KR20140033366A - 열적 변화 분석법을 이용한 표적 단백질에 결합하는 리간드를 결정하는 방법 - Google Patents

열적 변화 분석법을 이용한 표적 단백질에 결합하는 리간드를 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정제되지 않은 시료가 관심 있는 리간드에 결합된 표적 단백질을 함유하는 지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 상기 리간드에 결합된 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도보다 더 큰 정도로 결합하지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에 상기 정제되지 않은 시료를 노출시키는 단계; (b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및 (c) 표적 단백질의 존재에 대해 단계 (b)의 가용성 및 불용성 단백질 분획 중 하나 또는 둘 모두를 분석하는 단계를 포함하되, 상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서도 검출되지 않는다. 특히, 본 발명은 특정한 약제가 이러한 환자에 대한 요법에 사용될 수 있는지를 확인하기 위해 약제가 환자로부터 유래한 시료 중의 이들의 단백질 표적물에 결합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 기구, 및 항체 및/또는 비-단백질 융합 태그를 포함하는, 본 발명의 방법에서의 키트의 용도에 관한 것이다.

Description

열적 변화 분석법을 이용한 표적 단백질에 결합하는 리간드를 결정하는 방법{METHODS FOR DETERMINING LIGAND BINDING TO A TARGET PROTEIN USING A THERMAL SHIFT ASSAY}
본 발명은 특히 열적 변화 분석의 이용을 통해 단백질-리간드 결합 상호 작용을 조사하는 방법에 관한 것이다.
생물 및 의학 분야 모두에서 단백질에 결합하는 리간드의 검출은 중요하다. 특히 화학적 화합물의 약제로의 개발에 있어서, 화합물이 약물표적과 상호 작용하는지의 여부를 아는 것이 중요하다. 따라서 표적 단백질-리간드 상호 작용의 모니터링은, 초기 리간드의 후보 약제로의 최적화 도중에 사용될 뿐만 아니라, 상호 작용하는 리간드를 대형 화학적 라이브러리로부터 초기에 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 또한, 이와 같은 상호 작용이 치료 부작용을 초래할 수 있는 기타 단백질과 약제의 상호 작용(소위 "탈표적(off-target) 상호 작용")을 이해하는 것이 중요하다.
다른 의학적 응용에 있어서도, 환자 또는 동물 모델에서 특정 약제가 이의 표적 단백질에 결합할 수 있는지의 여부를 결정하는 것이 중요하다(질병에 대해). 약제가 효능을 나타내기 위해서는 이는 위/창자에서 흡수되고(또는 주사되는 경우에 이는 혈관내로 들어가야 함) 체내에서 올바른 위치로 전달될 필요가 있다. 약제가 세포 외 단백질 또는 수용체에 표적화되지 않는 경우, 상기 약제가 또한 표적 단백질에 접근할 수 있도록 세포 내로 전달될 필요가 있다. 이들 모든 전달 과정 도중에 상기 약제는 안정하고, 예를 들어 간에서 또는 세포 대사성 효소에 의해 신장으로부터의 분비 및 퇴화를 피해할 필요가 있다. 추가로 약제는 P450 효소에 의한 퇴화 또는 다중 약제 유출 채널에 의한 전위와 같은 세포성 약제 내성 과정에서 생존할 필요가 있다. 최종적으로, 상기 약제는 약제 표적 단백질에 결합할 수 있을 필요가 있다. 암 및 감염 요법에서의 약제 내성은 때때로 표적 단백질 상의 약제 결합 부위의 영역에서의 감지하기 힘든 돌연변이에 기인한다. 그러나 약제에서 표적물로 이어지는 경로에서 약제는 체내의 다수의 상이한 환경에 직면할 것이고, 잠재적으로는 상기 경로 도중에 다수의 상이한 단백질과 상호 작용할 수 있다.
약제가 표적 단백질 상의 결합 부위에 도달하기 이전에 약제를 위한 경로의 높은 복잡성은, 아마도 임상적인 진단법, 발현 프로파일링 및 시퀀싱에 기반을 둔 현재의 예측 방법이 치료학적 효능을 예측하는데 있어서 제한된 성공만을 나타내는 하나의 이유이다. 약제가 이의 표적물에 도달했는지의 여부를 측정하기 위한 잠재적인 수단은 체내의 표적 세포에서 약제-표적 단백질 상호 작용의 직접적인 측정을 수행하는 것이다. 이것이 약물표적의 하류에서의 사건을 측정할 수 없을지라도, 이는 상술한 바와 같은 약제에서 표적물로 이어진 모든 단계를 통합할 수 있었다. 따라서 이와 같은 측정은 치료학적 효능의 다수의 임상적인 단계를 포함할 수 있고, 다수 약제의 효능의 유용한 예측 인자일 수 있으며, 따라서 임상적인 진단 도구로서 유용할 수 있다. 따라서 약제의 상호 작용 및 효능을 연구하기 위해 정제되지 않은 시료, 예를 들어 환자에서 유래한 시료에서 리간드-단백질 상호 작용을 검출할 수 있는 것이 바람직하다.
열적 변화 분석법은 단백질-리간드 결합을 평가할 수 있는 것으로, 당해 기술분야에서 개발되었으며, 종래 기술에서 상기 단백질은 정제된 형태로 이용된다. 이들 분석법은 2개의 원리, 즉 정제된 단백질은 특정 온도에서 용융하여 풀린다(unfloding)는 원리, 및 단백질에 대한 리간드의 결합은 단백질을 열적으로 안정화시킬 것이라는 원리에 기초하여 개발되었다. 따라서 단백질에 대한 리간드의 결합에 있어서 정제된 단백질이 일단 리간드가 결합되면 열적 안정성에서의 증가를 나타낼 것이므로, 정제된 단백질이 단독으로 존재하는 경우보다는 리간드가 결합된 경우에 더욱 높은 온도에서 용융할 것이라는 사실에 기초하여 검출될 수 있다. 베다디(Vedadi) 등(문헌[PNAS, 103(43), 15835-15840, 2006])은 단백질의 안정성, 결정화(crystallisation) 및 구조 결정을 촉진하는 리간드를 식별하기 위해 화학적 스크리닝 방법을 평가하였다. 이들 방법에서, 정제된 재조합 단백질의 열적 안정성은 작은 분자 라이브러리에 대한 스크리닝 이후에 평가되었다. 단백질의 열적 안정성 증가, 및 그에 따른 리간드 결합은 형광 측정법(fluorimetry: 여기서 형광 탐침이 사용되었음) 및 정적 광산란(static light scattering) 중 하나를 이용하여 측정되었다. 그러나 상기에 기재된 바와 같이, 이러한 방법은 특정 온도(연결(ligation)되지 않은 단백질을 이용하여 참고용 시료에 의해 결정된 온도)에서 용융하는 정제된 단백질을 이용하였으며, 이는 용융 온도에서의 안정정의 증가를 측정할 수 있게 하였다.
모로(Moreau) 등(문헌[Mol. BioSyst., 6, 1285-1292, 2010])은 최근에 GFP를 리포터 시스템으로서 이용하여 표적 단백질의 안정성 및 이의 리간드 연결 안정화를 결정하였으며, 이때 GFP는 표적 단백질에 융합되어 있었다. 그러나 이러한 방법은 이상적인 것은 아니다. 첫째, 상기 방법은 융합 단백질의 구축 및 발현을 요구하며, 따라서 형질전환된 세포에서 뿐만 아니라 천연 세포 및 조직에서 사용될 수 있다. 또한 상기 방법은 오직 GFP보다 덜 안정한 단백질에 대한 리간드 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 최종적으로, 첨가제 또는 염의 사용은 GFP의 안정성에 영향을 미치고, 따라서 대조군 GFP는 모든 실험용으로 사용되어야 한다.
본 발명은 특히 열적 변화 분석의 이용을 통해 단백질-리간드 결합 상호 작용을 조사하는 방법에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은 정제되지 않은 표적 단백질에 결합하는 리간드를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 정제되지 않은 표적 단백질 및 리간드를 가열하는 단계, 및 가용성 표적 단백질을 검출하기 위해 생성물을 분석하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 발명의 방법은 가용성 표적 단백질, 및 그 결과 열적으로 안정한 리간드 결합 표적 단백질의 양을 추정하기 위해 열처리 이후에 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하는 분리 단계를 이용한다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 사용하기 위한 기구에 관한 것으로, 상기 기구는 가열 수단, 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위한 수단, 및 표적 단백질의 존재에 대해 가용성 또는 불용성 단백질을 분석하기 위한 수단을 포함한다. 본 발명의 방법에서 항체 또는 비-단백질 융합 태그를 포함하는 키트의 용도가 또한 개시되어 있다.
따라서 종래 기술분야에서 개시된 열적 변화 분석법은 오직 정제된 단백질과 함께 사용되었거나, 오직 한 케이스에서만(모로 등, 상기와 동일) 정제 이후에 또 다른 단백질과 혼합된 정제된 단백질과 함께 사용되었으며, 이때 단백질은 GFP와 융합되어 있다. 이와는 대조적으로, 본 발명자들은 정제되지 않은 단백질에 대한 리간드의 결합을 결정하기 위해 사용될 수 있는 분석법을 개발하였으며, 이때 상기 정제되지 않은 단백질은 여기에 융합된 임의의 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서는 검출되지 않는다. 따라서 본 발명자들은, 예를 들어 세포, 세포 용해물, 또는 다수의 상이한 생체 분자를 함유하는 기타 복합 액체 중의 정제되지 않은 단백질이 정제된 단백질과 유사한 방식으로 특성 온도 의존성에 따라 풀리고(unfold) 침전(precipitating)하는 것이 가능하다는 것을 제시하였다. 이러한 발견은, 세포 및 정제되지 않은 시료에 존재하는 조건들이 정제된 시료 내의 조건과 비교하여 상당히 상이하기 때문에 예상치 못한 것이었다. 따라서 정제되지 않은 시료 또는 세포에서 병렬적으로 작용할 수 있는 몇몇 상이한 과정, 예를 들어 상이한 단백질의 과밀 효과(crowding effect) 또는 부분적으로 풀린 단백질의 상이한 샤페론(chaperon) 또는 멤브레인 상호 작용이 단백질의 용해도에 영향을 미칠 수 있는 것으로 예상될 수 있었다. 본 발명자들은 상기에 기재된 바와 같은 이러한 발견을 이용하여 열적 변화 분석법을 개발하였으며, 상기 분석법은 특성 온도에서 용융하는 정제되지 않은 단백질의 능력에 기초하여 정제되지 않은 시료 중의 단백질에 대한 리간드 결합을 검출할 수 있다. 따라서 상기 방법은 선행 기술분야의 방법과는 다르게, 대부분의 표적 단백질과 리간드 조합을 위해 사용될 수 있다. 상기 분석법에서는 열적 안정성에서의 증가가 리간드 결합을 나타내는 특정 온도에서 정제되지 않은 형태인 표적 단백질의 열적 안정성을 조사하였다. 따라서 리간드가 첨가된 정제되지 않은 표적 단백질의 열적 안정성은 리간드가 없는 정제되지 않은 표적 단백질의 열적 안정성과 비교된다. 리간드가 없는 정제되지 않은 표적 단백질과 비교해서 리간드가 포함된 정제되지 않은 표적 단백질의 열적 안정성에서의 임의의 증가는 리간드가 상기 정제되지 않은 표적 단백질에 결합되어 있다는 것을 나타낸다. 특히, 열적 안정성에서의 임의의 증가는 열처리 이후에 표적 단백질이 가용성이거나 불용성인지를 검출함으로써 결정된다. 따라서 본 발명의 분석법은 임의의 가용성 표적 단백질을 식별하기 위해 불용성 단백질로부터 가불용성 단백질을 분리하는 간단한 단계를 이용한다. 상기에서 토의된 바와 같이, 이와 같은 가용성 단백질은 시료에 적용된 온도에서 열적으로 안정하고, 따라서 결합된 리간드를 구비한다는 것과 관계가 있다. 그 결과, 가용성 단백질과 불용성 단백질 사이를 구별하기 위한 분리 단계는 임의의 표적 단백질을 검출하고, 따라서 일반적인 방법을 제공하기 위해 본 발명의 분석법이 사용되도록 한다.
따라서 하나의 양태에서 본 발명은 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 식별하기 위한 방법으로, 이때 상기 표적 단백질은 정제되어 있지 않은 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 상기 정제되지 않은 표적 단백질 및 시험 분자(test molecule)를 포함하는 시료를 상기 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에 노출시키는 단계,
(b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계, 및
(c) 표적 단백질에 대해 단계 (b)의 가용성 단백질을 분석하는 단계를 포함하되,
상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서는 검출되지 않는다.
따라서 상기에서 토의된 바와 같이, 본 발명의 방법은 정제되지 않은 시료 중의 표적 단백질에 대한 리간드 결합을 검출하는 것에 관한 것으로, 놀랍게도 이와 같은 시료 중의 표적 단백질은 특성 온도에서 용융하거나 풀릴 수 있다. 표적 단백질이 리간드에 결합하여 있는 경우, 표적 단백질의 열적 안정성은 일반적으로 증가하고, 그 결과 상기 표적 단백질은 어떠한 리간드도 존재하지 않는 경우보다 리간드가 결합된 경우에 더욱 높은 온도에서 용융할 수 있다. 따라서 통상적으로 시료가 결합된 표적 단백질을, 용융되거나/풀리는 온도에 적용하는 것은, 결합된 표적 단백질이 풀리게 할 수 있고, 리간드가 결합되어 있는 표적 단백질이 더욱 광범위한 정도로 접힌 상태로 남아 있게 할 수 있다. 따라서 접힌 표적 단백질(folded target protein)이 더욱 높은 수준으로 검출된다는 것은 리간드 결합(ligand binding)의 존재를 나타낸다. 접힌 표적 단백질은 일반적으로 가용성인 반면, 접혀있지 않은 단백질은 일반적으로 불용성이다. 그 결과, 단백질의 용해도는 이의 열적 안정성과 연관되어 있다. 따라서 표적 단백질이 침전하여 불용성이 되기 시작하는 온도를 이용한 열처리 이후에 가용성 표적 단백질의 더욱 높은 수준의 검출은 열적 안정성의 증가, 및 그에 따른 리간드의 결합과 더불어 접힌 표적 단백질의 존재를 나타내다.
본 발명은 순수하지않은(impure) 시료의 분석에 관한 것이다. 이는 상기 기술이 "바이오센서" 유형의 방법에서 사용되도록 한다. 특히 임상적인 또는 환경적 시료 중에서 관심 있는 리간드를 함유할 수 있는 정제되지 않은 시료는, 정제된 단백질로서 또는 정제되지 않은 시료(예를 들어, 세포 용해물로서의 시료)에서 표적 단백질을 시료에 첨가함으로써 분석될 수 있다. 이와 같은 방법은 비록 처음에는 혈청에 상기 표적 단백질이 존재하지 않았을지라도 혈청 시료 중에 약제 또는 기타 분석물질의 존재의 정량화를 허용한다. 표적 단백질을 함유하는 세포 용해물, 예를 들어 상기 약제의 표적 세포로부터 유래한 세포 용해물을 임상적인 시료에 첨가할 수 있다.
따라서 본 발명은 정제되지 않은 시료에 관심 있는 리간드에 결합되어 있는 표적 단백질이 함유되어 있는지의 여부를 결정하는 더욱 일반적인 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 상기 리간드에 결합한 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도보다 더 높은 온도로서, 결합하지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에서, 상기 정제되지 않은 시료를 노출시키는 단계;
(b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 상기 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
(c) 표적 단백질의 존재에 대해 단계 (b)의 가용성 및 불용성 단백질 분획 중 하나 또는 둘 모두를 분석하는 단계를 포함하되,
상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서는 검출되지 않는다.
