CN116577472B - 植物细胞环境蛋白组学分析方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种植物细胞环境蛋白组学分析方法及应用，使用从植物分离的活细胞通过测量蛋白质组的热稳定性，能够有效地分析植物活细胞内蛋白质组水平上的蛋白结合或组装情况，特别是可以用于分析内质网内部的蛋白质翻译、折叠和加工、核糖体蛋白和光系统的成分、蛋白质组装以及基因复制和蛋白质进化等。

Description

植物细胞环境蛋白组学分析方法及应用
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域，具体植物细胞环境蛋白组学分析方法及应用。
背景技术
在生命漫长的进化长河中，各类物种都积累了自身特有的适应环境的特性；与动物不同，植物即使在环境变得极度恶劣时也无法移动，因此具有特异的感受环境、适应气候变化的能力。蛋白质是生命的物质基础，蛋白质组学是以蛋白质为研究对象、研究细胞或生命体蛋白质组成及变化规律的一门学科。近年来，随着质谱学技术的快速发展，蛋白质组学技术也取得了长足进步，能够帮助人类从组学层面挖掘单个或某类蛋白质参与生命过程的机制及规律；然而，截至目前，人类对于植物蛋白组的了解还处于初级阶段，而对于组学层面的植物蛋白组热稳定性特点更是知之甚少。基于此，本发明涉及一种基于质谱学技术的植物蛋白质组学的分析方法，能够实现从组学层面剖析植物的环境热适应特点、挖掘蛋白复合体及探究植物蛋白进化。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
针对现有技术中的至少部分技术问题，本发明使用从植物分离的活细胞通过测量蛋白质组的热稳定性，分析了植物蛋白质组水平的蛋白结合情况，发现本发明的方法能够在蛋白质组水平上有效地分析植物活细胞内蛋白的结合或组装情况，特别是可以用于分析内质网(ER)内部的蛋白质翻译、折叠和加工、核糖体蛋白和光系统的成分、推断蛋白质组装、基因复制和蛋白质进化等。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种植物细胞环境蛋白组学分析方法，其包括以下步骤：
(1) 从植物中分离得到完整细胞，经不同温度的热处理，收集各温度下的可溶性馏分，根据各温度下单个蛋白质的丰度拟合制作热稳定性曲线图谱；
(2) 将所述热稳定性曲线图谱与由所述完整细胞对应的裂解物得到的热稳定性曲线图谱比较；和
(3) 如果热稳定性曲线图谱中两种以上不同蛋白因变性共聚集而使其曲线类似，且在裂解液热稳定性曲线图谱中对应的两种以上不同蛋白各自的曲线不同，则将所述两种以上不同蛋白判断为在细胞环境下存在结合。
在某些实施方案中，根据本发明所述的植物细胞环境蛋白组学分析方法，优选地，步骤(1)包括将完整细胞分为等量的多份，每份分别在梯度温度下热处理，进一步经低温处理，然后裂解细胞，除去细胞碎片和蛋白聚集体，取每份对应的上清液测量蛋白质丰度。
在某些实施方案中，根据本发明所述的植物细胞环境蛋白组学分析方法，优选地，包括使用裂解液处理细胞，所述裂解液包含HEPES、氯化镁、乙基苯基聚乙二醇(NP40)、植物特异性蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
在某些实施方案中，根据本发明所述的植物细胞环境蛋白组学分析方法，优选地，所述裂解液热稳定性曲线图谱的制作包括制备植物细胞裂解物，将裂解物分为等量的多份，梯度温度下热处理每份裂解物，进一步经低温处理，然后去细胞碎片和蛋白聚集体，取每份对应的上清液测量蛋白质丰度。
在某些实施方案中，根据本发明所述的植物细胞环境蛋白组学分析方法，优选地，使用质谱分析测量蛋白质丰度，其中用于质谱分析的样品制备方法包括：用TCEP还原蛋白，然后室温下用氯乙酰胺处理，然后对蛋白质样品进行丙酮沉淀，将蛋白质颗粒重新悬浮在TEAB中，经预消化后，用胰蛋白酶消化，收集上清液中消化的肽进行标记。
在某些实施方案中，根据本发明所述的植物细胞环境蛋白组学分析方法，优选地，两种以上不同蛋白的复合物具有非随机共沉降特征时则将热稳定性曲线判断为类似。
