층의 분획물, 디클로로메탄층의 분획물 또는 에틸아세테이트층의 분획물을 의미하며, 특히 디클로로메탄층의 분획물을 의미한다. 여기서 "순차적 분획한다"의 의미는 분획 후의 잔여 물층을 계속 사용하여 상기 열거된 순서의 용매로 분획한다는 것이며, 또 여기서 %는 부피 백분율에 의한 농도(v/v) 표현으로서, 당업계에 알려진 바와 같이 일정 부피의 용액 중에 녹아 있는 일정 부피의 용질을 의미한다. 예컨대 30%(v/v)는 용액 100㎖에 용질 30㎖가 용해되어 있다는 것이 된다. 본 명세서의 "추출물"의 의미에는 여과 등을 통하여 정제된 형태의 추출물, 추출 용매가 일부 제거된 액상의 농축된 추출물 그리고 추출 용매가 완전히 제거된 고형상의 추출물이 포함된다.
또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또 본 명세서에서, "항염증"은 아래에서 정의되는 염증성 질환의 개선 활성을 의미한다.
또 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응을 수반하는 질환으로서 정의될 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증 반응을 수반하는 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.
또 본 명세서에서, "개선"이란 어떤 질병 또는 증상의 치료, 그러한 질병 또는 증상의 예방, 및/또는 그러한 질병 또는 증상의 억제를 포함하는 의미이다.
본 발명의 항염증용 조성물은 그 유효성분인 상기 넓미역 추출물을 제형, 배합 목적 등에 따라 항염증 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.999 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항염증 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 유효성분인 넓미역 추출물을 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 첨가제 등과 혼합하여 경구투여용 또는 비경구투여용으로 제제화하게 된다.
제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 예는 락토스, 스테아린산 마그네슘, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아고무, 올리브유, 참기름, 카카오버터, 에틸렌글리콜, 기타 상용되는 것을 포함한다.
경구투여용 고체 조성물의 예는 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제 등을 포함한다. 이와 같은 고체 조성물에서는 유효성분인 식물 추출물이 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 포도당, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 미결정성 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 마그네슘 알루미노메타실리케이트 등과 혼합된다. 고체 조성물은, 통상적인 방법에 따라 불활성 희석제 이외의 첨가물, 예를들면, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 섬유소 글리콜산 칼슘과 같은 붕해제, 글루타민산 또는 아스파라긴산과 같은 용해보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는, 필요에 따라 슈크로스, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등의 물질로 이루어진 필름으로 피복될 수 있고, 경우에 따라서는 2개 이상의 층으로 피복될 수 있다.
경구투여용 액체조성물은, 약제학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하고, 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 정제수, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 이 조성물은, 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제 등을 포함할 수 있다.
비경구투여용 주사제로는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 에멀젼화제가 포함된다. 수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 주사용 물 및 주사용 생리식염수가 포함된다. 비수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 에탄올과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80® 등이 포함된다. 이와 같은 조성물은, 다시 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예를 들면, 유당), 용해보조제(예를 들면, 글루타민산, 아스파르트산)와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 정밀여과막에 의한 여과멸균, 고압증기멸균과 같은 가열멸균, 또는 살균제 배합 등의 통상적인 멸균 방법으로 무균화될 수 있다. 주사제는 용액제제, 또는 사용 시에 용해시켜 사용할 수 있는 동결-건조 제제일 수 있다. 동결-건조를 위한 부형제로는 예를 들면, 만니톨, 글루코스 등의 당알콜이나 당류를 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구투여방법 또는 비경구 투여방법으로 투여된다.
바람직하기는 비경구 투여방법, 예를 들면, 주사에 의한 투여(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강 내에의 주사 등으로 투여), 경피투여, 경점막투여(경직장투여 등), 경폐투여 등이다. 물론 경구투여방법도 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분의 투여량은 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로는 0.005 ㎍/kg ~ l00 mg/kg의 범위이고, 바람직하기는 0.02㎍/kg ~ 5mg/kg의 범위이다. 그러나 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등의 형태의 것들이 이용될 수 있다.
생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.
미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.
이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. "극미량"이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.
사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성(예컨대 관절염 또는 골다공증 예방)을 부가하여 가지도록 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어서 화장료 조성물로 파악할 수 있다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로서 파악될 경우, 그 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.
여기서 "화장료 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장료 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.
그러나 상기 비율은 화장료의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.