본 분야의 기술자라면 정제된 단백질의 열적 변화 분석 및 이에 의해 생성된 융점 곡선에 대하여 잘 알고 있다. 융점 곡선의 중간점은 단백질의 유점인 것으로 받아들여질 수 있으며, 이러한 온도는 리간드 결합 시에 변할 수 있다. 리간드 결합에 의해 야기된 변화의 특성에 따라 특정한 온도에서 결합된 단백질 및 결합하지 않은 단백질 둘 모두의 용융(침전)이 일부 존재할 수 있지만, 결합하지 않은 단백질에 의해 더욱 큰 정도로 침전이 발생하는 것으로 인지된다. 상기 변화가 관측 가능하고 침전된 단백질의 양이 상이한 온도는 차등 온도(discriminatory temperature)이며, 이와 같은 범위 내의 온도는 상기 단계 (a)에 따라 단일 차등 온도로서 사용될 수 있다. 상기 결합하지 않은 표적 단백질 및 결합한 표적 단백질의 융점이 공지되어 있고 이는, 상기 방법이 시료 중의 표적 단백질 및/또는 리간드 존재에 대한 분석법으로서 수행되는 경우에 특히 그러하다. 따라서 리간드는 표적 단백질의 존재를 확인하기 위해 시료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 방법은 정제되지 않은 시료에서 리간드-표적 단백질 결합을 결정하기 위한 일반적인 방법이다. 문맥에서 달리 명백하게 개시하지 않는 한, "정제되지 않은 단백질"에 대한 본원에서의 토의에 따르면, 필요한 변경을 가하여(mutatis mutandis) '정제되지 않은 시료'에 적용한다. 이러한 방법은 당해 기술분야의 방법에 대해 다수의 이점을 갖는다. 첫째, 이는 리간드 결합을 조사하기 위해 단백질을 정제할 필요성을 없앤다. 또한, 상기 방법은 표적 단백질의 재조합성 발현, 또는 융합 리포터 단백질을 함유하는 단백질의 생성을 요구하지 않는다(모로 등[상기와 동일]에서와 같음). 이는 또한 열적 변화 결합 분석법을 이용하여 이전에는 불가능하였던 세포 배양, 동물 또는 환자 시료에서의 리간드 결합의 조사를 허용한다. 상기에서 토의된 바와 같이, 이는 특정 환자에서 질병을 치료하고 약제의 최적의 투여량을 결정하는 것을 조력하기 위해 특정 약제가 효과적으로 사용될 수 있는지의 여부를 분석하기 위해 중요하다. 예를 들어, 이는 약제 내성이 종종 발생할 수 있는 암 및 감염성 질병의 치료를 위한 중요한 결과를 갖는다. 상기 약제에 의해 효과적으로 치료되지 않을 수 있는 환자를 찾을 수 있는 이와 같은 경우에 기타 요법이 개시되도록 하거나, 약제 투여량이 조절되도록 한다.
또한 본 발명의 방법의 검출 단계는 고가의 장비 또는 기기의 사용을 요구하지 않지만, 실제로 분리 단계는 필터를 이용하여 달성될 수 있으며, 표적 단백질은, 예를 들어 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 상기 방법은 임의의 단백질이 리간드의 결합을 검출하도록 사용될 수 있지만, 상기 방법에서 검출될 각각의 단백질에 대한 특정 탐침 등을 설계하기 위한 어떠한 요건도 없다. 따라서 본 발명의 방법은 정제되지 않은 시료에서 단백질-리간드 결합을 결정하는 효과적이고 신뢰 가능한 방식을 나타낸다. 부가적으로, 하기에 추가로 토의된 바와 같이, 상기 방법은 용이하게 다중화 될 수 있으며, 상호 작용을 위해 리간드 또는 단백질의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "표적 단백질"이란 용어는 리간드 결합을 위해 본 발명의 방법에서 평가되고 있는 단백질을 지칭한다. 따라서 표적 단백질은 시료에 존재하는 임의의 단백질일 수 있다. 표적 단백질은, 예를 들어 세포 또는 세포 용해물, 또는 동물 또는 환자 시료에서 천연적으로 발생할 수 있거나, 재조합에 의해 발현될 수 있으며, 예를 들어 세포에 형질전환되었던 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 표적 단백질은 초기에 시료에 존재하지 않을 수 있지만, 출발 시료에서 리간드의 존재를 조사하기 위해 여기에 첨가될 수 있다. 따라서 본 발명에 따르면 상기 '시료'는 단계 (a)에서 처리되는 시험 시료이고, 이는 출발 시료, 예를 들어 임상적인 시료와는 상이할 수 있다. 마찬가지로, 리간드는 출발 시료에 첨가될 수 있다. 공지된 양의 표적 단백질 또는 리간드를 첨가하는 것은 정량적 데이터를 수득하는데 도움이 될 수 있다.
상기 표적 단백질은 야생형 형태일 수 있으며, 즉 이는 통상적으로 자연적으로 발생할 수 있거나, 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 따라서 단백질을 암호화하는 유전자/cDNA/코딩 영역은 상기 리간드와 결합하는 다양한 능력을 갖는 이러한 단백질의 변이체, 예를 들어 돌연변이체를 생성하기 위해 돌연변이 될 수 있다. 하기에서 추가로 토의된 바와 같이, 이들 돌연변이체는, 예를 들어 리간드 결합이 증가된 변이체가 본 발명의 방법을 이용하여 선택될 수 있는 발현 시스템에서 생성될 수 있다.
일반적으로는, 상기 표적 단백질은 고유의 형상 또는 고유-유사 형상을 가질 것이고, 가용성일 것이다. 고유의 단백질 또는 고유-유사 단백질은 가용성 형태로 발현되고/되거나 정확히 접혀 있다. 고유-유사 멤브레인 단백질은 용액에서 유리된 상태로 존재해서는 안되지만, 봉입체가 아닌 세포성 멤브레인 또는 멤브레인 소포에 존재할 수 있다. 따라서 고유-유사 단백질은 일반적으로는 불용성이 아니거나, 봉입체 내에 존재하거나, 응집되어 있거나, 잘못 접혀있다.
표적 단백질은 동물 개체군에 걸쳐 다수의 변이체 형태로 존재할 수 있다. 이들 변이체는 건강한 동물 개체군 내에 존재할 수 있거나, 단백질에서의 변이가 개체군 내에서의 질병 또는 약제 저항성을 초래할 수 있다. 본 발명의 방법은 상이한 표적 단백질 변이체의 범위 전반에 걸쳐 리간드를 스크리닝하는 수단을 제공한다. 이와 같은 정보는 특정 단백질 변이체에 특이적으로 결합하는 리간드를 개발하기 위해 유용할 수 있거나, 이들이 자연적으로 발현하는 단백질 변이체에 기초하여 환자에 대해 요법의 어떠한 형태가 가장 적합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 유용할 수 있다. 따라서 상기 방법은 2개 이상의 표적 단백질을 이용하여 반복될 수 있으며, 이때 이들 표적 단백질은 동일한 단백질의 변이체이다.
"가용성 단백질"은 고유의 형상 또는 고유-유사 형상의 소유와 관련하여 한정될 수 있다. 또한 가용성 단백질은 시료의 원심분리(상기 단백질이 세포 내에 있는 경우에 이전의 용해 단계와 함께) 이후에 상층액에 남아 있는 단백질로서 개시될 수 있다. 원심분리는 일반적으로 100g와 20,000g 사이에서 수행될 수 있다. 원심분리의 지속 시간은 1분 내지 적어도 1시간 범위(일반적으로는 적어도 10분)일 수 있으며, 이때 요구되는 지속 시간은 일반적으로 원심력이 증가함에 따라 감소한다. 얻어진 상층액에서 가용성 단백질만을 제공하기 위한 특히 적합한 조건은 3,000g에서 30분, 또는 20,000g에서 15분을 포함한다.
"정제되지 않은 표적 단백질"이란 용어는 단리된 형태가 아닌 경우, 또는 대안적으로 볼 때 기타 화합물, 예를 들어 단백질과 함께 존재하는 경우의 표적 단백질을 지칭한다. 본 발명의 방법에서 사용될 정제되지 않은 표적 단백질은 시험 분자(잠재적인 리간드)의 첨가 이전 또는 시험 분자의 존재 하에 정제되지 않은 형태이다. 따라서 상기 정제되지 않은 표적 단백질은 이것이 표적 단백질을 위한 리간드인지의 여부를 결정하기 위해 시험되는 시험 분자(잠재적인 리간드)가 아닌 화합물과 함께 존재한다. 따라서 정제되지 않은 표적 단백질은 조직 시료, 혈액, 혈청, 혈장, 림프 등과 같이 환자(인간 환자 또는 동물 환자, 또는 질병 모델, 예를 들어 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 마우스, 래트 등)로부터 직접 수득된 세포, 세포 용해물 및 시료 내부 또는 상에 포함되는 경우의 표적 단백질을 포함한다. 상기 정제되지 않은 표적 단백질은 하나 이상의 세포 콜로니에 포함되는 경우의 표적 단백질을 포함하며, 이때 세포 콜로니는 고체 또는 반고체 배지(즉,0.1% 초가의 아가가 첨가된 배양 배지) 상에서 성장하는 단일 세포 또는 소집단의 세포로부터 정상적으로 유래한 제한된 그룹의 세포로서 한정된다. 또한 상기 정제되지 않은 표적 단백질은 세포의 액체 배양액 중에 포함될 수 있다. 세포의 액체 배양액은 모두 단일 세포에서 유래했던 세포를 포함할 수 있으며, 즉 액체 배양액 내의 세포는 클론성일 수 있거나, 상기 액체 배양액은 상이한 세포의 현탁액을 포함할 수 있다. 상기 콜로니의 세포 또는 액체 배양액 중의 세포는 원핵생물, 즉 박테리아일 수 있거나, 진핵생물 세포, 예를 들어 효모, 단세포성 진핵생물(예를 들어,리슈마니아(Leishmainia)), 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 또는 세포주일 수 있다. 액체 배양액 중의 세포 또는 콜로니로서 성장한 세포는 대장균(E. coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트랩코커스 라티스(Streptococcus lactis), 스트랩코커스 리비덴스( Streptococcus lividens ), 락토코커스 라티스(Lactococcus lactis), 스타필로코커스 아우레아스(Staphylococcus aureas), 아스파질러스 나이거(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Picia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccaromyces pombe)로서 형성될 수 있다. 상기 모두는 표적 단백질을 포함하는 시료의 예이다.
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명에 대한 열쇠(key)는 '탁한(dirty)' 상태의 시료가 열적 변화 분석을 겪는 경우에 신뢰 가능한 정보를 산출할 수 있다는 발견이다. 따라서 단계 (a)에서의 시료는 정제되지 않았지만, 정제된 표적 단백질이 탁한 상태의 출발 시료에 첨가되었던 환경일 수 있다. 상기 시료는 정제되어 있지 않으며, "정제되지 않은 표적 단백질"의 문맥에서 본원에 개시되지 않은 바와 같이 기타 단백질, 세포 잔사, 핵산 등과 같은 성분을 함유한다.
일반적으로는, 정제되지 않은 표적 단백질은 표적 단백질의 정제를 야기할 수 있는 정제 과정에 적용되지 않았다. 이와 같은 정제 과정은 몇몇 단계로 이루어져 있을 수 있으며, 따라서 본 발명에서 사용된 정제되지 않은 표적 단백질은 정제된 단백질을 생성하기에 필요한 이와 같은 모든 단계에 적용되지 않았다. 예를 들어, 단백질이 조직 내에 존재하는 경우, 추출, 침전 및 분리의 단계, 예를 들어 원심분리 또는 크로마토그래피에 의한 추출, 침전 및 분리의 단계는 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 정제되지 않은 표적 단백질은 이와 같은 모든 단계에 적용되지 않을 수 있으며, 따라서 정제된 표적 단백질이 단리되지 않을 수 있다. 상기 정제 과정이 완료되지 않고 정제된 단백질이 단리되지 않는 한 상기 정제되지 않은 표적 단백질은 하나 이상의 단계, 예를 들어 정제 과정의 추출 단계에 적용되었을 수 있다는 것이 가능하다. 따라서 상기 정제되지 않은 표적 단백질은 일반적으로 기타 화합물 또는 단백질과 함께 존재하고, 따라서 상기 표적 단백질은 단리된 형태로 존재하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "시험 분자"란 용어는 분자 또는 화합물이 표적 단백질을 위한 리간드인지의 여부를 결정하기 위해 본 발명의 방법에서 시험된 임의의 분자 또는 화합물을 지칭한다. 대안적으로 볼 때, 상기 시험 분자는 표적 단백질을 위한 잠재적인 리간드이다. 따라서 상기 시험 분자 또는 리간드는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, RNA, 또는 DNA 분자일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 분자/리간드는 약제 또는 의약품, 세포 대사산물, 또는 예를 들어 혈청 중의 호르몬일 수 있다. 상기 시험 분자 또는 리간드는 천연적으로 발생하거나, 앞서 개시된 방법 또는 하기에 추가로 토의될 방법 중 임의의 방법을 이용하여 합성 또는 재조합에 의해 생성될 수 있다.
상기에서 사용된 시험 분자는 표적 단백질에 결합하거나 결합하지 않을 수 있지만, 하나의 양태에서 본 발명의 방법에 의해 특정 분자 또는 화합물이 표적 단백질에 결합할 수 있는지의 여부, 즉 시험 분자 또는 화합물이 리간드인지의 여부가 결정되거나 평가된다. 따라서 본 발명은 표적 단백질에 결합할 수 있는 분자를 위해 작은 분자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 시험된 분자 중 일부는 표적 단백질에 결합할 수 없는 반면, 기타 분자는 표적 단백질에 결합할 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 방법은 표적 단백질에 결합하는 것으로 공지된 작은 분자의 변이체를 식별하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 상기 작은 분자의 변이체는 더욱 높은 친화도(또는 대안적으로 더욱 낮은 친화도)로 표적 단백질을 결합시킬 수 있는데, 이는 종종 열적 안정화 정도에서 반영된다. 따라서 시험 분자는 돌연변이 리간드, 또는 공지된(또는 공지되지 않은) 표적 단백질 결합 파트너일 수 있다. 이와 같이 돌연변이 분자의 생성은 본원에서 개시된 임의의 돌연변이 과정을 이용하여 달성된다.
따라서 하나의 양태에서 본 발명은 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 식별하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 상기 표적 단백질 및 시험 분자를 포함하는 정제되지 않은 시료를 표적 단백질의 초기 용융 온도와 동일하거나 이를 초과하는 온도를 포함하는 일련의 상이한 온도에 노출시키는 단계;
(b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
(c) 표적 단백질의 존재에 대해 단계 (b)의 가용성 단백질 및 불용성 단백질 분획 중 하나, 또는 둘 모두를 분석하는 단계를 포함하되, 상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서도 검출되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "리간드"란 용어는 시험 분자를 지칭하는 것일 수 있고, 더욱 일반적으로는 표적 단백질에 결합할 수 있는 화합물을 지칭한다. 표적 단백질에 보조 인자 또는 생리학적 기질이 결합될 수 있지만, 본 발명의 방법은 그러한 리간드가 결합되지 않은 표적 단백질의 융점과 비교하여, 관심 있는 리간드에 결합된 표적 단백질의 융점을 조사한다. 상기 관심 있는 리간드는 단백질 상의 다른 부위에 결합할 수 있거나, 예를 들어 생리학적 리간드와 결합하기 위해 경쟁할 수 있다. 관심 있는 리간드는 약제 또는 약제 후보물질, 또는 천연적으로 발생하는 결합 파트너, 생리학적 기질 등일 수 있다. 따라서 리간드는 표적 단백질과 결합하여 더욱 큰 복합체를 형성할 수 있다. 상기 리간드는 임의의 친화도, 즉 높거나 낮은 친화도로 표적 단백질에 결합할 수 있다. 일반적으로, 높은 친화도로 표적 단백질에 결합하는 리간드의 경우, 더욱 낮은 친화도로 표적 단백질에 결합하는 리간드와 비교하여, 열적으로 더욱 안정하다. 일반적으로는, 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드는 적어도 0.25 또는 0.5℃, 및 바람직하게는 적어도 1, 1.5 또는 2℃ 정도에서 그러한 표적 단백질의 열적 안정화를 초래할 수 있다.
