JP2022515221A - クロマチンマッピングアッセイ用のdnaバーコード化ヌクレオソーム - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2018年12月21日出願の米国仮出願第62/783,861号の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、クロマチンアクセシビリティアッセイ、例えば、繋留酵素を用いるクロマチンマッピングアッセイ、及び他のクロマチンアッセイ用のスパイクインコントロールとして用いるために操作されたDNAバーコード化組み換えヌクレオソーム及びポリヌクレオソームに関する。本発明はさらに、クロマチンアクセシビリティアッセイ、クロマチンマッピングアッセイ、及び他のクロマチンアッセイにおいて、操作されたDNAバーコード化組み換えヌクレオソームを使用する方法に関する。
クロマチン構造は、DNAと結合する制御機構(例えば、転写因子)の到達性を制御することによって遺伝子転写の調節を促進する(Stavreva及びHager 2015)。このプロセスは、DNA鋳型上のヌクレオソームの局所的位置決めによって部分的に制御される(Bai及びMorozov 2010)。いわゆる「オープン」領域は、ヌクレオソームを大幅に欠き、しばしば平衡を保つか又は積極的に転写される遺伝子と関連付けられる(Tsompana及びBuck 2014)。対照的に、ヌクレオソーム密度が高いゲノム領域は、この立体構造が制御機構によるアクセスを制限するので、しばしば転写不活性である。その結果、クロマチンアクセシビリティは、細胞の分化と同一性をしっかりと追跡する活性遺伝子状態の特徴である(Natarajan,Yardimciら 2012,Jung,Angaricaら 2017,Cao,Cusanovichら 2018,Miyamoto,Nguyenら 2018)。その結果、高度に到達可能なクロマチン領域のゲノム分布は、癌(Gomez,Hepperlaら 2016,Qu,Zabaら 2017,Corces,Granjaら 2018)及び老化(Ucar,Marquezら 2017,Janes,Dongら 2018,Wang,Zibettiら 2018)から精神神経疾患(Medrano-Fernandez及びBarco 2016,Fullard,Haubergら 2018,Rizzardi,Hickeyら 2019)まで多くのヒトの病理で変わる。
本発明は、クロマチンアクセシビリティアッセイ、クロマチンマッピングアッセイ(例えば、繋留酵素を用いる)、及び他のクロマチンアッセイ用のスパイクインコントロールとして用いるために操作されたDNAバーコード化組み換えヌクレオソーム及びポリヌクレオソームに関する。本発明はさらに、クロマチンアクセシビリティ及びマッピングアッセイにおいて操作されたDNAバーコード化組み換えヌクレオソームを用いる方法に関する。注目すべきは、ヌクレオソームスパイクインコントロールは、複数の細胞(すなわち、バルク分析)、単一細胞(すなわち、単細胞分析)、又は無細胞ヌクレオソームを含むアッセイに使用され得る。これらのスパイクインコントロールは、限定されないが、アッセイの最適化、技術的変動性の観察、定量的な試料正規化、及び抗体性能試験(抗体ベースのアッセイ、例えば、抗体の標的特異性及び捕捉効率について)を含むいくつかの主要な用途に使用され得る。
a.ヒストンH2A、H2B、H3、及びH4の各々を2コピー、及び任意選択でリンカーヒストンH1を、含むタンパク質オクタマー;並びに
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソーム位置決め配列、
ii.ヌクレオソームの特徴の素性及び/又は濃度を示すDNAバーコード;及び
iii.ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むDNA分子;
を含むヌクレオソームであって、
ヌクレオソームの特徴が翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上であるヌクレオソームに関する。
c.DNA分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバーを含む。
a.各々が、ヒストンH2A、H2B、H3、及びH4の各々を2コピー、並びに任意選択でリンカーヒストンH1を、含む、2以上のタンパク質オクタマー;並びに
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソーム位置決め配列、
ii.ヌクレオソームの特徴の素性及び/又は濃度を示すDNAバーコード;及び
iii.ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むDNA分子;
を含むポリヌクレオソームであって、
ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上であるポリヌクレオソームに関する。
c.DNA分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバーを含む。
a)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
b)本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを、a)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程;
c)b)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びb)のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、又は認識剤とを接触させる工程;
d)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体-結合剤又は認識剤-結合剤を添加する工程;
e)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが、細胞、核、オルガネラ、又は組織中のDNA、及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプール中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断並びに/又はタグ付けすることを可能にする工程;
f)任意に、切断及び/又はタグ付けされたDNAを分離する工程;並びに
g)切断及び/又はタグ付けされたDNAを識別し、
それによってクロマチンをマッピングする工程
を含み、
ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である方法に関する。
a)細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合させる工程;
b)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
c)固体支持体に本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを結合させる工程;
d)b)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織又はa)の無細胞ヌクレオソーム及びc)の結合したヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、若しくは認識剤とを接触させる工程;
e)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体-結合剤又は認識剤-結合剤を添加する工程;
f)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソーム中のDNA、及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプール中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断及び/又はタグ付けすることを可能にする工程;
