CN113677712A - 染色质相关蛋白的定量作图 - Google Patents

染色质相关蛋白的定量作图 Download PDF

Info

Publication number
CN113677712A
CN113677712A CN202080026856.XA CN202080026856A CN113677712A CN 113677712 A CN113677712 A CN 113677712A CN 202080026856 A CN202080026856 A CN 202080026856A CN 113677712 A CN113677712 A CN 113677712A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chap
nucleosome
polynuclear
dna
library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080026856.XA
Other languages
English (en)
Inventor
M·W·考尔斯
Z-W·孙
M-C·基奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Love Pizza Co
Epicypher Inc
Original Assignee
Love Pizza Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Love Pizza Co filed Critical Love Pizza Co
Publication of CN113677712A publication Critical patent/CN113677712A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及DNA条形码化重组核小体和多聚核小体，其已被工程化以用作使用染色质免疫沉淀(ChIP)测定、基于拴系酶的作图测定和其他染色质作图测定来对染色质相关蛋白进行定量作图的掺入对照。本发明还涉及在ChIP测定、基于拴系酶的作图测定和其他染色质作图测定中使用工程化的DNA条形码化重组核小体的方法。

Description

染色质相关蛋白的定量作图
优先权声明
本申请案要求2019年2月15日提交的美国临时申请案序号62/806,174的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及DNA条形码化重组核小体和多聚核小体，其被构建为使用染色质免疫沉淀(ChIP)测定、基于拴系酶的作图测定和其他染色质作图测定来对染色质相关蛋白进行定量作图的掺入对照。本发明还涉及在ChIP测定、基于拴系酶的作图测定和其他染色质作图测定中使用工程化的DNA条形码化重组核小体的方法。
发明背景
染色质免疫沉淀接连下一代测序(ChIP-seq)被广泛用于对染色质元件，如组蛋白翻译后修饰(PTM)和染色质相关蛋白(ChAP；例如，转录因子(TF)或染色质结合蛋白(CBP))的基因组位置作图(Collas 2010,Nakato和Shirahige 2017)。在该方法中，使用特异性抗体(或类似的亲和试剂)来富集含有特定PTM或ChAP的染色质片段。然后分离相关DNA并用下一代测序(NGS)或qPCR对其定量，分别提供正在研究的靶标的全基因组视图或局部视图。ChIP-Seq已成为详细研究基因组功能的基本策略，并在药物靶标鉴定/临床前药物验证研究中发挥重要作用。然而，该方法受到收率差、精度/可靠性低的阻碍。这些缺陷源于使用验证不充分的ChIP级抗体(Bock,Dhayalan等人2011,Egelhofer,Minoda等人2011,Fuchs,Krajewski等人2011,Fuchs和Strahl 2011,Nishikori,Hattori等人2012,Rothbart,Lin等人2012,Hattori,Taft等人2013,Rothbart,Dickson等人2015,Shah,Grzybowski等人2018)，从大量过量的片段化竞争染色质中富集/扩增特定区域时不可避免的背景，以及缺乏能够监测染色质富集期间的可变性/对靶位点的信号定量的内部控制(Chen,Hu等人2015)。值得注意的是，外源性异种染色质(通常来自酵母或果蝇)用作样本标准化的掺入对照(Orlando,Chen等人2014,Egan,Yuan等人2016)；然而天然染色质作为试剂未充分明确，且因此在许多性能度量上差异很大。此外，该方法未提供对中靶抗体富集的深入了解，因此仍非常需要ChAP靶标(包括TF和其他CBP)的定量作图工具。
已开发超越ChIP的替代染色质作图方法，包括那些将酶拴系到基因组区域的方法，从而导致靶物质的释放、富集和随后分析(例如DamID、ChIC、ChEC、CUT&RUN和CUT&Tag)。例如，相关的ChIC(染色质免疫切割(Schmid,Durussel等人2004))和CUT&RUN(核酸酶靶向切割和释放(Skene和Henikoff 2017,Skene,Henikoff等人2018))方法使用因子特异性抗体，将蛋白A-微球菌核酸酶(pA-MNase)的融合物拴系到完整细胞或提取细胞核中的基因组结合位点，然后通过添加钙将融合物激活以切割DNA。pA-MNase为针对任何PTM或ChAP的抗体提供切割拴系系统。通过使用固体支持物(例如，凝集素包被的磁珠)粘附细胞(或细胞核)，进一步简化了CUT&RUN方案。这些进步简化了处理，提高了样本回收率，并实现了方案自动化。值得注意的是，对于选定的PTM(例如，H3K27me3(Skene和Henikoff 2017))或转录因子(例如，CTCF[19])，CUT&RUN测定非常灵敏，需要的初始材料(即细胞)比ChIP-Seq少>100倍，测序深度比ChIP-Seq少10-100倍。与CUT&RUN类似，CUT&Tag使用抗体原位结合染色质蛋白，然后将蛋白A和高活性Tn5转座酶(pA-Tn5)融合物拴系到这些位点。在受控激活后，Tn5在基因组位点选择性片段化和整合衔接头序列。然后对标记的靶DNA进行扩增和测序，从而绕过了几个文库制备步骤，节省了时间(总工作流程时间＜1天)，并消除了实验偏差的来源。CUT&Tag方法的高灵敏度(即信噪比)使其适用于超低输入量，包括单细胞(Kaya-Okur,Wu等人2019)。
全基因组分析均需掺入标准品，因为它们：i)对于实现交叉样本比较的标准化至关重要；ii)可用作内部对照以监测测定性能(例如抗体特异性或技术变异性)。最近开发了携带明确的组蛋白PTM的DNA条形码化重组核小体作为掺入对照以标准化ChIP方法(称为内部校准的ChIP或ICeChIP；WO2015117145A1)。ICeChIP方法的一种版本已在
Figure BDA0003289901420000031
掺入平台下商业化。ICeChIP技术利用携带特定组蛋白PTM的DNA条形码化dNuc的池作为内部标准来监测抗体性能(即特异性/效率和原位技术变异性)，并用于定量性样本标准化。在该方法中，DNA条形码化核小体组包括一种或更多种携带单一浓度或一系列浓度的独特PTM的核小体，在染色质片段化之前或之后掺入到样本中。将产生的核小体混合物(dNuc和所获取的细胞(cell derived))用针对目的PTM的珠固定的抗体进行免疫沉淀。在后续处理后，分析来自IP和输入池的qPCR(或NGS)数据，以获取针对1)每个DNA条形码和2)样品DNA检测到的读段数量。然后将每次IP的读段数量针对每个条形码化dNuc的输入浓度归一化，从而提供样本DNA读段的直接定量。dNuc用作直接性能试剂/校准品，因为它们模拟内源性抗体靶标(修饰的单核小体)，并且在ChIP处理过程中受到与样本染色质经历的相同变异性来源的影响。该技术最近用于系统地检查靶向各种甲基形式的H3K4(例如me1、me2或me3)的抗体的特异性(Shah,Grzybowski等人2018)。
除了ChIP方法之外，DNA条形码化重组核小体也已应用于开发中等通量染色质结合((Nguyen,Bittova等人2014)；WO 2013/184930)和重塑(Dann,Liszczak等人2017)测定。在每一种应用中，DNA条形码化核小体包括合成的编码独特的“标识符序列”(或“条形码”)的DNA模板，其缠绕在携带一个或更多个PTM的组蛋白八聚体周围。对于基因组作图，可将DNA条形码化核小体以一种或更多种浓度汇集，以表示抗体特异性检测或ChIP测定归一化的多个相关标记。然而，目前的DNA条形码化重组核小体不能应用于ChAP的基因组作图研究(如ChIP、ChIC、CUT&RUN或CUT&Tag)，因为它们缺乏捕获代表性抗体所需的表位。
鉴于以上所述，本领域需改进用于染色质测定例如ChIP测定和使用拴系酶的染色质作图测定的对照。
发明概述
本发明涉及作为ChAP作图研究的掺入对照的DNA条形码重组核小体的开发和应用。ChAP包括与染色质直接相互作用的任何蛋白质，包括与DNA直接结合的转录因子和与组蛋白和/或DNA相互作用或修饰组蛋白和/或DNA的“阅读器”蛋白质和酶。ChAP还包括通过大分子复合物(例如转录调节复合物和染色质重塑复合物)间接与染色质相互作用的蛋白质。现有技术中描述的DNA条形码化核小体的关键变化包括：ChAP捕获表位，例如1)ChAP表位；或2)与组蛋白亚基(如组蛋白H3、H4、H2A或H2B)之一的N端或C端融合的短肽标签(SPT；如FLAG)，以捕获ChAP或SPT特异性抗体而用于染色质作图研究(如ChIP、ChIC或CUT&RUN)。ChAP表位可以是正在测量的ChAP中存在的抗体结合序列。SPT可以是已添加到正在测量的ChAP中的一种。这些掺入对照可用于多种应用形式，包括测定优化、抗体特异性测试、技术变异性监测和交叉样本比较的定量归一化。
在一些实施方案中，ChAP捕获表位可融合至组蛋白亚基(例如，组蛋白H3、H4、H2A或H2B)的N端或C端。在一些实施方案中，ChAP捕获表位可以取代组蛋白亚基的片段。在一些实施方案中，ChAP组蛋白可以重组表达为融合蛋白。在一些实施方案中，ChAP捕获表位或组蛋白可以化学合成。在一些实施方案中，ChAP组蛋白融合蛋白可通过化学或酶学连接方法生成。这些融合连接可以使用两种重组蛋白(一种合成肽和一种重组蛋白，或两种合成肽)生成。因此，ChAP组蛋白融合蛋白可以是完全重组、半合成或完全合成的。