在某些实施方案中，根据本发明所述的植物细胞环境蛋白组学分析方法，优选地，热稳定性曲线图谱中蛋白复合物的Tm值比裂解液热稳定性曲线图谱中对应蛋白的Tm值显著高时，则判断在细胞环境下所述蛋白复合物中的蛋白存在结合。
本发明的第二方面，提供根据本发明第一方面所述的方法在分析植物基因复制、内质网内部蛋白质、核糖体蛋白、光系统的成分、蛋白质组装以及蛋白质进化中的应用。
在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，优选地，植物基因复制分析包括获取旁系同源物的热稳定性数据，并分析热稳定性是否存在显著变化的步骤。
本发明的植物细胞环境蛋白组学分析方法使用从植物分离的活细胞通过测量蛋白质组的热稳定性，能够有效地分析植物活细胞内蛋白质组水平上的蛋白结合或组装情况，特别是可以用于分析内质网内部的蛋白质翻译、折叠和加工、核糖体蛋白和光系统的成分、蛋白质组装以及基因复制和蛋白质进化等。
附图说明
图1 拟南芥蛋白质组在细胞环境中的热稳定性分析。
图2 蛋白质稳态网络分析。
图3 含有朊病毒样结构域(PrD)的蛋白质构成拟南芥蛋白质组的分析。
图4 蛋白质-蛋白质相互作用分析。
图5 弱相互作用分析结果。
图6 参与三羧酸(TCA)循环的酶之间相互作用的分析结果。
图7 拟南芥中旁系同源物的热稳定性分析。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
实施例
一、实验方法
1. 质粒
使用的引物和质粒列于表1中。使用Q5 DNA聚合酶通过PCR扩增野生型拟南芥A.thaliana Col-0 cDNA得到目标基因的全长cDNA。使用TaKaRa MiniBEST DNAPurification试剂盒对片段进行凝胶纯化。使用NEBuilder HiFi DNA组装混合物，将片段与XhoI/BamHI线性化pSAT4A-cEYFP-N1或pSAT4A nEYFP-N1质粒(ABRC)组装在一起。通过测序验证最终的构建体。
表-1
2. 植物生长和单细胞分离
拟南芥Col-0种子在23℃的12小时白天和12小时夜光照周期下生长于0.5XMurashige和Skoog琼脂平板14天。将拟南芥幼苗的地上部分轻轻切碎并迅速转移到直径90毫米装有10ml缓冲液的培养皿中，缓冲液含有400mM甘露醇、20mM氯化钾、20mM MES-KOH、10mM氯化钙、1%纤维素酶R10、0.5% Macerozyme R10和0.1%BSA。将切碎的幼苗在溶液中于28℃下在黑暗中孵育3 小时，同时以40 rpm的速度轻轻摇动。将释放的拟南芥细胞稀释、过滤并用由2 mM MES、154 mM NaCl、125 mM CaCl2和5 mM KCl组成的缓冲液洗涤。通过以200g离心3分钟收集细胞。在彻底去除上清液后，将细胞重悬于含有2 mM HEPES (pH 7.0)、154mM NaCl、125 mM CaCl2和5 mM KCl的缓冲液中。
3. 拟南芥蛋白质的热蛋白质组分析/细胞热转移分析实验
对于使用完整细胞进行分析的实验，将等量的细胞添加到10个PCR管中。使用96孔热循环仪在10个不同温度(23℃、33℃、38℃、43℃、48℃、52℃、56℃、60℃、65℃和70℃)下加热细胞3分钟，然后在4℃下孵育3分钟。通过添加裂解缓冲液和使用液氮进行5轮冻融循环来裂解细胞。裂解缓冲液的最终浓度包含50 mM HEPES (pH7.5)、10 mM MgCl2、0.8%NP40、植物特异性蛋白酶抑制剂(Sigma)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOP EASY, Roche)。使用NP40来提高膜蛋白的提取效率。植物特异性蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按照用户指南添加(https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/sds/sigma/p9599和https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/sds/roche/phoss-ro)。通过在4℃下以20,000g离心30分钟去除因温度刺激而变性的细胞碎片和蛋白质聚集体。然后将得到的上清液用于质谱样品制备。
