JPWO2020132388A5 - - Google Patents
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Description
ＣＵＴ＆ＲＵＮと同様に、ＣＵＴ＆Ｔａｇは抗体を用いて、インサイチュでクロマチンタンパク質を結合し、次いで、プロテインＡ、プロテインＧ／機能亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼ（ｐＡＧ－Ｔｎ５）融合物をこれらの部位に繋留する。制御された活性化の際に、Ｔｎ５は、ゲノム部位で選択的に断片化を行い、アダプター配列の統合を行う。次いで、タグ付き標的ＤＮＡが増幅され、配列決定されることによって、いくつかのライブラリー調製工程を迂回し、時間を節約し（１日未満の合計ワークフロー時間）、実験的バイアスの原因を排除する。重要なことに、ＣＵＴ＆Ｔａｇアッセイは、ＣＵＴ＆ＲＵＮと同様に信頼性の高いデータをもたらす。また、ＣＵＴ＆Ｔａｇアプローチが高感度であるため（すなわち、シグナル対ノイズ；ＦＲｉＰ分析）、単一細胞を含む超低いインプットに適している（Ｋａｙａ－Ｏｋｕｒ，Ｗｕら ２０１９）。クロマチンマッピングアッセイ（例えば、クロマチンアクセシビリティアッセイ、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、及びイムノテザリングアッセイ）の著しい進歩にもかかわらず、試料の変動性、及び抗体性能を監視できないこと（抗体ベースの適用の場合）が、依然として手ごわい技術的障壁である。
スパイクインコントロールは、ｉ）試料間比較を可能にするための試料の正規化に不可欠であり、ｉｉ）アッセイの変動（例えば、抗体特異性／効率又は技術的変動性）を監視する内部対照として使用することができるので、全てのゲノム全体の分析に必要である。最近、ＣｈＩＰ法を標準化するためのスパイクインコントロールとして、ヒストンＰＴＭを保有するＤＮＡバーコード化組み換えヌクレオソームが開発された（内部較正済みＣｈＩＰ又はＩＣｅＣｈＩＰと命名；ＷＯ ２０１５／１１７１４５）。ＩＣｅＣｈＩＰアプローチのバージョンは、ＳＮＡＰ－ＣｈＩＰ（登録商標）として製品化されている。ＩＣｅＣｈＩＰ技術は、抗体性能（すなわち、インサイチュでの特異性／効率及び技術的変動性）を監視するための、および定量的な試料正規化のための、内部対照基準として特定のヒストンＰＴＭを保持するＤＮＡバーコード化デザイナーヌクレオソーム（ｄＮｕｃ）のプールを利用する。このアプローチでは、単一濃度又はある範囲の濃度（複数可）で特有のＰＴＭを保有する１以上のヌクレオソームを含むＤＮＡバーコード化ヌクレオソームパネルが、クロマチン断片化の前後に試料にスパイクされる。得られたヌクレオソーム混合物（ｄＮｕｃ及び細胞由来）は、目的のＰＴＭに特異的なビーズ固定化抗体で免疫沈降される。後続の処理の後に、ＩＰプール及びＩＮＰＵＴプールからのｑＰＣＲ（又はＮＧＳ）データは、１）各ＤＮＡバーコード；及び２）試料ＤＮＡについて検出される読み取り情報の数について分析される。次いで、各免疫沈降の読み取り数値は、各バーコード化ｄＮｕｃのＩＮＰＵＴ濃度に正規化され、試料ＤＮＡ読み取り情報の直接的な定量を提供する。ｄＮｕｃは、内因性抗体標的（修飾されたモノヌクレオソーム）を模倣し、ＣｈＩＰ処理中に試料クロマチンが経験する同じ変動源の影響を受けるため、直接的な性能試薬／検量用試料として機能する。
Claims (51)
- ａ．ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の各々を２コピー、及び任意選択でリンカーヒストンＨ１を、含むタンパク質オクタマー；並びに
ｂ．ＤＮＡ分子であって、
ｉ．ヌクレオソーム位置決め配列、
ｉｉ．ヌクレオソームの特徴の素性及び／又は濃度を示すＤＮＡバーコード；及び
ｉｉｉ．ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むＤＮＡ分子；
を含むヌクレオソームであって、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び／又はヒストン変異体及び／又は転写後修飾を含む前記ＤＮＡ分子のどれでもないか、それらのうちの１つか、又はそれ以上である、
ヌクレオソーム。 - ｃ．前記ＤＮＡ分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバー
をさらに含む、請求項１に記載のヌクレオソーム。 - 前記ＤＮＡ分子が、前記ヌクレオソーム位置決め配列と前記結合メンバーとの間に約１０～約８０ヌクレオチド長であるリンカーを含み、前記リンカーが、ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を含む、請求項１又は２に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、エンドデオキシリボヌクレアーゼによって認識される、請求項１～３のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、Ａ／Ｔに富む領域である、請求項４に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、トランスポザーゼによって認識される、請求項１～３のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記認識配列が、Ｇ／Ｃに富む領域である、請求項６に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバー及びその結合パートナーが、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ナノタグとストレプトアビジン、グルタチオンとグルタチオントランスフェラーゼ、抗原／エピトープと抗体、ポリヒスチジンとニッケル、ポリヌクレオチドと相補ポリヌクレオチド、アプタマーとその特異的標的分子、又はＳｉタグとシリカである、請求項２～７のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記ＤＮＡ分子の５’末端に連結される、または
前記結合メンバーが、前記ＤＮＡ分子の３’末端に連結される、
