JP2022520616A - クロマチン会合タンパク質の定量的マッピング - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、それらの内容の全体が、参照により本明細書の一部をなす、2019年2月15日に出願された、米国仮出願第62/806,174号の利益を主張する。
本発明は、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ、テザリング酵素ベースのマッピングアッセイ、および他のクロマチンマッピングアッセイを使用する、クロマチン会合タンパク質の定量的マッピングのためのスパイクイン対照として操作された、DNAでバーコード処理された組換えヌクレオソームおよび組換えポリヌクレオソームに関する。本発明は、さらに、操作され、DNAでバーコード処理された組換えヌクレオソームを、ChIPアッセイ、テザリング酵素ベースのマッピングアッセイ、および他のクロマチンマッピングアッセイにおいて使用する方法に関する。
a.ヒストンであるH2A、H2B、H3、およびH4を各2コピーずつ含有し、任意選択的にリンカーヒストンであるH1を含有する、タンパク質オクタマー;
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソームポジショニング配列、
ii.クロマチン会合タンパク質(ChAP)捕捉エピトープを示すDNAバーコード
を含むDNA分子;ならびに
c.ヒストンのうちの1つもしくは複数のN末端および/もしくはC末端、またはDNA分子内の任意の位置へと融合されたChAP捕捉エピトープ
を含むヌクレオソームに関する。
a.ヒストンであるH2A、H2B、H3、およびH4を各2コピーずつ含有し、任意選択的にリンカーヒストンであるH1を含有する、タンパク質オクタマー;
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソームポジショニング配列、
ii.ChAP捕捉エピトープを示すDNAバーコード
を含むDNA分子;ならびに
c.ヒストンのうちの1つもしくは複数のN末端および/もしくはC末端、またはDNA分子内の任意の位置へと融合されたChAP捕捉エピトープ
を含むポリヌクレオソームに関する。
a)核、細胞小器官、細胞、または組織を、固体支持体へと結合させるステップ;
b)核、細胞小器官、細胞、または組織を透過処理するステップ;
c)本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、またはプールを、固体支持体へと結合させるステップ;
d)b)の、透過処理された核、細胞小器官、細胞、または組織、およびc)の、結合させられたヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、またはプールを、ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤と接触させるステップ;
e)ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼへと連結された抗体結合剤、アプタマー結合剤、ナノボディー結合剤、または認識剤結合剤を添加するステップ;
f)ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼに、核内、細胞小器官内、細胞内、または組織内のDNA、およびヌクレオソーム内、パネル内、ポリヌクレオソーム内、アレイ内、またはプール内の、ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列を切断させるか、またはこれらに標識付けさせるステップ;
g)切断または標識付けされたDNAを分離するステップ;ならびに
h)切断または標識付けされたDNAを同定するステップ
を含み、これにより、クロマチンをマッピングする方法に関する。
a.生物学的試料を単離するステップ;
b.生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、ここで、ライブラリーが1つまたは複数のChAPをさらに含み;
c.参照標準物質を創出するために、ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、プール、またはビーズを用意するステップ;
d.ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、天然ヌクレオソームライブラリーおよび参照標準物質に添加するステップ;
e.天然ヌクレオソームライブラリー中および参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;ならびに
f.天然ヌクレオソームライブラリー中のその相対存在度を、参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量するステップ
を含む方法に関する。
a.生物学的試料を単離するステップ;
b.生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、ここで、ライブラリーが2つまたはこれを超えるChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.参照標準物質を創出するために、ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、プール、またはビーズを用意するステップ;
d.ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する2つまたはこれを超える抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、天然ヌクレオソームライブラリーおよび参照標準物質へと添加するステップ;
e.天然ヌクレオソームライブラリー中および参照標準物質中の各ChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;ならびに
f.天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、参照標準物質と比較することにより、各ChAPの存在度を定量するステップ
を含む方法に関する。
a.対象から生物学的試料を単離するステップ;
b.生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、ここで、ライブラリーが、1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.参照標準物質を創出するために、ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、プール、またはビーズを用意するステップ;
d.ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、天然ヌクレオソームライブラリーおよび参照標準物質へと添加するステップ;
e.天然ヌクレオソームライブラリー中および参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;ならびに
f.天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量するステップ
を含む方法に関する。
a.対象から生物学的試料を単離するステップ;