그 결과, 시험 분자가 표적 단백질과 결합하는 것으로 이미 공지되어 있는 경우(그 결과 표적 단백질을 위한 리간드인 경우) 본 발명의 방법은 표적 단백질에 대한 리간드의 결합을 평가하기 위해, 예를 들어 상호 작용의 강도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 양태에서, 본 발명은 표적 단백질에 대한 리간드 결합을 평가하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 표적 단백질 및 상기 리간드를 포함하는 시료를 상기 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에 노출시키는 단계, (b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계, 및 (c) 표적 단백질의 존재에 대해 단계 (b)의 가용성 단백질을 분석하는 단계를 포함하되, 상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서도 검출되지 않는다.
정제되지 않은 표적 단백질에 대한 리간드 결합을 평가하거나 결정하기 위해, 또는 정제되지 않은 표적 단백질에 대한 리간드를 식별하기 위해, 일반적으로는 상기 시험 분자 또는 리간드는 시료에 첨가된다. 그러나 상기 시험 분자 또는 리간드가 정제되지 않은 표적 단백질을 포함하는 시료에 이미 존재한다는 것, 예를 들어 천연적으로 발생한다는 것이 가능하다. 따라서 본 발명은 또한 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 식별하기 위한 방법을 제공할 수 있으며, 이때 상기 표적 단백질은 정제되어 있지 않으며, 상기 방법은:
(ai) 시험 분자를 상기 정제되지 않은 표적 단백질에 첨가하는 단계;
(a) 단계 (ai)의 생성물을 상기 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에 노출시키는 단계;
(b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
(c) 표적 단백질의 존재에 대해 단계 (b)의 가용성 단백질을 분석하는 단계를 포함하되, 상기 표적 단백질의 존재는 상기 분자가 상기 표적 단백질에 결합되어 있으며, 상기 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드임을 나타내고, 상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서도 검출되지 않는다.
일반적으로, 상기 시험 분자(잠재적인 리간드)가 세포 외에 존재하는 경우, 예를 들어 용액 중에 존재하는 경우, 이는 정제되지 않은 표적 단백질에 첨가될 수 있으며, 예를 들어 이것이 또한 용액에 존재하거나 표적 단백질에 적가하는 경우, 예를 들어 표적 단백질이 수확된 세포의 분취액(aliquot)에 존재하는 경우에 정제되지 않은 표적 단백질과 혼합될 수 있다. 대안적으로, 상기 시험 분자(잠재적인 리간드)는 시험 분자를 암호화하는 벡터로부터 재조합에 의해 발현될 수 있다. 따라서 상기 시험 분자를 첨가하는 단계는 세포성 시료를 시험 분자를 암호화하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, 및/또는 일단 형질전환 또는 형질감염이 수행되면 세포성 시료 중의 벡터로부터 시험 분자의 발현을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시험 분자를 첨가하는 단계는 세포성 시료에서 천연적으로 발생하는 유전자에 의해 암호화된 시험 분자의 발현을 유도하는 단계를 더 포함한다.
또한 상기 표적 단백질이 세포 내에 존재하는 경우, 상기 방법은 상기 표적 단백질과 접촉하기 위해 세포 내로 전달될 세포 외 시험 분자 또는 리간드를 요구할 수 있다. 그러나 세포 표면 상의 표적 단백질에 결합하는 시험 분자 또는 리간드에 있어서, 세포 내로의 전달 필요성은 없다. 대안적이거나 부가적으로, 상기 표적 단백질이 세포 내(세포 표면 상)에 존재하는 경우, 용해 단계는 상기 시험 분자 또는 리간드의 첨가 이전, 동시 및 이후에 수행될 수 있다. 이와 같은 용해 단계는 표적 단백질과 시험 분자 또는 리간드 사이의 접촉을 허용하고/하거나, 상기 시험 분자 또는 리간드와 표적 단백질 사이의 임의의 결합에 대한 추후의 평가를 허용한다. 따라서 임의의 필요한 용해 단계는 일반적으로 본 발명의 방법의 분리 단계 이전에 수행된다. 용해 단계는 표적 단백질이 세포 내에 포함되어 있는 경우에 시료 상에서만 수행되는 것이 필요할 수 있다는 것이 자명할 것이다. 상기 용해 단계는 열적 의존성을 가질 수 있으며, 즉 용해는 오직 특정 온도, 예를 들어 열적 주기가 끝날 무렵에 일어날 수 있다.
본 발명의 용해 단계는 세포가 임의의 용해 단계 이전 또는 이후에 열처리에 적용되었는지의 여부에 따라 상이한 요건을 가질 수 있다. 열처리 이전에 용해에 적용된 세포에 있어서, 바람직하게는 상기 용해 단계는 비-변성 단계이며, 이는 표적 단백질이 고유의 형상, 즉 정확하게 접힌 형상 또는 고유-유사 형상을 유지하도록 한다. 이는 본원에서 고유 용해로서 지칭된다. 이는 화학적으로 수행되거나, 그렇지 않는 경우에는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있는 시약, 예를 들어 우레아, 리소자임 함유 완충액, 또는 세정제를 이용하여 수행될 수 있다. 용해의 정또는 세포의 단백질이 상기 세포 밖으로 자유롭게 통과하도록 하기에 충분해야 한다. 일반적으로, 멤브레인 결합 단백질을 다루는 경우, 용해는 멤브레인으로부터 단백질을 방출하기 위해 세정제 또는 양친매성 물질(amphiphile), 예를 들어 트리톤 X-100 또는 도데실말토시드의 존재 하에 수행된다. 상기 용해 단계는 대안적으로 세포 또는 콜로니를 동결 해동시킴으로써 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 용해는 고유의 용해 완충액의 이용 및 세포의 동결 해동 둘 모두에 의해 수행된다. 바람직하게는, 상기 용해 완충액은 리소자임을 예를 들어 50 내지 750㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 100 내지 200㎎/㎖로 함유한다. DNAse는 고유의 용해 완충액에 바람직하게는 250 내지 750㎎/㎖로 발견될 수도 있다. 고유의 용해 완충액은, 예를 들어 20mM 트리스, pH 8, 100mM NaCl, 리소자임(200㎎/㎖), 및 DNAse I(750㎎/㎖)을 함유할 수 있다. 세포성 멤브레인 내로 삽입되는 것으로 공지된 표적 단백질에 있어서, 세정제는 1% n-도데실-β-말토시드와 같이 고유의 형태를 갖는 멤브레인 삽입 단백질을 가용화하는 것으로 공지된 경우에 정형적인 농도로 상기 용해 완충액에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 상기 세포는 15 내지 60분, 바람직하게는 약 30분 동안 용해 완충액에 노출될 것이다. 상기 동결 해동 단계는 바람직하게는 반복되며, 즉 2회 이상의 주기, 바람직하게는 3회 이상의 주기의 동결 해동을 수행한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 용해는 용해 완충액을 이용하여 실온에서 30분 동안 배양하고, 10분 동안의 동결 해동을 3회 수행함으로써 달성된다.
일반적으로, 용해 단계 도중에 시료(예를 들어, 세포 콜로니 또는 세포 배양액) 내에서 용해된 세포의 비율은 5 내지 100%이다. 따라서 이는 시료 내의 모든 세포가 용해되는 용해 단계를 수행하는 경우에는 필요하지 않다. 오직 적은 비율의 세포만이 리간드와 접촉하기에 충분한 표적 단백질을 방출하기 위해 용해되고/되거나, 분리 단계에 적용될 필요가 있다.
상기에서 간단하게 토의된 바와 같이, 상기 표적 단백질을 포함하는 시료에 이미 시험 분자 또는 리간드가 존재하는 것이 가능하다. 이러한 예에서, 예를 들어 완충액으로 시료를 희석하고, 리간드가 방출되는 경우에 표적 단백질의 열적 안정성에 있어서 임의의 음의 변화를 검출함으로써 상기 표적 단백질에 대한 천연 리간드 결합을 조사하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 "상기 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도"에 정제되지 않은 시료를 노출시킬 것을 요구한다. 이는 시험 분자(잠재적인 리간드)의 부재 하에 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도를 지칭한다. 마찬가지로, 상기 정제되지 않은 시료는 "상기 리간드에 결합된 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도보다 더욱 큰 정도로 결합되지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도" 노출된다. "결합되지 않은"이란 용어는 상기 관심 있는 리간드에 결합되지 않은 경우의 표적 단백질, 즉 상기 관심 있는 리간드의 부재 하의 표적 단백질을 지칭한다.
따라서 앞서 토의된 바와 같이, 본 발명자들은 정제되지 않은 형태의 단백질은 일반적으로 정제되지 않은 시료, 특히 세포 내에서 발견되는 다양한 조건에도 불구하고 정제된 단백질과 유사한 방식으로 특정 온도 의존성(즉 독특한 용융 온도를 가짐)에 의해 침전한다는 것을 발견하였다. 따라서 상기 단백질은 작은 온도 범위에 걸쳐 침전할 수 있다. 가끔 일부 단백질은 시료에 존재하는 단백질의 몇몇 형태(예를 들어, 상이한 접합된 형태, 인산화된 형태, 또는 기타 단백질에 결합된 형태)가 존재한다는 것을 나타내는 온도 범위에서 가열하는 동안에 이들의 상태에서 몇몇 전이를 겪을 수 있다. 이러한 상환에서, 시험 분자/리간드가 모든 전이 상태에서 있는 모든 형태의 단백질에 결합하지 못할 것이라는 것이 가능하다. 그 결과, 시험 분자 또는 리간드는 이의 전이 상태들 중 하나 이상의 상태에서 단백질과 결합할 수만 있다. 따라서 시험 분자/리간드가 특정한 전이 상태 또는 단백질의 형태를 열적으로 안정화시킬 수만 있고, 안정성에서의 열적 변화가 이들 전이 상태에 대해서만 오직 관측될 것이라는 것이 가능하다.
표적 단백질이 작은 온도 범위에 걸쳐 침전하는 경우, 초기 용융 온도는 상기 범위 내에서의 최초 온도이고, 마지막 용융 온도는 상기 범위 내에서의 최후 온도이다. 따라서 상기 초기 용융 온도는 표적 단백질이 침전하기 시작하는 가장 낮은 온도, 예를 들어 5%의 표적 단백질이 침전된 가장 낮은 온도이고, 상기 마지막 용융 온도는 어떠한 가용성 표적 단백질도 검출되지 않는 최초 온도이다. 예를 들어, 5% 미만의 표적 단백질은 가용성 형태이다. 일반적으로, 적어도 95%의 표적 단백질은 용융되고, 침전되어 있다.
따라서 표적 단백질이 온도 범위에 걸쳐 침전하는 경우, 상기 표적 단백질은 특정 온도에서 침전하거나 풀리기 시작할 수 있으며, 이 시점에 가용성 표적 단백질의 존재량이 감소하기 시작할 것이고, 불용성 표적 단백질의 존재량이 증가할 것이다(열적 안정성이 용해도에 연관되어 있기 때문). 따라서 몇몇 가용성 단백질은 약간 더 높은 온도가 적용될 때까지 초기 용융 온도에서도 여전히 검출될 수 있으며, 이 시점에 가용성 단백질이 거의 검출되지 않는다.
따라서 단백질에 대한 마지막 용융 온도는 가용성 단백질의 유의한 감소가 검출되는 특정 온도, 일반적으로는 적어도 95%의 단백질이 불용성인 특정 온도이다. 다중 전이를 갖는 문제의 단백질에 있어서, 이들 전이 각각은 더욱 작은 양의 단백질이 불용성이 되게 할 수 있지만, 이는 여전히 측정되기에 충분히 유의할 수 있다(예를 들어, 적어도 10%의 단백질이 각 전이에서 가용성이 됨). 상기 단백질이 작은 온도 범위에서 침전하는 경우, 그리고 가용성 단백지의 비율이 어떠한 가용성 단백질도 검출되지 않을 때까지 감소하고, 그 결과 상기 단백질이 완전히 풀려 있거나 침전되어 있는 경우, 초기 및 마지막 용융 온도가 결정될 수 있다. 그 결과, 이와 같은 온도 범위의 초기 용융 온도, 즉 표적 단백질이 용융하거나 침전하기 시작하는 가장 낮은 온도에서, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 표적 단백질은 용융하거나 침전할 수 있다. 대안적으로 볼 때, 온도 범위의 초기 용융 온도에서 가용성 표적 단백질의 검출량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 정도 감소한다. 게다가, 불용성 표적 단백질의 존재량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 정도 증가할 수 있다.
또한 표적 단백질이 하나의 특정 온도에서 풀리고 침전할 수 있다는 것이 가능하다. 이러한 경우, 바람직하게는 적어도 95%의 표적 단백질이 특정 온도에서 불용성 형태일 것이며, 그 결과 상기 단백질은 작은 온도 범위에 걸쳐 침전할 수 없다. 따라서 이와 같은 단백질에 대한 초기 용융 온도는 마지막 용융 온도에 근접하게 될 수 있다.
본 발명에서 적용될 수 있는 온도는 상기 표적 단백질이 풀리기 시작하는 초기 용융 온도로부터의 임의의 온도일 수 있다. 상기 초기 용융 온도와 동일하거나 이를 초과하는 임의의 온도는 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있을 것이다. 따라서 리간드 결합으로 인해 더욱 높은 열적 안정성을 갖는 표적 단백질은 일반적으로 이러한 온도에서 풀리거나 침전하지 않을 것이고, 완전히 풀렸거나 또는 풀리기 시작했던 표적 단백질 단독에 비해 더욱 많은 양의 가용성 단백질이 검출될 것이다. 따라서 상기 온도는 차등적이며, 이는 관심 있는 리간드에 결합된 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시키는 온도보다 더욱 큰 정도로 결합되지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킨다. 시험 분자가 존재하지 않을 때 가용성 표적 단백질의 존재량에 비해 시험 분자가 존재할 때 특정 온도에서 증가된 가용성 표적 단백질의 양의 검출은 상기 분자가 표적 단백질에 대한 리간드임을 나타내고, 상기 시험 분자가 표적 단백질에 결합되어 있다는 것을 나타낸다. 본 발명에서 사용된 온도는 초기 용융 온도이거나, 상기 초기 용융 온도와 마지막 용융 온도 사이의 온도(즉, 적어도 95%의 표적 단백질이 불용성이 되게 하는 온도는 아님(마지막 용융 온도 또는 이보다 높은 온도))인 경우, 둘 모두의 경우에 검출된 가용성 단백질의 양을 비교하기 위해 리간드가 존재하지 않은 표적 단백질에 대해 대조 반응(control reaction)을 동시에 수행하여, 표적 단백질 단독에 비해 증가된 양의 가용성 표적 단백질이 존재하는 경우에 리간드를 이용하여 시료를 검출하는 것이 필요할 수 있다. 이는 정제되지 않은 시료와 유사하게 단백질의 용융 곡선을 측정함으로써 일반적으로 이루어진다. 그러나 가용성 단백질이 거의 검출되지 않는 온도(즉, 리간드가 없는 표적 단백질), 예를 들어 마지막 용융 온도가 본 발명에서 사용되는 경우, 모든 측정에 대한 비교 또는 대조를 이용할 필요는 없다. 이러한 경우, 상기 방법에서의 가용성 단백질의 임의의 검출은 열적으로 안정하여 리간드가 결합한 표적 단백질의 존재를 나타낸다. 이와 같은 온도는 일반적으로 상기 마지막 용융 온도와 동일하거나 이를 초과할 수 있다.
부가적으로, 상기 온도는 높은 친화도를 갖는 표적 단백질에 결합하는 리간드만을 스크리닝하기 위해 본 발명에서 선택될 수 있다. 따라서 일반적으로 가용성 단백질 및 그 결과 열적으로 안정한 리간드 결합 표적 단백질이 검출되는 온도가 높을수록 표적 단백질에 대한 리간드 결합의 친화도가 더욱 높을 가능성이 있다. 그 결과, 높은 친화도 상호 작용만이 검출될 필요가 있는 경우, 마지막 용융 온도보다 높은 온도는, 예를 들어 마지막 용융 온도보다 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃ 정도 높게 선택될 수 있다. 따라서 바람직하게는 상기 선택된 온도는 온도 범위에서 마지막 용융 온도보다 높을 수 있다. 대안적으로, 표적 단백질에 결합된 모든 분자/리간드를 식별하는 것이 필요한 경우, 더욱 낮은 온도, 예를 들어 온도 범위에서 초기 용융 온도와 동일한 온도가 사용될 수 있다. 대안적으로 볼 때, 높은 친화도 상호 작용을 위해 선택하는 경우, 단계 (a)의 차등 온도는 리간드 결합 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시키는 온도보다 높은 정도, 예를 들어 적어도 30% 이상, 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80% 이상으로 결합하지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시키는 것이다.