在一些实施方案中，包含ChAP捕获表位的DNA条形码化核小体可用作染色质免疫沉淀测定(即ChIP、ChIP-qPCR和ChIP-Seq)的掺入对照。在一些实施方案中，这些核小体与147bp的DNA组装在一起。在一些实施方案中，这些核小体与长度超过147bp的DNA组装在一起；即，包括延伸到核小体核心颗粒(NCP)之外的“接头”DNA。例如，核小体可在147bp NCP的任一侧含有约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100bp的DNA。在一些实施方案中，在NCP的一侧的接头DNA比另一侧的更长。例如，核小体可在5'端包含20bp的接头，而在3'端包含60bp的接头。在一些实施方案中，可以进一步修饰DNA，使其在5’或3’末端含有结合部分。携带一种或更多种ChAP的各DNA条形码化核小体可以以单一或一系列浓度被合并。该核小体池可在IP步骤之前掺入到ChIP反应中。qPCR或NGS对中靶DNA条形码化核小体的捕获效率可用于确定抗体特异性(通过比较中靶与脱靶捕获)或用于样品标准化(通过在生物样品之间比较中靶核小体捕获)。在一些实施方案中，样品可包括细胞、组织或生物流体(例如，血液、血浆、血清、脊髓液、唾液等)。在一些实施方案中，可将DNA长度和修饰整合以使其与其他染色质作图方法(包括ChIP、ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag)正向兼容。
在一些实施方案中，包含ChAP捕获表位的DNA条形码化核小体可用作染色质拴系测定(例如ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag)的掺入对照。在一些实施方案中，这些核小体与长度超过147bp的DNA组装在一起；即，包括延伸到核小体核心颗粒(NCP)之外的“接头”DNA。该接头的长度可被优化以获得最大的酶活性。例如，与使用高活性转座酶Tn5靶向染色质的CUT&Tag测定相比，使MNase靶向抗体靶向的染色质进行后续序列切割的CUT&RUN测定可能需要不同的接头长度来实现最佳的MNase切割。核小体可在147bp NCP的任一侧含有约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100bp的DNA。在一些实施方案中，在核小体核心颗粒的一侧的接头DNA比另一侧的更长。例如，核小体可在5’端包含20bp的接头，而在3’端包含60bp的接头。在一些实施方案中，可以进一步修饰DNA以使在其5’或3’末端含有结合部分。该结合部分可用于将核小体结合至固体支持物。携带一种或更多种ChAP的多种DNA条形码核小体可以以单一或一系列浓度被合并。在ChAP-抗体孵育步骤之前，可将该核小体池掺入到染色质拴系反应并结合至固体支持物。中靶DNA条形码核小体的捕获效率通过qPCR或NGS进行确定，且可用于确定抗体特异性(通过比较中靶与脱靶捕获)或用于样品标准化(通过在生物样品之间比较中靶核小体捕获)。在一些实施方案中，样品可包括细胞、组织或生物液体(例如，血液、血浆、血清、脊髓液、唾液等)。在一些实施方案中，可将DNA长度和修饰整合，使其与其他染色质作图方法(包括ChIP、ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag)正向兼容。
本发明的这些和其他方面将在下面对本发明的描述中更详细阐述。
附图说明
图1A-1B显示了，(A)使用修饰的肽的verSaNuc核小体上连接(on-nucleosomeligation)策略的概述。(B)verSaNuc方法如何可用于快速生成ChAP-CUT&RUN dNuc(SEQ IDNO：9)的示意图。
详述
下面将更详细地解释本发明。该描述并不旨在成为本发明可被实施的所有不同方式，或者可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一种实施方案说明的特征可以并入到其他实施方案中，并且关于特定实施方案说明的特征可以从该实施方案中删除。此外，根据公开内容，本文所建议的各种实施方案的许多变化和添加对本领域技术人员来说应是明显的，其没有脱离本发明。因此，以下详细描述旨在说明本发明的一些特定实施方案，而不是详尽指定其所有排列、组合和变化。
除非上下文另有规定，否则特别预期的是，本文所述的本发明的各种特征可以任意组合地使用。此外，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。举例来说，如果说明书指出一种复合物包含组分A、B和C，那么特别预期的是，A、B或C中的任何一种或其组合均可单独或以任何组合被省略和放弃。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本文对本发明的描述中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案的目的，而并不旨在限制本发明。
核苷酸序列在本文中仅以5'到3’方向、从左到右的单链形式呈现，除非另外特别说明。根据37 C.F.R.§1.822和已确立的用法，核苷酸和氨基酸在本文中以IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的方式表示，或(对于氨基酸)以单字母代码或三字母代码表示。
除非另有说明，本领域技术人员已知的标准方法可用于生产重组和合成的多肽、抗体或其抗原结合片段、操作核酸序列、生产转化细胞、构建核小体以及瞬时和稳定转染细胞。此类技术对本领域技术人员是已知的。参见，例如，SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL第四版(Cold Spring Harbor,NY,2012)；F.M.AUSUBEL等人，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.and JohnWiley&Sons,Inc.,纽约)。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列和其他参考文献均通过引用全部并入本文。
如在本发明和所附权利要求书的描述中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
如本文使用的，“和/或”涉及并涵盖一个或更多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，并且当在替代方案中解释时没有组合(“或”)。
而且，本发明还考虑到，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。
此外，当指可测量的值如本发明的化合物或剂的量、剂量、时间、温度等时，本文所用的术语“约”意指包括指定量的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。
本文所用的与核酸、蛋白质有关的术语“主要由……组成”意指核酸或蛋白质不包含除所述元件以外的显著改变(例如，超过约1％、5％或10％)核酸或蛋白质目的功能的任何元件。
如本文使用的，术语“多肽”包括肽和蛋白质，除非另有说明。
“核酸”或“核苷酸序列”是核苷酸碱基序列，且可以是RNA、DNA或DNA-RNA杂交序列(包括天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸)，但优选单链DNA序列或双链DNA序列。
如本文使用的，“分离的”核酸或核苷酸序列(例如，“分离的DNA”或“分离的RNA”)是指与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分分离或基本上不含天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分的核酸或核苷酸序列，所述天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分例如细胞或病毒结构组分，或其他多肽，或通常发现的与所述核酸或核苷酸序列缔合的核酸。
同样，“分离的”多肽是指与天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分分离或基本上不含天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分的多肽，所述天然存在的微生物或病毒的至少一些其他组分例如细胞或病毒结构组分，或其他多肽，或通常发现的与所述多肽缔合的核酸。
所谓“基本上保留”一种特性(例如，活性或其他可测量特性)，是指至少保留了该特性的约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
术语“合成的”是指自然界中不存在的化合物、分子或复合物。
术语“DNA条形码”指可用于明确识别其所在DNA分子的核酸序列。条形码的长度决定了1个文库中可以存在多少独特序列。例如，一条1核苷酸(nt)条形码可为4个文库成员提供代码，一条2nt条形码可为16个变体提供代码，3nt条形码可为64个变体提供代码，4nt条形码可为256个变体提供代码，5nt条形码可为1024个变体提供代码等等。条形码可以是单链(ss)DNA或双链(ds)DNA或其组合。
本发明的一个方面涉及核小体，其包括：
a.蛋白质八聚体，其包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个拷贝，以及任选的接头组蛋白H1；
b.DNA分子，其包含：
i.核小体定位序列，
ii.指示染色质相关蛋白(ChAP)捕获表位的DNA条形码；和
c.融合到一个或更多个组蛋白的N端和/或C端或DNA分子中的任一位置的ChAP捕获表位。
核小体定位序列(NPS)可以是本领域已知的任何NPS。实例包括但不限于Widom601序列和601.2和601.3变体、绿海胆(Lytechinus variegatus)5S rDNA序列以及MMTVLTR核小体A和B序列。
ChAP可以是但不限于，转录因子、染色质阅读器(chromatin reader)、组蛋白/DNA修饰酶或染色质调节复合物。转录因子的实例包括但不限于在en.wikipedia.org/wiki/List_of_human_transcription_factors中列出的转录因子(通过引用整体并入本文)。阅读器的实例包括但不限于，BRD4、YEATS2和PWWP。组蛋白/DNA修饰酶的实例包括但不限于NSD2、JMJD2A、CARM1、MLL1、DOT1L、EZH2和DNMT3A/B。染色质调节复合物的实例包括但不限于RNA聚合酶Ⅱ、SMARCA2和ACF。
ChAP捕获表位可以是目的ChAP中存在的任何氨基酸序列，并且可被抗体或其他识别剂或结合剂特异性结合。
在一些实施方案中，ChAP捕获表位是一个或更多个短肽标签。短肽标签的实例包括但不限于FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO：1))、HA(YPYDVPDYA(SEQ ID NO：2))、6His(HHHHHH(SEQ ID NO：3))、Myc(EQKLISEEDL(SEQ ID NO：4))、Strep-Ⅰ(AWRHPQFGG(SEQ ID NO:5))、Strep-Ⅱ(NWSHPQFEK(SEQ ID NO:6))、蛋白C(EDQVDPRLIDGK(SEQ ID NO：7))、V5或GST或所述标签的2、3、4或更多次重复物。