对于使用细胞裂解物进行的分析实验，首先使用裂解缓冲液制备裂解物。将等量的裂解物加入10个PCR管中，在10个不同的温度(23℃、33℃、38℃、43℃、48℃、52℃、56℃、60℃、65℃和70℃)在96-孔热循环仪中孵育3分钟，然后在4℃孵育3分钟。通过在4℃下以20,000g离心30分钟去除细胞碎片和蛋白质聚集体。然后将所得上清液用于质谱样品制备。
4. 用于定量质谱(MS)分析的样品制备
可溶性蛋白用BCA测定法进行定量。在55℃下用10 mM TCEP还原蛋白质20分钟，然后在室温下用55 mM氯乙酰胺(CAA)处理30分钟。对蛋白质样品进行丙酮沉淀，以去除与随后的MS分析不兼容的物质。将蛋白质颗粒重新悬浮在100 mM TEAB中，在37℃下用LysC(Wako)预消化3小时，然后在37℃下用胰蛋白酶(Promega)消化18小时。通过离心收集上清液中消化的肽，并根据制造商的说明(https://www.thermofisher.cn/document 391connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.cn%2FTFS-Assets%2F LSG%2Fmanuals%2FMAN0016969_2162457_TMT10plex_UG.pdf)用TMT10-plexisobaric标记试剂进行标记。通过1M Tris缓冲液(pH7.4)淬灭标记。然后使用0.1% FA酸化样品，合并，并通过C18 Sep-Pak固相萃取柱(水；洗涤溶剂：0.1% FA；洗脱溶剂：0.1%FA中80%CAN)脱盐。
5. 肽的分样
将脱盐的样品干燥并重新悬浮在5%氢氧化铵溶液(pH10.0)中。在LC-2030C Plus系统 (Shimadzu)上使用高pH反相XBridge Peptide BEH C18柱(3.5 µm，4.6mm × 250mm，Waters)将样品分馏为90个级分。HPLC条件设置如下：
(1) 含有10 mM甲酸铵(pH10)的缓冲液A和含有10 mM甲酸铵(pH10)、80% ACN的缓冲液B；
(2) 流速：0.5毫升/分钟；
(3) 从1到10分钟0-5%的缓冲液B，从10到70分钟5-40%的缓冲液B，从70到110分钟40-80%的缓冲液B，从110到120分钟80%的缓冲液B。收集分级样品并将样品合并为20个级分。在LC-MS/MS分析之前，将每个分馏样品在真空离心机中干燥并重悬于0.1% FA、1% ACN中。
6. LC-MS/MS分析
将肽样品通过Ultimate 3000 RSLC nano System联用Fusion Lumos质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。分析柱为Acclaim PepMap RSLC C18，75 µm×25cm，2 µm，Thermo Scientific，分离方法是使用以下梯度以300 nl/min流速共计75分钟：从0到4分钟2-4%的缓冲液B，从4到8分钟4-8%的缓冲液B，从8到58分钟8-35%的缓冲液B，从58分钟到62分钟35-90%的缓冲液B，从62分钟到67分钟90%的缓冲液B(缓冲液A，0.1% FA；缓冲液B，0.1% FA，80% CAN)。使用以下设置获取MS/MS谱图数据：
(1) MS1采集设置为60,000分辨率，质量范围为300-1500 m/z；
(2) 使用0.7m/z的窗口宽度分离肽段离子；
(3) 分离的前体离子在38%的归一化碰撞能量下被HCD裂解，然后在Orbitrap中以50,000分辨率在从110 m/z开始的动态质量范围内进行分析；