g)任意に、切断及び/又はタグ付けされたDNAを分離する工程;並びに
h)切断及び/又はタグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンをマッピングする工程
を含み、
ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である方法に関する。
a)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
b)本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを、a)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程;
c)a)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びb)のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールとトランスポザーゼとを接触させる工程;
d)トランスポザーゼが、細胞、核、オルガネラ、又は組織中のDNA及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプール中のDNAにタグ付けすることを可能にする工程;並びに
e)タグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法に関する。
a)細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合する工程;
b)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
c)固体支持体に本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを結合する工程;
d)b)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織、又はa)の無細胞ヌクレオソーム及びc)の結合したヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプールと、トランスポザーゼとを接触させる工程;
e)トランスポザーゼが細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソーム中のDNA及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプール中のDNAにタグ付けすることを可能にする工程;並びに
f)タグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法に関する。
本発明を以下でより詳細に説明する。この説明は、発明が実施され得る全ての異なる方法、又は本発明に追加され得る全ての特徴の詳細なカタログを意図するものではない。例えば、一実施形態に関して例示された特徴は、他の実施形態に組み込まれても良く、かつ特定の実施形態に関して例示された特徴は、その実施形態から除かれてもよい。加えて、本明細書で提案される様々な実施形態への多数のバリエーション及び追加は、本発明から逸脱しない本開示を考慮して、当業者には明らかであろう。したがって、以下の明細書は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例示することを意図するものであり、その全ての順列、組み合わせ及びそのバリエーションを網羅的に指定することを意図するものではない。
a.ヒストンH2A、H2B、H3、及びH4の各々を2コピー、及び任意に、リンカーヒストンH1を含むタンパク質オクタマー;並びに
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソーム位置決め配列、
ii.ヌクレオソームの特徴の素性及び/又は濃度を示すDNAバーコード;及び
iii.ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むDNA分子;
を含むヌクレオソームであって、
ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上であるヌクレオソームに関する。
c.DNA分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバーを含む。
a.各々がヒストンH2A、H2B、H3、及びH4の各々を2コピー、及び任意に、リンカーヒストンH1を含む2以上のタンパク質オクタマー;並びに
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソーム位置決め配列、
ii.ヌクレオソームの特徴の素性及び/又は濃度を示すDNAバーコード;及び
iii.ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むDNA分子;
を含むポリヌクレオソームであって、
ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上であるポリヌクレオソームに関する。
c.DNA分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバーを含む。
a)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
b)本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを、a)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程;
c)b)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びb)のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、又は認識剤とを接触させる工程;
d)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体-結合剤又は認識剤-結合剤を添加する工程;
e)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが、細胞、核、オルガネラ、又は組織中のDNA、及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプール中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断及び/又はタグ付けすることを可能にする工程;
f)任意に、切断及び/又はタグ付けされたDNAを分離する工程;並びに
g)切断及び/又はタグ付けされたDNAを識別し、
それによってクロマチンをマッピングする工程
を含み、
ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である方法に関する。
a)細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合させる工程;
b)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
c)固体支持体に本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを結合させる工程;
d)b)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織又はa)の無細胞ヌクレオソーム及びc)の結合したヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、若しくは認識剤とを接触させる工程;
e)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体-結合剤又は認識剤-結合剤を添加する工程;