표적 단백질에 대한 리간드의 결합 친화도는 리간드의 농도 또는 표적 단백질의 농도의 다양한 범위에서 상술한 방법의 단계를 수행함으로써 결정될 수 있다. 이와 같은 방법에서, 단계 (a)에서 처리된 시료는 여기에 첨가된 표적 단백질 또는 리간드의 공지된 양을 가질 것이다. 당업자는 용량 반응 곡선을 작도하고, 따라서 리간드의 결합 상수(즉, 표적 단백질의 50%가 리간드에 결합되어 있는 리간드 또는 표적 단백질의 농도)를 결정할 수 있다. 순수하지 않은 임상 시료에서 수득된 이와 같은 결합 정보는 순수한 시료에서 유래한 정보에 비해 생리학적 조건 하에서 표적 단백질에 대한 리간드의 결합 특징의 더욱 정확한 해석을 제공할 수 있다. 이와 같은 정보는 환자를 위한 투여 계획을 설정하거나, 체내의 상이한 기관에서의 겉보기 결합 상수의 연구에 의해 약제에 대한 치료 영역(therapeutic window)을 찾는데 있어서 유용한 응용을 가질 수 있다. 따라서 본 발명의 특정 양태는 또한 추가적인 단계를 포함할 수 있다: d) 하나 이상(예를 들어, 2 이상, 바람직하게는 3 또는 4 이상)의 상이한 농도의 리간드 또는 표적 단백질을 이용하여 단계 (a) 내지 단계 (c)를 반복하는 단계.
상기 가열 단계는 시료를 특정 온도까지 가열하는 임의의 열 공급원을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서 상기 정제되지 않은 표적 단백질 및 시험 분자(잠재적인 리간드)가 액체 형태인 경우, 바람직하게는 상기\ 가열 단계는 PCR 기기에서 수행될 수 있다. 그러나 배양기, 수욕 등이 또한 사용될 수 있다. 표적 단백질이 세포 콜로니 내에 있는 경우, 배양기는 바람직하게는 상기 가열 단계를 수행하기 위해 사용된다.
본 발명은 온도의 범위를 상기 표적 단백질 및 시험 분자에 적용하는 단계, 및 표적 단백질과 시험 분자의 각 조합에 대한 침전 곡선을 생성하기 위해 각각의 온도에서 배양한 이후에 표적 단백질을 가공 및 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서 표적 단백질 및 리간드는 표적 단백질(즉 결합된 리간드가 없는 단백질)의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도가 사용되는 한 임의의 온도 범위에서 배양될 수 있다. 따라서 바람직하게는 상기 적용된 온도 범위는 초기 용융 온도에서의 배양 또는 상기 초기 용융 온도보다 높은 온도에서의 배양을 포함한다. 상기 정제되지 않은 표적 단백질 및 시험 분자를 전체 온도 범위에서 배양함으로써 리간드가 결합한 경우에 표적 단백질이 침전하는 온도를 결정하는 것이 가능하다. 게다가, 리간드가 없는 정제되지 않은 시료의 대조군이 동일한 온도 배양에 적용되는 경우에 표적 단백질의 용융 온도를 사전에 알지 못한 채 리간드 결합 단백질 시료를 식별하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 이와 같은 임의의 대조군의 가열은 상기 정제되지 않은 시료 및 시험 분자/리간드의 가열과 동시에 수행될 수 있다. 침전 곡선을 이용함으로써 하나 이상의 리간드가 연구되고 있는 경우에 열적 안정성에 대해 가장 큰 효과를 나타내는 리간드를 결정하는 것이 가능하다.
일반적으로 온도 범위는 사용된 온도가 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 또는 10℃로 서로 상이한 경우의 침전 곡선을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 상기 표적 단백질 및 시험 분자는 상기 온도 중 하나의 온도가 표적 단백질에 대한 초기 용융 온도와 동일하거나 이를 초과하는 경우에 27℃, 30℃, 33℃, 36℃, 39℃, 42℃, 45℃, 48℃, 51℃, 54℃, 57℃, 60℃, 63℃, 66℃, 69℃, 72℃, 및 75℃ 중 임의의 하나의 온도에서 배양될 수 있다. 상기 표적 단백질 및 시험 분자가 온도 범위 전반에서 가열되는 경우, 이는 초기 온도가 설정된 후, 특정 시간의 양, 예를 들어 1분, 2분, 3분, 4분 또는 5분 이후에 목적하는 양으로 증가될 수 있는 PCR 기기에서 수행될 수 있다. 앞서 토의된 바와 같이, 시료의 작은 분취량 또는 소량(예를 들어, 1 또는 2㎕)이 표적 단백질의 용해도를 분석하기 위해서 각각의 온도에서 가열한 이후에 제거될 수 있다. 상기 정제되지 않은 표적 단백질이 하나 이상의 세포 콜로니에 존재하는 경우, 상기 콜로니의 일부는, 예를 들어 여과지를 상기 콜로니의 상면에 놓음으로써 각각의 배양 이후에 분취될 수 있다.
본 발명의 방법을 적용하기 위해서, 시험 분자/리간드의 존재 하에 임의의 열적 변화가 검출될 수 있도록 시험 분자/리간드가 없는 관시 있는 표적 단백질의 용융 온도(들)를 결정하는 것이 필요하다. 따라서 상기 표적 단백질의 용융 온도(들)는 본 발명의 방법이 수행되기 이전에 결정될 수 있거나, 동시의 대조군 반응이, 예를 들어 침전 곡선을 생성하기 위해 상기에서 토의된 바와 같이 대조군 및 표적 단백질 및 분자에 온도의 범위를 적용하는 본 발명의 방법과 함께 수행될 수 있다. 상기 정제된 시료 중의 다수의 표적 단백질의 Tm(50%의 단백질이 침전되는 온도)은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 정제되지 않은 표적 단백질에 대한 Tm이 약간 상이할 지라도 이들은 종종 정제되지 않은 단백질의 용융 온도에 대한 가이드로서 사용될 수 있다.
따라서 표적 단백질의 "침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도"는 침전에서의 증가가 있거나 대안적으로 볼 때 더욱 낮은 온도에서의 표적 단백질에 비해 표적 단백질의 풀림 또는 용융에서의 증가가 있는, 상기에서 토의된 바와 같은 온도 또는 온도 범위를 지칭한다. 상기 온도는 일반적으로 상기 표적 단백질이 통상적으로 발견되는 온도, 예를 들어 환자 내에서의 표적 단백질에 대해 37℃에 비해 증가된 온도이다. 따라서 상기 적용된 온도는 일반적으로는 37℃ 초과, 바람직하게는 40℃ 초과, 예를 들어 50℃초과이다.
따라서 본 발명에서 사용된 온도는 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 정도의 표적 단백질의 침전에서의 증가를 야기한다. 단백질 침전에서의 증가는 통상적으로 불용성 단백질이 생성되게 하며, 따라서, 대안적으로 볼 때, 본 발명에서 사용된 온도는 불용성 단백질의 존재량에서의 증가, 예를 들어 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 증가를 야기할 수 있다. 본 발명에서, 침전의 임의의 증가는 가용성 표적 단백질의 존재량에서의 감소 또는 축소, 예를 들어 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 축소를 측정함으로써 측정될 수 있다. 이러한 감소의 측정은, 예를 들어 결합된 항체의 양이 예를 들어 형광 표지된 항체들의 형광 신호의 통합을 이용하여 정량화될 수 있는 도트 블랏(dot-blot) 또는 ELISA 실험을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 분리 단계 (b)의 이용을 추가로 필요로 한다. 상기 분리 단계는 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리할 수 있는 임의의 분리 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 원심분리 단계는 상술한 바와 같이 사용될 수 있거나, 바람직한 실시형태에서 여과 단계가 사용될 수 있다. 따라서 필터는 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 사용될 수 있으며, 이때 상기 가용성 단백질은 필터를 통과할 것이다. 표준 필터 멤브레인은 가열된 시료를 여과하기 위해 사용될 수 있으며, 이대 상기 필터는 일반적으로 0.015㎛ 내지 12㎛, 바람직하게는 0.35㎛ 내지 1.2㎛, 더욱 바람직하게는 0.45㎛ 내지 0.8㎛의 기공 크기를 가질 것이다. 바람직하게는, 상기 필터는 4.0㎛ 미만, 일반적으로는 2.0㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 1.0㎛ 미만의 기공 크기를 갖는다. 상기 표적 단백질이 박테리아, 예를 들어 대장균과 같은 세포에서 생성되거나 발현되는 경우, 최적의 기공 크기는 0.1㎛ 내지 1.5㎛일 수 있다. 표적 단백질이 진핵생물 세포 또는 시료로부터 유래한 경우에 바람직한 기공 크기는 더욱 클 수 있다. 필터가 특정 기공 크기를 갖는 것으로 제조되고 거래되지만, 제조 공정은 종종 조금 더 작거나 큰 기공을 초래할 수 있으며, 따라서 직경으로 지칭되는 나열된 크기는 주어진 필터의 가장 일반적인 기공 크기인 것으로 인지될 것이다. 잠재적인 기공 크기 범위를 참고할 지라도 임의의 단일 필터는 통상적으로 하나의 주어진 기공 크기, 예를 들어 0.45㎛의 기공 크기를 가질 것이다. 적합한 필터로는 Super 및 GH polypro(Pall사 제품) 및 Nucleopore(와트만사의 제품)가 있다.
진핵생물 및 원핵생물 시료에서 유래한 표적 단백질, 및 상이한 세포 유형에서 유래한 표적 단백질은 기공 크기의 크기가 상이한 필터의 사용을 필요로 할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 적합한 필터의 선택은 충분히 이러한 분야에서의 숙련자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 목적하는 세포 유형 또는 시료에 대해 한 세트의 시험용 단백질을 사용하고, 다양한 기공 크기를 갖는 필터로 이들의 거동을 조사함으로써 적당한 기공 크기를 선택하는 것이 가능하다.
앞서 토의된 바와 같이, 상기 표적 단백질이 세포 내에 존재하는 경우, 세포 용해 단계는 분리 단계 이전에 수행될 수 있다. 또한 세포 용해는 상기 시료가 세포 시료이고 리간드의 존재에 대해 검정하기 위해 표적 단백질이 여기에 첨가되는 경우에 요구될 것이다. 본 발명의 방법이 세포 콜로니 상에 수행되는 경우, 상기 용해는 이들 콜로니 상에서 직접 수행될 수 있으며, 즉 콜로니를 분취하여 액체 배양액에서 이들을 성장시킬 필요가 없다(비록 이것이 이루어질 수 있을지라도). 이 경우에, 상기 분리 단계는 여과 중 하나인 것이 바람직하다. 게다가, 상기 방법이 세포 콜로니 상에 수행되는 경우, 바람직하게는 상기 여과지는 반고체 또는 고체 성장 배지로부터 콜로니를 채취하기 위해 상기 콜로니 상에 덧씌운다. 대안적으로, 필터는 성장 배지 상에 놓이고 세포가 필터 상에 직접 시딩(seeding)되어야 하는 경우, 상기 필터는 단순히 이미 필터 상에 있는 콜로니와 함께 리프팅(lifting)되어 제거될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 방식으로 콜리니의 리프팅은 용해 단계 이전에 수행될 수 있다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 상기 용해는 필터 상의 콜로니에 대해 직접 수행될 수 있다. 상기 콜로니가 부착되어 있는 필터는 용해 완충액으로 처리될 수 있거나, 용해 완충액으로 처리된 기타 멤브레인/필터 상에 도금될 수 있다.
여과는 또한 세포의 액체 배양액, 예를 들어 다중-웰 플레이트, 예를 들어96-웰 플레이트에서 성장하는 액체 배양액에 대해 수행될 수 있다.
여과는 임의의 필요한 용해 단계가 수행된 이후에 수행된다. 그러나 몇몇 세포는 기타 세포가 용해를 겪기 전에 용해를 겪을 수 있으며, 그 결과 기타 세포가 용해되기 이전 또는 기타 세포의 용해와 동시에 여과될 수 있기 때문에 전체 콜로니를 고려할 경우에 여과 및 용해는 동시에 발생할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
바람직하게는, 상기 분리 단계가 여과인 경우, 필터를 통과한 단백질은 고체 지지체, 예를 들어 포획 멤브레인 상에 유지되어 상기 표적 단백질(들)의 스크리닝/검출을 허용한 후, 리간드에 결합된 표적 단백질을 함유하는 시료(들)의 식별을 허용한다. 이와 같은 포획 멤브레인은 일반적으로 니트로셀룰로오스를 포함한다. 그러나 이것이 이러한 방법에서 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하는 첫 번째 필터인 것으로 인지될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 단백질은 가능하게는 모세관 작용의 결과로서 단순히 필터를 통과하도록 허용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 여과지에 대해 수직으로 힘이 가해질 수 있으며, 이때 이와 같은 힘은 압력 또는 진공의 적용을 포함할 수 있다.
상기 포획 멤브레인은 개개의 시료(들)로부터 가용성 단백질을 고정시킬 수 있으며, 이러한 방식으로 이러한 방법을 멀티플렉싱(multiplexing) 하는 것이 가능하다. 따라서 상기 포획 멤브레인 상에서의 표적 단백질(들)의 위치는 상기 방법이 세포 콜로니 상에서 수행되고 있는 경우에 최초 세포 콜로니를 갖고 있거나, 시료 스팟(sample spot)을 갖고 있는 필터와 비교될 수 있다. 따라서 여과 블랏으로부터 상기 표적 단백질 및 결합된 리간드를 포함하는 최초 시료를 다시 추적하고 식별하는 것이 가능하다. 리간드에 결합된 표적 단백질을 포함하는 콜로니를 식별하는 공정을 돕기 위해 양성 대조군이 사용될 수 있다. 이들은 마지막 콜로니 여과 블랏 상에서 명백하게 관측되며, 상기 멤브레인/블랏이 최초 콜로니와 정확하게 순응하도록 할 수 있다. 그 결과, 임의의 여과 단계가 수행된 이후에 포획 멤브레인과 같은 고체 지지체는 리간드에 결합된 표적 단백질을 갖는 시료의 용이한 식별을 허용한다.
다른 실시형태에서, 열처리된 시료(들)가 구비된 상기 필터는 시료 측이 하향하도록 놓을 수 있고, 이어 (니트로셀룰로오스) 포획 멤브레인을 필터의 상부에 놓을 수 있으며, 여러 층의 여과지(및 종이 타월)는 이의 상부에 놓을 수 있다. 이어 이러한 "샌드위치"의 상부, 및 이상적으로는 포획 멤브레인 상에 단백질의 여과 및 전달을 조장하기 위해 바닥부 주변에 부은 이동 완충액의 상부에 힘이 가해질 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 필터는 포획 멤브레인 상에 시료 측이 하향하도록 놓고, 단백질을 여과지를 통해 "인출"하고 포획 멤브레인 상에 "인출"하기 위해 진공을 적용한다.