b.生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップと、ここで、ライブラリーが、1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.参照標準物質を創出するために、ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、プール、またはビーズを用意するステップ;
d.ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、天然ヌクレオソームライブラリーおよび参照標準物質へと添加するステップ;
e.天然ヌクレオソームライブラリー中および参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;
f.天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量するステップ;ならびに
g.1つまたは複数のChAPの絶対存在度に基づき、対象についての予後診断を決定するステップ
を含む方法に関する。
a.対象から生物学的試料を単離するステップ;
b.生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップと、ここで、ライブラリーが、1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.参照標準物質を創出するために、ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、プール、またはビーズを用意するステップ;
d.ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、天然ヌクレオソームライブラリーおよび参照標準物質へと添加するステップ;
e.天然ヌクレオソームライブラリー中および参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;
f.天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量するステップ;ならびに
g.1つまたは複数のChAPの絶対存在度を、疾患または障害と相関させるステップ
を含み、これにより、疾患または障害についてのバイオマーカーを同定する方法に関する。
a.対象から生物学的試料を単離すること;
b.生物学的試料から、天然ヌクレオソームのライブラリーを調製すること、ここで、ライブラリーが、標的エピトープ(複数可)内の1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.参照標準物質を創出すつために、ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、プール、またはビーズを用意すること;
d.ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、天然ヌクレオソームライブラリーおよび参照標準物質へと添加すること;
e.天然ヌクレオソームライブラリー中および参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施すること;
f.天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量すること
を含み、薬剤の存在下および非存在下における、ChAP状態の変化が、クロマチン上のChAP状態を修飾する薬剤を同定する方法に関する。
<組換え法を使用する、ChAP含有ヌクレオソームの作出>
ChAPエピトープを含有するヌクレオソームは、当技術分野で公知の任意の手法を使用して作出され得る。下記で、本発明者らは、2つの方法について記載する。第1に、組換え法を使用して、ChAP-ヒストン融合タンパク質を、直接発現させることができる。3×FLAG、3×TY1、および3×HAを含む、一般的なSPTを含有する、一連のヌクレオソーム(「verSaNuc」と称する)を作出した。これらのヌクレオソームのために、ヒストンであるH3へと融合させた、GGGGS(配列番号8)リンカーを後続させたSPTを発現させた。次いで、250bpのDNA(ヌクレオソームコア粒子の各側における、約50bpずつのリンカーDNA)を使用して、この修飾ヒストンを組換えヌクレオソームへと組み込んだ。同様の手法は、CTCFなど、他のChAP断片にも使用され得る。第2に、ChAP含有ヒストンは、合成ペプチドまたは組換え発現タンパク質を連結することにより作出することもでき、化学的ライゲーションまたは酵素的ライゲーションにより作出することもできる。
<酵素の連結を使用する、ChAP含有ヌクレオソームの作出>
ヌクレオソームの作製を加速化させるために、トランスクリプターゼである黄色ブドウ球菌(S.aureus)ソルターゼA(SrtA)を使用して、修飾ペプチドを、完全にアセンブルされたテールなしのヌクレオソームへと、直接ライゲーションすることができる(図1A)。この手法は、a)修飾ヌクレオソームの、小規模バッチ(標準物質であるdNucアセンブリーのためのmgスケールと対比したμgスケール)における、迅速な開発;およびb)修飾ヌクレオソーム合成物の複合体化という、2つの能力をもたらす。この手法は、各アッセイに少量を要求するが、市場の必要を満たすように大きな多様性を要求するChAP含有ヌクレオソームの開発に、極めてよく適する。
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Claims (95)
- a.ヒストンであるH2A、H2B、H3、およびH4を各2コピーずつ含有し、任意選択的にリンカーヒストンであるH1を含有する、タンパク質オクタマー;
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソームポジショニング配列、
ii.クロマチン会合タンパク質(ChAP)捕捉エピトープを示すDNAバーコード
を含むDNA分子;ならびに
c.前記ヒストンのうちの1つもしくは複数のN末端および/もしくはC末端、または前記DNA分子内の任意の位置へと融合された前記ChAP捕捉エピトープ
を含むヌクレオソーム。 - 前記ChAP捕捉エピトープが、1つまたは複数の短いペプチドタグである、請求項1に記載のヌクレオソーム。
- 前記1つまたは複数の短いペプチドタグが、FLAG(DYKDDDDK(配列番号1))、HA(YPYDVPDYA(配列番号2))、6His(HHHHHH(配列番号3))、Myc(EQKLISEEDL(配列番号4))、Strep-I(AWRHPQFGG(配列番号5))、Strep-II(NWSHPQFEK(配列番号6))、プロテインC(EDQVDPRLIDGK(配列番号7))、V5、TY1、もしくはGST、または前記タグの、2つ、3つ、4つ、またはこれを超えるリピートである、請求項2に記載のヌクレオソーム。