(4) 使用循环时间为3s的Top speed模式，母离子受到60秒的动态排斥。
7. 蛋白质鉴定和定量
使用Proteome Discoverer 2.4软件(Thermo Scientific)按照标准程序对Thermo RAW文件中的拟南芥蛋白质进行定性和定量。拟南芥蛋白组数据库由Uniprot获取(39268个条目，2021年7月19日下载)。MS前体质量公差设置为15 ppm，碎片质量公差设置为0.02Da。对于肽段分配，氨基酸的最小长度为6，最大缺失切割为2。考虑不同类型进行动态修饰，包括氧化(M)、脱酰胺(NQ)和乙酰化(N-末端蛋白)。脲甲基化(C)和TMT10plex(K和肽N末端)被认为是静态修饰。仅使用信噪比值(S/N) > 1.5的峰。在PSM和肽段两个水平上评估错误发现率(FDR)控制：设置为0.01表示高置信度，0.05表示中等置信度，低置信度的置信度被排除在外。共隔离阈值设置为50%，reporter S/N阈值设置为10。
8. 定量MS数据分析和数据可视化
R环境(http://www.R-project.org/)按照先前建立的程序进行(https： //github.com/nkdailingyun/mineCETSA)。在每个数据集中，在不同温度下测量的蛋白质丰度通过同一蛋白质在最低温度下的丰度进行归一化。相对蛋白质丰度大于或仅在三分之一的重复中检测到的蛋白质被排除在下游分析之外。对于归一化，首先，十个温度的中位数medianRawt = (mrt1, ... mrt10)被用于推导出一条S形曲线，该曲线通过R包“drc”拟合了四参数对数逻辑函数(LL.4)(剂量反应曲线分析)。然后，获得十个温度下的拟合原始中位数 medianFitt = 443 (mft1,…mft10)。计算拟合因子medianFitt / medianRawt为以生成拟合偏差。与最低温度相比，比例因子1/mft1被用作所有拟合值的标准化。对于每种蛋白质，十个温度下的相对蛋白质丰度分别拟合为四次函数。为了可靠地计算熔点，R2≥0.8被用作接受参数估计的基本标准，并且仅选择了重复距离平均值不超过Q3+1.5*IQR的蛋白质。然后，生成每个蛋白质的平均熔解曲线，所有重复的相对蛋白质丰度基于PSM的数量进行加权平均，然后是第二轮数据集级别标准化。Tm值是通过使用四次函数和用于数据可视化的“drc”包从加权平均矩阵计算的。
9. GO富集和蛋白质-蛋白质相互作用分析
为了获得蛋白质列表之间的物理和功能相互关系，相应的Uniprot ID由Metascape (https://metascape.org)上传和分析(Zhou等人., 2019)。默认的参数用于Path & Process Enrichment和Protein-protein Interaction Enrichment。MCODE算法用于查找高度互连的子图，以生成PPI网络中的密集连接区域。基因和簇注释由Metascape生成。
10. 热邻近共聚分析
从plant.MAP数据库 (http://plants.proteincomplexes.org/database)下载拟南芥的蛋白质复合物数据集(McWhite等，2020)。删除冗余后，该列表用于搜索测量蛋白质复合物。只有识别出至少三种蛋白质的复合物才被保留用于下游分析。计算蛋白质对之间的欧几里德距离。从BIOGRID数据库(https://thebiogrid.org)中检索相互作用的蛋白质对(Oughtred等人，2019年；Stark等人，2006年)。将相互作用蛋白质之间的欧几里德距离与数据集中所有可能的欧几里德距离相比。复合物的平均距离(表示为Distancecomplex)定义为所有距离的总和除以复合物内成对的数量。为了评估获得比包含n个蛋白质的已知复合物(Distancec)的平均距离相同或更小的值的概率，计算了10,000个随机选择的相同大小n的蛋白质集的平均距离(Distances)和观察到的蛋白质集的经验p值被确定为Distances≤Distancec的随机蛋白质集的频率。p值小于0.05的蛋白质复合物表示存在共沉降特征。