여과 및 원심분리에 대해 대안적으로는, 가용성 단백질의 친화도 포획이 수행될 수 있다. 단백질의 접힌 구조를 인식하는 다수의 항체 및 친화도 시약은 접혀있지 않고 침전된 단백질보다 훨씬 높은 친화도를 갖는 가용성 단백질과 결합할 것이다. 또한 금속 접합체에 결합하는 폴리-히스티딘(His) 태그와 같은 더욱 작은 태그의 인식은 종종 이들 태그가 침전된 단백질에 덜 접근 가능한 경우에 용해도와 상관 관계가 있을 것이다. 항체, 금속 접합체 및 기타 친화도 시약은 열처리되고 정제되지 않은 시료와 혼합되는 자성 비드 또는 칼럼 수지에 연결될 수 있다. 이러한 혼합물은 후속적인 단계에서 적당한 밸브에 넣고, 이것이 친화도 시약에 대해 높은 친화도를 갖는 경우에 불용성 단백질을 제거하기 위해 세척할 수 있다. 후속적으로, 친화도 시약에 결합된 단백질의 양은, 예를 들어 브래드포드(Bradford) 기법영동, 겔 전기영동, ELISA, 또는 표면 플라즈몬 공명 검출법을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 표적 단백질의 존재에 대해 불용성 및 가용성 분획 중 하나(둘 모두)를 분석하는 것이 가능하다. 바람직하게는 상기 불용성 분획은, 예를 들어 실시예 3에서 개시된 바와 같이 분석 이전에 가용화 되고, 상기 침전된 단백질은 분리 겔에 적용하기 이전에 로딩 완충액에서 용해될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 표적 단백질의 존재에 대해 가용성 단백질을 분석하는 단계 (c)를 포함한다. 따라서 분리 단계 이후에 수득된 가용성 단백질은 바람직하게는 표적 단백질의 존재에 대해 분석된다. 그 결과, 원심분리 단계가 수행되었을 경우, 상층액은 표적 단백질의 존재에 대해 분석될 수 있으며, 여과 분리 단계가 수행되었을 경우에는 상기 필터를 통과한 단백질은 표적 단백질의 존재에 대해 분석될 수 있다.
상기 표적 단백질은 다양한 상이한 방법에 의해 검출될 수 있다. 따라서 표적 단백질은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있는 다양한 태그, 예를 들어 히스티딘 태그, VS 태그, T7 태그, FLAG 태그, 또는 특정 항체가 이용 가능한 임의의 짧은 단백질 서열, 티오레독신(thioredoxin), 및 말토오스 결합 단백질을 이용하여 검출될 수 있다. 태그는 바람직하게는 1 내지 100개의 아미노산의 범위의 길이를 갖고, 바람직하게는 1 내지 70개의 아미노산, 2 내지 50개의 아미노산, 1 내지 30개의 아미노산, 또는 1 내지 20개의 아미노산의 범위의 길이를 갖는다. 그러나 상기 표적 단백질은 표적 단백질에 융합되어 있는 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 효소 활성에 기초하여서도 검출되지 않는다. 따라서 표적 단백질은 상기 표적 단백질에 융합된 임의의 이와 같은 태그 또는 단백질에 의해 나타나는 효소 활성을 이용하여도 검출되지 않으며, 이때 예를 들어 상기 효소 활성으로 인해 검출 가능한 신호의 생성이 초래된다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질, 고추냉이 페록시다아제, 루시페라아제 및 글루타티온-S-전이효소와 같이 효소 활성을 갖는 융합 태그는 표적 단백질을 검출하기 위해 본 발명에서 사용되지 않는다. 따라서 임의의 태그/단백질이 표적 단백질에 융합되는 것이 가능할 지라도 상기 표적 단백질은 임의의 이와 같은 태그 또는 단백질이 갖는 효소 활성을 이용하여도 검출되지 않는다. 따라서 GFP 태그의 경우에 형광 녹색광이 효소 반응에 의해 생성되고, 그 결과 이와 같은 반응을 이용하여 표적 단백질이 검출되는 것이 본 발명에서 구체적으로 배제된다. 그 결과, 이와 같은 형광이 태그가 갖는 효소 활성의 결과이기 때문에 GFP 태그에 의해 생성된 형광에 의해 표적 단백질의 검출은 배제된다. 게다가 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 표적 단백질은 효소 활성을 갖는 리포터 단백질에 융합되지 않는다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 표적 단백질은 GFP에 융합되지 않는다. 따라서 대안적으로 볼 때, 표적 단백질에 융합된 임의의 태그가 비-단백질 태그인 것이 바람직하다.
태그가 표적 단백질에 융합되기 위해서는, 단일 분자로서 표적 단백질과 함께 전사 및 해독되는 것이 일반적이다. 따라서 표적 단백질에 결합하고 HRP 등으로 표지될 수 있는 항체들은 표적 단백질에 융합되는 것으로 간주되지 않는다. 이와 같은 경우, 이것이 표적 단백질 내의 융합 단백질의 일부가 아니기 때문에 HRP 태그를 이용하여 표적 단백질을 검출할 수 있다.
따라서 태그는 이와 같은 단백질을 융합 단백질로서 발현함으로써 표적 단백질에 부착될 수 있다. 이와 같이, 관심 있는 단백질이 고유-유사 형상을 유지하도록 하기 위해 짧은 태그가 바람직하다. 게다가, N-말단 His 태그가 또한 사용될지라도 C-말단 태그가 바람직하다. 상기 표적 단백질이 재조합성 발현 시스템으로부터 유래하는 경우 표적 단백질에 융합된 태그의 사용을 포함한 검출 단계만이 사용될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 따라서 상기 표적 단백질이 예를 들어 환자로부터 수득되는 경우에 일반적으로는 이러한 검출 방법이 사용되지 않을 것이다.
표적 단백질은 효소적 검출 방법에서 기질로서 작용하는 융합 태그를 통해 추가로 검출될 수 있으며, 이러한 경우에 특히 His 태그가 적합하다. 예를 들어, INDIA His 탐침-HRP(미국 일리노이주의 록퍼드(Rockford) 소재의 피에르(Pierre))가 검출용으로 사용될 수 있으며, 이때 상기 표적 단백질은 폴리-히스티딘 태깅(tagging)되거나, 히스티딘이 풍부하며, 상기 표적 단백질이 His 태그와 결합하는 고추냉이 페록시다아제의 니켈 활성화된 유도체에 의해 검출된다. 또한 표적 단백질이 이들 자신의 효소 활성에 기초하여 검출될 수도 있다.
대안적으로, 검출은 표적 단백질과 검출 잔기 사이, 또는 상기 표적 단백질이 융합된 태그와 검출 잔기, 예를 들어 항체, 항체 단편 또는 애피바디(affibody; 비-항체 기반 단백질 결합 파트너) 사이의 친화도 결합에 기초하여 검출될 수 있다. 바람직하게는, 표적 단백질은 태그에 대해 지향하거나 표적 단백질에 대해 직접 지향하는 항체, 예를 들어 단클론성 또는 다클론성 항체(그 자신 상에 발현되거나 유합체로서 발현됨)를 이용하여 검출될 수 있다. 표적 단백질에 대해 지향하는 항체는 일반적으로 환자의 시료로부터 표적 단백질을 검출하기 위해 사용된다. 이와 같은 방법은 그 자체가 촉매 활성을 갖지 않는 단백질을 포함하여 매우 다양한 표적 단백질에 대한 신속하고 신뢰 가능한 분석을 허용한다.
또한 표적 단백질은 반정량적 질량 분석법(MS)을 이용하여 검출될 수 있다. 오비트랩(orbitrap) 기구를 이용한 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 실험에서, 일반적으로는 용해물에서 유래한 시료에서 1,000 내지 2,000개의 단백질이 동시에 검출될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 세포의 온도 스캔 및 그 이후의 용해 및 여과, 그리고 마지막 단계에서 상기 각 스캔 온도에서 질량 분석법을 이용한 모든 잔류하는 가용성 단백질의 검출은 다수의 단백질에 대해 침전 곡선이 동시에 측정되도록 한다. 이러한 포괄적인 프로테옴 용융 곡선 분석(proteome melting curve analysis)은, 예를 들어 소의 약제의 표적 효과를 검출하기 위해, 즉 세포 내 기타 단백질이 상기 약제와 결합하는 것으로 나타나는지를 모니터링 하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 포괄적인 프로테옴 용융 곡선 분석은 또한 약제에 대한 약물표적을 조사할 때, 또는 약물표적이 공지되어 있지 않은 약제 후보를 조사할 때 사용될 수도 있다. 예를 들어, 세포 상에서의 직접적인 화합물 라이브러리 스크리닝에 의해 이들 세포에서 바람직한 표현형을 생성하는 화합물이 식별될 수 있으며, 이는 상기 화합물이 특정한 질병에 대한 약물표적로서 유용한 세포에서의 과정에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 그러나 약제 후보물질이 세포 중의 어떤 단백질 또는 단백질들과 상호 작용을 하는지를 식별하는 것이 정상적으로는 매우 어렵다. 상기 열적 변화에 대한 포괄적인 프로테옴 용융 곡선 분석에 따르면, 이는 MS에 의해 검출하기에 충분한 정도로 이용 가능한 단백질에 대해 수행되도록 한다.
표적 단백질에 대한 분자/리간드 결합은 재조합성 발현 시스템에서 연구될 수 있다. 따라서 표적 단백질에 대한 유전자/cDNA/코딩 영역은 플라스미드, 바이러스성 벡터, 코스미드 및 YAC과 같은 벡터/구조에서의 발현 시스템 내로 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 이와 같은 벡터는 조절 서열, 및 당해 기술분야에 널리 공지된 기타 요소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 유전자/cDNA/코딩 영역은 벡터 중의 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 본원에서 사용된 프로모터는 일반적으로 특정 숙주 내에서 표적 단백질을 발현할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 사용된 프로모터는 유도성이며, 즉 상기 표적 단백질의 발현은 제어될 수 있다. 이와 같은 유도성 프로모터/시스템은 IPTG의 첨가에 의해 발현 유도가 제어되는 lac, 및 tet on/off를 포함하며, 이때 발현의 유도는 테트라시클린의 존재/부재에 의해 제어되며, 기타 시스템은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
앞서 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 표적 단백질에 결합할 것에 대해 작은 분자의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이는 상기 라이브러리의 각 화합물이 세포의 분취액 또는 세포 용해물에 첨가되어 있는 다중-웰 플레이트를 이용하여 수행된다. 대안적으로, 돌연변이 표적 단백질의 라이브러리는 특정 리간드에 대해 변경된 결합을 나타내는 돌연변이 표적 단백질을 결정하기 위해 스크리닝 될 수 있다. 예를 들어, 야생형 표적 단백질보다 더 밀접하거나 단단하게 리간드와의 연결을 갖는 돌연변이 표적 단백질이 식별될 수 있다. 돌연변이 표적 단백질이 평가되고 있는 경우, 리간드가 없는 단백질의 안정성에 대한 측정은 상기 안정화가 리간드 상호 작용에 기인하는 것인지, 아니면 그 자체가 더욱 안정한 돌연변이체, 즉 돌연변이 단백질에 대해 안정화 효과를 갖는 돌연변이에 기인하는 것인지를 결정하는데 바람직할 수 있다. 리간드가 다른 단백질인 경우, 안정성 측정은 대신에 이러한 비-돌연변이 단백질에 대해 수행될 수 있으며, 이때 돌연변이 되지 않은 단백질을 안정화시키는 돌연변이 된 단백질 변이체가 선택될 수 있다. 예를 들어, 이는, 예를 들어 항체들, FAB-단편, 단일쇄 항체, 또는 무작위 돌연변이가 결합 단백질에 부가된 애피바디와 같이 결합 단백질(즉, 리간드)을 성숙시키기 위해 사용될 수 있으며, 향상된 겉보기 결합을 나타내는 변이체는 상기 돌연변이 되지 않은 단백질의 개선된 안정화를 측정함으로써 검출된다. 이와 같은 방식으로, 친화도고 더욱 높은 결합제는 친화도가 더욱 낮은 결합제로부터 선택될 수 있다. 결합 단백질이, 예를 들어 특정 수용체 또는 사이토카인에 대해 표적화된 단백질 약제로서 작용할 수 있는 경우, 상기 방법은 단백질 약제의 약물표적에 대한 이와 같은 결합 친화도를 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
많은 상이한 돌연변이 유발 방법은 표적 단백질의 변이체 또는 표적 단백질의 변이체 라이브러리를 생성하기 위해 이용될 수 있는 것으로, 당해 기술분야에 공지되어 있다. 가능한 과정으로는 서열의 절두(truncation), 엑소뉴클레아제 효소의 사용, 예를 들어 오류 발생(error-prone) PCR을 이용한 무작위 점 돌연변이의 도입, 무작위 카세트의 도입, 또는 부위 지향 돌연변이 유발을 들 수 있다. 절두에 있어서, 제거된 뉴클레오티드의 개수는 2,000개 미만, 바람직하게는 1,000개 미만, 및 더욱 바람직하게는800개 미만일 수 있다. 돌연변이 유발을 위한 무작위 카세트의 도입은 100개 미만의 뉴클레오티드를 함유하는 카세트를 이용하는 것이 바람직하다.
돌연변이 유발은 표적 단백질을 암호화하는 몇몇 복제수의 핵산 서열 상에서 수행될 수 있어서, 한 세트의 상이한 돌연변이 된 서열이 스크리닝 될 수 있으며, 따라서 목적하는 리간드 결합 특성을 갖는 표적 단백질 변이체를 식별할 가능성을 증가시킨다. 무작위 돌연변이 유발의 이용은 특정 돌연변이가, 예를 들어 리간드에 더욱 견고하게 결합하는 변이체, 즉 리간드에 대해 더욱 높은 친화도를 갖는 변이체를 얻을 수 있다는 선행 기술의 지식이 없는 경우에 특히 바람직하다.
코딩 영역이 무작위로 돌연변이 되었으며 길이가 상이한 구조체가 단일 염기 삭제(erase-a-base) 또는 무작위 프라이밍(priming) 반응에 의해 생성되었던 단백질의 라이브러리를 생성할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법은 리간드에 대한 친화도 결합이 변경된 표적 단백질 변이체, 및 바람직하게는 결합 친화도가 증가되거나 높은 표적 단백질 변이체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 방법은 세포 배양액 또는 환자 시료 중의 표적 단백질이 특정 시험 분자, 예를 들어 약제와 상호 작용할 것인지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 그 결과, 상기 방법의 바람직한 이용은 이러한 세포 유형의 표적 단백질에 약제가 결합한다는 것을 확인하기 위해 약제 개발 기간 동안에 세포 배양액에서의 약제-단백질 상호 작용을 결정하는 것이다. 유사하게, 상기 방법은 목적하지 않은 단백질에 대한 약제 결합, 소위 탈표적 결합을 모니터링 하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법의 다른 바람직한 이용은 특정 약제 요법이 환자에 대해 효과적인지에 대한 암시를 제공하기 위해 이러한 환자의 시료(예를 들어, 조직, 혈액, 림프 등)에서의 약제-단백질 상호 작용을 결정하는 것이다. 조직 시료가 조사되어야 하는 경우, 본 발명의 방법은 또한 조직으로부터 표적 단백질을 추출하는 단계를 혼입할 수 있다. 부가적이거나 대안적으로, 용해 단계가 사용될 수 있다. 적당한 용해 조건이 상기에 개시되어 있다.
일단 본 발명의 방법을 이용하여 표적 단백질과 리간드의 상호 작용을 정제하지 않은 시료에서 검출되었을 경우, 표적 단백질의 서열 또는 구조를 식별하는 것이 바람직할 수 있으며, 표적 단백질 변이체가 연구되는 경우에 특히 바람직할 수 있다. 대안적으로, 상기에서 토의된 바와 같이 수득된 결과는 약제 요법이 환자에 효과적인 가능성이 있는지, 그로 인해 환자에 제공된 용법을 테일러링(tailoring) 할 가능성이 있는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 실시예 4, 5, 6 및 7에서 나타낸 바와 같이 확립된 약물표적에 대한 높은 친화도 약제의 결합은 일반적으로 더욱 높은 온도로의 용융 온도의 양의 변화에 의해 지지되는 바와 같이 표적 단백질의 안정화를 초래한다.
그러나 표적 단백질에 대한 결합 시에 더욱 낙은 온도로의 용융 온도의 음의 변화, 즉 불안정화를 야기하는 리간드도 존재한다. 예를 들어, 음의 변화는 표적 단백질에 대해 공유 결합(몇몇 금속을 포함함)을 형성하는 리간드에 대해 나타날 수 있다. 공유 결합의 결합 에너지 및 이와 같은 결합을 형성함으로서 생성된 효과 면에서 바람직하지 못한 균주는 몇몇의 경우에 단백질의 불안정화를 조장할 수 있는 것으로 추정된다. 예를 들어, 에릭슨(Ericsson) 등(문헌[Anal Biochem 357 (2006) pp 289-298])에 따르면, 염화리튬(II) 6수화물과 같은 중금속 원자를 함유하는 화합물이 결합 시에 다수의 박테리아성 단백질을 불안정화시킬 수 있다.