在一些实施方案中，ChAP捕获表位是抗体结合序列，即被抗体或其它识别剂或结合剂识别和特异性结合的表位。在一些实施方案中，该表位是ChAP特有的，例如与相关蛋白(即家族成员)具有低序列同源性。在一些实施方案中，该表位是被针对ChAP的已知抗体识别的表位。
核小体中的每种组蛋白独立地是完全合成(例如，化学合成)、半合成(例如，重组产生，然后例如，通过化学或酶法添加肽序列被合成改变)或重组的。
DNA分子可包括其他元件。在一些实施方案中，DNA分子还包含与DNA分子连接的结合元件，其中所述结合元件与结合配偶体特异性结合。结合元件及其结合配偶体的实例包括但不限于，生物素与亲和素或链霉亲和素、nano标签(nano-tag)与链霉亲和素、谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶、抗原/表位与抗体、聚组氨酸与镍、多核苷酸与互补多核苷酸、适体与其特定靶分子、或Si标签与二氧化硅。在一些实施方案中，结合元件连接到DNA分子的5’端。在一些实施方案中，结合元件连接到DNA分子的3’端。
在一些实施方案中，DNA分子在核小体定位序列和结合元件之间包含接头，其长度为约10至约80个核苷酸，例如，约15至约40个核苷酸的长度或约15至约30个核苷酸的长度，例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个核苷酸长度或其任何范围。
在一些实施方案中，DNA分子例如在接头中包括核酸酶或转座酶识别序列。
核酸酶或转座酶识别序列可以是优选被核酸酶或转座酶识别的任何核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸酶或转座酶识别序列被脱氧核糖核酸内切酶识别。合适的脱氧核糖核酸内切酶包括但不限于微球菌核酸酶(MNase)、S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、酵母HO或I-SceI核酸内切酶、限制性核酸内切酶或归巢核酸内切酶及其修饰或增强形式。在一些实施方案中，识别序列是富含A/T的区域。
在一些实施方案中，核酸酶或转座酶识别序列被转座酶识别。合适的转座酶包括但不限于Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、Mariner、P元件(P Element)、Tn3、Tn1O或Tn903及其修饰或增强形式，例如，突变的高活性转座酶。这些修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是Tn5或修饰的Tn5，例如包括E54K、M56A或L372P中的一个或更多个突变的高活性Tn5。在一些实施方案中，识别序列是富含G/C的区域。
在一些实施方案中，接头包括核酸酶识别序列(例如，富含A/T序列的一个或更多个区域)和转座酶识别序列(例如，富含G/C序列的一个或更多个区域)，以致于本发明的核小体可用于多种方法。富含A/T区域或富含G/C区域是分别包含的A/T碱基或G/C碱基超过50％，例如超过50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％区域。
在一些实施方案中，DNA条形码具有约6至约50个碱基对，例如约7至约30个碱基对或约8至约20个碱基对的长度。在一些实施方案中，DNA条形码可具有少于50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，DNA条形码可具有至少6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸的长度。
本发明的另一方面涉及本发明的核小体的组(例如，集合)，其中该组中的核小体包含一种或更多种浓度的ChAP捕获表位于该组中，并且每个核小体的DNA条形码指示该核小体在组中存在的浓度。
在一些实施方案中，该组包含至少两个包含不同的ChAP捕获表位的核小体。在一些实施方案中，包括不同ChAP捕获表位的每种核小体在该组中以相同浓度存在。在其它实施方案中，包含不同ChAP捕获表位的每种核小体在该组中以多种浓度存在，并且每种核小体的DNA条形码标明该核小体在该组中存在的浓度。
在一些实施方案中，该组还可以包括合成的核小体，其不包含ChAP捕获表位，例如作为对照。
本发明的另一方面涉及多聚核小体，其包括：
a.蛋白质八聚体，其包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个拷贝，以及任选的接头组蛋白H1；
b.DNA分子，其包含：
i.核小体定位序列，
ii.指示ChAP捕获表位的DNA条形码；和
c.融合到一个或更多个组蛋白的N端和/或C端或DNA分子中的任一位置的ChAP捕获表位。
在一些实施方案中，多聚核小体可包括2到10个核小体，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个核小体或其中的任何范围。
核小体定位序列(NPS)可以是本领域已知的任一NPS。实例包括但不限于Widom601序列及601.2和601.3变体、绿海胆5S rDNA序列以及MMTV LTR核小体A和B序列。
ChAP捕获表位可以是目的ChAP中存在的任何氨基酸序列，并且可以与抗体或其他结合剂特异性结合。
在一些实施方案中，ChAP捕获表位是一个或更多个短肽标签。短肽标签的实例包括但不限于FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO：1))、HA(YPYDVPDYA(SEQ ID NO：2))、6His(HHHHHH(SEQ ID NO：3))、Myc(EQKLISEEDL(SEQ ID NO：4))、Strep-Ⅰ(AWRHPQFGG(SEQ ID NO：5))、Strep-Ⅱ(NWSHPQFEK(SEQ ID NO：6))、蛋白C(EDQVDPRLIDGK(SEQ ID NO：7))、V5、TY1或GST或所述标签的2、3、4或更多次重复物。
在一些实施方案中，ChAP捕获表位是抗体结合序列，即被抗体识别并特异性结合的表位。
核小体中的每个组蛋白独立地是完全合成(例如，化学合成)、半合成(例如，重组产生，然后例如，通过化学或酶法添加肽序列被合成改变)或重组的。
DNA分子可包含其他元件。在一些实施方案中，DNA分子还包含与DNA分子连接的结合元件，其中所述结合元件与结合配偶体特异性结合。结合元件及其结合配偶体的实例包括但不限于，生物素与亲和素或链霉亲和素、nano标签与链霉亲和素、谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶、抗原/表位与抗体、聚组氨酸与镍、多核苷酸与互补多核苷酸、适体与其特定靶分子、或Si标签和二氧化硅。在一些实施方案中，结合元件连接到DNA分子的5’端。在一些实施方案中，结合元件连接到DNA分子的3’端。
在一些实施方案中，DNA分子在核小体定位序列和结合元件之间包含接头，其长度为约10至约80个核苷酸，例如，约15至约40个核苷酸的长度或约15至约30个核苷酸的长度，例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个核苷酸的长度或其任何范围。
在一些实施方案中，DNA分子例如在接头中包含核酸酶或转座酶识别序列。
核酸酶或转座酶识别序列可以是优选被核酸酶或转座酶识别的任何核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸酶或转座酶识别序列被脱氧核糖核酸内切酶识别。合适的脱氧核糖核酸内切酶包括但不限于微球菌核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、酵母HO或I-SceI核酸内切酶、限制性核酸内切酶或归巢核酸内切酶及其修饰或增强形式。在一些实施方案中，识别序列是富含A/T的区域。
在一些实施方案中，核酸酶或转座酶识别序列被转座酶所识别。合适的转座酶包括但不限于Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、Mariner、P元件、Tn3、Tn1O或Tn903及其修饰或增强形式，例如，突变的高活性转座酶。这些修饰的转座酶在本领域是已知的。在一些实施方案中，转座酶是Tn5或修饰的Tn5，例如包括突变E54K、M56A或L372P中的一个或更多个的高活性Tn5。在一些实施方案中，识别序列是富含G/C的区域。
在一些实施方案中，接头包括核酸酶识别序列(例如，富含A/T序列的一个或更多个片段)和转座酶识别序列(例如，富含G/C序列的一个或更多个片段)，以致于本发明的核小体可用于多种方法。富含A/T的区域或富含G/C的区域分别包含的A/T碱基或G/C碱基超过50％例如超过50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的区域。
在一些实施方案中，DNA条形码具有约6至约50个碱基对，例如约7至约30个碱基对或约8至约20个碱基对的长度。在一些实施方案中，DNA条形码可具有少于50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，DNA条形码可具有至少6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30个核苷酸的长度。
本发明的另一方面涉及包括本发明的多聚核小体的阵列。多聚核小体阵列可包含单个ChAP捕获表位，也可以包括不同ChAP捕获表位的集合。阵列上的DNA条形码可用于表示整个阵列或阵列内的独特特征。
本发明的另一方面涉及本发明的阵列的池，其中所述每个阵列包含独特的ChAP捕获表位。在一些实施方案中，多聚核小体阵列组包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、21、25、30、35或40个或更多个包含不同ChAP捕获表位的多聚核小体阵列或其中的任何范围。在一些实施方案中，包含不同ChAP捕获表位的每个多聚核小体阵列在阵列中以相同浓度存在。在其它实施方案中，包含不同ChAP捕获表位的每个核小体阵列在阵列中以多种浓度存在，并且每个多聚核小体的DNA条形码指示该多聚核小体在阵列中存在的浓度。在一些实施方案中，阵列还包括不包含ChAP捕获表位的多核糖体阵列，例如用作对照。