- 前記ChAP捕捉エピトープが、抗体結合性配列である、請求項1または2に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレオソーム内の各ヒストンが、独立に、完全合成ヒストン、半合成ヒストン、または組換えヒストンである、請求項1~4のいずれか1項に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNA分子が、前記DNA分子へと連結された結合メンバーをさらに含み、前記結合メンバーが、結合パートナーに特異的に結合する、請求項1~5のいずれか1項に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNA分子が、前記ヌクレオソームポジショニング配列と前記結合メンバーとの間に、約10~約80ヌクレオチドの長さのリンカーを含む、請求項6に記載のヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約40ヌクレオチドの長さである、請求項7に記載のヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約30ヌクレオチドの長さである、請求項8に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNA分子が、ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列を含む、請求項6~9のいずれか1項に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列が、エンドヌクレアーゼにより認識される、請求項10に記載のヌクレオソーム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ミクロコッカスヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、ヤエナリヌクレアーゼ、膵DNアーゼI、酵母HOエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項11に記載のヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、A/Tリッチ領域である、請求項12に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列が、トランスポザーゼにより認識される、請求項10に記載のヌクレオソーム。
- 前記トランスポザーゼが、Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、Mariner、Pエレメント、Tn3、Tn1O、Tn903、または上記のうちのいずれかの修飾形である、請求項14に記載のヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、G/Cリッチ領域である、請求項14または15に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーおよびその結合パートナーが、アビジンまたはストレプトアビジンを伴うビオチン、ストレプトアビジンを伴うナノタグ、グルタチオントランスフェラーゼを伴うグルタチオン、抗体を伴う抗原/エピトープ、ニッケルを伴うポリヒスチジン、相補性ポリヌクレオチドを伴うポリヌクレオチド、その特異的標的分子を伴うアプタマー、またはSiタグおよびシリカである、請求項6~16のいずれか1項に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の5’末端へと連結されている、請求項6~17のいずれか1項に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の3’末端へと連結されている、請求項6~17のいずれか1項に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約6~約50塩基対の長さを有する、請求項1~19のいずれか1項に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約7~約30塩基対の長さを有する、請求項20に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約8~約20塩基対の長さを有する、請求項21に記載のヌクレオソーム。
- パネル内の前記ヌクレオソームが、ChAP捕捉エピトープを前記パネル内に1つまたは複数の濃度で含み、ヌクレオソームが、前記パネル内に存在する濃度を各ヌクレオソームの前記DNAバーコードが指し示す、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソームのパネル。
- 前記パネルが、異なるChAP捕捉エピトープを含む、少なくとも2つのヌクレオソームを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソームのパネル。
- 異なるChAP捕捉エピトープを含む各ヌクレオソームが、前記パネル内に同じ濃度で存在する、請求項24に記載のパネル。
- 異なるChAP捕捉エピトープを含む各ヌクレオソームが、前記パネル内に複数の濃度で存在し、各ヌクレオソームの前記DNAバーコードが、ヌクレオソームが前記パネル内に存在する濃度を指し示す、請求項24に記載のパネル。
- ChAP捕捉エピトープを含まない合成ヌクレオソームをさらに含む、請求項23~26のいずれか1項に記載のパネル。
- a.ヒストンであるH2A、H2B、H3、およびH4を各2コピーずつ含有し、任意選択的にリンカーヒストンであるH1を含有する、タンパク質オクタマー;
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソームポジショニング配列、
ii.ChAP捕捉エピトープを示すDNAバーコード
を含むDNA分子;ならびに
c.前記ヒストンのうちの1つもしくは複数のN末端および/もしくはC末端、または前記DNA分子内の任意の位置へと融合された前記ChAP捕捉エピトープ
を含むポリヌクレオソーム。 - 2~10個のヌクレオソームを含む、請求項28に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ChAP捕捉エピトープが、1つまたは複数の短いペプチドタグである、請求項28または29に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記短いペプチドタグが、FLAG(DYKDDDDK(配列番号1))、HA(YPYDVPDYA(配列番号2))、6His(HHHHHH(配列番号3))、Myc(EQKLISEEDL(配列番号4))、Strep-I(AWRHPQFGG(配列番号5))、Strep-II(NWSHPQFEK(配列番号6))、プロテインC(EDQVDPRLIDGK(配列番号7))、V5、TY1、もしくはGST、または前記タグの、2つ、3つ、4つ、またはこれを超えるリピートである、請求項30に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ChAP捕捉エピトープが、抗体結合性配列である、請求項28または29に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ポリヌクレオソーム内の各ヒストンが、独立に、完全合成ヒストン、半合成ヒストン、または組換えヒストンである、請求項28~32のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNA分子が、前記DNA分子へと連結された結合メンバーをさらに含み、前記結合メンバーが、結合パートナーに特異的に結合する、請求項28~33のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNA分子が、前記ヌクレオソームポジショニング配列と、前記結合メンバーとの間に、約10~約80ヌクレオチドの長さのリンカーを含む、請求項34に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約40ヌクレオチドの長さである、請求項35に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約30ヌクレオチドの長さである、請求項36に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNA分子が、ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列を含む、請求項34~37のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列が、エンドヌクレアーゼにより認識される、請求項38に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記エンドヌクレアーゼが、ミクロコッカスヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、ヤエナリヌクレアーゼ、膵DNアーゼI、酵母HOエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項39に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、A/Tリッチ領域である、請求項39または40に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列が、トランスポザーゼにより認識される、請求項38に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記トランスポザーゼが、Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、Mariner、Pエレメント、Tn3、Tn1O、Tn903、または上記のうちのいずれかの修飾形である、請求項42に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、G/Cリッチ領域である、請求項42または43に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーおよびその結合パートナーが、アビジンまたはストレプトアビジンを伴うビオチン、ストレプトアビジンを伴うナノタグ、グルタチオントランスフェラーゼを伴うグルタチオン、抗体を伴う抗原/エピトープ、ニッケルを伴うポリヒスチジン、相補性ポリヌクレオチドを伴うポリヌクレオチド、その特異的標的分子を伴うアプタマー、またはSiタグおよびシリカなどの対合物である、請求項34から44のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の5’末端へと連結されている、請求項34から45のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の3’末端へと連結されている、請求項34から45のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約6~約50塩基対の長さを有する、請求項28~47のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約7~約30塩基対の長さを有する、請求項48に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約8~約20塩基対の長さを有する、請求項49に記載のポリヌクレオソーム。
- 請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソームを含むアレイ。
- 各アレイが、固有のChAP捕捉エピトープを含む、請求項51に記載のアレイのプール。
- 請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、または請求項52に記載のプールの前記結合メンバーに対する結合パートナーを含むビーズであって、前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、またはプールへと結合させられたビーズ。
- 磁気ビーズである、請求項53に記載のビーズ。
- 請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズを含むキット。
- 前記ChAP捕捉エピトープ、またはヒストン翻訳後修飾(PTM)、ヒストン突然変異、ヒストン変異体、もしくはDNA転写後修飾に特異的に結合する抗体、アプタマー、ナノボディー、または他の認識剤をさらに含む、請求項55に記載のキット。
- 抗体結合性タンパク質、または前記認識剤に結合する実体へと連結されたヌクレアーゼまたはトランスポザーゼをさらに含む、請求項56に記載のキット。
- 前記抗体結合性タンパク質が、プロテインA、プロテインG、プロテインAとプロテインG、プロテインLまたはプロテインYとの融合体である、請求項57に記載のキット。
- 磁気ビーズなどの前記結合メンバーに対する結合パートナーを含むビーズをさらに含む、請求項55~58のいずれか1項に記載のキット。
- テザリング酵素を使用するクロマチンマッピングのための方法であって、改善点が、アッセイにおける、請求項6から22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23から27のいずれか1項に記載のパネル、請求項34から50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズの、スパイクイン対照としての使用である方法。
- テザリング酵素を使用して、クロマチンをマッピングするための方法であって、
a)核、細胞小器官、細胞、または組織を、固体支持体へと結合させるステップ;
b)前記核、細胞小器官、細胞、または組織を透過処理するステップ;
c)請求項6~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項34~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、または請求項52に記載のプールを、固体支持体へと結合させるステップ;
d)ステップ(b)の前記透過処理された核、細胞小器官、細胞、または組織、およびステップ(c)の前記結合させられたヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、またはプールを、前記ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤に接触させるステップ;
e)ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼへと連結された抗体結合剤、アプタマー結合剤、ナノボディー結合剤、または認識剤結合剤を添加するステップ;
f)前記ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼに、前記核内、細胞小器官内、細胞内、または組織内のDNA、および前記ヌクレオソーム内、パネル内、ポリヌクレオソーム内、アレイ内、またはプール内の前記ヌクレアーゼ認識配列またはトランスポザーゼ認識配列を切断させるか、またはこれらに標識付けさせるステップ;