따라서, 또 다른 양태에서 본 발명은 정제되지 않은 시료가 관심 있는 리간드에 결합된 표적 단백질을 함유하고 있는지의 여부를 결정하는 방법을 제공하되, 상기 리간드는 융합 단백질이 아니다. 여기서 상기 방법은,
(a) 결합하지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도보다 더 높은 온도로서, 상기 리간드가 결합한 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에서, 상기 정제되지 않은 시료를 노출시키는 단계;
(b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 상기 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
(c) 표적 단백질에 대해 단계 (b)의 가용성 및 불용성 단백질 분획 중 하나 또는 둘 모두를 분석하는 단계를 포함하되, 상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서도 검출되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 정제되지 않은 시료가 관심 있는 리간드에 결합된 표적 단백질을 함유하는지의 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은;
(a) 결합하지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도보다 더 높은 온도로서, 상기 리간드가 결합한 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에서, 상기 정제되지 않은 시료를 노출시키는 단계;
(b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
(c) 표적 단백질 존재에 대해 단계 (b)의 가용성 단백질 분획을 분석하는 단계를 포함하되, 상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여서도 검출되지 않는다.
상술한 양태에서, 당 업자라면 상기 불안정화 리간드에 결합된 표적 단백질이 결합하지 않은 표적 단백질에 비해 낮은 온도에서 침전할 수 있기 때문에 리간드에 결합된 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에 상기 정제되지 않은 시료를 노출시킬 수 있다. 따라서 단계 (a)에서 개시된 특징적인 온도에서 당업자라면 불용성 단백질 분획에서 더욱 많은 결합된 단백질을 찾을 수 있고, 가용성 단백질 분획에서 결합하지 않은 단백질을 더욱 많이 찾을 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
본 발명의 방법의 다양한 특징, 및 리간드 결합에 의해 야기된 불안정화와 관련하여 개시된 바람직한 실시형태의 토의는 리간드 결합이 불안정화를 야기하는 본 발명의 이들 양태에 대해 필요한 변경을 가하여 적용한다.
몇몇의 경우, ATP 또는 NADP와 같은 생리학적 기질 또는 보조 인자가 세포 용해물에 존재할 수 있으며, 이들은 리간드에 시료에 첨가되기 전에도 표적 단백질에 결합할 수 있다. 관심 있는 리간드가 이와 같은 용해물에 첨가되는 경우, 더욱 높은 온도를 향한 용융 곡선의 변화는 생리학적 리간드가 용해물에 존재하지 않는 경우에 비해 일반적으로 작을 것이다. 극단적인 경우, 초기의 약제 선도물질 후보와 같이 매우 낮은 친화도 리간드(일반적으로는 작은 양의 열적 변화를 나타냄)는 NADP와 같이 더욱 강력한 생리학적 리간드(일반적으로는 큰 양의 열적 변화를 나타냄)와 매우 낮은 농도에서 경쟁할 수 있다. 이와 같은 경우, 생리학적 리간드의 치환은 겉보기 변화가 상기 2가지의 단백질의 리간드 결합 형태의 변화 사이의 차이인 경우에 음의 변화, 즉 더욱 낮은 온도로의 변화를 초래할 수 있다. 이와 같은 환경 하에서 상기 음의 변화는 표적 단백질의 용융 온도에서의 감소와 같이 검출 가능할 수 있기 때문에 불안정화를 야기하는 리간드와 관련된 본 발명의 양태가 본원에 적용할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 기구를 더 포함하되, 상기 기구는 가열 수단, 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위한 수단, 및 표적 단백질 존재에 대해 단백질을 분석하기 위한 수단, 예를 들어 적합한 단백질을 분석하기 위한 수단을 포함한다.
대안적으로 볼 때, 가열 수단, 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위한 수단, 및 표적 단백질의 존재에 대해 단백질(예를 들어, 가용성 단백질)을 분석하기 위한 수단을 포함하는, 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용하도록 구성된 기구가 포함된다.
게다가, 본 발명은 가열 수단, 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위한 수단, 및 본 발명의 방법에서 표적 단백질의 존재에 대해 단백질(예를 들어, 가용성 단백질)을 분석하기 위한 수단을 포함하는 기구의 용도에 관한 것이다.
상기 기구는 먼저 시료가 가열 수단과 연결된 후, 분리 수단과 연결되며, 최종적으로 분석 수단과 연결되도록 배열된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "가열 수단"이란 용어는 특정 온도까지 시료를 가열할 수 있는 임의의 열 공급원을 지칭한다. 따라서 상기 가열 수단은 특정 온도까지 시료를 가열하기 위해 프로그래밍 될 수 있는 열판으로 이루어져 있거나 구성될 수 있으며, 예를 들어 PCR는 이러한 방식으로 시료를 가열하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 가열 수단은 배양기 또는 수욕(water bath)을 포함할 수 있다.
"불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위한 수단"이란 용어는 가용성 및 불용성 단백질을 분리할 수 있는 임의의 공지된 장치를 지칭한다. 따라서 상기 수단은 여과지를 포함할 수 있으며, 이때 가용성 단백질은 상기 여과지를 통과할 것이다. 대안적으로, 상기 수단은 가열된 시료에 대해 원심력을 제공할 수 있는 장치, 예를 들어 원심분리기를 포함할 수 있다. 부가적으로, 상기 수단은 가용성 단백질의 친화도 포획을 가능케 하는 장치를 포함할 수 있다. 이와 같은 장치는 가용성 단백질의 접힌 구조를 인식할 수 있는 항체 또는 기타 친화도 시약을 포함할 수 있다. 항체, 금속 접합체 또는 기타 친화도 시약은 자성 비드 또는 칼럼 수지에 연결될 수 있다. 불용성 단백질은 세척에 의해 제거될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "표적 단백질에 대해 단백질(예를 들어, 가용성 단백질)을 분석하기 위한 수단"이란 용어는 표적 단백질을 검출할 수 있는 임의의 장치를 지칭한다. 따라서 이는 질량 분석계를 지칭할 수 있지만, 더욱 바람직하게는 예를 들어 HRP로 표지된 항체 또는 표적 단백질에 결합된 형광 분자를 검출하기 위해 요구되는 장치(즉, 니트로셀룰로오스 멤브레인 또는 형광계)를 지칭할 수 있다. 게다가, 표적 단백질의 존재에 대해 단백질을 분석하기 위한 수단은 표적 단백질을 결합시키기 위한 친화도 칼럼을 포함할 수 있다. 표적 단백질의 존재에 대해 단백질을 분석하기 위한 수단은 표적 단백질을 검출하기 위해 필요한 임의의 시약을 더 포함할 수 있거나, 대안적으로 이들은 개별적으로 제공될 수 있다.
최종적으로, 본 발명은 항체 및/또는 비-단백질 태그를 포함하는, 본 발명의 방법에서의 키트의 용도를 포함한다.
도 1은 상이한 온도 범위에 노출한 이후에 대장균 시료에서 발현된 3개의 상이한 단백질에 대해 가용성 단백질의 존재의 평가 결과를 나타낸다. 상기 정제된 단백질의 공지의 용융 온도는 도면의 우측면 상에 도시되어 있다.
도 2는 리간드인 워트마닌(Wortmannin) 및 3-[4-(4-모폴리닐)티에노[3,2-d]피리미딘2-일]-페놀(화합물 15e)(+)의 첨가 이후에 가용성 PIK3C3-단백질의 존재의 평가 결과를 나타낸다. 리간드가 첨가되지 않은 참고용 시료는 또한 (-)로 나타나 있다. 열적 변화는 리간드가 있는 시료에서 관찰될 수 있다. 리간드 플러스 단백질의 레인(lane)은 리간드가 없는 단백질보다 열적으로 더욱 안정하다.
도 3은 표적물인 사이클린 의존성 키나아제-2(CDK-2)(a) 및 단백질 키나아제 C(PKC)(b)의 웨스턴 블랏 멤브레인을 나타낸다. 검은 밴드는 가용성 단백질의 존재가 특정 온도까지에서 검출되어, 점점 희미해졌으며, 상기 온도가 증가함(좌측에서 우측으로 증가함)에 따라 결국 사라진다는 것을 나타낸다. 침전된 단백질을 함유하는 펠릿은 가장 높은 온도로부터 로딩 완충액에서 용해되었고, 이러한 분획에서 표적 단백질의 존재를 나타내기 위해 레인의 마지막 레인에 적재하였다.
도 4는 포유동물 세포 추출물에서 상이한 온도 범위에 노출한 이후에 존재하는 가용성 티미딜산 합성효소(TS), 디하이드로폴산 환원효소(DHFR), CDK-2 또는 PKC 단백질의 수준을 나타낸다. X축은 노출 온도(℃)를 나타내고 Y축은 웨스턴 블랏으로부터의 적분 강도(integrated intensity)를 나타낸다.
도 5는 억제제인 메토트렉사트(methotrexate: ◆)의 첨가 이후의 가용성 DHFR 단백질의 인간 세포 추출물로부터의 열적 용융 곡선을 나타낸다. 억제제가 없는 참고용 시료도 또한 도시되어 있다(■). X축은 노출 온도(℃)를 나타내고 Y축은 웨스턴 블랏으로부터의 적분 강도를 나타낸다.
도 6은 억제제인 랄티트렉세드(raltitrexed)(+)의 첨가 이후에 가용성 TS 단백질의 인간 세포 추출물로부터의 열적 용융 곡선을 나타낸다. 억제제가 없는 참고용 시료도 또한 도시되어 있다(●). X축은 노출 온도(℃)를 나타내고 Y축은 웨스턴 블랏으로부터의 적분 강도를 나타낸다.
도 7은 소의 간 추출물(a) 또는 인간 세포 추출물 (b)로부터의 리간드 TNP-470(×)의 첨가 이후에 가용성 메티오닌-아미노펩티다아제-2의 열적 용융 곡선을 나타낸다. 리간드가 없는 참고용 시료도 또한 도시되어 있다(○). X축은 노출 온도(℃)를 나타내고 Y축은 웨스턴 블랏으로부터의 적분 강도를 나타낸다.
도 8은 소의 간 추출물의 TNP-470 처리에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. X축은 첨가된 TNP-470의 농도를 나타내고 Y축은 웨스턴 블랏으로부터의 적분 강도를 나타낸다.
도 9는 표적 단백질을 함유하는 세포 용해물로 스파이킹(spiking)함으로서 생성된 TNP-470의 용량 반응 곡선을 나타낸다. X축은 첨가된 TNP-470의 농도를 나타내고 Y축은 웨스턴 블랏으로부터의 적분 강도를 나타낸다.
도 10은 리간드 SB590885의 첨가 이후에 가용성 V600E 변이체 B-raf 단백질(◆) 또는 야생형 B-raf 단백질(▲)의 열적 용융 곡선을 나타낸다. 리간드가 없는 참고용 시료도 또한 V600E 변치에 B-raf 단백질(■) 및 야생형 B-raf 단백질(×) 둘 모두에 대해 도시되어 있다. X축은 노출 온도(℃)를 나타내고 Y축은 웨스턴 블랏으로부터의 적분 강도를 나타낸다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에서 하기와 같이 추가로 설명될 것이다.
실시예 1: 4개의 시험용 단백질의 용융 온도의 결정
N-말단 His-태그를 갖는 발현 벡터 내의 3개의 인간의 가용성 단백질 발현 구조체는 세포에서 각 단백질의 용융 온도를 결정하기 위해 사용되었다. 이는 증가하는 온도 구획에 단백질 함유 세포를 노출하고, 각 온도 단계 이후에 용해 완충액에 침지된 "용해/여과 샌드위치" 상에 세포를 스팟팅함으로써 수행되었다. 이러한 용해/여과 단계를 이용함으로써 가용성 단백질(단백지의 특정 용융 온도까지)을 포획용 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에서 검은 스팟으로서 검출될 수 있는 반면, 침전된 단백질(즉, 이의 특정 용융 온도 초과)은 필터 멤브레인을 통과할 수 없었으며, 따라서 검출될 수 없었다.
재료 및 방법
관심 있는 3개의 단백질을 과발현하는 대장균 세포의 액체 배양은 50㎍/㎖ 카나마이신(시그마-알드리히: 미국) 및 35㎍/㎖ 클로람페니콜(두세파 바이오케미(Duchefa Biochemie): 네덜란드)을 함유하는 1㎖의 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배양액(LB)(포디디움(Formedium Ltd.): 영국)을 글리세롤 저장액으로부터의 냉동 대장균과 함께 96웰 딥웰 플레이트(포바이르(Porvair Plc.)사: 영국)에서 배양함으로써 시작하였다. 배양액은 +37℃에서 700rpm으로 하룻밤 동안 교반판 상에서 배양하였다. 다음 날, 하룻밤 동안 배양한 100㎕의 각 배양액을 900㎕의 LB, 50㎍/㎖의 카나마이신 및 35㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 새로운 96웰 딥웰 플레이트의 상응하는 웰로 전달하였다. 상기 배양액을 +37℃에서 700rpm으로 교반판 상에서 배양하였다. 1.5시간 이후, 온도를 +18℃(30분)까지 내리고, 100mM IPTG(애나트레이스/애피메트릭스(Anatrace/Affymetrix Co.): 미국)를 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. +18℃에서 700rpm으로 교반판 상에서 하룻밤 동안 세포를 성장시켰다. 다음 날에 1,500g에서 2분 동안 세포를 원심분리하여 펠릿화 하고, 900㎖㎕의 상층액을 흡인에 의해 각 웰에서 제거하고, 폐기하였다. 세포 펠릿은 나머지 100㎖의 배지에서 재현탁하였다(즉, 10배 농축함). 세포 현탁액을 8-튜브 PCR 스트립(8-strip PCR tube; 어플라이드 바이오시스템즈: 영국)으로 옮기고, 열순환 반응기(thermocycler)에 넣었다. 하기 온도 프로그램이 사용되었다: 3℃의 증분으로 +27℃ 내지 +75℃ 및 각 단계에서 3분 동안 유지. 각 온도에서 3분의 유지 이후, 열순환 반응기를 멈추고, 2㎕의 각 세포 현탁액을 기공 크기가 0.45㎛인 듀라포어(Durapore) 필터 멤브레인(밀리포어(Millipore Inc.): 미국)(상부층), 프로트란(Protran) BA 45 니트로셀룰로오스 멤브레인(슈라이허&휴엘(Schleicher & Schuell): 독일)(중간층), 및 3MM 와트만(Whatman) 페이퍼(브이더블유알 인터내셔널(VWR Int'l. Ltd.): 영국)로 이루어진 "용해/여과 샌드위치" 상에 신속하게 스팟팅하였다. 상기 "용해/여과 샌드위치"를 고유 용해 완충액(20mM 트리스-HCl(pH 8.0), 100mM NaCl, 10㎎/㎖의 리소자임(시그마-알드리히: 미국), 25U/㎕ 벤조나아제(Benzonase) 뉴클레아제(노바겐: 덴마아크) 및 완전 프로테아제 억제제 EDTA 무첨가 정제(로슈(Roche): 스위스))에 침지시켰다. "용해/여과 샌드위치" 상에 세포를 스팟팅한 후, 각 온도 단계에서 상술한 과정을 반복하였다. 마지막 세포 분취액을 스팟팅한 후, 완전 용해 및 필터 멤브레인을 통한 액체 세포성 물질의 전달을 가능케 하기 위해 "용해/여과 샌드위치"를 실온에서 15분 동안 배양하였다. 그 이후에 상기 "용해/여과 샌드위치"를 -80℃에서 10분 동안 동결시키고, +37℃에서 10분 동안 해동하였다. 이러한 동결/해동 과정을 3회 반복하였다. 1% BSA(브이더블유알 인터내셔널: 영국)를 함유하는 TBST 완충액(20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 500mM NaCl, 및 0.05% 트윈-20)에서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 1시간 동안 차단(blocking)하였다. 이어, 블랏을 약간의 교반(탁상용 교반기)에 의해 TBST에서 10분 동안 3회 세척하였다. 상기 멤브레인을 TBST에서 1:5000로 희석된 INDIA His 탐침-HRP(테모 사이언티픽(Thermo Scientific): 미국)과 함께 1시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 블랏을 TBST에서 10분 동안 3회 세척하였다. 상기 블랏 상의 각 스팟에서의 표적 단백질의 발현 수준에 대한 화학 발광 검출은 수퍼시그날 웨스트 듀라(피어스(Pierce)) 확장형 듀레이션 기질(Extended Duration Substrate; 테모 사이언티픽: 미국)을 이용하여 수행하였다. 화학 발광은 CCD 카메라(바이로라드 래보래토리스(BioRad Laboratories, Inc.): 미국)를 이용하여 검출하고 기록하였다.