상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에 알려진 피부 보습 활성 물질, 항아토피 활성 물질, 항여드름 활성 물질, 미백 활성 물질 등 기능성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 또 다른 구체적인 양태에 있어 비누 조성물로서 파악될 수 있다.
본 발명의 조성물이 비누 조성물로서 파악될 경우에, 본 발명의 비누 조성물은 비누 기재에 유효성분을 포함하여 제조될 수 있다.
상기 비누 기재로서는 야자유, 팜유, 대두유, 파마자유, 올리브유, 팜핵류 등의 식물유지 또는 우지, 돈지, 양지, 어유 등의 동물유지 등이 사용될 수 있고, 상기 피부 보습제로서는 글리세린, 에리트리톨, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 헥실글리콜, 이소프로필미리스테이트, 실리콘 유도체, 알로에베라, 솔비톨 등이 사용될 수 있으며, 상기 유화제로서는 천연오일, 왁스 지방알콜, 탄화수소류, 천연식물 추출물 등이 사용될 수 있고, 상기 경수연화제로서는 테트라소듐 이디티에이 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 비누 조성물은 또한 첨가제로서 항균제, 분산제, 거품억제제, 용매, 물때 방지제, 부식 방지제, 향료, 색소, 금속이온 봉쇄제, 산화방지제, 방부제 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 비누 조성물에 있어서, 비누 기재나 첨가제는 당업계에 일반적으로 사용되고 있는 함량으로 포함될 수 있는데, 비누 기재는 일반적으로 비누 조성물의 전체 중량을 기준으로 하였을 때 99.999 중량 % 내지 50 중량 %로 첨가될 수 있으며, 첨가제는 1 중량 % 내지 20 중량 %로 첨가될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 넓미역 추출물을 이용한 항염증용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 항염증용 조성물은 약품, 식품, 화장품, 비누 등의 제품으로 제품화될 수 있으며, 염증성 질환에서 항염증 용도로 사용될 수 있다.
도 1은 넒미역 추출물과 분획물의 NO 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 2는 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 NO 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 3은 넒미역 추출물과 분획물의 PGE2 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 4는 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 PGE2 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 5 내지 도 7은 넒미역 추출물과 분획물의 염증성 사이토카인 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 8 내지 도 10은 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 염증성 사이토카인 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 11은 넒미역 추출물과 분획물의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 12는 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 2는 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 NO 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 3은 넒미역 추출물과 분획물의 PGE2 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 4는 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 PGE2 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 5 내지 도 7은 넒미역 추출물과 분획물의 염증성 사이토카인 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 8 내지 도 10은 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 염증성 사이토카인 생성 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 11은 넒미역 추출물과 분획물의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 나타낸 결과이다.
도 12는 넒미역 분획물 중 디클로로메탄 분획물의 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 나타낸 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
>
넓미역
추출물의 제조
제주도에 자생하고 있는 넓미역을 2010년 8월경에 채집하였으며, 채집된 시료는 동결건조기를 사용하여 수분을 완전히 제거한 후 마쇄기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
넓미역의 에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 제조는 70% 에탄올 (EtOH) 및 분획용 헥산 (n-hexane), 디클로로메탄 (CH2Cl2), 에틸아세테이트 (EtOAc) 그리고 부탄올 (BuOH)을 사용하여 용매의 극성을 이용한 순차적 추출법을 사용하였다.
구체적으로, 분말 건조된 시료에 70% 에탄올로 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전히 건조시켰다. 건조된 에탄올 추출물에 10배 중량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 잔여 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다.
<
실험예
>
넓미역
추출물의 항염증 활성 실험
<1> 세포 배양
한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)로부터 생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7세포를 구입하여, 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/mL), 및 streptomycin (100 g/mL)을 첨가하여 Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM; GIBCO Inc.)에서 보관하였다. 이들 세포들은 37℃ 에서 95% air, 5% CO2가습 공기 조건 하 포화 상태(subconfluence)에서 배양하였으며, 각각 3일마다 계대배양 하였다. 혈구계를 이용하여 세포의 수를 측정하였으며, trypan blue dye exclusion을 통하여 생세포의 수를 확인하였다.
<2> 질소화합물( Nitric oxide ) 생성 억제 효능 평가
RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5×105cells/mL로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 추출물 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 L와 Griess 시약 100 L를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 standard로 비교하였다.
실시예의 추출물과 분획물을 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 1]에 나타내었고, 실시예의 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 25, 50 및 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 2]에 나타내었다.