f)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソーム中のDNA、及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプール中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断及び/又はタグ付けすることを可能にする工程;
g)切断及び/又はタグ付けされたDNAを分離する工程;並びに
h)切断及び/又はタグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンをマッピングする工程
を含み、
ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である方法に関する。
a)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
b)本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを、a)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程;
c)a)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びb)のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールとトランスポザーゼとを接触させる工程;
d)トランスポザーゼが、細胞、核、オルガネラ、又は組織中のDNA及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプール中のDNAにタグ付けすることを可能にする工程;並びに
e)タグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法に関する。
a)細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合する工程;
b)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
c)固体支持体に本発明のヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールを結合する工程;
d)b)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織、又はa)の無細胞ヌクレオソーム及びc)の結合したヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプールと、トランスポザーゼとを接触させる工程;
e)トランスポザーゼが細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソーム中のDNA及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプール中のDNAにタグ付けすることを可能にする工程;並びに
f)タグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法に関する。
以下の実施例は、固体支持体を用いるゲノムマッピングアッセイにおいて、DNAバーコード化ヌクレオソームをスパイクインコントロールとして使用することができる方法を示す。注目すべきことに、ヌクレオソームスパイクインは、固体支持体を使用しない同様のワークフローでも使用できる。図1の上の例には、試料が固体支持体に結合される前後に、試料(細胞又は核)にヌクレオソームスパイクインを加えることができるATAC-seqワークフローが示されている。固定化後、試料を透過処理し、オープンクロマチンに結合するTn5(イルミナ社のシーケンサーと互換性のあるアダプターと共にロードした)とインキュベートする。タグ付断片化を、マグネシウムの添加によって開始し、続いてDNA精製、PCR、及び次世代配列決定を行う。試料クロマチンと同様に、Tn5はスパイクインヌクレオソーム上でリンカーDNAと結合し、タグ付断片化する。スパイクインヌクレオソームから回収したDNAは、アッセイ最適化、技術的変動性監視、及び試料間比較のための定量的な試料正規化に使用できる。図1の下の例には、CUT&RUNワークフローが示され、試料が固体支持体に結合される前後に、ヌクレオソームスパイクイン(オンターゲット及び/又はオフターゲットヌクレオソームを含む)を試料(細胞又は核)に添加することができる。固定化後、試料を透過処理し、抗体及びpAG-MNアーゼとインキュベートする。次いで、pAG-MNアーゼを、カルシウムの添加によって活性化し、続いてDNA精製、ライブラリー調製、及び次世代配列決定を行う。スパイクインヌクレオソームから回収したDNAは、抗体特異性試験、アッセイ最適化、技術的変動性監視、及び試料間比較のための定量的な試料正規化に使用できる。同様のワークフローを、pAG-MNアーゼをpAG-Tn5に置き換え、カルシウムの代わりにマグネシウムで活性化し、ライブラリーの調製をPCR工程に置き換えて、次世代配列決定用のタグ付断片化されたDNA断片を調製することを含む、いくつかの変更を加えたCUT&Tagアッセイにも使用できる。
様々なDNA構成は、CUT&RUN又はCUT&Tagなどのイムノテザリングアプローチと互換性があるDNAバーコード化組み換えヌクレオソームスパイクインを開発するために、ヌクレオソーム位置決め配列として用いることができる。ここでは、ヌクレオソームアセンブリ用の2つの異なるDNA鋳型が示されている。各鋳型は、Widom 601シーケンス(Lowary及びWidom 1998)に由来し、147bpの3’端の近くに24bpのバーコードを含むように変更されている。5’ビオチンと147bpヌクレオソーム位置決め配列に隣接する様々な長さのリンカーも加えた(図2A~2B)。次に、これらの鋳型を用いて、未修飾であるか、又はH3K4me1、H3K4me2、又はH3K4me3を保有する組み換え改変オクタマーを使用して、DNAバーコード化ヌクレオソームのパイロットパネルを作製した(各ヌクレオソームは、特有のDNAバーコードによって示される;図2C)。次に、これらのヌクレオソームが、CUT&RUNワークフローにおいてH3K4me3抗体(EpiCypher;#13-0028)の特異性を監視するために使用できるかどうかを試験した(図2C)。これらの実験では、i)ビオチン化dNucスパイクインを捕捉するために、Con Aビーズにストレプトアビジンコーティングビーズを補充したこと;及びii)ヌクレオソームスパイクインパネルを添加した後に、Con Aビーズと細胞を結合させたことを除いて、以前に記載された(Meers,Brysonら 2019)ようにCUT&RUN実験を行った。スパイクインが最適に実行されている場合、配列決定データ内のH3K4me3 dNucバーコード配列の選択的濃縮が期待される(未修飾、H3K4me1、又はH3K4me2 dNucのDNAバーコードに対して)。この実験では、約50万個のK562細胞を使用し、試料をイルミナMiniSeq(400万ペア-末端読み取り情報)で配列決定した。予想通り、H3K4me3の特異的濃縮が観察され(図2D)、SNAP-ChIPにおけるこの抗H3K4me3の特異性プロファイルと同様であった(図2E)。注目すべきことに、これらのデータは、図2Bに示すDNA鋳型(すなわち、より長いリンカーDNA)を用いて生み出された。リンカーDNAが長いほど、より短いリンカー断片を有するヌクレオソームに対してDNAバーコード化ヌクレオソームの回収が多くなることが判明した。
Claims (102)
- a.ヒストンH2A、H2B、H3、及びH4の各々を2コピー、及び任意選択でリンカーヒストンH1を、含むタンパク質オクタマー;並びに
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソーム位置決め配列、
ii.ヌクレオソームの特徴の素性及び/又は濃度を示すDNAバーコード;及び
iii.ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むDNA分子;