請求項２～８のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。 - 前記ＤＮＡバーコードが、約６～約５０塩基対の長さを有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヒストン翻訳後修飾が、セリン及びアラニンのＮ－アセチル化；セリン、スレオニン及びチロシンのリン酸化；リジンのＮ－クロトニル化、Ｎ－アシル化；リジンのＮ６－メチル化、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル化、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６－トリメチル化；アルギニンのオメガ－Ｎ－メチル化、対称のジメチル化、非対称のジメチル化；アルギニンのシトルリン化；リジンのユビキチン化；リジンのスモイル化；セリン及びスレオニンのＯ－メチル化、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のＡＤＰ－リボシル化、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異が発癌性変異である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記発癌性変異が、Ｈ３Ｋ４Ｍ、Ｈ３Ｋ９Ｍ、Ｈ３Ｋ２７Ｍ、Ｈ３Ｇ３４Ｒ、Ｈ３Ｇ３４Ｖ、Ｈ３Ｇ３４Ｗ、Ｈ３Ｋ３６Ｍ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１２に記載のヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異体が、Ｈ３．３、Ｈ２Ａ．Ｂｂｄ、Ｈ２Ａ．Ｚ．１、Ｈ２Ａ．Ｚ．２、Ｈ２Ａ．Ｘ、ｍＨ２Ａ１．１、ｍＨ２Ａ１．２、ｍＨ２Ａ２、ＴＨ２Ｂ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 前記ＤＮＡ転写後修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルシトシン、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のヌクレオソーム。
- 請求項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオソームのパネルであって、異なるヌクレオソームの特徴を含む少なくとも２つのヌクレオソームを含む、パネル。
- ａ．各々が、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の各々を２コピー、並びに任意選択でリンカーヒストンＨ１を、含む、２つ以上のタンパク質オクタマー；並びに
ｂ．ＤＮＡ分子であって、
ｉ．ヌクレオソーム位置決め配列、
ｉｉ．ヌクレオソームの特徴の素性及び／又は濃度を示すＤＮＡバーコード；及び
ｉｉｉ．ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列
を含むＤＮＡ分子；
を含むポリヌクレオソームであって、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び／又はヒストン変異体及び／又は転写後修飾を含むＤＮＡ分子のどれでもないか、それらのうちの１つか、又はそれ以上である
ポリヌクレオソーム。 - ｃ．前記ＤＮＡ分子に連結された結合メンバーであって、結合パートナーに特異的に結合する結合メンバー
をさらに含む、請求項１７に記載のポリヌクレオソーム。 - ２～１０個のヌクレオソームを含む、請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ＤＮＡ分子が、前記ヌクレオソーム位置決め配列と前記結合メンバーとの間に約１０～約８０ヌクレオチド長であるリンカーを含み、前記リンカーが、ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、エンドデオキシリボヌクレアーゼによって認識される、請求項１７～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記認識配列がＡ／Ｔに富む領域である、請求項２１に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列が、トランスポザーゼによって認識される、請求項１７～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記認識配列がＧ／Ｃに富む領域である、請求項２３に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバー及びその結合パートナーが、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ナノタグとストレプトアビジン、グルタチオンとグルタチオントランスフェラーゼ、抗原／エピトープと抗体、ポリヒスチジンとニッケル、ポリヌクレオチドと相補ポリヌクレオチド、アプタマーとその特異的標的分子、又はＳｉタグとシリカである、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記結合メンバーが、前記ＤＮＡ分子の５’末端に連結される、または
前記結合メンバーが、前記ＤＮＡ分子の３’末端に連結される、
請求項１８～２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。 - 前記ＤＮＡバーコードが、約６～約５０塩基対の長さを有する、請求項１７～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヒストン翻訳後修飾が、セリン及びアラニンのＮ－アセチル化；セリン、スレオニン及びチロシンのリン酸化；リジンのＮ－クロトニル化、Ｎ－アシル化；リジンのＮ６－メチル化、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル化、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６－トリメチル化；アルギニンのオメガ－Ｎ－メチル化、対称のジメチル化、非対称のジメチル化；アルギニンのシトルリン化；リジンのユビキチン化；リジンのスモイル化；セリン及びスレオニンのＯ－メチル化、アルギニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のＡＤＰ－リボシル化、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１７～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異が発癌性変異である、請求項１７～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記発癌性変異が、Ｈ３Ｋ４Ｍ、Ｈ３Ｋ９Ｍ、Ｈ３Ｋ２７Ｍ、Ｈ３Ｇ３４Ｒ、Ｈ３Ｇ３４Ｖ、Ｈ３Ｇ３４Ｗ、Ｈ３Ｋ３６Ｍ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項２９に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ヒストン変異体が、Ｈ３．