11. 基因复制事件分析
使用先前发布的DupGen_finder软件从拟南芥基因组中搜索基因复制事件(Qiaoet al., 2019)。基因重复分为五类，包括WGD-全基因组复制、TD-串联重复(两个相邻的重复基因)、PD-近端重复(基因重复间隔小于10次)、TRD-转置重复(由祖先和新基因座组成的重复基因)和DSD-分散复制(非相邻或共线重复基因)。
12. 朊病毒样结构域(PrDs)
预测PrDs是由一个名为Prion-Like Amino Acid Composition (PLAAC)的网络应用程序预测的，该应用程序扫描蛋白质序列以寻找由Lindquist实验室开发的可能的朊病毒结构域(Lancaster 等人，2014)。
13. 双分子荧光互补测定(BiFC)
BiFC测定是根据先前制定的方案进行的(Walter等人，2004年)。GAPDH的编码序列被扩增并克隆到pSAT4A-cEYFP-N1中以生成包含编码C末端黄色荧光蛋白(YFP)区域的融合构建体。扩增PGK、TIM和TKL的编码序列并克隆到pSAT4A-nEYFP-N1中，生成包含编码N末端黄色荧光蛋白(YFP)的区域的融合构建体。使用PEG-钙介导的转化将选定的质粒对转化为拟南芥原生质体。16小时后，在Leica SP8激光共聚焦显微镜(Leica Microsystems，Mannheim，Germany)下观测样品。
二、结果
1. 分析从拟南芥中分离的活细胞的热蛋白质组
为了揭示拟南芥蛋白质组在细胞环境中的热稳定性，从两周大的拟南芥幼苗中分离出的完整细胞。首先经过不同温度(从23℃到70℃)的热变性，细胞裂解后通过离心去除热变性蛋白质。收集来自每个温度的剩余可溶性馏分，消化，用TMT标记，合并，并通过液相色谱(LC)-MS/MS进行分析(图1的A)。
最终，测量了6476种拟南芥蛋白在三个生物学重复中的热稳定性。每种蛋白质的独特肽段的平均值在6.56到6.9之间(图1的B)。为了确保数据集的质量，应用了一系列过滤标准。剩下的4085种蛋白质用于后续分析。热稳定性曲线是根据每个温度下单个蛋白质的丰度拟合的，并且计算了Tm值，即50%蛋白质保持可溶时的温度。比较了两个数据集之间单个蛋白质的Tm，发现两者具有高度重现性(图1的C)。图1的D显示了拟南芥蛋白在很宽的温度范围内溶解度的动态变化。
2. 拟南芥中的热敏和耐热蛋白质网络
为了探究拟南芥蛋白质组中热敏感和热耐受蛋白质网络，定义具有最低Tm的10%的蛋白质是热敏蛋白，具有最高Tm的10%的蛋白质被归类为热稳定蛋白。对这些蛋白质进行功能聚类分析，可以揭示富含相应类别的蛋白质网络。
通过本发明的方法发现蛋白质稳态网络是热应激最脆弱的环节之一(图2的A)，几乎包括了参与蛋白质生命周期的每个步骤，从氨酰-tRNA生物合成到mRNA poly-A结合蛋白，从蛋白质翻译起始因子再到蛋白质折叠和降解因子(图2的A和C)。有趣的是，尽管伴侣蛋白的功能是在热应激期间稳定蛋白质，但通过本发明的方法发现三类分子伴侣蛋白--钙网蛋白、钙联接蛋白和Hsp89--都是热敏感的(图2的A和C)。由于钙网蛋白和钙连接蛋白在ER糖蛋白折叠中的关键作用(Helenius和Aebi，2004年；Xu和Ng，2015年)，可以预期ER在热应激下通常会出现功能障碍。此外，还发现26S蛋白酶体AAA-ATP酶的亚基，包括RPT1A、RPT2a、RPT3和RPT6A，以及26S蛋白酶体调节蛋白EMB2107是热敏感的(图2的C)。因此，这些结果表明替代降解途径，即自噬液泡途径，对于在拟南芥中维持热应激下的蛋白质稳态非常重要。事实上，液泡ATP酶的亚基-调节液泡pH值和确保细胞器降解能力的关键因子，是最耐热的蛋白质之一(图2的B)。其他热敏蛋白包括含有肽基-脯氨酰顺式反式异构酶结构域的旋转异构酶亲环蛋白、低聚高尔基复合体的成分和网格蛋白的亚基(图2的A和C)，进一步表明蛋白质折叠和运输是在热压力下受损。