g)切断または標識付けされたDNAを分離するステップ;ならびに
h)前記切断または標識付けされたDNAを同定するステップ
を含み、これにより、クロマチンをマッピングする方法。 - ステップ(e)の前記ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼが、不活性であり、ステップ(f)が、前記ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼを活性化させることを含む、請求項61に記載の方法。
- 前記切断されたDNAを同定するステップが、前記切断されたDNAを増幅および/またはシーケンシングにかけることを含む、請求項61または62に記載の方法。
- 前記シーケンシングが、qPCR、次世代シーケンシング、またはナノストリングを含む、請求項63に記載の方法。
- 前記切断または標識付けされたDNA内の前記DNAバーコードの配列に基づき、前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、またはプールのアイデンティティーを決定するステップをさらに含む、請求項61~64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記固体支持体が、ビーズまたはウェルである、請求項61~65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、またはプールにより検出された結果に基づき、前記方法を最適化するステップをさらに含む、請求項61~66のいずれか1項に記載の方法。
- クロマチン上のChAPの存在を検出および定量するための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 疾患または障害を有する対象における、クロマチン上のChAPを決定および定量するための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 対象における、経過時間にわたるクロマチン上のChAPの変化をモニタリングするための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 薬物のオンターゲット活性を測定するための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 疾患または障害を有する対象における、治療の有効性をモニタリングするための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 前記対象におけるクロマチン上のChAP状態に基づき、疾患または障害を有する対象に適する処置を選択するための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 前記対象におけるクロマチン上のChAP状態に基づき、疾患または障害を有する対象についての予後診断を決定するための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 対象におけるクロマチン上のChAP状態に基づき、疾患または障害についてのバイオマーカーを同定するための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 対象におけるクロマチン上のChAP状態を修飾する薬剤についてスクリーニングするための方法であって、請求項61~67のいずれか1項に記載の方法を含む方法。
- 前記核、細胞小器官、細胞、または組織が、疾患組織に由来する、請求項61~76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核、細胞小器官、細胞、または組織が、末梢血単核細胞などの末梢組織に由来する、請求項61~76のいずれか1項に記載の方法。
- クロマチンをChAPについてアッセイする方法であって、改善点が、アッセイにおける、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズの、スパイクイン対照としての使用である方法。
- クロマチン免疫沈降(ChIP)を使用して、生物学的試料中のクロマチン会合タンパク質(ChAP)の存在度を定量するための方法であって、
a.生物学的試料を単離するステップ;
b.前記生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、ここで、前記ライブラリーが、1つまたは複数のChAPを加えて含み;
c.前記ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズを用意して、参照標準物質を創出するステップ;
d.前記ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、前記天然ヌクレオソームライブラリーおよび参照標準物質に添加するステップ;
e.前記天然ヌクレオソームライブラリー中および参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;ならびに
f.前記天然ヌクレオソームライブラリー中のその相対存在度を、前記参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量するステップ
を含む方法。 - 生物学的試料中の、2つまたはこれを超えるChAPの存在度を定量するための方法であって、
a.生物学的試料を単離するステップ;
b.前記生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、ここで、前記ライブラリーが、2つまたはこれを超えるコアChAPエピトープを含むヌクレオソームを含み;
c.前記ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズを用意して、参照標準物質を創出するステップ;
d.前記ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する2つまたはこれを超える抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、前記天然ヌクレオソームライブラリーおよび前記参照標準物質へと添加するステップ;
e.前記天然ヌクレオソームライブラリー中および前記参照標準物質中の各ChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;ならびに
f.前記天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、前記参照標準物質と比較することにより、各ChAPの存在度を定量するステップ
を含む方法。 - 疾患または障害を有する対象に由来する生物学的試料中の、1つまたは複数のChAPの存在度を定量するための方法であって、
a.前記対象から生物学的試料を単離するステップ;
b.前記生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、ここで、前記ライブラリーが、1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.前記ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズを用意して、参照標準物質を創出するステップ;