本发明的另一方面涉及固体支持物，例如珠，其包括针对本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列或池的结合元件的结合配偶体，其中所述珠与核小体、组、多聚核小体、阵列或池结合。珠可以是任何适合于从样本中分离染色质、核小体或多聚核小体和/或将染色质、核小体或多聚核小体附着于固体支持物的珠。珠可以由天然材料(例如藻酸盐)或合成材料(例如聚苯乙烯)组成。在一些实施方案中，珠是可通过暴露于磁场而被分离的磁珠。
本发明的另一方面涉及试剂盒，其包括本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池和珠。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括特异性结合ChAP捕获表位或核小体特征(例如，组蛋白翻译后修饰(PTM)、组蛋白突变、组蛋白变体或DNA转录后修饰)的抗体、适体、纳米抗体或其他识别剂或结合剂。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括与抗体结合蛋白或与结合识别剂的实体连接的核酸酶或转座酶。在某些实施方案中，抗体结合蛋白可以是但不限于蛋白A、蛋白G、蛋白A和蛋白G的融合物、蛋白L或蛋白质Y。在一些实施方案中，结合识别剂的实体是蛋白质。在其他实施方案中，试剂盒还可以包括未与抗体结合蛋白或结合识别剂的实体连接的核酸酶或转座酶。在某些实施方案中，试剂盒还可以包含包括结合元件的结合配偶体的珠，例如磁珠。试剂盒还可包括用于实施本发明的方法的试剂和/或容器，例如缓冲液、酶(例如核酸酶、转座酶、聚合酶、连接酶)、检测试剂等。在一些实施方案中，试剂盒还可以包含实施本发明的方法的说明书。
掺入对照可以用于其中改进的对照/校准品将是有用的本领域已知的任何染色质测定中。实例包括但不限于CUT&RUN测定(WO2019/060907)、ChIC测定(美国专利号7,790,379)和ICeChIP测定(WO 2015/117145)。这些参考文献中的每一篇均全文并入本文。
本发明的一方面涉及使用拴系酶进行染色质作图的方法，其中所述改进是在该测定中使用本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠作为掺入对照。
本发明的另一方面涉及使用拴系酶进行染色质作图的方法，其包括以下步骤：
a)将细胞核、细胞器、细胞或组织结合至固体支持物；
b)透化所述细胞核、细胞器、细胞或组织；
c)将本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、或池结合至固体支持物；
d)使b)中的透化的细胞核、细胞器、细胞或组织和c)中的被结合的核小体、组、多聚核小体、阵列或池与特异性结合ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂接触；
e)加入与核酸酶或转座酶连接的抗体结合剂、适体结合剂、纳米抗体结合剂或识别剂结合剂；
f)允许核酸酶或转座酶切割或标记细胞核、细胞器、细胞或组织中的DNA以及核小体、组、多聚核小体、阵列或池中的核酸酶或转座酶识别序列；
g)分离被切割或标记的DNA；和
h)鉴定被切割或标记的DNA；
从而进行染色质作图。
在一些实施方案中，步骤(e)中的核酸酶或转座酶是无活性的，并且步骤(f)包括例如通过加入离子如钙或镁激活核酸酶或转座酶。
在一些实施方案中，鉴定被切割的DNA包括对切割的DNA进行扩增和/或测序。测序可以包括，例如，qPCR、下一代测序或Nanostring。
在一些实施方案中，该方法还可包括基于被切割或标记的DNA的DNA条形码序列来确定核小体、组、多聚核小体、阵列或池的身份。
在一些实施方案中，该方法还包括基于用核小体、组、多聚核小体、阵列或池检测的结果优化该方法。例如，中靶/脱靶DNA条形码化核小体的回收可用于优化酶浓度、酶活化时间、细胞与酶的比值等。
该方法可以使用为细胞、细胞核、细胞器或组织提供固体支持物的任何合适的形式来进行。在一些实施方案中，固体支持物是珠，例如磁珠。在一些实施方案中，固体支持物是平板例如6、12、24、96、384或1536孔板的孔。
从本发明的方法获得的结果可用于其中关于ChAP和染色质结构和/或修饰的信息(例如表观遗传变化)将是有用的任何目的。在一些实施方案中，该方法还可包括使用测序结果比较健康组织和疾病组织之间的染色质特征的步骤。在一些实施方案中，该方法还可包括使用测序结果预测疾病状态的步骤。在一些实施方案中，该方法还可包括使用测序结果监测对治疗的响应的步骤。在一些实施方案中，该方法还可包括使用测序结果分析肿瘤异质性的步骤。
本发明的方法可用于检测和定量染色质中ChAP的存在。特异性结合ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂可用于检测和定量各基因组位点的ChAP。
本发明的方法可用于确定和定量患有疾病或障碍的受试者的染色质上的ChAP。特异性结合可能与受试者的疾病或障碍相关或与疾病或障碍相关的基因的表达相关的ChAP的抗体、适体、纳米抗体或识别剂可用于检测和定量各基因组位点的ChAP。通过该方法，人们可以确定患有疾病或障碍(例如肿瘤)的受试者是否具有已知与例如肿瘤类型相关的ChAP。
本发明的方法可用于监测受试者中染色质上的ChAP随时间的变化。该方法可用于确定ChAP状态(例如，水平和/或活性)是否随着时间的推移而改善、稳定或恶化。该方法的步骤可以根据需要重复多次，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50或100次或更多次，以监测ChAP状态的变化。该方法可以定期(例如，每天、每周、每月、每年)或根据需要重复。该方法可以例如，在受试者的治疗性治疗之前、期间和/或之后；在诊断受试者的疾病或障碍之后；作为确定受试者疾病或障碍的诊断的一部分；在确认受试者有发生疾病或障碍的风险后重复；或需要监测各基因组位点ChAP的可能变化的任何其它情况。
本发明的方法可用于测量药物的中靶活性。该方法可在给予药物之前、期间和/或之后实施，以确定药物改变受试者ChAP状态的能力。
本发明的方法可用于监测治疗在患有疾病或障碍的受试者中的有效性。该方法的步骤可以根据需要重复许多次，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50或100次或更多次，以监测治疗的有效性。该方法可以定期(例如，每天、每周、每月、每年)或根据需要重复，例如，直至治疗性治疗结束。该方法可以在例如受试者的治疗性治疗之前、期间和/或之后重复，例如在每次给予治疗之后重复。在一些实施方案中，治疗持续进行，直到本发明的方法显示治疗有效。
本发明的方法可用于基于受试者染色质上ChAP的状态为患有疾病或障碍的受试者选择合适的治疗。该方法可以应用于例如已诊断为患有或疑似患有疾病或障碍的受试者。ChAP状态的确定可以指示ChAP的状态已经过修饰，并且应给予受试者纠正该修饰的治疗。相反，确定ChAP状态未经过修饰将指示治疗预计不会有效，且应避免。
本发明的方法可用于基于受试者染色质上的ChAP状态，确定患有疾病或障碍的受试者的预后。在一些实例中，ChAP指示疾病或障碍的预后。因此，确定已诊断为患有或疑似患有疾病或障碍的受试者的表位ChAP状态可能有助于确定受试者的预后。
本发明的方法可用于基于受试者染色质上ChAP的状态，确定疾病或障碍的生物标志物。在该方法中，病变组织的生物样本可以取自许多具有疾病或障碍并确定ChAP状态的患者。然后可以使用本领域已熟知的分析技术确定ChAP状态与发生、阶段、亚型、预后等之间的相关性。
本发明的方法可用于筛选改变受试者染色质ChAP状态的药剂。
该筛选方法可用于鉴定增加或减少ChAP的表达、水平和/或活性的药剂。在一些实施方案中，检测到的增加或减少具有统计学意义，例如至少p<0.05，例如p<0.01、0.005或0.001。在其他实施方案中，检测到的增加或减少为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
根据本发明可以筛选任何目的化合物。合适的测试化合物包括有机和无机分子。合适的有机分子可以包括但不限于小分子(小于约1000道尔顿的化合物)、多肽(包括酶、抗体和抗体片段)、碳水化合物、脂质、辅酶和核酸分子(包括DNA、RNA及其嵌合体和类似物)以及核苷酸和核苷酸类似物。
此外，可以实施本发明的方法以筛选化合物文库，例如小分子文库、组合的化合物文库、多肽文库、cDNA文库、反义核酸文库等，或化合物的阵列集合，例如多肽和核酸阵列。
可以使用任何合适的筛选测定形式，例如高通量筛选。
该方法也可用于表征已被鉴定为改变染色质ChAP状态的剂的剂。表征，例如临床前表征，可包括例如确定有效浓度、确定有效剂量方案以及测量药代动力学和药效学。
在一些实施方案中，细胞核、细胞器、细胞或组织来自病变组织或样品。在一些实施方案中，细胞核、细胞器、细胞或组织来自非病变组织或样品。在一些实施方案中，细胞核、细胞器、细胞或组织是或来自外周组织或细胞，例如外周血单核细胞。在一些实施方案中，细胞核、细胞器、细胞或组织是或来自培养的细胞，例如原代细胞。
本发明的一个方面涉及测定染色质的ChAP的方法，其中所述改进是在测定中使用本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠作为掺入对照。
本发明的另一方面涉及使用染色质免疫沉淀(ChIP)定量生物样品中的染色质相关蛋白(ChAP)的丰度的方法，该方法包括：
a.分离生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库另外包括一种或更多种ChAP；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠，以创建参考标准品；
d.添加特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；和
f.通过比较其在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP丰度。
本发明的另一方面涉及用于定量生物样品中两种或更多种ChAP的丰度的方法，该方法包括：
a.分离生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含两种或更多种ChAP的核小体；
c.提供本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠，其包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位，以创建参考标准品；
d.添加两种或更多种抗体、适体、纳米抗体或识别剂，其特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中每一种ChAP的量；和