有趣的是，核糖体的成分是最热稳定的蛋白质之一(图2的B)，这与参与蛋白质翻译的其他机制相反。鉴于在大肠杆菌中也有类似的报道(Leuenberger等人，2017年)，因此很容易推测耐热性是核糖体蛋白的一个保守特征，一旦热应激退去，它可以帮助细胞迅速恢复正常翻译。正如预期的那样，我们发现光系统和线粒体脱氢酶的成分是热稳定的(图2的B)，表明它们可能已经适应了能量产生过程中的热耗散。超氧化物歧化酶也是热稳定的，与其在热应激期间消除氧化自由基的作用一致。其他耐热蛋白包括DNA结合蛋白，如组蛋白、液泡ATP酶的亚基和流体转运蛋白(图2的B)。
含有朊病毒样结构域(PrD)的蛋白质构成拟南芥蛋白质组的重要部分(Chakrabortee等人，2016年)。他们的鉴定依赖于识别序列特征的计算算法，与具有良好特征的自我延续的酵母朊病毒具有高度相似性。通过本发明的方法研究收集了所检测到的所有含有PrD的拟南芥蛋白质，并根据排名分数绘制了它们的Tm(图3)。本领域已知如果排名分数越高，则蛋白质的构象受温度升高影响的可能性就越小。通过本发明的研究发现这种相关性在活细胞内部并不存在。例如，尽管poly-A结合蛋白具有非常不同的PrD分数，但Tm非常相似(图3)。产生这种现象的原因不清楚，可能在于这些蛋白质与其他蛋白质的相互作用不同，进而调节它们在体内的热稳定性，并可能调节它们的功能。本研究的结果表明，研究含有PrD的蛋白质的相互作用组可能是了解其功能的关键。
3. 本发明的方法可用于揭示蛋白质-蛋白质相互作用
已知本数据集可用于推断蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，这是因为相互作用的蛋白质倾向于在热变性时共聚集；换句话说，显示出类似的热稳定性曲线(图4的A)。
为了评估本发明方法得到的数据集是否可以捕获PPI，利用现有的数据库，其中包含通过各种方法生成的带注释的PPI信息。欧几里德距离作为反映一对蛋白质相似性的倒数指标。在本研究中测量的具有热稳定性曲线的蛋白质中，从BioGRID数据库中组装了5246个PPI(Oughtred等人，2019年；Stark等人，2006年)。实际上，在已建立的方法例如酵母双杂交测定(Y2H)、亲和纯化-质谱(AP-MS)和共分馏MS (CF-MS)中检测到的蛋白质对之间的相互作用具有比所有蛋白质对更相似的熔解曲线(图4的B)。因此，共沉降特征可用于揭示拟南芥中的PPI。
本发明检测了86个包含至少三个亚基的植物复合体，发现49个蛋白质复合体显示出非随机共沉降特征(p<0.05)。例如，可以容易地检出一些众所周知的蛋白质复合物，如14-3-3蛋白质、胞质伴侣蛋白CCT、叶绿体伴侣蛋白Cpn60、RuBisCo和20S蛋白酶体(图4的C)。
4. 本发明的方法可用于研究弱相互作用的蛋白复合体
已知在细胞内存在大量弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白，其高度依赖于细胞环境。例如Srere最初提出的“代谢笼”概念，其为由连续的通路酶和结构元素组成的大分子复合物，通过这个概念来解释细胞内的高效代谢控制，对于代谢笼存在论述中一个关键点是由极高浓度的蛋白质和代谢物组成的细胞内含物。
已知拟南芥糖酵解的酶之间会形成“代谢笼”(Giege等人，2003年；Graham等人，2007年；Zhang等人，2020年)。通过本发明的方法发现糖酵解酶的热稳定性曲线具有很高的相似性(图5的A和B)。因此进一步证明了这些酶在细胞内作为一个整体发挥作用。相反，在裂解液中，这些糖酵酶的行为更像是随机蛋白质(图5的B)。原因在于裂解物中酶之间相对较弱的相互作用被破坏。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPC)为例，完整细胞中的Tm比裂解物中的Tm高超过20℃，说明酶在不同环境中可能是完全不同的行为(图5的B)。GAPC的热不稳定性表明它们在单独时采用不稳定的构象。已知参与三羧酸(TCA)循环的酶也会形成代谢笼(Zhang等人，2017年)。这些酶的解链曲线在完整细胞中具有更高的相似性，而这些共沉降特征在裂解物中消失(图6)。