[도 1]을 참조하여 보면, 실시예의 추출물과 분획물 모두 LPS 만의 처리군에 비해 NO 생성 억제 활성을 보이고 있고, 특히 n-헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에서 높은 NO 생성 억제 활성을 보이고 있음을 알 수 있다.
[도 2]는 특히 활성이 우수한 디클로로메탄 분획물이 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보임을 나타낸 결과이다.
<3> 세포독성 평가( LDH assay )
RAW 264.7 세포 (1.5×105cells/mL)를 DMEM 배지에 추출물 시료와 LPS (1 ㎍/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 ㎕와 reconstituted substrate mix를 50 ㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 ㎕의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
결과를 [도 1]과 [도 2]에 함께 나타내었다. [도 1]과 [도 2]를 참조하여 보면, 실시예의 추출물과 분획물 모두 특별한 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있으며, 다만 디클로로메탄 분획물의 경우 최고 처리농도인 100 ㎍/mL에서 약간의 세포독성을 보임을 알 수 있다. 이러한 실험 결과는 전체적으로 상기 NO 생성 억제 활성이 세포독성에 의한 결과가 아님을 말해준다고 할 수 있다.
<4> Prostaglandin E 2 ( PGE 2 ) 생성 억제 효능 평가
RAW 264.7 세포(1.5×105cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 RAW 264.7 세포는 10배 농도로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1 ㎍/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 prostaglandin E2(PGE2)를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE2의 측정은 PGE2 ELISA kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.
실시예의 추출물과 분획물을 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 3]에, 실시예의 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 25, 50 및 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 4]에 나타내었다.
[도 3]과 [도 4]를 참조하여 보면, 상기 NO 생성 억제 결과와 유사하게 n-헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물의 PGE2 생성 억제 활성이 높음을 알 수 있고, 디클로로메탄 분획물의 경우 농도 의존적으로 PGE2 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다.
<5> 염증성 사이토카인( TNF -α, IL -1 and IL -6) 생성 억제 효능 평가
RAW 264.7 세포(1.5×105cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 RAW 264.7 세포는 10배 농도로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1 ㎍/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다. pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.
실시예의 추출물과 분획물을 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 5] 내지 [도 7]에 나타내었고, 디클로로메탄 분획물을 25, 50 및 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 8] 내지 [도 10]에 나타내었다.
[도 5] 내지 [도 7]를 참조하여 보면, 상기의 실험 결과들과 유사하게 n-헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 높은 염증성 사이토카인 생성 억제 활성을 보이고 있으며, 또한 [도 8] 내지 [도 10]에서 확인되듯이, 디클로로메탄 분획물은 농도 의존적으로 염증성 사이토카인 생성 억제 활성을 보이고 있다.
<6> iNOS 및 COX -2 발현 억제 효능 평가( westernblotting )
배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 phosphate buffered saline (PBS)로 세척 한 후 세포 용해 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 25 ㎍/mL aprotinin, 25 ㎍/mL leupeptin]를 첨가하여 30분간 4℃에서 용해시킨 후 4, 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 분리된 단백질 20~30 ㎍를 8~12% mini gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (0.1% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 TTBS 용액에서 1:1000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)과 1~3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.
실시예의 추출물과 분획물을 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 11]에 나타내었고, 디클로로메탄 분획물을 25, 50 및 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였을 때의 결과를 [도 12]에 나타내었다.
[도 11]과 [도 12]를 참조하여 보면, 상기의 결과들과 유사한 경향을 보이면서, n-헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물 및 에틸아세테이트 분획물이 높은 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 보이고 있으며, 또한 [도 8] 내지 [도 10]에서 확인되듯이, 디클로로메탄 분획물의 경우 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 보이고 있다.
Claims (6)
- 넓미역 추출물 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 추출물은 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ) 중 하나인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
(Ⅰ) 넓미역을 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 물 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 얻어진 추출물;
(Ⅱ) 넓미역을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 고형상의 추출물을 물과 헥산, 물과 디클로로메탄, 물과 에틸아세테이트로 또는 물과 부탄올로 분획하여 얻어진 어느 한 분획 용매층의 추출물; 및
(Ⅲ) 넓미역을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 고형상의 추출물을 물에 현탁한 후, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 추출물.
- 제1항에 있어서,
상기 항염증은 염증성 질환의 개선 활성을 의미하며,
상기 염증성 질환은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진 및 다발성 경화증 중 하나인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
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-
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