d.前記ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、前記天然ヌクレオソームライブラリーおよび前記参照標準物質へと添加するステップ;
e.前記天然ヌクレオソームライブラリー中および前記参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;ならびに
f.前記天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、前記参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量するステップ
を含む方法。 - 1つまたは複数のChAPの絶対定量に基づき、疾患または障害を有する対象についての予後診断を決定するための方法であって、
a.前記対象から生物学的試料を単離するステップ;
b.前記生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、ここで、前記ライブラリーが、1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.前記ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズを用意して、参照標準物質を創出するステップ;
d.前記ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、前記天然ヌクレオソームライブラリーおよび前記参照標準物質へと添加するステップ;
e.前記天然ヌクレオソームライブラリー中および前記参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;
f.前記天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、前記参照標準物質と比較することにより、標的エピトープ内のChAPの存在度を定量するステップ;ならびに
g.前記1つまたは複数のChAPの絶対存在度に基づき、前記対象についての前記予後診断を決定するステップ
を含む方法。 - 1つまたは複数のChAPの絶対定量に基づき、疾患または障害についてのバイオマーカーを同定するための方法であって、
a.前記対象から生物学的試料を単離するステップ;
b.前記生物学的試料から天然ヌクレオソームのライブラリーを調製するステップ、こここで、前記ライブラリーが、1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含み;
c.前記ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズを用意して、参照標準物質を創出するステップ;
d.前記ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、前記天然ヌクレオソームライブラリーおよび前記参照標準物質へと添加するステップ;
e.前記天然ヌクレオソームライブラリー中および前記参照標準物質中のChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施するステップ;
f.前記天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、前記参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量するステップ;ならびに
g.前記1つまたは複数のChAPの絶対存在度を、前記疾患または障害と相関させるステップ
を含み、これにより、前記疾患または障害についてのバイオマーカーを同定する方法。 - 対象の生物学的試料に由来するクロマチン上のChAP状態を修飾する薬剤についてスクリーニングする方法であって、前記薬剤の存在下および非存在下における、1つまたは複数のChAPの絶対定量を決定するステップを含み、前記1つまたは複数のChAPの前記絶対定量を決定するステップが、
a.前記対象から生物学的試料を単離すること;
b.前記生物学的試料から、天然ヌクレオソームのライブラリーを調製することであって、前記ライブラリーが、1つまたは複数の標的エピトープ内に1つまたは複数のChAPを含むヌクレオソームを含むこと;
c.前記ChAP内に存在するChAP捕捉エピトープを含む、請求項1~22のいずれか1項に記載のヌクレオソーム、請求項23~27のいずれか1項に記載のパネル、請求項28~50のいずれか1項に記載のポリヌクレオソーム、請求項51に記載のアレイ、請求項52に記載のプール、または請求項53または54に記載のビーズを用意して、参照標準物質を創出すること;
d.前記ChAP捕捉エピトープに特異的に結合する1つまたは複数の抗体、アプタマー、ナノボディー、または認識剤を、前記天然ヌクレオソームライブラリーおよび前記参照標準物質へと添加すること;
e.前記天然ヌクレオソームライブラリー中および前記参照標準物質中の、ChAPの量を測定するために、アフィニティー試薬ベースのアッセイを実施すること;
f.前記天然ヌクレオソームライブラリー中の相対存在度を、前記参照標準物質と比較することにより、ChAPの存在度を定量すること
を含み、前記薬剤の存在下および非存在下における、前記ChAP状態の変化が、クロマチン上のChAP状態を修飾する薬剤を同定する方法。 - 前記生物学的試料が、細胞を含み、前記クロマチンが、前記細胞から単離される、請求項80~85のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、1つまたは複数のヒストン翻訳後修飾、DNA修飾、および/またはChAPの変化と関連する疾患または障害に由来する細胞である、請求項86に記載の方法。
- 前記細胞が、後成的修飾および/またはChAPと関連する疾患または障害に由来する細胞ではない、請求項86に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、生検である、請求項80~85のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、体液である、請求項80~85のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、末梢血単核細胞を含む、請求項80~85のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、血漿、尿、唾液、糞便、リンパ液、または脳脊髄液である、請求項90に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項80~92のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アフィニティー剤が、前記ChAPへと方向付けられた抗体または類似のエンリッチメント試薬である、請求項80~93のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つまたは複数のChAPの定量が、抗体または類似のエンリッチメント試薬ベースの検出法により決定される、請求項80~94のいずれか1項に記載の方法。
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