f.通过比较每种ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量每种ChAP的丰度。
本发明的另一方面涉及用于定量来自患有疾病或障碍的受试者的生物样品中的一种或更多种ChAP的丰度的方法，该方法包括：
a.从受试者中分离生物样品；
b.从生物样品中制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；和
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP的丰度。
本发明的另一个方面涉及基于一种或更多种ChAP的绝对定量确定患有疾病或障碍的受试者的预后的方法，该方法包括：
a.分离来自该受试者的生物样品；
b.从该生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；
f.通过比较在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP的丰度；和
g.基于一种或更多种ChAP的绝对丰度确定受试者的预后。
本发明的另一个方面涉及基于一种或更多种ChAP的绝对定量确定疾病或障碍的生物标志物的方法，该方法包括：
a.分离来自受试者的生物样品；
b.从生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种抗体、适体、纳米抗体或识别剂，其特异性结合天然核小体文库和参考标准品的ChAP捕获表位；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP的丰度；和
g.将一种或更多种ChAP的绝对丰度与疾病或障碍相关联；从而确定疾病或障碍的生物标志物。
本发明的另一方面涉及从受试者的生物样品中筛选改变染色质ChAP状态的剂的方法，该方法包括在该剂存在和不存在的情况下确定一种或更多种ChAP的绝对定量，其中确定一种或更多种ChAP的绝对定量包括：
a.分离来自所述受试者的生物样品；
b.从所述生物样品中制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含靶表位中的一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的本发明的核小体、组、多聚核小体、阵列、池或珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP的丰度；
其中存在和不存在该剂的情况下ChAP状态的变化鉴定出改变染色质ChAP状态的剂。
本发明的方法中使用的抗体、适体、纳米抗体或识别剂可以是特异性识别并结合目的ChAP的任何试剂。在一些实施方案中，亲和剂是针对ChAP捕获表位的抗体或抗体片段。抗体或其片段可以是全长免疫球蛋白分子、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv片段、纳米抗体、VHH或最小识别单元。药剂可以是适体或非免疫球蛋白支架，例如亲和抗体、affilin分子、AdNectin、载脂蛋白突变蛋白、DARPin、Knottin、Kunitz型结构域、Avimer、四连接素或透膜抗体(transbody)。在一些实施方案中，该剂是针对ChAP捕获表位的抗体或类似富集试剂。
在一些实施方案中，一种或更多种ChAP的定量由基于亲和剂(例如，抗体或类似富集试剂)的检测测定确定。基于抗体的检测方法的实例包括但不限于ChIP、ELISA、AlphaLISA、AlphaSCREEN、Luminex和免疫印迹。在一些实施方案中，基于抗体的检测测定使用两种不同的抗体用于底物捕获和检测。在一些实施方案中，基于抗体的检测测定使用相同的抗体用于底物捕获和检测。
在本发明的每一种方法中，生物样品可以是可从中分离染色质的任何样品。生物样品可以是例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、前列腺液、乳头抽吸液、泪液、汗液、粪便、颊拭子、脑脊液、细胞裂解物样品、羊水、胃肠液、活检组织、淋巴液或脑脊液。在一些实施方案中，生物样品包括细胞，且染色质是从细胞中分离的。在一些实施方案中，细胞是来自与一种或更多种ChAP的变化相关的疾病或障碍的细胞，例如病变细胞。在一些实施方案中，细胞是来自受与一种或更多种ChAP变化相关的疾病或障碍影响的组织或器官例如病变组织或器官的细胞。细胞可以通过本领域已知的任何方法从病变器官或组织获得，包括但不限于活检、抽吸和手术。在一些实施方案中，细胞是培养的细胞，例如原代细胞。
在其他实施方案中，细胞不是来自受与ChAP变化相关的疾病或障碍影响的组织或器官的细胞。细胞可以是例如充当病变细胞的代表(proxy)的细胞。细胞可以是比病变细胞更容易接近的细胞，例如，无需复杂或痛苦的程序(如活检)即可获得的细胞。合适细胞的实例包括但不限于外周血单核细胞。
在一些实施方案中，生物样品是活组织检查。在其他实施方案中，生物样品是生物流体。在一些实施方案中，生物样品包括外周血单核细胞。在其他实施方案中，生物样品包括循环核小体，例如从死细胞释放的核小体。循环核小体可以是，例如，来自血液或来自疾病或障碍的细胞。在某些实施方案中，生物样品是血浆、尿、唾液、粪便、淋巴液或脑脊液。在一些实施方案中，可以用酶处理生物样品以将染色质消化成单核小体和/或多聚核小体。酶可以是但不限于核酸酶，例如微球菌核酸酶。
受试者可以是需要本发明方法的任何受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，受试者是实验动物，例如小鼠、大鼠、犬或猴，例如疾病的动物模型。在某些实施方案中，受试者可以是已诊断患有或怀疑患有疾病或障碍的受试者。在一些实施方案中，受试者可以是有发展疾病或障碍风险的受试者，例如由于遗传学、家族史、暴露于毒素等。
已经描述了本发明，将在以下实施例中更详细地解释本发明，本文包含这些实施例仅用于说明的目的，并不旨在限制本发明。
实施例
实施例1：使用重组方法生成含有ChAP的核小体
含有ChAP表位的核小体可以使用本领域已知的任何方法生成。下面我们介绍两种方法。第一种，可以使用重组方法直接表达ChAP组蛋白融合蛋白。生成一系列含有常见SPT的核小体(称为“verSaNuc”)，包括3xFLAG、3xTY1和3xHA。对于这些核小体，表达了SPT，其后面是与组蛋白H3融合的GGGGS(SEQ ID NO：8)接头。然后使用250bp的DNA(核小体核心颗粒两侧各约50bp的接头DNA)，将这种修饰的组蛋白整合到重组核小体中。类似的方法可用于其他ChAP片段，如CTCF。第二种，含有ChAP的组蛋白可以通过化学或酶连接将合成肽或重组表达的蛋白质连接起来而生成。
将核小体掺入物工程化为含有与组蛋白H3的N-末端融合的CTCF、BRD4或3xFLAG表位(DYKDDDDK(SEQ ID NO：1))，以在基因组作图测定(如ChIP-seq、CUT&RUN、CUT&Tag)中捕获ChAP或SPT特异性抗体。例如，选择ChAP表位和SPT二者以使用户在抗体选择、富集策略和实验设计方面的灵活性最大化。基于与相关蛋白质(即家族成员；两种蛋白质的C端区域)的低序列同源性并且包含最广泛使用的CTCF或BRD4抗体的靶表位，选择了人CTCF(aa 650-727)和人BRD4(aa 1031-1362)表位区域。为了生成这些核小体，融合组蛋白(例如CTCF-H3)在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化，然后组装成DNA条形码化重组核小体。
DNA条形码化dNuc可以用Widom 601序列(Lowary and Widom 1998)缠绕，该序列被构建为在3’端附近具有嵌入的22bp条形码(由两个链状11bp组成)(Herold,Kurtz etal.2008)设计，类似于用于SNAP-ChIP掺入物的掺入物(例如，EpiCypher K-MetStat；19-1001)。在SNAP-ChIP中，掺入物是在没有“接头”DNA(即147bp)的情况下组装的。为了使dNuc与染色质拴系技术(如CUT&RUN/CUT&Tag)兼容，可对DNA组装序列进行修饰，使其包含一个5’生物素，用于将校准品固定至链霉亲和素包被的磁珠固体支持物。此外，将核小体组装序列(即带有嵌入条形码的601)进行修饰以包括＞20bp的接头DNA(即未缠绕在组蛋白八聚体周围的DNA)，以允许MNase切割并从磁珠中释放校准品。值得注意的是，MNase可以可靠地消化酵母和人类中的15bp接头区域(Cole,Cui等2016)。为了对DNA条形码化核小体进行质量评估，可以将它们固定在珠上并用MNase(消化未被组装的DNA)处理，然后进行qPCR以测量核小体条形码序列。
实施例2：使用酶连接生成含有ChAP的核小体
为了加速核小体的制造，可以使用金黄色葡萄球菌(S.aureus)分选酶A(SrtA)转肽酶将修饰的肽直接连接到完全组装的无尾核小体上(图1A)。该方法提供了两种能力：a)快速开发小批量修饰的核小体(微克与毫克规模，用于标准dNuc组装)；和b)修饰的核小体合成的多路复用。该方法非常适合含ChAP的核小体开发，其对于每次测定需要少量的核小体，但多样性很大以满足市场需求。
在一个实施例中，组装了verSaNuc核小体，其包含：(i)独特的DNA条形码标识符，以及(ii)H3 N-末端的GGGGS(SEQ ID NO：8)基序。接下来，使用编码ChAP表位(或SPT)和C-末端天然分选酶靶基序(LPATG(SEQ ID NO：9)；图1B)的重组蛋白(或合成肽)进行分选酶介导的核小体上连接反应。
使用这种“核小体上”连接方法，针对一组ChAP表位和SPT生成含有ChAP的核小体标准品。这里，ChAP表位集中于BET家族的含溴结构域蛋白，包括BRD2、BRD3和BRD4。为了生成该核小体组，使用了每种蛋白的C-末端片段，因为这在蛋白家族中是不同的，且因此用于抗体开发。然后通过在大肠杆菌(E.coli)中重组表达产生ChAP表位。然后将这些重组蛋白中的每一种连接到含有独特DNA条形码的核小体上。然后可以将这些核小体合并，并掺入ChIP或染色质拴系实验中，并用于抗体特异性测试、测定优化、技术变异性监测或样品标准化。
前述实施例是对本发明的说明，且不应理解为对本发明的限制。尽管已参考优选实施方案详细描述了本发明，但是在如以下权利要求书所述和限定的本发明的范围和精神内存在变化和修改。
参考文献
Bock，I.，A.Dhayalan，S.Kudithipudi，O.Brandt，P.Rathert and A.Jeltsch(2011).″Detailed specificity analysis of antibodies binding to modifiedhistone tails with peptide arrays.″Epigenetics 6(2)：256-263.