を含むヌクレオソームであって、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含む前記DNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である、
ヌクレオソーム。 - c.前記DNA分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバー
をさらに含む、請求項1に記載のヌクレオソーム。 - 前記DNA分子が、前記ヌクレオソーム位置決め配列と前記結合メンバーとの間に約10~約80ヌクレオチド長であるリンカーを含み、前記リンカーが、ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を含む、請求項1又は2に記載のヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約40ヌクレオチド長である、請求項3に記載のヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約30ヌクレオチド長である、請求項4に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、エンドデオキシリボヌクレアーゼによって認識される、請求項1~5のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記エンドデオキシリボヌクレアーゼが、マイクロコッカスヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓DNアーゼI、酵母HO又はI-SceIエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、又はホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項6に記載のヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、A/Tに富む領域である、請求項6又は7に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、トランスポザーゼによって認識される、請求項1~5のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記トランスポザーゼが、Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、マリナー、Pエレメント、Tn3、Tn1O、又はTn903である、請求項9に記載のヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、G/Cに富む領域である、請求項9又は10に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバー及びその結合パートナーが、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ナノタグとストレプトアビジン、グルタチオンとグルタチオントランスフェラーゼ、抗原/エピトープと抗体、ポリヒスチジンとニッケル、ポリヌクレオチドと相補ポリヌクレオチド、アプタマーとその特異的標的分子、又はSiタグとシリカである、請求項2~11のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の5’末端に連結される、請求項2~12のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の3’末端に連結される、請求項2~12のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約6~約50塩基対の長さを有する、請求項1~14のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約7~約30塩基対の長さを有する、請求項15に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約8~約20塩基対の長さを有する、請求項16に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレオソーム内の各ヒストンが、独立して完全に合成、半合成、又は組み換えである、請求項1~17のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヒストン翻訳後修飾が、セリン及びアラニンのN-アセチル化;セリン、スレオニン及びチロシンのリン酸化;リジンのN-クロトニル化、N-アシル化;リジンのN6-メチル化、N6,N6-ジメチル化、N6,N6,N6-トリメチル化;アルギニンのオメガ-N-メチル化、対称のジメチル化、非対称のジメチル化;アルギニンのシトルリン化;リジンのユビキチン化;リジンのスモイル化;セリン及びスレオニンのO-メチル化、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のADP-リボシル化、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項1~18のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異が発癌性変異である、請求項1~18のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記発癌性変異が、H3K4M、H3K9M、H3K27M、H3G34R、H3G34V、H3G34W、H3K36M、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項20に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異体が、H3.3、H2A.Bbd、H2A.Z.1、H2A.Z.2、H2A.X、mH2A1.1、mH2A1.2、mH2A2、TH2B、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項1~18のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記DNA転写後修飾が、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、5-カルボキシルシトシン、3-メチルシトシン、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項1~18のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソームのパネルであって、異なるヌクレオソームの特徴を含む少なくとも2つのヌクレオソームを含む、パネル。
- 異なるヌクレオソームの特徴を含む各ヌクレオソームが、前記パネル内に同じ濃度で存在する、請求項24に記載のパネル。
- 異なるヌクレオソームの特徴を含む各ヌクレオソームが、前記パネル内に複数の濃度で存在し、各ヌクレオソームのDNAバーコードが、前記ヌクレオソームが前記パネル内に存在する濃度を示す、請求項24に記載のパネル。
- ヌクレオソームの特徴を含まないヌクレオソームをさらに含む、請求項24~26のいずれか一項に記載のパネル。
- a.各々が、ヒストンH2A、H2B、H3、及びH4の各々を2コピー、並びに任意選択でリンカーヒストンH1を、含む、2つ以上のタンパク質オクタマー;並びに
b.DNA分子であって、
i.ヌクレオソーム位置決め配列、
ii.ヌクレオソームの特徴の素性及び/又は濃度を示すDNAバーコード;及び
iii.ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むDNA分子;
を含むポリヌクレオソームであって、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である
ポリヌクレオソーム。 - c.前記DNA分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバー
をさらに含む、請求項28に記載のポリヌクレオソーム。 - 2~10個のヌクレオソームを含む、請求項28又は29に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNA分子が、前記ヌクレオソーム位置決め配列と前記結合メンバーとの間に約10~約80ヌクレオチド長であるリンカーを含み、前記リンカーが、ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を含む、請求項28~30のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約40ヌクレオチド長である、請求項31に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記リンカーが、約15~約30ヌクレオチド長である、請求項32に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、エンドデオキシリボヌクレアーゼによって認識される、請求項28~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記エンドデオキシリボヌクレアーゼが、マイクロコッカスヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓DNアーゼI、酵母HO又はI-SceIエンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、又はホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項34に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記認識配列がA/Tに富む領域である、請求項34又は35に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、トランスポザーゼによって認識される、請求項28~33のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記トランスポザーゼが、Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、マリナー、Pエレメント、Tn3、Tn1O、又はTn903である、請求項37に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記認識配列がG/Cに富む領域である、請求項37又は38に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバー及びその結合パートナーが、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ナノタグとストレプトアビジン、グルタチオンとグルタチオントランスフェラーゼ、抗原/エピトープと抗体、ポリヒスチジンとニッケル、ポリヌクレオチドと相補ポリヌクレオチド、アプタマーとその特異的標的分子、又はSiタグとシリカである、請求項29~39のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の5’末端に連結される、請求項29~40のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記DNA分子の3’末端に連結される、請求項29~40のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約6~約50塩基対の長さを有する、請求項28~42のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約7~約30塩基対の長さを有する、請求項43に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNAバーコードが、約8~約20塩基対の長さを有する、請求項44に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヌクレオソーム内の各ヒストンが、独立して完全に合成、半合成、又は組み換えである、請求項28~45のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヒストン翻訳後修飾が、セリン及びアラニンのN-アセチル化;セリン、スレオニン及びチロシンのリン酸化;リジンのN-クロトニル化、N-アシル化;リジンのN6-メチル化、N6,N6-ジメチル化、N6,N6,N6-トリメチル化;アルギニンのオメガ-N-メチル化、対称のジメチル化、非対称のジメチル化;アルギニンのシトルリン化;リジンのユビキチン化;リジンのスモイル化;セリン及びスレオニンのO-メチル化、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のADP-リボシル化、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項28~46のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異が発癌性変異である、請求項28~46のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記発癌性変異が、H3K4M、H3K9M、H3K27M、H3G34R、H3G34V、H3G34W、H3K36M、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項48に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異体が、H3.3、H2A.Bbd、H2A.Z.1、H2A.Z.2、H2A.X、mH2A1.1、mH2A1.2、mH2A2、TH2B、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項28~46のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記DNA転写後修飾が、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、5-カルボキシルシトシン、3-メチルシトシン、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項28~46のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソームを含む、アレイ。
- 各アレイがヌクレオソームの特徴を含む、請求項52に記載のアレイのプール。
- 請求項2~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、又は請求項53に記載のプールの結合メンバーに対する結合パートナーを含むビーズであって、前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールに結合するビーズ。
- 磁気ビーズである、請求項54に記載のビーズ。
- 請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、請求項53に記載のプール、又は請求項54若しくは55に記載のビーズを含むキット。
- ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、又は他の認識剤をさらに含む、請求項56に記載のキット。
- 抗体結合タンパク質又は前記認識剤に結合する実体に連結したヌクレアーゼ又はトランスポザーゼをさらに含む、請求項56に記載のキット。
- 前記抗体結合タンパク質が、プロテインA、プロテインG、プロテインAとプロテインGの融合物、プロテインL、又はプロテインYである、請求項58に記載のキット。
- 前記認識剤に結合する前記実体がタンパク質である、請求項58に記載のキット。