本发明的方法还可用于研究由酶和支架蛋白组成的代谢笼。膜类固醇结合蛋白(MSBP1和MSBP2)在木质素生物合成中作为CYP450单加氧酶(C4H、C3ʹH和F5H)组装的结构支架(图5的C)。在没有MSBP1和MSBP2的情况下，这些CYP450被降解，影响木质素沉积(Gou等人，2018)。本发明的方法研究表明，C4H、C3ʹH、F5H和MSBP之间的相互作用在裂解物环境中受损，导致三种 CYP450而非MSBP的热稳定性急剧下降(图5的D)。因此，本发明的方法证明MSBP具有类似伴侣的功能，可通过相互作用稳定其他热不稳定的酶。
先前的研究表明，一些卡尔文-本森循环酶形成酶-酶组装体(Zhang和Fernie，2021)。叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)直接与磷酸核酮激酶 (PRK)相互作用，在此过程中，磷酸核酮激酶在氧化还原调节中起着核心作用(Gurrieri等人，2021年；Yu等人，2020年)。通过本发明得到的共沉降特征表明磷酸甘油酸激酶(PGK)、转酮醇酶(TKL)和丙糖磷酸异构酶(TIM)等酶以细胞环境依赖性方式结合(图5的E和F)。这些体内相互作用进一步通过双分子荧光互补(BiFC)分析得到证实(图5的G)。总而言之，本发明的方法能够用来研究非工程植物中的酶组装。
5. 本发明的方法可用于系统地比较拟南芥中旁系同源物的热稳定性
作为第一个进行全基因组测序的开花植物，拟南芥可以说是研究基因复制的最佳模型植物。拟南芥经历了三轮全基因组复制(WGD)和许多小基因重复，如串联重复(TD)、近端重复(PD)、转座重复(TRD)和分散重复(DSD)(Ganko等人., 2007; 218焦等人, 2011)。然而，目前的研究主要集中在旁系同源基因的选择压力及其表达差异上。关于数百万年进化过程中旁系同源物之间生物物理特性的差异，人们知之甚少。本发明的方法提供了在蛋白质组水平比较拟南芥旁系同源物热稳定性的机会。
总的来说，通过测量226个WGD衍生对、45个TD衍生对、246个TRD衍生对、11个PD衍生对和690个DSD衍生对的热稳定性差异(ΔTm)。正如预期的那样，与随机选择的蛋白质对相比，旁系同源物具有更相似的热稳定性(图7的A)。无论重复模式如何，ΔTm在很大程度上是由旁系同源序列之间的序列相似性决定的(图7的B)。具有较高序列相似性的那些具有更相似的热稳定性。有趣的是，由小基因重复产生的旁系同源物，特别是TRD和DSD衍生对，比WGD衍生对的ΔTm更大，表明来自不同复制模式的旁系同源物经历不同的选择压力塑造它们的进化(图7的A)。
通过GO分析，由空心圆图对参与相似生物过程的旁系同源物进行分组分析(图7的C)。每个实心点代表一对旁系同源物，其中ΔTm由颜色梯度编码。在不同的生物过程中广泛存在热稳定性发生显着变化的旁系同源物(图7的C)。在如毒素代谢过程、对温度刺激的反应和细胞对化学应激的反应中，观察到许多对具有相对较高的ΔTm。活性氧(ROS)的积累是暴露于热胁迫的植物的标志。有趣的是，发现参与氧化还原稳态的多个酶旁系同源物在Tm上有显着变化。例如，叶绿体定位的谷胱甘肽S-转移酶F8 (GSTF8)比其细胞溶质表亲GSTF11更稳定，叶绿体硫氧还蛋白Trxf1与细胞溶质Trxh3相比，线粒体单硫醇谷氧还蛋白GrxS15与细胞溶质GrsS17更稳定。这些结果表明，调节酶的ROS已经进化为适应线粒体和叶绿体环境中的热耗散。此外，ER定位的Hsp70 BiP是一种进化上保守的分子伴侣，参与ER蛋白易位、折叠和降解。它在叶绿体中的DSD衍生对Hsp70-7更热稳定。那些与压力相关的蛋白质的热稳定性变化可能反映了突变保留在一个复制副本中的情况，新功能化可以赋予优势以更好地应对新环境，或者至少不会产生不利影响。相比之下，参与细胞醛代谢过程和光呼吸等过程的旁系同源物对具有非常相似的热稳定性，表明两个拷贝上的选择压力并未放松，并且突变改变了热稳定性蛋白质被消除。
6.本发明方法优势