Chen，K.，Z.Hu，Z.Xia，D.Zhao，W.Li and J.K.Tyler(2015).″The OverlookedFact：Fundamental Need for Spike-In Control for Virtually All Genome-WideAnalyses.″Mol Cell Biol 36(5)：662-667.
Cole，H.A.，F.Cui，J.Ocampo，T.L.Burke，T.Nikitina，V.Nagarajavel，N.Kotomura，V.B.Zhurkin and D.J.Clark(2016).″Novel nucleosomal particlescontaining core histones and linker DNA but no histone H1.″Nucleic Acids Res44(2)：573-581.
Collas，P.(2010).″The current state of chromatin immunoprecipitation.″Mol Biotechnol 45(1)：87-100.
Dann，G.P.，G.Liszczak，J.D.Bagert，M.M.Muller，U.T.T.Nguyen，F.Wojcik，Z.Z.Brown，J.Bos，T.Panchenko，R.Pihl，S.B.Pollock，K.L.Diehl，C.D.Allis andT.W.Muir(2017).″ISWI chromatin remodellers sense nucleosome modifications todetermine substrate preference.″Nature.
Egan，B.，C.C.Yuan，M.L.Craske，P.Labhart，G.D.Guler，D.Arnott，T.M.Maile，J.Busby，C.Henry，T.K.Kelly，C.A.Tindell，S.Jhunjhunwala，F.Zhao，C.Hatton，B.M.Bryant，M.Classon and P.Trojer(2016).″An Alternative Approach to ChIP-SeqNormalization Enables Detection of Genome-Wide Changes in Histone H3 Lysine27 Trimethylation upon EZH2 Inhibition.″PLoS One 11(11)：e0166438.
Egelhofer，T.A.，A.Minoda，S.Klugman，K.Lee，P.Kolasinska-Zwierz，A.A.Alekseyenko，M.S.Cheung，D.S.Day，S.Gadel，A.A.Gorchakov，T.Gu，P.V.Kharchenko，S.Kuan，I.Latorre，D.Linder-Basso，Y.Luu，Q.Ngo，M.Perry，A.Rechtsteiner，N.C.Riddle，Y.B.Schwartz，G.A.Shanower，A.Vielle，J.Ahringer，S.C.Elgin，M.I.Kuroda，V.Pirrotta，B.Ren，S.Strome，P.J.Park，G.H.Karpen，R.D.Hawkins andJ.D.Lieb(2011).″An assessment of histone-modification antibody quality.″Nat Struct Mol Biol 18(1)：91-93.
Fuchs，S.M.，K.Krajewski，R.W.Baker，V.L.Miller and B.D.Strahl(2011).″Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effectorprotein recognition.″Curr Biol 21(1)：53-58.
Fuchs，S.M.and B.D.Strahl(2011).″Antibody recognition of histone post-translational modifications：emerging issues and future prospects.″Epigenomics3(3)：247-249.
Hattori，T.，J.M.Taft，K.M.Swist，H.Luo，H.Witt，M.Slattery，A.Koide，A.J.Ruthenburg，K.Krajewski，B.D.Strahl，K.P.White，P.J.Famham，Y.Zhao and S.Koide(2013).″Recombinant antibodies to histone post-translational modifications.″Nat Methods 10(10)：992-995.
Herold，J.，S.Kurtz and R.Giegerich(2008).″Efficient computation ofabsent words in genomic sequences.″BMC Bioinformatics 9：167.
Kaya-Okur，H.S.，S.J.Wu，C.A.Codomo，E.S.Pledger，T.D.Bryson，J.G.Henikoff，K.Ahmad and S.Henikoff(2019).″CUT&Tag for efficient epigenomic profiling ofsmall samples and single cells.″Nat Commun 10(1)：1930.
Lowary，P.T.and J.Widom(1998).″New DNA sequence rules for highaffinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosomepositioning.″J Mol Biol 276(1)：19-42.Nakato，R.and K.Shirahige(2017).″Recentadvances in ChIP-seq analysis：from quality management to whole-genomeannotation.″Brief Bioinform 18(2)：279-290.
Nguyen，U.T.，L.Bittova，M.M.Muller，B.Fierz，Y.David，B.Houck-Loomis，V.Feng，G.P.Dann and T.W.Muir(2014).″Accelerated chromatin biochemistry usingDNA-barcoded nucleosome libraries.″Nat Methods 11(8)：834-840.
Nishikori，S.，T.Hattori，S.M.Fuchs，N.Yasui，J.Wojcik，A.Koide，B.D.Strahland S.Koide(2012).″Broad ranges of affinity and specificity of anti-histoneantibodies revealed by a quantitative peptide immunoprecipitation assay.″J Mol Biol 424(5)：391-399.
Orlando，D.A.，M.W.Chen，V.E.Brown，S.Solanki，Y.J.Choi，E.R.Olson，C.C.Fritz，J.E.Bradner and M.G.Guenther(2014).″Quantitative ChIP-Seqnormalization reveals global modulation of the epigenome.″Cell Rep 9(3)：1163-1170.
Rothbart，S.B.，B.M.Dickson，J.R.Raab，A.T.Grzybowski，K.Krajewski，A.H.Guo，E.K.Shanle，S.Z.Josefowicz，S.M.Fuchs，C.D.Allis，T.R.Magnuson，A.J.Ruthenburg and B.D.Strahl(2015).″An Interactive Database for theAssessment of Histone Antibody Specificity.″Mol Cell 59(3)：502-511.
Rothbart，S.B.，S.Lin，L.M.Britton，K.Krajewski，M.C.Keogh，B.A.Garcia andB.D.Strahl(2012).″Poly-acetylated chromatin signatures are preferred epitopesfor site-specific histone H4 acetyl antibodies.″Sci Rep 2：489.
Schmid，M.，T.Durussel and U.K.Laemmli(2004).″ChIC and ChEC；genomicmapping of chromatin proteins.″Mol Cell 16(1)：147-157.
Shah，R.N.，A.T.Grzybowski，E.M.Cornett，A.L.Johnstone，B.M.Dickson，B.A.Boone，M.A.Cheek，M.W.Cowles，D.Maryanski，M.J.Meiners，R.L.Tiedemann，R.M.Vaughan，N.Arora，Z.W.Sun，S.B.Rothbart，M.C.Keogh and A.J.Ruthenburg(2018).″Examining the Roles of H3K4 Methylation States with SystematicallyCharacterized Antibodies.″Mol Cell.
Skene，P.J.，J.G.Henikoff and S.Henikoff(2018).″Targeted in situgenome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.″Nat Protoc13(5)：1006-1019.
Skene，P.J.and S.Henikoff(2017).″An efficient targeted nucleasestrategyfor high-resolution mapping of DNA binding sites.″Elife 6.