３、Ｈ２Ａ．Ｂｂｄ、Ｈ２Ａ．Ｚ．１、Ｈ２Ａ．Ｚ．２、Ｈ２Ａ．Ｘ、ｍＨ２Ａ１．１、ｍＨ２Ａ１．２、ｍＨ２Ａ２、ＴＨ２Ｂ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１７～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 前記ＤＮＡ転写後修飾が、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、３－メチルシトシン、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１７～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオソーム。
- 請求項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項１６に記載のパネル、または請求項１７～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオソームを含む、キット。
- 繋留酵素を用いてクロマチンをマッピングする方法であって、
ａ）細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程；
ｂ）請求項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項１６に記載のパネル、または請求項１７～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオソームを、ａ）の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程；
ｃ）ｂ）の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びｂ）の前記ヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソームと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、又は認識剤とを接触させる工程；
ｄ）ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体－結合剤又は認識剤－結合剤を添加する工程；
ｅ）前記ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが、前記細胞、核、オルガネラ、又は組織中のＤＮＡ、及び前記ヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソーム中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断及び／又はタグ付けすることを可能にする工程；
ｆ）任意に、切断及び／又はタグ付けされたＤＮＡを分離する工程；並びに
ｇ）前記切断及び／又はタグ付けされたＤＮＡを識別し、
それによってクロマチンをマッピングする工程
を含み、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び／又はヒストン変異体及び／又は転写後修飾を含むＤＮＡ分子のどれでもないか、それらのうちの１つか、又はそれ以上である方法。 - 工程（ｄ）のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが不活性であり、工程（ｅ）がヌクレアーゼ又はトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項３４に記載の方法。
- 繋留酵素を用いてクロマチンをマッピングする方法であって、
ａ）細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合させる工程；
ｂ）細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程；
ｃ）請求項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項１６に記載のパネル、または請求項１７～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオソームを固体支持体に結合させる工程；
ｄ）ｂ）の透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織又はａ）の無細胞ヌクレオソーム及びｃ）の結合したヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソームと、ヌクレオソームの特徴に特異的に結合する抗体、アプタマー、若しくは認識剤とを接触させる工程；
ｅ）ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼに連結された抗体－結合剤又は認識剤－結合剤を添加する工程；
ｆ）ヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソーム中のＤＮＡ、及びヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソーム中のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼ認識配列を切断及び／又はタグ付けすることを可能にする工程；
ｇ）任意に、切断及び／又はタグ付けされたＤＮＡを分離する工程；並びに
ｈ）切断及び／又はタグ付けされたＤＮＡを識別し、
それによって、クロマチンをマッピングする工程
を含み、
前記ヌクレオソームの特徴が、翻訳後修飾若しくは変異を含むヒストン及び／又はヒストン変異体及び／又は転写後修飾を含むＤＮＡ分子のどれでもないか、それらのうちの１つか、又はそれ以上である方法。 - 工程（ｅ）のヌクレアーゼ又はトランスポザーゼが不活性であり、工程（ｆ）がヌクレアーゼ又はトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項３６に記載の方法。
- 切断及び／又はタグ付けされたＤＮＡを識別することが、切断及び／又はタグ付けされたＤＮＡを増幅及び／又は配列決定に供することを含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び／又は配列決定が、ｑＰＣＲ、次世代配列決定、又はナノストリングを含む、請求項３８に記載の方法。
- 切断及び／又はタグ付けされたＤＮＡ中のＤＮＡバーコードの配列に基づいて、前記ヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソームの素性を決定することをさらに含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無細胞ヌクレオソームが、ヌクレオソームを認識する一般的な結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、または
前記無細胞ヌクレオソームが、ヒストン翻訳後修飾、ヒストン変異、ヒストン変異体、又はＤＮＡ転写後修飾に特異的に結合する結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、
請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。 - クロマチンアクセシビリティを決定する方法であって、
ａ）細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程；
ｂ）請求項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項１６に記載のパネル、または請求項１７～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオソームを、ａ）の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織に添加する工程；
ｃ）ａ）の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、又は組織及びｂ）の前記ヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソームとトランスポザーゼとを接触させる工程；
ｄ）前記トランスポザーゼが、前記細胞、核、オルガネラ、又は組織中のＤＮＡ及びヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソーム中のＤＮＡにタグ付けすることを可能にする工程；並びに
ｅ）前記タグ付けされたＤＮＡを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法。 - 工程（ｃ）のトランスポザーゼが不活性であり、工程（ｄ）がトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項４２に記載の方法。
- クロマチンアクセシビリティを決定する方法であって、
ａ）細胞、核、オルガネラ、組織、又は無細胞ヌクレオソームを固体支持体に結合する工程；
ｂ）前記細胞、核、オルガネラ、又は組織を透過処理する工程；
ｃ）請求項１～１５のいずれか一項に記載のヌクレオソーム、請求項１６に記載のパネル、または請求項１７～３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオソームを固体支持体に結合する工程；
ｄ）ｂ）の前記透過処理した細胞、核、オルガネラ、若しくは組織、又はａ）の前記無細胞ヌクレオソーム及びｃ）の前記結合したヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソームと、トランスポザーゼとを接触させる工程；
ｅ）前記トランスポザーゼが前記細胞、核、オルガネラ、組織中のＤＮＡ、又は無細胞ヌクレオソーム及び前記ヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソーム中のＤＮＡにタグ付けすることを可能にする工程；並びに
ｆ）前記タグ付けされたＤＮＡを識別し、
それによって、クロマチンアクセシビリティを決定する工程
を含む方法。 - 工程（ｄ）のトランスポザーゼが不活性であり、工程（ｅ）がトランスポザーゼを活性化することを含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記タグ付けされたＤＮＡを識別することが、前記タグ付けされたＤＮＡを増幅及び／又は配列決定に供することを含む、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び／又は配列決定が、ｑＰＣＲ、次世代配列決定、又はナノストリングを含む、請求項４６に記載の方法。
- 前記タグ付けされたＤＮＡ中のＤＮＡバーコードの配列に基づいて、前記ヌクレオソーム、パネル、またはポリヌクレオソームの素性を決定することをさらに含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記無細胞ヌクレオソームが、ヌクレオソームを認識する一般的な結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、または
前記無細胞ヌクレオソームが、ヒストン翻訳後修飾、ヒストン変異、ヒストン変異体、又はＤＮＡ転写後修飾に特異的に結合する結合剤を用いて前記固体支持体に結合される、
請求項４４～４８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞、核、オルガネラ、組織が、周辺組織又は細胞である、請求項３４～４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記周辺組織又は細胞が末梢血単核細胞である、請求項５０に記載の方法。
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