결과
가용성 단백질의 존재를 나타내는 검은 스팟은 특정 온도까지 검출되었지만, 이들은 점점 희미해졌고, 더욱 높은 온도에서 결국 사라졌다(도 1). 3개의 MAC-정제된 단백질(오른쪽 패널)의 용융 온도에 대한 이전 데이터와의 비교에 따르면, 2세트의 결과 사이에는 양호한 상호관계가 존재하는 것으로 나타났다. 상기 융점은 단백질이 세포 및 정제 완충액에서 상이한 용매 환경을 가짐에 따라 정확한 것으로 예상되지는 않는다. 이러한 실험에 따르면, 이들 단백질은 상기 세포 환경에서 독특한 융점을 가지며, 이들 융점은 단백질의 침전을 모니터링 함으로써 용이하게 검출될 수 있는 것으로 나타난다.
실시예 2: 리간드에 결합 이후 용융 온도 증가에 대한 검출
N-말단 His-태그가 구비된 발현 벡터 내의 인간의 가용성 PIK3C3 단백질의 발현 구조체는 2개의 PIK3C3 특이적 억제제, 즉 워트마닌 및 화합물 15e 중 하나의 첨가 및 결합 이후에 PIK3C3 구조체의 용융 온도에서의 가능한 증가를 조사하기 위해 사용되었다. 상기 2개의 억제제 중 하나로 처리하거나 처리하지 않은 이후, 상기 PIK3C3 구조체를 발현하는 세포를 증가하는 온도의 패널에 노출시키고, 각 온도 단계 이후에 상기 단백질을 발현하는 세포를 용해 완충액에 침지된 "용해/여과 샌드위치" 상에 스팟팅하였다. 상기 "용해/여과 샌드위치" 상에서의 이러한 용해/여과 단계를 이용함으로써, 상기 가용성 단백질(구조체의 특정 용융 온도까지)은 포획용 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 검은 스팟으로서 검출될 수 있는 반면, 침전된 단백질(즉, 이의 특정 용융 온도 초과)은 필터 멤브레인을 통과할 수 없었으며, 따라서 검출될 수 없었다. 화합물 15e 또는 워트마닌로 처리된 구조체의 용융 온또는 처리하지 않은 시료의 용융 온도와 비교하였다.
재료 및 방법
PIK3C3 구조체를 과발현하는 대장균 세포의 액체 배양은 50㎍/㎖ 카나마이신(시그마-알드리히: 미국) 및 35㎍/㎖ 클로람페니콜(두세파 바이오케미: 네덜란드)을 함유하는 1㎖의 루리아-베르타니 배양액(LB)(포디디움(Formedium Ltd.): 영국)을 글리세롤 저장액으로부터의 냉동 대장균과 함께 96웰 딥웰 플레이트(포바이르사: 영국)에서 배양함으로써 시작하였다. 상기 배양액은 +37℃에서 700rpm으로 하룻밤 동안 교반판 상에서 배양하였다. 다음 날, 하룻밤 동안 배양한 100㎕의 각 배양액을 900㎕의 LB, 50㎍/㎖의 카나마이신 및 35㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 새로운 96웰 딥웰 플레이트의 상응하는 웰로 전달하였다. 상기 배양액을 +37℃에서 700rpm으로 교반판 상에서 배양하였다. 1.5시간 이후, 온도를 +18℃(30분)까지 내리고, 100mM IPTG(애나트레이스/애피메트릭스: 미국)를 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. +18℃에서 700rpm으로 교반판 상에서 하룻밤 동안 세포를 성장시켰다. 다음 날에 1,500g에서 2분 동안 세포를 원심분리하여 펠릿화 하고, 900㎕의 상층액을 흡인에 의해 각 웰에서 제거하고, 폐기하였다. 세포 펠릿은 나머지 100㎕의 배지에서 재현탁하였다(즉, 10배 농축함). 각 실험을 위해, DMSO에 용해된 1mM의 PIK3C3 억제제 화합물 15e(산타크루즈 바이오테크노로지(Santa Cruz Biotechnology, Inc.): 미국) 또는 500μM의 워트마닌(산타크루즈 바이오테크노로지: 미국), 또는 등가량 부피(1㎕ 및 0.5 ㎕ 각각)의 순수한 DMSO를 첨가하고, 시료를 실온에서 30분 동안 서서히 교반하였다. 세포 현탁액을 8-튜브 PCR 스트립(어플라이드 바이오시스템즈: 영국)으로 옮기고, 열순환 반응기에 넣었다. 하기 온도 프로그램이 사용되었다: 3℃의 증분으로 +27℃ 내지 +75℃ 및 각 단계에서 3분 동안의 유지. 각 온도에서 3분 동안의 유지 이후, 열순환 반응기를 멈추고, 2㎕의 각 세포 현탁액을 기공 크기가 0.45㎛인 듀라포어 필터 멤브레인(밀리포어: 미국)(상부층), 프로트란 BA 45 니트로셀룰로오스 멤브레인(슈라이허&휴엘: 독일)(중간층), 및 3MM 와트만(Whatman) 페이퍼(브이더블유알 인터내셔널: 영국)로 이루어진 "용해/여과 샌드위치" 상에 신속하게 스팟팅하였다. 상기 "용해/여과 샌드위치"를 고유 용해 완충액(20mM 트리스-HCl(pH 8.0), 100mM NaCl, 10㎎/㎖의 리소자임(시그마-알드리히: 미국), 25U/㎕ 벤조나아제(Benzonase) 뉴클레아제(노바겐: 덴마아크) 및 완전 프로테아제 억제제 EDTA 무첨가 정제(로슈: 스위스)에 침지시켰다. "용해/여과 샌드위치" 상에 세포를 스팟팅한 후, 각 온도 단계에서 상술한 과정을 반복하였다. 마지막 세포 분취액을 스팟팅한 후, 완전 용해 및 필터 멤브레인을 통한 액체 세포성 물질의 전달을 가능케 하기 위해 "용해/여과 샌드위치"를 실온에서 15분 동안 배양하였다. 그 이후에 상기 "용해/여과 샌드위치"를 -80℃에서 10분 동안 동결시키고, +37℃에서 10분 동안 해동하였다. 이러한 동결/해동 과정을 3회 반복하였다. 1% BSA(브이더블유알 인터내셔널: 영국)를 함유하는 TBST 완충액(20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 500mM NaCl, 및 0.05% 트윈-20)에서 니트로셀룰로오스 멤브레인을 1시간 동안 차단하였다. 이어, 블랏을 약간의 교반(탁상용 교반기)에 의해 TBST에서 10분 동안 3회 세척하였다. 상기 멤브레인을 TBST에서 1:5000로 희석된 INDIA His 탐침-HRP(테모 사이언티픽: 미국)과 함께 1시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 블랏을 TBST에서 10분 동안 3회 세척하였다. 상기 블랏 상의 각 스팟에서의 표적 단백질의 발현 수준에 대한 화학 발광 검출은 수퍼시그날 웨스트 듀라(피어스) 확장형 듀레이션 기질(테모 사이언티픽: 미국)을 이용하여 수행하였다. 화학 발광은 CCD 카메라(바이로라드 래보래토리스: 미국)를 이용하여 검출하고 기록하였다.
결과
가용성 단백질의 존재를 나타내는 검은 스팟은 특정 온도까지 검출되었지만, 상기 온도를 초과한 온도에서는 더 이상 보이지 않았다(도 2). 화합물 15e의 첨가는 약 +55℃에서 +58℃로의 용융 온도의 증가를 초래하는 반면, 워트마닌의 첨가는 약 +55℃에서 +65℃로의 용융 온도의 증가를 초래하였다. 화합물 15e 또는 워트마닌의 첨가 유무에 따른 IMAC-정제된 PIK3C3 구조체의 용융 온도에 대한 이전 데이터와의 비교에 따르면, 2세트의 결과 사이에는 양호한 상호관계가 존재하는 것으로 나타났다. 이러한 실험에 따르면, 2종의 PIK3C3 억제제인 워트마닌 및 화합물 15e 중 하나의 첨가 및 결합 이후에 상기 세포 환경에서 PIK3C3 구조체의 용융 온도에서의 증가를 검출하는 것이 가능한 것으로 나타난다.
실시예 3: 포유동물 세포 시스템에서의 4개의 시험용 단백질의 용융 온도의 결정
4개의 단백질의 용융 온도를 결정하기 위해, 배양된 포유동물 세포로부터 용해물을 제조하고, 증가하는 온도의 패널에 노출시켰다. 상기 온도 단계 이후, 침전된 단백질을 제거하여, 가용성 단백질(즉, 단백질의 특정 용융 온도까지)만 검출되도록 하였다.
재료 및 방법
배양된 인간 선암 세포(A549)로부터 용해물을 제조하였다. 세포를 저장성 완충액 중의 얼음 상에서 분쇄하여 균질화하였다. 현탁액을 냉동 및 해동 과정에 다수 회 적용하였으며, 용해가 완료된 이후에 모든 불용성 응집체 및 세포 잔사를 원심 분리에 의해 펠릿화 하였다. 광학적으로 투명한 사이토졸 분획을 함유하는 상층액을 8-스트립 PCR 튜브 내로 분취하였으며, 증가하는 온도의 패널에 적용하였다. 3분 동안 가열한 후, 상기 시료를 냉각시키고, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 펠릿화 하였다. 가용성 단백질을 함유하는 상층액을 분리용 겔 상에 적재하였다. 또한, 상기 가장 높은 온도에서부터 침전된 단백질을 함유하는 펠릿을 로딩 완충액에서 용해하고, 이러한 분획에서 단백질의 존재를 나타내기 위해 상기 겔의 마지막 레인에 적재하였다. 상기 겔은 웨스턴 블랏 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에서 블랏팅하였다. 상기 멤브레인을 세척하고, 차단용 시약으로 차단하고, 디하이드로폴산 환원효소(DHFR), 티미딜산 합성효소(TS), 사이클린 의존성 키나아제-2(CDK-2) 및 단백질 키나아제 C(PKC)에 대한 일차 항체로 탐침하였다. 2차 항체가 결합하고, 상기 결합된 이차 항체로부터의 신호는 화학 형광에 의해 검출되며, CCD 카메라에 의해 기록되었다. 강도를 측정하고, 작도하였다.
결과
가용성 단백질의 존재를 나타내는 검은 밴드는 특정 온도까지 검출되어, 점점 희미해졌으며, 더욱 높은 온도에서는 결국 사라졌다(도 3). 이러한 실험에 따르면, 이들 단백질은 상기 세포 환경에서 독특한 용융 온도 및 거동을 가지며, 이들 융점은 단백질의 침전을 모니터링 함으로써 용이하게 검출될 수 있는 것으로 나타난다(도 4).
실시예 4: 포유동물 세포에서 리간드의 결합 이후 용융 온도의 증가의 검출
억제제의 첨가 및 결합 이후에 용융 온도에서의 가능한 증가 또는 감소를 조사하기 위해, 디하이드로폴산 환원효소(DHFR) 및 티미딜산 합성효소(TS)와 같은 단백질을 배양된 포유동물 세포에서 연구하였다.
배양된 선암 세포로부터의 용해물은 2개의 억제제, 즉 랄티트렉세드 및 메토트렉사트 중 하나로 처리하였으며, 여기서 메토트렉사트의 가능한 안정화 또는 불안정화 효과를 DHFR에 대해 분석하였으며, 랄티트렉세드는 TS에 대해 분석하였다. 억제제의 유무에 따른 처리 이후, 상기 시료는 가열 단계에 적용한 후, 침전된 단백질을 제거하였다. 처리된 시료의 용융 온도는 처리되지 않은 시료의 용융 온도와 비교하였다.
재료 및 방법
배양된 인간 선암 세포(A549)로부터 용해물을 제조하였다. 세포를 저장성 완충액 중의 얼음 상에서 분쇄하여 균질화하였다. 현탁액을 냉동 및 해동 과정에 다수 회 적용하였으며, 용해가 완료된 이후에 모든 불용성 응집체 및 세포 잔사를 원심 분리에 의해 펠릿화 하였다. 광학적으로 투명한 사이토졸 분획을 함유하는 상층액을 4개의 분취액으로 나누고, 2개의 분취액에는 하나의 상응하는 음성 대조군이 구비된 이들 각각의 리간드가 보충되었다. 첨가된 리간드의 농도는 약제/표적물 상호 작용을 위한 상술한 IC50 값의 10배 높았다. 각각의 리간드는 DMSO에서 용해하였으며, 최종 농도는 1%로 설정하였다.
배양 이후, 각각의 분취액을 8-튜브 PCR 스트립 내로 분할하고, DHFR에 대해 +36℃ 내지 60℃ 범위, 및 TS에 대해 +51℃ 내지 +69℃ 범위의 일련의 온도에 적용하였다(실시예 3으로부터의 용융 곡선에 의해 가이딩됨). 3분 동안 가열한 이후, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 펠릿화 하였다. 상기 얻어진 상층액을 분리용 겔에 적재하고, 웨스턴 블랏 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 차단한 후, 일차 및 이차 항체로 이를 탐침하였다. 결합된 이차 항체로부터의 신호는 화학 형광을 이용하여 검출하고, CCD 카메라를 이용하여 기록하였다. 강또는 리간드 처리 이후에 용융 온도에서의 변화를 시각화하기 위해 작도되었다.
결과
메토트렉사트 또는 랄티트렉세드의 첨가는 용융 온도의 증가를 초래하였다(도 5 및 도 6). 이러한 실험에 따르면, 억제제인 메토트렉사트 및 랄티트렉세드 각각의 첨가 및 결합 이후에 세포 환경에서 DHFR 또는 TS의 용융 온도에서의 증가를 검출하는 것이 가능한 것으로 나타난다.
실시예 5: 리간드의 결합 시 용융 온도에서의 변화를 결정하기 위해 상이한 세포 시스템 및 유기체에서 연구된 세포성 열적 변화
상이한 시스템에서 리간드 결합 효과를 연구하기 위해, 단백질 메티오닌-아미노펩티다아제-2에 리간드 TNP-470인 혈관 신생 억제제의 첨가 시에 가능한 안정화 및 불안정화를 결정하였다. 연구들은 2개의 상이한 시스템으로부터의 세포, 즉 (a) TNP-470과 함께 배양한 손상되지 않은 소의 간 생검, 및 (b) TNP-470과 함께 배양한 인간 배양 세포 상에서 이루어졌다. 모든 시료는 TNP-470에 노출되지 않은 참고용 시료와 비교하였다. 상기 억제제 유무에 따른 처리 이후, 상기 시료를 준비하고, 일련의 증가하는 온도에 적용하였다. 침전된 단백질 분획은 원심분리에 의해 펠릿화 하고, 각 온도 단계로부터의 상층액은 겔 상에서 웨스턴 블랏에 의해 분석하였다. TNP-470으로 처리된 단백질의 용융 온도는 처리되지 않은 시료의 용융 온도와 비교하였다.
재료 및 방법
배양된 인간 세포(K562) 및 소의 간 시료로부터 용해물을 준비한 후, 저장성 완충액 중의 얼음 상에서 파쇄하고, 균질화하였다. 현탁액을 냉동 및 해동 과정에 다수 회 적용하였으며, 용해가 완료된 이후에 모든 불용성 응집체 및 세포 잔사를 원심 분리에 의해 펠릿화 하였다. 각각의 세포 유형의 용해물은 2개의 분취액으로 나누었으며, 이때 하나의 분취액에는 TNP-470(순수한 DMSO에서 용해됨)이 보충되고, 나머지 하나의 분취액에는 등가량 부피의 순수한 DMSO가 보충되었다. 실온에서의 배양 이후, 상기 시료를 8-튜브 PCR 스트립 내에서 50㎕의 분획으로 나누고, 후속적으로 베리티(Veriti) 열순환 반응기에 넣었다.