本发明方法得到的结果提供了对拟南芥热蛋白质组的功能分析，这是其他方法难以获得的。特别是本发明的方法是使用从拟南芥幼苗中分离的活细胞进行的，而不是稀释的植物组织裂解物；因为蛋白的三维内部结构和弱蛋白质-蛋白质或蛋白质-代谢物相互作用在细胞裂解后可能会受到损害。
本发明揭示了受细胞环境影响很大的拟南芥蛋白质组的热稳定性。综合分析发现了拟南芥中的热敏和耐热蛋白质网络。其中，热敏蛋白几乎参与了蛋白质生命周期的每一步，从氨酰-tRNA生物合成和mRNA poly-A结合蛋白，从蛋白质翻译起始因子再到蛋白质折叠和降解因子。相反，核糖体蛋白-蛋白质翻译机制的组成部分-是热稳定性最高的蛋白质之一，推测核糖体的耐热特性可能是进化过程中的一个特性，它可能为生物体更好地从热应激中恢复做好准备。
本发明还系统地测量了含有PrD的蛋白质的热稳定性，其Tm与PrD的排名分数无关。本发明的这种方法在研究植物PPI方面具有一些明显的优势。首先，它反映了细胞环境背景下的PPI。其次，无需通过基因工程将表位，如串联亲和纯化(TAP)标签或绿色荧光蛋白(GFP)等添加到感兴趣的蛋白上，这既费时又可能改变蛋白的表达(在大多数情况下过度表达)和/或它们的整体结构和结合伙伴。本发明的共沉降特征可用于监测细胞内14-3-3家族蛋白在盐、碱、干旱和寒冷等非生物胁迫条件下的动态变化。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (2)

1.一种用于在蛋白组水平分析拟南芥植物细胞环境内代谢笼的方法，其特征在于，所述代谢笼为糖酵解酶之间形成的代谢笼、参与三羧酸循环的酶形成的代谢笼、由酶和支架蛋白组成的代谢笼或卡尔文-本森循环酶形成的酶-酶组装体，所述方法包括以下步骤：
(1) 将拟南芥幼苗切碎并转移到有10ml缓冲液的培养皿中，缓冲液含有400mM甘露醇、20mM氯化钾、20mM MES-KOH、10 mM氯化钙、1%纤维素酶R10、0.5% Macerozyme R10和0.1%BSA，将切碎的幼苗在溶液中于28℃下在黑暗中孵育，同时轻轻摇动，将释放的拟南芥细胞稀释、过滤并用由2 mM MES、154 mM NaCl、125 mM CaCl2和5 mM KCl组成的缓冲液洗涤，收集细胞，去除上清液后，将细胞重悬于含有2 mM HEPES (pH 7.0)、154 mM NaCl、125 mMCaCl2和5 mM KCl的缓冲液，由此从植物中分离得到完整细胞，将完整细胞分为等量的10份，每份分别在23℃、33℃、38℃、43℃、48℃、52℃、56℃、60℃、65℃和70℃的梯度温度下热处理，进一步经低温处理，然后裂解细胞，除去细胞碎片和蛋白聚集体，取每份对应的上清液测量蛋白质丰度，根据各温度下单个蛋白质的丰度拟合制作热稳定性曲线图谱，其中使用裂解液裂解细胞，其包含HEPES、氯化镁、乙基苯基聚乙二醇NP40、植物特异性蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂；
(2) 将所述热稳定性曲线图谱与由所述完整细胞对应的裂解物得到的热稳定性曲线图谱比较，其中，裂解物得到的热稳定性曲线图谱的制作包括制备植物细胞裂解物，将裂解物分为等量的10份，分别在23℃、33℃、38℃、43℃、48℃、52℃、56℃、60℃、65℃和70℃的梯度温度下热处理每份裂解物，进一步经低温处理，然后去细胞碎片和蛋白聚集体，取每份对应的上清液测量蛋白质丰度；和
(3) 如果热稳定性曲线图谱中代谢通路中两种以上不同蛋白的蛋白复合物的Tm值比裂解液稳定性曲线图谱中对应蛋白的Tm值显著高时，则将所述两种以上不同蛋白判断为在细胞环境下存在由连续的通路酶和结构元素组成的大分子复合物，即代谢笼。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用质谱分析测量蛋白质丰度，其中用于质谱分析的样品制备方法包括：用TCEP还原蛋白，然后室温下用氯乙酰胺处理，然后对蛋白质样品进行丙酮沉淀，将蛋白质颗粒重新悬浮在TEAB中，经预消化后，用胰蛋白酶消化，收集上清液中消化的肽进行标记。
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