- 前記結合メンバーに対する結合パートナーを含むビーズをさらに含む、請求項56~60のいずれか一項に記載のキット。
- 前記ビーズが磁気ビーズである、請求項61に記載のキット。
- クロマチンマッピング又はクロマチンアクセシビリティを決定する方法であって、前記改善が、請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、請求項53に記載のプール、又は請求項54若しくは55に記載のビーズをスパイクインコントロールとしてアッセイで使用することである方法。
- 繋留酵素を用いてクロマチンをマッピングする方法であって、
a)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
b)請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、又は請求項53に記載のプールを、a)の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程;
c)b)の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びb)の前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、又は認識剤とを接触させる工程;
d)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体-結合剤又は認識剤-結合剤を添加する工程;
e)前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが、前記細胞、核、オルガネラ、又は組織中のDNA、及び前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプール中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断及び/又はタグ付けすることを可能にする工程;
f)任意に、切断及び/又はタグ付けされたDNAを分離する工程;並びに
g)前記切断及び/又はタグ付けされたDNAを識別し、
それによってクロマチンをマッピングする工程
を含み、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である方法。 - 工程(d)のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが不活性であり、工程(e)がヌクレアーゼ又はトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項64に記載の方法。
- 繋留酵素を用いてクロマチンをマッピングする方法であって、
a)細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合させる工程;
b)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
c)請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、又は請求項53に記載のプールを固体支持体に結合させる工程;
d)b)の透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織又はa)の無細胞ヌクレオソーム及びc)の結合したヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、若しくは認識剤とを接触させる工程;
e)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体-結合剤又は認識剤-結合剤を添加する工程;
f)ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソーム中のDNA、及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプール中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断及び/又はタグ付けすることを可能にする工程;
g)任意に、切断及び/又はタグ付けされたDNAを分離する工程;並びに
h)切断及び/又はタグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンをマッピングする工程
を含み、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び/又はヒストン変異体及び/又は転写後修飾を含むDNA分子のどれでもないか、それらのうちの1つか、又はそれ以上である方法。 - 工程(e)のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが不活性であり、工程(f)がヌクレアーゼ又はトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項66に記載の方法。
- 切断及び/又はタグ付けされたDNAを識別することが、切断及び/又はタグ付けされたDNAを増幅及び/又は配列決定に供することを含む、請求項64~67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は配列決定が、qPCR、次世代配列決定、又はナノストリングを含む、請求項68に記載の方法。
- 切断及び/又はタグ付けされたDNA中のDNAバーコードの配列に基づいて、前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールの素性を決定することをさらに含む、請求項64~67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体がビーズ又はウェルである、請求項66~70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無細胞ヌクレオソームが、ヌクレオソームを認識する一般的な結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、請求項66~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無細胞ヌクレオソームが、ヒストン翻訳後修飾、ヒストン変異、ヒストン変異体、又はDNA転写後修飾に特異的に結合する結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、請求項66~71のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールで検出された結果に基づいて、前記方法を最適化することをさらに含む、請求項64~73のいずれか一項に記載の方法。
- クロマチンアクセシビリティを決定する方法であって、
a)細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
b)請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、又は請求項53に記載のプールを、a)の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程;
c)a)の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びb)の前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールとトランスポザーゼとを接触させる工程;
d)前記トランスポザーゼが、前記細胞、核、オルガネラ、又は組織中のDNA及びヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプール中のDNAにタグ付けすることを可能にする工程;並びに
e)前記タグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法。 - 工程(c)のトランスポザーゼが不活性であり、工程(d)がトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項75に記載の方法。