다음으로, +56℃ 내지 +88℃ 범위의 일련의 온도를 2℃ 또는 4℃의 증분 및 3분 동안의 유지 조건으로 상이한 시료에 적용한 후, 각 단계에서 3분 동안 유지하였다. 가열 이후, 상기 시료를 냉각시키고, 침전된 단백질은 원심분리에 의해 펠릿화 하였다. 20㎕의 각각의 상층액을 제거하고, 여기에 겔 로딩 완충액을 보충하였으며, 가열에 의해 완전히 변성시켰다. 상기 시료를 분리용 겔에 적재하였으며, 이는 완전한 운전 시간 이후에 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 블랏팅되었다. 상기 멤브레인을 세척하고, 차단용 시약으로 차단하였으며, 일차 및 이차 항체로 탐침하였다. 결합된 이차 항체로부터의 신호는 화학 형광에 의해 검출되었으며, CCD 카메라를 이용하여 기록하였다. 강도는 리간드 처리 이후에 용융 온도에서의 변화를 시각화하기 위해 작도되었다.
결과
웨스턴 블랏 멤브레인 상의 검은 밴드는 상층액 중에 여전히 가용성 단백질이 존재한다는 것을 보여준다. 상기 가용성 단백질은 특정 온도까지 검출되었지만, 그 이상의 온도에서는 더 이상 관측되지 않았다. TNP-470의 첨가는 인간의 세포 용해물에 대해 62℃에서 80℃로의 용융 온도의 변화(18℃의 변화)를 초래하였으며, 소의 간 용해물에 대해 66℃에서 80℃로의 용융 온도의 변화(14℃의 변화)를 초래하였다(도 7).
실시예 6: 열적 안정화의 농도 의존성으로부터의 용량 반응 곡선
겉보기 결합 상수를 추정하기 위해 용량 반응 곡선을 구성할 목적으로, 소의 간 용해물을 리간드 TNP-470, 구체적으로는 표적화용 메티오닌 아미노펩티다아제-2의 일련의 희석에 적용하였다. 본 실시예에 앞서, 처리된 시료 및 처리되지 않은 시료에 상응하는 곡선이 수득되었으며(실시예 5 참조), 여기서 용량은 포화 수준으로 설정되어 있었다. 이어 용융 온도에서의 차이는 처리된 시료가 여전히 존재하는 반면에 처리되지 않은 시료는 침전하는 온도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 실시예에 있어서, 상기 온도는 +76℃로 설정되었다. 일련의 희석은 일련의 10배 희석으로 구성되었다. 생성된 곡선은 상기 용해물에서 표적 단백질을 조합할 필요가 있는 리간드의 농도의 표시를 제공한다.
재료 및 방법
소의 간 시료로부터 용해물을 준비하였다. 저장성 완충액 중의 얼음 상에서 세포를 분쇄하고, 균질화하였다. 현탁액을 냉동 및 해동 과정에 다수 회 적용하였으며, 용해가 완료된 이후에 모든 불용성 응집체 및 세포 잔사를 원심 분리에 의해 펠릿화 하였다. 광학적으로 투명한 사이토졸 분획을 함유하는 상층액을 8-스트립 PCR 튜브 내로 분취하였으며, 이때 각 튜브는 리간드 TNP-470의 증가하는 양을 포함하여, 리간드 농도를 1pmole 내지 10nmole 범위로 하였으며, DMSO의 농도는 최종 부피의 1%로 하였다. 상기 시료를 배양하고, 후속적으로 76℃에서 3분 동안 가열하였다. 열처리 이후, 상기 시료를 냉각시키고, 침전된 분획은 원심분리에 의해 펠릿화 하였다. 20㎕의 각 상층액을 제거하고, 여기에 겔 로딩 완충액을 보충하였으며, 가열에 의해 완전히 변성시켰다. 상기 시료를 분리용 겔에 적재하고, 이는 완전한 운전 시간 이후에 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 블랏팅되었다. 상기 멤브레인을 세척하고, 차단용 시약으로 차단하였으며, 일차 및 이차 항체로 탐침하였다. 결합된 이차 항체로부터의 신호는 화학 형광에 의해 검출되었으며, CCD 카메라를 이용하여 기록하였다. 강도를 측정하여 작도하였다.
결과
웨스턴 블랏 멤브레인 상의 검은 밴드는 상층액 중에 단백질의 존재를 보여준다. 단백질이 매우 소량이거나 존재하지 않는 경우, 매우 낮은 신호가 관측되거나 신호가 전혀 관측되지 않을 것이다. 리간드의 농도가 증가함에 따라, 안정화된 단백질의 양도 또한 증가한다. 이는 웨스턴 블랏 멤브레인 상의 검은 밴드의 점진적으로 증가하는 신호로서 관측된다. 적분 강도를 작도하면, 용량 반응 곡선을 얻을 것이며(도 8), 그 결과 시료 중의 단백질의 절반이 결합된 리간드(즉 안정화된 리간드)에 조합되었을 겉보기 농도를 정확하게 나타내는 것이 가능하게 되었다. 이는 환자에 대한 투여 계획을 설정하거나 체내의 상이한 기관에서 겉보기 결합 상수에 대한 연구에 의해 약제에 대한 치료학적 영역을 찾는데 있어 유용한 응용을 가질 수 있다.
실시예 7: 바이오센서 응용 - 복합 유체에서 리간드 존재의 측정
동종의 리간드 결합 단백질(예를 들어, 약물표적)이 존재하는 리간드(예를 들어, 약제)의 존재는 표적 단백질이 결핍된 복합 시험용 시료에서도 나타날 수 있다. 이는 상기 단백질을 함유하는 분취액(예를 들어, 표적 세포 또는 정제된 단백질의 용해물)을 생물학적 유체 시험용 시료에 첨가함으로써 달성된다. 실시예 6의 라인에서, 용량 반응 곡선이 또한 관심 있는 리간드를 함유하는 생물학적 유체(예를 들어, 혈액 혈장 또는 혈청)에 대한 일련의 희석을 이용하여 구성될 수도 있다. 따라서 이렇게 생성된 곡선은 생물학적 유체 중의 리간드의 추정 농도를 제공하기 위해 스파이킹함으로써 생성된 용량 반응 곡선 상에 적합하도록 할 수 있다.
재료 및 방법
배양된 인간 선암 세포(A549)로부터 용해물을 제조하였다. 저장성 완충액 중의 얼음 상에서 세포를 분쇄하고, 균질화하였다. 현탁액을 냉동 및 해동 과정에 다수 회 적용하였으며, 용해가 완료된 이후에 모든 불용성 응집체 및 세포 잔사를 원심 분리에 의해 펠릿화 하였다. 광학적으로 투명한 사이토졸 분획을 함유하는 상층액을 8-스트립 PCR 튜브 내로 분취하였으며, 이때 각 튜브는 열처리된 A549 용해물 (76℃에서의 열처리에 의해 모든 표적 단백질(메티오닌 아미노펩티다아제-2)이 침전하였으며, 이는 어떠한 리간드도 소비되지 않았음을 확실케 함)에서 용해된 리간드 TNP-470의 증가하는 양을 포함하고 있었다. 실시예 6에서와 같이, 상기 농도는 1pmole 내지 100nmole의 유효 농도 범위였다.
상기 시료를 배양하고, 후속적으로 3분 동안 76℃까지 가열하였다. 열처리 이후, 상기 시료를 냉각하고, 침전된 분획은 원심분리에 의해 펠릿화 하였다. 20㎕의 각 상층액을 제거하고, 여기에 겔 로딩 완충액을 보충하였으며, 가열에 의해 완전히 변성시켰다. 상기 시료를 분리용 겔에 적재하고, 이는 완전한 운전 시간 이후에 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 블랏팅되었다. 상기 멤브레인을 세척하고, 차단용 시약으로 차단하였으며, 일차 및 이차 항체로 탐침하였다. 결합된 이차 항체로부터의 신호는 화학 형광에 의해 검출되었으며, CCD 카메라를 이용하여 기록하였다. 강도를 측정하여 작도하였다.
결과
열처리된 용해물은 표적 단백질이 결핍된 생물학적 유체를 모방하기 위해 생성되었다. 이어, 리간드를 이용한 열처리된 용해물의 스파이킹 및 이의 일련의 희석은 시료 중에 얼마나 많은 리간드가 존재하는지에 대한 추정을 하기 위해 시험관 내에서 생성된 용량 반응 곡선과 비교하고 이에 적합하도록 할 수 있는 반응 곡선(도 9)을 만들었다.
실시예 8: 특정 단백질 변이를 표적화하는 리간드
인간 개체군내에는 통상적으로 작은 수의 아미노산 치환을 갖는 상이한 변이체로서 단백질이 존재한다. 몇몇의 경우, 이들 치환은, 예를 들어 암과 같은 질병을 조장한다. 단백질 B-raf는 조절 및 기능에서의 교란으로 인해 이 같이 질병이 발생할 수 있는 경로와 관련이 있다. 다수의 상이한 아미노산 치환은 발암성 단백질을 야기하는 B-raf에 대해 개시되어 있다. 아미노산 치환은 또한 단백질이 약제와 덜 결합하도록 할 수 있으며, 이는 암 치료 동안에 내성 발생의 이면에서 하나의 극적인 원인이 된다.
리간드 SB590885는 소라페닙(Sorafenib)과 같은 약물로 처리하기 어려울 수 있는 B-raf의 600E 변이체와 결합하는 것으로 공지되어 있다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 치환된 단백질에 대한 야생형 단백질에서 안정성 차이가 있으며, 리간드의 결합이 단백질 변이체에 상이한 정도로 영향을 미친다는 것을 보여준다.
재료 및 방법
B-raf에서 V600E 치환을 함유하는 배양된 인간 A375 세포, 및 이의 야생형 버전을 함유하는 K562로부터 용해물을 제조하였다. 저장성 완충액 중의 얼음 상에서 세포를 분쇄하고, 균질화하였다. 현탁액을 냉동 및 해동 과정에 다수 회 적용하였으며, 용해가 완료된 이후에 모든 불용성 응집체 및 세포 잔사를 원심 분리에 의해 펠릿화 하였다. 광학적으로 투명한 사이토졸 분획을 함유하는 상층액을 2개의 튜브 내로 분취하였으며, 이때 각 튜브는 DMSO에 용해된 리간드 SB590885 또는 대조를 위해 순수한 DMSO를 포함하고 있었다. 상기 시료를 배양하고, 후속적으로 50㎕의 분획으로 8-튜브 PCR 스트립에 분취하였다. +44℃ 내지 +62℃ 범위의 일련의 온도를 2℃의 증분 및 각 온도에서 3분의 유지 조건으로 상기 상이한 시료에 적용하였다. 가열 이후, 상기 시료를 냉각시키고, 침전된 단백질을 원심분리에 의해 펠릿화 하였다. 20㎕의 각 상층액을 제거하고, 여기에 겔 로딩 완충액을 보충하였으며, 가열에 의해 완전히 변성시켰다. 상기 시료를 분리용 겔에 적재하고, 이는 완전한 운전 시간 이후에 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 블랏팅되었다. 상기 멤브레인을 세척하고, 차단용 시약으로 차단하였으며, 일차 및 이차 항체로 탐침하였다. 결합된 이차 항체로부터의 신호는 화학 형광에 의해 검출되었으며, CCD 카메라를 이용하여 기록하였다. 강도를 정규화 한 후, 리간드 처리 이후에 용융 온도의 변화를 시각화하기 위해 작도하였다(도 10).
결과
도 10에서의 용융 곡선에 따르면, 치환된 V600E B-raf는 안정화 리간드가 존재하지 않는 경우에 야생형보다 덜 안정한 것으로 나타난다. 처리 시, V600E 치환 B-raf는 용융 온도에서의 증가가 약 6℃로 안정화되는 반면, 일단 안정화된 야생형 단백질은 용융 온도에서 3℃의 증가를 나타냈다. 안정화 이후, V600E B-raf 및 야생형 B-raf 둘 모두는 55℃의 용융 온도를 나타냈다.

Claims (18)

  1. 정제되지 않은 시료가 관심 있는 리간드에 결합한 표적 단백질을 함유하는지의 여부를 결정하는 방법에 있어서,
    (a) 상기 리간드에 결합한 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도보다 더 높은 온도로서, 결합하지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에서, 상기 정제되지 않은 시료를 노출시키는 단계;
    (b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 상기 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
    (c) 상기 표적 단백질의 존재에 대해 상기 단계 (b)의 가용성 단백질 분획 및 불용성 단백질 분획 중 하나, 또는 둘 모두를 분석하는 단계를 포함하되,
    상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여 검출되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에 따라 상기 가용성 단백질 분획을 분석하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 정제되지 않은 시료는 세포 콜로니, 세포의 액체 배양액, 또는 환자 또는 동물 시료인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 단백질, DNA 또는 RNA 분자, 세포성 대사산물, 약제, 또는 다른 화학물질인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도는 상기 표적 단백질의 초기 용융 온도와 동일하거나 이를 초과하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도는 40℃ 초과인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제되지 않은 시료는 표적물의 초기 용융 온도와 동일하거나 이를 초과하는 온도를 포함하는 일련의 다른 온도에 노출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 항체 및/또는 비-단백질 융합 태그를 이용하여 식별되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가공 단계 (b)는 원심분리, 여과 또는 친화도 분리 단계인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 여과 단계에서 얻어진 여과액 중의 표적 단백질은 상기 단계 (c) 이전에 고체 지지체 상에서 포획되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질은 상기 시료 중에 관심 있는 리간드의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 상기 시료에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 있는 리간드는 상기 시료 중에 표적 단백질의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 상기 시료에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드를 식별하기 위한 방법에 있어서,
    (a) 상기 표적 단백질 및 시험 분자를 포함하는 정제되지 않은 시료를 상기 표적 단백질의 초기 용융 온도와 동일하거나 이를 초과하는 온도를 포함하는 일련의 상이한 온도에 노출시키는 단계;
    (b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
    (c) 상기 표적 단백질의 존재에 대해 상기 단계 (b)의 가용성 및 불용성 단백질 분획 중 하나 또는 둘 모두를 분석하는 단계를 포함하되,
    상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여 검출되지 않는 것을 특징으로 하는, 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드의 식별 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 시험 분자의 첨가가 없는, 상기 표적 단백질을 포함하는 정제되지 않은 시료 또한 대조 반응으로 제 13 항의 방법에 적용되는 것을 특징으로 하는, 표적 단백질에 결합할 수 있는 리간드의 식별 방법.
  15. 정제되지 않은 시료가 관심 있는 리간드에 결합된 표적 단백질을 함유하는지의 여부를 결정하되, 상기 리간드가 융합 단백질이 아닌 방법에 있어서,
    (a) 결합하지 않은 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도보다 더 높은 온도로서, 상기 리간드가 결합한 표적 단백질의 침전을 야기하거나 증가시킬 수 있는 온도에서, 상기 정제되지 않은 시료를 노출시키는 단계;
    (b) 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위해 상기 단계 (a)의 생성물을 가공하는 단계; 및
    (c) 상기 표적 단백질의 존재에 대해 상기 단계 (b)의 가용성 및 불용성 단백질 분획 중 하나 또는 둘 모두를 분석하는 단계를 포함하되,
    상기 표적 단백질은 여기에 융합된 태그, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 효소 활성에 기초하여 검출되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 용도로 사용되는 기구에 있어서, 상기 기구는
    가열 수단;
    불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위한 수단; 및
    표적 단백질의 존재에 대해 단백질을 분석하기 위한 수단을 포함하는 기구.
  17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법에서의 기구의 용도에 있어서,
    상기 기구는 가열 수단; 불용성 단백질로부터 가용성 단백질을 분리하기 위한 수단; 및 표적 단백질의 존재에 대해 단백질을 분석하기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 기구의 용도.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 표적 단백질을 검출하기 위한 방법에서의 키트의 용도에 있어서, 상기 키트는 항체 및/또는 비-단백질 융합 태그를 포함하는 키트의 용도.
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