序列表
<110> 爱披萨佛公司
M·W·考尔斯
Z-W·孙
M-C·基奥
<120> 染色质相关蛋白的定量作图
<130> 1426-20WO
<150> US 62/806,174
<151> 2019-02-15
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 1
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 2
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 3
His His His His His His
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 4
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 5
Ala Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 6
Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 7
Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工的( Artificial)
<220>
<223> 肽
<400> 9
Leu Pro Ala Thr Gly
1 5

Claims (95)

1.一种核小体，其包括：
a.蛋白质八聚体，其包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个拷贝，以及任选的接头组蛋白H1；
b.DNA分子，其包含：
i.核小体定位序列，
ii.指示染色质相关蛋白(ChAP)捕获表位的DNA条形码；和
c.融合到一个或更多个组蛋白的N端和/或C端或所述DNA分子中的任何位置的ChAP捕获表位。
2.根据权利要求1所述的核小体，其中所述ChAP捕获表位是一个或更多个短肽标签。
3.根据权利要求2所述的核小体，其中所述一个或更多个短肽标签是FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO：1))、HA(YPYDVPDYA(SEQ ID NO：2))、6His(HHHHHH(SEQ ID NO：3))、Myc(EQKLISEEDL(SEQ ID NO：4))、Strep-Ⅰ(AWRHPQFGG(SEQ ID NO：5))、Strep-Ⅱ(NWSHPQFEK(SEQ ID NO：6))、蛋白C(EDQVDPRLIDGK(SEQ ID NO：7))、V5、TY1或GST或所述标签的2、3、4或更多次重复物。
4.根据权利要求1或2所述的核小体，其中所述ChAP捕获表位是抗体结合序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的核小体，其中所述核小体中的每个组蛋白独立地是全合成、半合成或重组的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的核小体，其中所述DNA分子还包括与所述DNA分子连接的结合元件，其中所述结合元件与结合配偶体特异性结合。
7.根据权利6所述的核小体，其中所述DNA分子在所述核小体定位序列和所述结合元件之间包含约10至约80个核苷酸长度的接头。
8.根据权利要求7所述的核小体，其中所述接头为约15至约40个核苷酸的长度。
9.根据权利要求8所述的核小体，其中所述接头为约15至约30个核苷酸的长度。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的核小体，其中所述DNA分子包含核酸酶或转座酶识别序列。
11.根据权利要求10所述的核小体，其中所述核酸酶或转座酶识别序列被核酸内切酶识别。
12.根据权利要求11所述的核小体，其中所述核酸内切酶是微球菌核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、酵母HO核酸内切酶、限制性核酸内切酶或归巢核酸内切酶。
13.根据权利要求12所述的核小体，其中所述识别序列是富含A/T的区域。
14.根据权利要求10所述的核小体，其中所述核酸酶或转座酶识别序列被转座酶识别。
15.根据权利要求14所述的核小体，其中所述转座酶是Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、Mariner、P元件、Tn3、Tn1O、Tn903或以上任何一种的修饰形式。
16.根据权利要求14或15所述的核小体，其中所述识别序列是富含G/C的区域。
17.根据权利要求6-16中任一项所述的核小体，其中所述结合元件及其结合配偶体是生物素与亲和素或链霉亲和素、nano标签与链霉亲和素、谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶、抗原/表位与抗体、聚组氨酸与镍、多核苷酸与互补多核苷酸、适体与其特定靶分子、或Si标签与二氧化硅。
18.根据权利要求6-17中任一项所述的核小体，其中所述结合元件连接到所述DNA分子的5’端。
19.根据权利要求6-17中任一项所述的核小体，其中所述结合元件连接到所述DNA分子的3’端。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的核小体，其中所述DNA条形码具有约6至约50个碱基对的长度。
21.根据权利要求20所述的核小体，其中所述DNA条形码具有约7至约30个碱基对的长度。
22.根据权利要求21所述的核小体，其中所述DNA条形码具有约8至约20个碱基对的长度。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的核小体的组，其中所述组中的核小体包括以一种或更多种浓度在所述组中的ChAP捕获表位，并且每个核小体的DNA条形码指示该核小体在所述组中存在的浓度。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的核小体的组，其中所述组包括至少两种包含不同ChAP捕获表位的核小体。
25.根据权利要求24所述的组，其中包含不同ChAP捕获表位的每种核小体在所述组中以相同浓度存在。
26.根据权利要求24所述的组，其中包含不同ChAP捕获表位的每种核小体在所述组中以多种浓度存在，并且每种核小体的DNA条形码指示所述核小体在所述组中存在的浓度。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的组，其还包括不包含ChAP捕获表位的合成核小体。
28.一种多聚核小体，其包括：
a.蛋白质八聚体，其包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个拷贝，以及任选的接头组蛋白H1；
b.DNA分子，其包含：
i.核小体定位序列，
ii.指示ChAP捕获表位的DNA条形码；和
c.融合到一个或更多个组蛋白的N端和/或C端或所述DNA分子中的任何位置的ChAP捕获表位。
29.根据权利28所述的多聚核小体，其包含2-10个核小体。
30.根据权利要求28或29所述的多聚核小体，其中所述ChAP捕获表位是一个或更多个短肽标签。
31.根据权利要求30所述的多聚核小体，其中所述短肽标签是FLAG(DYKDDDDK(SEQ IDNO：1))、HA(YPYDVPDYA(SEQ ID NO：2))、6His(HHHHHH(SEQ ID NO：3))、Myc(EQKLISEEDL(SEQ ID NO：4))、Strep-Ⅰ(AWRHPQFGG(SEQ ID NO：5))、Strep-Ⅱ(NWSHPQFEK(SEQ ID NO：6))、蛋白C(EDQVDPRLIDGK(SEQ ID NO：7))、V5、TY1或GST或所述标签的2、3、4或更多次重复物。
32.根据权利要求28或29所述的多聚核小体，其中所述ChAP捕获表位是抗体结合序列。
33.根据权利要求28-32中任一项所述的多聚核小体，其中所述多聚核小体中的每个组蛋白独立地是全合成、半合成或重组的。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的多聚核小体，其中所述DNA分子还包括与所述DNA分子连接的结合元件，其中所述结合元件与结合配偶体特异性结合。
35.根据权利34所述的多聚核小体，其中所述DNA分子在所述核小体定位序列和所述结合元件之间包含约10至约80个核苷酸长度的接头。
36.根据权利要求35所述的多聚核小体，其中所述接头为约15至约40个核苷酸的长度。
37.根据权利要求36所述的多聚核小体，其中所述接头为约15至约30个核苷酸的长度。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的多聚核小体，其中所述DNA分子包含核酸酶或转座酶识别序列。
39.根据权利要求38所述的多聚核小体，其中所述核酸酶或转座酶识别序列被核酸内切酶识别。
40.根据权利要求39所述的多聚核小体，其中所述核酸内切酶是微球菌核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰DNA酶I、酵母HO核酸内切酶、限制性核酸内切酶或归巢核酸内切酶。
41.根据权利要求39或40所述的多聚核小体，其中所述识别序列是富含A/T的区域。
42.根据权利要求38所述的多聚核小体，其中所述核酸酶或转座酶识别序列被转座酶识别。
43.根据权利要求42所述的多聚核小体，其中所述转座酶是Tn5、Mu、IS5、IS91、Tn552、Ty1、Tn7、Tn/O、Mariner、P元件、Tn3、Tn1O、Tn903或以上任何一种的修饰形式。
44.根据权利要求42或43所述的多聚核小体，其中所述识别序列是富含G/C的区域。
45.根据权利要求34-44中任一项所述的多聚核小体，其中所述结合元件及其结合配偶体是成对物质例如生物素与亲和素或链霉亲和素、nano标签与链霉亲和素、谷胱甘肽与谷胱甘肽转移酶、抗原/表位与抗体、聚组氨酸与镍、多核苷酸与互补多核苷酸、适体与其特定靶分子、或Si标签与二氧化硅。
46.根据权利要求34-45中任一项所述的多聚核小体，其中所述结合元件连接到所述DNA分子的5’端。
47.根据权利要求34-45中任一项所述的多聚核小体，其中所述结合元件连接到所述DNA分子的3’端。
48.根据权利要求28-47中任一项所述的多聚核小体，其中所述DNA条形码具有约6至约50个碱基对的长度。
49.根据权利要求48所述的多聚核小体，其中所述DNA条形码具有约7至约30个碱基对的长度。
50.根据权利要求49所述的多聚核小体，其中所述DNA条形码具有约8至约20个碱基对的长度。
51.一种包括权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体的阵列。
52.一种根据权利要求51所述的阵列的池，其中每个阵列包含独特的ChAP捕获表位。
53.一种珠，其包括针对权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列或权利要求52所述池的结合元件的结合配偶体，其中所述珠与所述核小体、组、多聚核小体、阵列或池结合。
54.根据权利要求53所述的珠，其为磁珠。
55.一种试剂盒，其包括权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其还包括特异性结合ChAP捕获表位或组蛋白翻译后修饰(PTM)、组蛋白突变、组蛋白变体或DNA转录后修饰的抗体、适体、纳米抗体或其他识别剂。
57.根据权利要求56所述的试剂盒，其还包括与抗体结合蛋白或与结合识别剂的实体连接的核酸酶或转座酶。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述抗体结合蛋白是蛋白A、蛋白G、蛋白A和蛋白G的融合物、蛋白L或蛋白Y。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的试剂盒，其还包括珠，例如磁珠，所述珠包含针对所述结合元件的结合配偶体。
60.一种使用拴系酶进行染色质作图的方法，其中所述改进是在测定中使用权利要求6-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求34-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠作为掺入对照。
61.一种使用拴系酶进行染色质作图的方法，其包括以下步骤：
a)使细胞核、细胞器、细胞或组织结合至固体支持物；
b)透化所述细胞核、细胞器、细胞或组织；
c)使权利要求6-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求34-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池结合至固体支持物；
d)使b)中的透化的细胞核、细胞器、细胞或组织和c)中的被结合的核小体、组、多聚核小体、阵列或池与特异性结合ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂接触；
e)加入与核酸酶或转座酶连接的抗体结合剂、适体结合剂、纳米抗体结合剂或识别剂结合剂；
f)允许核酸酶或转座酶切割或标记所述细胞核、细胞器、细胞或组织中的DNA以及所述核小体、组、多聚核小体、阵列或池中的核酸酶或转座酶识别序列；
g)分离被切割或标记的DNA；和
h)鉴定被切割或标记的DNA；
从而对染色质作图。
62.根据权利要求61所述的方法，其中步骤(e)的所述核酸酶或转座酶是无活性的，且步骤(f)包括激活所述核酸酶或转座酶。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中鉴定被切割的DNA包括对被切割的DNA进行扩增和/或测序。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述测序包括qPCR、下一代测序或Nanostring。
65.根据权利要求61-64中任一项所述的方法，其还包括基于被切割或标记的DNA中DNA条形码的序列来确定所述核小体、组、多聚核小体、阵列或池的身份。
66.根据权利要求61-65中任一项所述的方法，其中所述固体支持物是珠或孔。
67.根据权利要求61-66中任一项所述的方法，其还包括基于用所述核小体、组、多聚核小体、阵列或池检测的结果来优化所述方法。
68.一种检测和定量染色质上ChAP的存在的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
69.一种用于确定和定量患有疾病或障碍的受试者的染色质上的ChAP的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
70.一种监测受试者中染色质上的ChAP随时间变化的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
71.一种测量药物的中靶活性的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
72.一种用于在患有疾病或障碍的受试者中监测治疗有效性的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
73.一种基于受试者中染色质的ChAP状态为患有疾病或障碍的受试者选择合适治疗方案的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
74.一种基于受试者中染色质上的ChAP状态确定患有疾病或障碍的受试者的预后的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
75.一种基于受试者中染色质上的ChAP状态确认疾病或障碍的生物标志物的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
76.一种筛选改变受试者中染色质上的ChAP状态的剂的方法，其包括权利要求61-67中任一项所述的方法。