- クロマチンアクセシビリティを決定する方法であって、
a)細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合する工程;
b)前記細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程;
c)請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、又は請求項53に記載のプールを固体支持体に結合する工程;
d)b)の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織、又はa)の前記無細胞ヌクレオソーム及びc)の前記結合したヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、若しくはプールと、トランスポザーゼとを接触させる工程;
e)前記トランスポザーゼが前記細胞、核、オルガネラ、組織中のDNA、又は無細胞ヌクレオソーム及び前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプール中のDNAにタグ付けすることを可能にする工程;並びに
f)前記タグ付けされたDNAを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法。 - 工程(d)のトランスポザーゼが不活性であり、工程(e)がトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項77に記載の方法。
- 前記タグ付けされたDNAを識別することが、前記タグ付けされたDNAを増幅及び/又は配列決定に供することを含む、請求項75~78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は配列決定が、qPCR、次世代配列決定、又はナノストリングを含む、請求項79に記載の方法。
- 前記タグ付けされたDNA中のDNAバーコードの配列に基づいて、前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールの素性を決定することをさらに含む、請求項75~80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体支持体がビーズ又はウェルである、請求項77~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無細胞ヌクレオソームが、ヌクレオソームを認識する一般的な結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、請求項77~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無細胞ヌクレオソームが、ヒストン翻訳後修飾、ヒストン変異、ヒストン変異体、又はDNA転写後修飾に特異的に結合する結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、請求項77~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレオソーム、パネル、ポリヌクレオソーム、アレイ、又はプールで検出された結果に基づいて、前記方法を最適化することをさらに含む、請求項75~84のいずれか一項に記載の方法。
- クロマチン内のエピジェネティック修飾又は変異の存在を検出及び定量する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- 疾患又は障害を有する対象におけるクロマチンのエピジェネティック状態又は変異状態を決定及び定量する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- 対象においてクロマチンのエピジェネティック状態又は変異状態の変化を経時的に監視する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- エピジェネティック標的化薬のオンターゲット活性を測定する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- エピジェネティック修飾又は変異と関連付けられる疾患又は障害を有する対象におけるエピジェネティック療法又は変異療法の有効性を監視する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- 対象におけるクロマチンのエピジェネティック状態若しくは変異状態に基づいて、エピジェネティック修飾若しくは変異と関連付けられる疾患又は障害を有する対象に適する治療を選択する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- 対象におけるクロマチンのエピジェネティック状態若しくは変異状態に基づいて、エピジェネティック修飾若しくは変異と関連付けられる疾患又は障害を有する対象の予後を決定する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- 対象におけるクロマチンのエピジェネティック状態若しくは変異状態に基づいて、エピジェネティック修飾若しくは変異と関連付けられる疾患又は障害のバイオマーカーを特定する方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- 対象におけるクロマチンのエピジェネティック状態若しくは変異状態を変更する薬剤のためのスクリーニング方法であって、請求項64~85のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
- 前記細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームが、生体試料から得られる、請求項64~94のいずれか一項に記載の方法。
- 生体試料が、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、口腔粘膜検体採取、脳脊髄液、細胞可溶化試料、羊水、胃腸液、生検組織、リンパ液、又は脳脊髄液である、請求項95に記載の方法。
- 前記細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームが、疾患組織又は試料である、請求項64~94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞、核、オルガネラ、組織が、周辺組織又は細胞である、請求項64~94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記周辺組織又は細胞が末梢血単核細胞である、請求項98に記載の方法。
- ヒストン翻訳後修飾、変異、及び/又はヒストン変異体及び/又はDNA転写後修飾についてクロマチンをアッセイする方法であって、前記改善が、請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、請求項53に記載のプール、又は請求項54若しくは55に記載のビーズを前記アッセイにおいてスパイクインコントロールとして使用することである方法。
- クロマチンへの因子の結合をアッセイする方法であって、前記改善が、請求項1~23のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項24~27のいずれか一項に記載のパネル、請求項28~51のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム、請求項52に記載のアレイ、請求項53に記載のプール、又は請求項54若しくは55に記載のビーズを前記アッセイにおいてスパイクインコントロールとして使用することである方法。
- 前記因子がクロマチンリーダー、ライター、又はイレーサーである、請求項101に記載の方法。
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