77.根据权利要求61-76中任一项所述的方法，其中所述细胞核、细胞器、细胞或组织来自疾病组织。
78.根据权利要求61-76中任一项所述的方法，其中所述细胞核、细胞器、细胞或组织来自外周组织，例如外周血单核细胞。
79.一种测定染色质的ChAP的方法，其中所述改进是在测定中使用权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠作为掺入对照。
80.一种使用染色质免疫沉淀(ChIP)定量生物样品中染色质相关蛋白(ChAP)的丰度的方法，所述方法包括：
a.分离生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库另外包括一种或更多种ChAP；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠，以创建参考标准品；
d.添加特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；和
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP丰度。
81.一种用于定量生物样品中两种或更多种ChAP的丰度的方法，所述方法包括：
a.分离生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含两种或更多种核心ChAP表位的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠，以创建对照品；
d.添加两种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中每种ChAP的量；和
f.通过比较每种ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量每种ChAP的丰度。
82.一种用于定量来自受试者的生物样品中的一种或更多种ChAP的丰度的方法，所述方法包括：
a.分离来自受试者的生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包含存在于ChAP中的ChAP捕获表位的权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；和
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP的丰度。
83.一种基于对一种或更多种ChAP的绝对定量确定患有疾病或障碍的受试者的预后的方法，所述方法包括：
a.分离来自所述受试者的生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量靶表位中ChAP的丰度；和
g.基于一种或更多种ChAP的绝对丰度确定所述受试者的预后。
84.一种基于对一种或更多种ChAP的绝对定量来鉴定疾病或障碍的生物标志物的方法，所述方法包括：
a.分离来自受试者的生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品中的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP的丰度；和
g.将所述一种或更多种ChAP的绝对丰度与所述疾病或障碍相关联；从而鉴定所述疾病或障碍的生物标志物。
85.一种从受试者的生物样品中筛选改变染色质上的ChAP状态的剂的方法，所述方法包括在所述剂的存在和不存在的情况下确定一种或更多种ChAP的绝对定量，其中确定所述一种或更多种ChAP的绝对定量包括：
a.分离来自所述受试者的生物样品；
b.从所述生物样品制备天然核小体文库，其中所述文库包括包含靶表位中的一种或更多种ChAP的核小体；
c.提供包括存在于ChAP中的ChAP捕获表位的权利要求1-22中任一项所述的核小体、权利要求23-27中任一项所述的组、权利要求28-50中任一项所述的多聚核小体、权利要求51所述的阵列、权利要求52所述的池或权利要求53或54所述的珠，以创建参考标准品；
d.添加一种或更多种特异性结合天然核小体文库和参考标准品的ChAP捕获表位的抗体、适体、纳米抗体或识别剂；
e.进行基于亲和试剂的测定以测量天然核小体文库和参考标准品中ChAP的量；
f.通过比较ChAP在天然核小体文库中相对于参考标准品中的相对丰度来定量ChAP的丰度；
其中在存在和不存在所述剂的情况下ChAP状态的变化鉴定出改变染色质上ChAP状态的药剂。
86.根据权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括细胞，且所述染色质是从所述细胞中分离的。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述细胞来自与一种或更多种组蛋白翻译后修饰、DNA修饰和/或ChAP的变化相关的疾病或障碍的细胞。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述细胞不是来自与表观遗传修饰和/或ChAP相关的疾病或障碍的细胞。
89.根据权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述生物样品是活检组织。
90.根据权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述生物样品是生物流体。
91.根据权利要求80-85中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括外周血单核细胞。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述生物样品是血浆、尿、唾液、粪便、淋巴液或脑脊液。
93.根据权利要求80-92所述的方法，其中所述受试者是人。
94.根据权利要求80-93中任一项所述的方法，其中所述亲和剂是针对ChAP的抗体或类似的富集试剂。
95.根据权利要求80-94中任一项所述的方法，其中对至少一种或更多种ChAP的定量由基于抗体或类似富集试剂的方法或检测方法来确定。
CN202080026856.XA 2019-02-15 2020-02-14 染色质相关蛋白的定量作图 Pending CN113677712A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962806174P 2019-02-15 2019-02-15
US62/806,174 2019-02-15
PCT/US2020/018216 WO2020168151A2 (en) 2019-02-15 2020-02-14 Quantitative mapping of chromatin associated proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113677712A true CN113677712A (zh) 2021-11-19

Family

ID=72044800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080026856.XA Pending CN113677712A (zh) 2019-02-15 2020-02-14 染色质相关蛋白的定量作图

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220049245A1 (zh)
EP (1) EP3924507A4 (zh)
JP (1) JP2022520616A (zh)
CN (1) CN113677712A (zh)
AU (1) AU2020223318A1 (zh)
CA (1) CA3129907A1 (zh)
WO (1) WO2020168151A2 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202108185D0 (en) * 2021-06-08 2021-07-21 Belgian Volition Sprl Standardisation of nucleosome assays using biologically derived calibrants
WO2023159045A1 (en) * 2022-02-15 2023-08-24 Epicypher, Inc. Engineered recombinant protein-binding domains as detection reagents
WO2024081782A1 (en) * 2022-10-12 2024-04-18 Epicypher, Inc. High efficiency antibodies for chromatin targets

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013184930A2 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 Trustees Of Princeton University Dna barcoding of designer mononucleosome and chromatin array libraries for the profiling of chromatin readers, writers, erasers, and modulators thereof
CN107002289A (zh) * 2014-02-03 2017-08-01 芝加哥大学 用于定量评价dna‑蛋白质复合物密度的组合物和方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018213719A1 (en) * 2017-05-19 2018-11-22 Epicypher, Inc. Assays for nucleosome remodeling activity

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013184930A2 (en) * 2012-06-06 2013-12-12 Trustees Of Princeton University Dna barcoding of designer mononucleosome and chromatin array libraries for the profiling of chromatin readers, writers, erasers, and modulators thereof
CN107002289A (zh) * 2014-02-03 2017-08-01 芝加哥大学 用于定量评价dna‑蛋白质复合物密度的组合物和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GLEN LISZCZAK, ET AL.: "Acetylation blocks DNA damage-induced chromatin ADP-ribosylation", 《NAT CHEM BIOL.》, vol. 14, no. 9, pages 838 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3924507A4 (en) 2022-11-30
CA3129907A1 (en) 2020-08-20
EP3924507A2 (en) 2021-12-22
AU2020223318A1 (en) 2021-09-16
WO2020168151A3 (en) 2020-10-29
WO2020168151A2 (en) 2020-08-20
JP2022520616A (ja) 2022-03-31
US20220049245A1 (en) 2022-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11624083B2 (en) Use of aptamers in proteomics
US5843701A (en) Systematic polypeptide evolution by reverse translation
US20220049245A1 (en) Quantitative mapping of chromatin associated proteins
Kodadek Development of protein-detecting microarrays and related devices
WO1993003172A1 (en) Systematic polypeptide evolution by reverse translation
CN101512016A (zh) 可检测的核酸标签
Broeckx et al. Comparison of multiple protein extraction buffers for GeLC-MS/MS proteomic analysis of liver and colon formalin-fixed, paraffin-embedded tissues
US20230417742A1 (en) Improved assays to detect nucleosome modifications using antibody-targeted enzyme digestion
Ramberger et al. A universal peptide matrix interactomics approach to disclose motif-dependent protein binding
Matsumoto et al. The promise of targeted proteomics for quantitative network biology
US20220073904A1 (en) Devices and methods for display of encoded peptides, polypeptides, and proteins on dna
Brown et al. Direct seminal fluid identification by protease‐free high‐resolution mass spectrometry
US11459598B2 (en) Multiplex DNA immuno-sandwich assay (MDISA)
US20180284114A1 (en) Methods for processing biopolymeric arrays
JP2022515221A (ja) クロマチンマッピングアッセイ用のｄｎａバーコード化ヌクレオソーム
WO2023159045A1 (en) Engineered recombinant protein-binding domains as detection reagents
KR100607901B1 (ko) 분자비콘을 이용한 특정물질의 동정 및 분석방법
WO2024081782A1 (en) High efficiency antibodies for chromatin targets
WO2021152586A1 (en) Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state
JPWO2020168151A5 (zh)
Zürbig et al. Biomarker discovery
Hanash et al. Application of proteomics to disease diagnostics
WO2016191344A1 (en) Broad-spectrum serological diagnostics and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination