KR20180023357A - 생체시료 내 특정단백질의 추출법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 바이오커 발굴에 유용하게 사용될 수 있는 생체시료 내 미량 단백질을 추출하기 위한 전처리 방법에 관한 것으로, 구체적으로 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 생체시료 내에 존재하는 주단백질인 알부민(Albumin)과 IgG를 효율적으로 제거하여 특정단백질을 유용하게 추출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 추출법은 기존의 상업적인 키트(ProteExtract™, ProteoPre®)와 대비하여 동등 이상으로 알부민(Albumin)과 IgG를 제거할 수 있으며, 4가지 특정단백질인 비형 나트륨이뇨펩티드(B-type natriuretic peptide, 싸이토크롬 씨(Cytochrome C), 인슐린(Insulin), 유비퀴틴(Ubiquitin)을 효율적으로 추출할 수 있기에, 정상인과 구별되는 저분자량 단백질 마커를 찾아내는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

생체시료 내 특정단백질의 추출법{Extraction method for specific protein in biological material}
본 발명은 생체시료로부터 특정단백질의 추출법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 생체시료 내에 존재하는 주단백질인 알부민(Albumin)과 IgG를 효율적으로 제거하고 특정단백질을 유용하게 추출할 수 있는 방법으로, 생체시료 내에 미량 단백질로 존재하는 바이오 마커 후보군을 발굴하는데 유용하게 적용될 수 있다.
2000년 휴먼 지놈 프로젝트가 시작된 이후로, 펩티도믹스, 프로테오믹스도 지노믹스와 함께 눈부신 기술발전을 이루어왔으나, 아직까지 펩티도믹스, 프로테오믹스를 이용한 진단용 바이오마커, 치료용 타겟의 발굴은 아주 극소수에 불과하다. 오믹스를 이용한 바이오마커, 치료용 타겟의 발굴은 우선 다량 단백질에 의해 미량 단백질이 가려져 분석에서 제외되는 문제를 해결하는 것이 가장 급하고, 두 번째로는 막단백질과 수용성 단백질을 골고루 추출할 수 있는 혈장시료의 전처리 기술의 개발이 필요하고, 세 번째로는 막대한 양의 데이터를 처리하는 문제를 해결하는 것이고, 네 번째는 발굴한 바이오마커 후보군과 치료타겟 후보 단백질의 유의성을 효과적으로 검증하는 시스템의 개발이다.
본 기술에서는 다량 단백질에 의해 미량 단백질이 가려져 분석에서 제외되는 문제를 해결하고자 하며, 막단백질과 수용성 단백질을 골고루 추출할 수 있는 생체 시료의 전처리 기술을 제공하고자 한다.
Mol Cell Proteomics (2003) 2: 1096-1103. Characterization of the Low Molecular Weight Human Serum Proteome. Radhakrishna S. Tirumalai, King C. Chan, DaRue A. Prieto, Haleem J. Issaq et al. Anal Bioanal Chem (2012) 404: 22492258. Multireaction monitoring of 12 peptides for lowered immunity screening. Min-Jung Kang, Hyojeong Han, Oh-Seung Kwon et al. Electrophoresis (2008) 29: 43164323. Quantitative assessment of human serum high-abundance protein depletion. Rene Stempfer, Markus Kubicek, Irene M. Lang et al. J. Proteome Res. (2006) 5:(12) 34463452. A Clean, More Efficient Method for In-Solution Digestion of Protein Mixtures without Detergent or Urea. Sung Chan Kim, Yue Chen, Shama Mirza et al.
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 발명자들은 생체시료에 주단백질인 알부민(Albumin)과, 면역글로불린 G(IgG)를 효율적으로 제거하기 위해 50 ~ 80%의 농도를 갖고 -80℃ ~ -20℃ 온도에서 냉장 보관하여 아세톤 수용액의 온도를 낮춰 만든 -70℃ ~ 0℃인 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 원심분리하고 상층액이나 펠렛을 취하는 경우 종래의 상업적 키트(ProteExtract™, ProteoPre®)와 대비하여 동등 이상으로 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하여 특정단백질을 효과적으로 추출할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 신규 바이오 마커 발굴에 유용하게 사용될 수 있는 생체시료 내 특정단백질의 추출법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 상기 추출법을 이용하여 바이오마커 발굴방법을 제공하는데 있다.
위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심분리하여 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하고 특정단백질을 추출하는 단계를 포함하는 생체시료 내 특정단백질의 추출법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 추출법을 이용하여 바이오마커 발굴방법을 제공한다.
본 발명은 생체시료 특히, 혈장에서 다량 단백질인 알부민과 IgG를 80% 이상 제거할 수 있기에, 정상인과 환자군의 시료에서, 미량 단백질을 혈장으로부터 용이하게 분리할 수 있다. 본 발명을 사용하면, 정상인과 환자군에서 차이가 나게 발현된 미량 단백질을 효과적으로 발굴하여, 신규 바이오마커를 발굴하는데 유용하게 사용할 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 선정한 비형 나트륨이뇨펩티드(B-type natriuretic peptide, 싸이토크롬 씨(Cytochrome C), 인슐린(Insulin), 유비퀴틴(Ubiquitin)의 분자량과 pI를 나타낸 것이다.
도 2(a)는 ProteoExtract kit와 ProteoPrep Kit를 이용하여 알부민과 IgG를 제거하고 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법을 수행한 결과이고, 도 2(b)는 ProteoExtract kit와 ProteoPrep Kit에서 제공되는 단백질 회수용 버퍼 이외의 산성, 중성, 염기성의 용액을 사용하고 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 얻은 결과이며, 도 2(c)는 아세톤 침전법을 이용하여 얻은 펠렛(pellet)과 상층액(supernatant)에 대한 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 얻은 결과이다.
도 3은 단백질 회수용 버퍼를 달리 사용하여 특정단백질을 추출하고 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동을 수행하여 4가지 특정단백질을 분리한 결과이다.
도 4는 트리스-글라이신 겔을 이용한 전기영동법을 수행하여 4가지 특정단백질을 분리한 결과이다.
도 5는 ProteoExtract Kit와 ProteoPrep Kit를 단백질 회수용 버퍼로서 (a) 산성 (pH 1.8), (b) 중성 (pH 5.6), (c) 염기성 (pH 10)을 사용하여 추출한 4가지 특정단백질의 회수율을 나타낸 결과이다.
도 6은 아세톤 침전법을 이용하여 얻은 상층액과 펠렛에 대한 4가지 특정단백질의 회수율을 나타낸 결과이다.
도 7은 측정 조건을 조절하여 LC-MS/MS를 이용한 회수율을 비교한 결과이다.
도 8은 80% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하여 추출한 시료에 대해 LC-MS/MS를 이용하여 회수율을 측정한 결과이다.
도 9는 70% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하여 추출한 시료에 대해 LC-MS/MS를 이용하여 회수율을 측정한 결과이다.
도 10은 ProteoExtract Kit와 ProteoPrep Kit의 상업적 키트와 아세톤 침전법 중에서 회수율이 가장 좋을 때의 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 샘플시료 내 알부민과 IgG의 제거율을 나타낸 것이다.
도 12는 샘플시료 내 인슐린과 비형 나트륨이뇨펩티드의 회수율을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 추출법은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도이며 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심분리하여 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하고 특정단백질을 추출하는 단계를 포함한다. 본 발명에서의 생체시료는 혈장(plasma), 뇨, 객담, 세럼(serum)을 이용할 수 있다.
구체적으로 본 발명에서는 혈장에서 미량 단백질을 추출하고 신규 바이오마커를 발굴하는 전처리 방법을 개발하기 위해 3000　~　13,000 Dalton의 저분자량을 갖고 5 ~ 12 pI를 갖는 특정 단백질로서, 비형 나트륨이뇨펩티드(B-type natriuretic peptide, 싸이토크롬 씨(Cytochrome C), 인슐린(Insulin), 유비퀴틴(Ubiquitin)을 선정하였다. 도 1은 상기 4가지 단백질의 분자량과 pI를 나타낸 것이다.
본 발명에서는 생체시료 내 미량 단백질을 추출하기 위해 -70℃ ~ 0℃ 온도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하여 아세톤 침전법을 이용하여 알부민과 IgG를 효율적으로 제거한다. 더욱 바람직하게는 -70℃ ~ -10℃ 온도의 냉장 아세톤 수용액을 사용한다.
구체적으로 본 발명에서는 50 ~ 60% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 추출한 펠렛(pellet), 또는 70 ~ 90% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 추출한 상층액(Supernatant)에서 상기 4가지 특정단백질을 추출한다.
바람직하게는 50% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액 투입하고 원심분리하여 얻은 침전물인 펠렛(pellet), 또는 70% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액 투입하고 원심분리하여 얻은 상층액(supernatant)에서 상기 4가지 특정단백질을 추출한다.
아울러, 본 발명에서는 원심분리하여 얻은 침전물인 펠렛(pellet)이나 상층액(supernatant)을 취하고 트립신 프로테아제로 분해하고, 분해된 펩타이드 혼합제를 LC-MS/MS를 이용하여 회수율을 분석하고 단백질 동정함으로써 효율적으로 상기 4가지 특정 단백질이 추출되었는지 확인할 수 있다.
구체적으로 액체크로마토그래피로 분리된 검출피크를 고분해능 질량분석기 (LTQ-Orbitrap)를 사용할 수 있으며, Mascot database를 이용하여 상기 4가지 특정단백질을 동정할 수 있다. 아울러, LC-MS/MS를 이용 시 MS/MS scan analyzer의 조건을 FTMS를 Ion Trap으로 바꾸거나, Minimum Signal Threshold를 증가시켜 분석하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 추출법은 종래의 상업적 키트(ProteExtract™, ProteoPre®)와 대비하여 동등 이상으로 주단백질인 알부민과 IgG를 제거할 수 있기에 미량의 단백질 추출하는 것이 효율적이기에, 신규 바이오마커를 발굴하기 위한 시료의 전처리 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 혈장시료 및 재료 준비
정상인 45세 미만의 혼합 혈장시료(25 ~ 45 세 풀링, 남, 녀 혼합)에 다양한 분자량과 pKa 값을 가지는 4가지의 표준물질을 준비하였다. 구체적으로, 상기 4가지 표준물질은 B형 나트륨이뇨펩티드(BNP)는 Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (Burlingame, CA, USA)에서 구입하였고, 인슐린과 유비퀴틴은 Sigam-Aldrich (St.Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 싸이토크롬 씨는 ACROS Organics (NJ, USA)에서 구입하였다.
아울러, 혈장에 존재하는 알부민 (Albumin)과 면역글로불린 G (Immunoglubulin G)를 제거하기 위해서 ProteoExtract™ Albumin / IgG removal kit (EMD bioscience, Darm stadt, Germany)와 ProteoPrep®Immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)를 구입하였다. 또한 아세톤 침전법을 이용하기 위해서 아세톤 (Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea)을 구입하였다.
전기영동장치 (Mini PROTEAN® Tetra Cell)은 Bio-Rad Laboratories, Inc.(Hercules, CA, USA)에서 구입하였다. 폴리아크릴아마이드 겔 제조에 필요한 40 % acrylamide/Bis solution 37.5:1(2.6 % C) (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), Tris (Affymetrix, Inc., Cleveland, Ohio, USA), Sodium Dodecyl Sulfate (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), Ammonium persulfate (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), TEMED (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 구입하였다. 트리스-트라이신 겔 (Mini-PROTEAN®Tris/Tricine Precast Gels), 10X Tris/Tricine/SDS Running Buffer와 Tricine Sample Buffer for Protein Gels를 Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)에서 구입하였다. 단백질 확인을 위한 겔 쿠마시 블루 염색 (InstantBlue™)은 expedeon (Cambridgeshire, UK)에서 구입하였다.
실시예 2. 주단백질 제거 및 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법
2-1. ProteoExtract ™ Albumin / IgG removal kit
실시예 1에서 준비한 혈장 35 μl에 4개의 표준물질을 각각 7 μl씩 주입한 샘플시료를 준비하였다. 첨가된 표준물질의 최종 농도는 B형 나트륨이뇨펩티드(BNP) 200 μg/ml, 인슐린, 유비퀴틴, 그리고 싸이토크롬 씨 400μg/ml 였다. 우선 ProteoExtract™ Albumin / IgG removal kit에서 제공된 binding buffer로 표준물질이 첨가된 샘플시료를 10배 희석한 후, 컬럼에 주입하여 중력으로 흘러내려가게 하였다.
여기에 binding buffer 600 μl씩 2번 주입하여 알부민, 또는 면역글로불린 G의 항체에 결합하지 않은 미량의 단백질들을 씻어서 분리하였다. 두 번 모아진 샘플은 동결건조기를 이용하여 밤새 말린 후, - 80℃ 냉동고에 넣어 보관하였다.
다음으로, 혈장에 존재하는 알부민과 IgG가 얼마나 제거됐는지 확인하기 위해 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법을 수행하였다. 샘플시료를 0.2 % formic acid (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 가 포함된 증류수 (Millipore, Molsheim, France) 35 μl로 녹였다. 12.5 % 분리용 겔과 5 % 스태킹 겔을 만들어 폴리아크릴아마이드 겔을 제조하였다.
샘플 시료는 동일한 양 (20 μg)으로 15 μl씩 로딩하였다. 단백질이 스태킹 겔을 빠져나가기 전까지는 135 V로 20분 동안 전기영동 하였다. 스태킹 겔을 빠져나간 후에는 150 V로 80분 동안 전기영동 하였다. 이후, 겔에 쿠마시 블루 염색 용액을 넣고 상온에서 15분 동안 염색하였다.
2-2. ProteoPrep ® Immunoaffinity Albumin and IgG Depletion Kit
실시예 1에서 준비한 혈장 35 μl에 4개의 표준물질을 각각 7 μl씩 주입한 샘플시료를 준비하였다. 첨가된 표준물질의 최종 농도는 B형 나트륨이뇨펩티드(BNP) 200 μg/ml, 인슐린, 유비퀴틴, 그리고 싸이토크롬 씨 400μg/ml 였다. 샘플시료에 Equilibration buffer 37 μl을 넣어 약 두 배로 (100 μl) 희석하였다. 샘플시료를 컬럼에 주입한 후, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 원심분리기를 통해 8000 g로 1분 동안 원심분리를 하였다. 밑으로 흘러나온 샘플시료를 다시 컬럼에 주입하여 실온에서 10분 동안 배양한 후, 다시 같은 조건으로 원심분리를 하였다. 컬럼에 equilibration buffer 125 μl를 주입하여 원심분리기를 이용하여 알부민과 면역글로불린 G 항체에 결합하지 않은 미량의 단백질을 분리 하였다. 이후, 알부민과 면역글로불린 G가 제거된 샘플시료를 동결건조기를 이용하여 밤새 말려 - 80 ℃ 냉동고에 넣어 보관하였다. 아울러, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 전기영동하여 단백질을 분석하였다.
도 2(a)는 실시예 2-1 및 2-2의 샘플시료를 ProteoExtract kit와 ProteoPrep Kit를 이용하여 알부민과 IgG를 제거하고 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 얻은 결과이며, 도 2(b)는 상기 키트에서 사용하는 단백질 회수용 버퍼를 산성(pH1.8), 중성(pH 7.4), 염기성(pH 10) 용액을 사용하고 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 얻은 결과로서, 알부민과 IgG가 제거되었음을 확인할 수 있었다.
2-3. 아세톤 침전법
농도가 90%, 80%, 70%, 60%, 50%인 아세톤을 만들고 -20℃에 보관한 -10℃ 온도를 갖는 차가운 아세톤 수용액을 준비하였다. 혈장 35 μl에 4개의 표준물질을 각각 7 μl씩 주입한 샘플시료에 아세톤수용약 252 μl씩을 넣어 네 배로 희석하였다. 잘 섞은 후, 샘플 시료를 2시간 동안 얼음에 넣어두었다.
이후, 원심분리기를 이용하여 13000 g, 4℃에서 10분 동안 원심분리를 하였다. 상층액은 따로 분주하였고 펠렛을 아세톤수용액 252 μl로 다시 한 번 세척하여 같은 조건으로 원심분리를 한 후 분리된 상층액을 첫 번째 분주한 상층액과 혼합하여 기체질소 (Sinyang, Seoul, Korea)로 아세톤을 증발 시키고, Freeze-Dryer로 수용액을 밤새 건조하여, 분말상태로 20℃에 분석 시까지 보관하였다.
이렇게 얻은 시료를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 전기영동하여 단백질을 분석하였다.
도 2(c)는 본 발명에 따른 아세톤 침전법을 이용하여 얻은 펠렛(pellet)과 상층액(supernatant)에 대한 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 얻은 결과이다. 70 ~ 90% 농도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 추출한 상층액(Supernatant)과 50 ~ 60% 농도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 추출한 펠렛(pellet)이 알부민과 IgG 제거가 많이 되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 단백질 회수용 버퍼의 최적화
알부민과 IgG의 제거율을 향상시키고 4가지 표준물질을 잘 추출하기 위해, 기존의 상업적 키트에서 사용하는 단백질 회수용 버퍼를 최적화하는 실험을 진행하였다. 구체적으로 ProteoExtract Kit의 경우 키트에 포함된 오리지널 중성 버퍼(pH 7.4)와 염기성 버퍼(pH 10)를 혼합 사용하여 추출하였고, ProteoPrep Kit의 경우에는 오리지널 염기성 버퍼(pH 10.4)와 산성 버퍼(pH 1.8)를 혼합 사용하여 추출하였다. 아울러, 70, 80% 냉장 아세톤을 수용액을 사용하여 원심분리한 상층액과 펠렛을 이용하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법을 수행하였다.
도 3은 단백질 회수용 버퍼를 달리 사용하여 표준물질을 추출하고 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동을 수행하여 4가지 특정단백질을 분리한 결과이다. ProteoExtract Kit의 경우 키트에 포함된 오리지널 중성 버퍼(pH 7.4)와 염기성 버퍼(pH 10)를 혼합 사용한 경우, ProteoPrep Kit의 경우에는 오리지널 염기성 버퍼(pH 10.4)와 산성 버퍼(pH 1.8)를 혼합 사용한 경우, 아세톤 침전법은 70, 80% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용한 경우, 본 발명에서 선정한 상기 4가지 표준물질이 추출됨을 확인할 수 있다.
실시예 4. 트리스 -글라이신 겔을 이용한 전기영동법
작은 분자량을 가지고 있는 본 발명에서 선정한 4가지 표준물질을 확인하기 위해서 트리스-트라이신 겔(16.5 %)을 사용하였다. 실시예 2-3의 70% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 알부민과 IgG가 제거된 상층액인 샘플시료과 50% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 알부민과 IgG가 제거된 펠렛 샘플시료 각각을 0.2 % formic acid (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 가 포함된 증류수 (Millipore, Molsheim, France) 35 μl로 녹였다. 모든 샘플을 동일한 양(30 μg)으로 30 μl씩 로딩 하였다. 전기영동장치에 겔을 넣고 100 V로 100분 동안 전기영동 하였다. 이후, 쿠마시 블루 염색 용액으로 겔을 상온에서 15분 동안 염색하였다.
도 4는 샘플시료 내 트립신 분해가 이루어진 정도를 파악하기 위해서, 저분자량 범위까지 분석이 가능한 트라이신 겔(Tricine Gel)을 사용하여 트립신 분해 전후의 펩타이드 양을 비교 분석한 것으로, 트립신 분해 후, 분해가 되지 않은 오리지널 단백질이 없음을 확인하여, 트립신 분해 농도, 시간을 최적화 하였다. 결과적으로, 1:30의 비율 (트립신:단백질, w/w)로 24시간 분해하는 것이 가장 좋은 결과를 보였다.
실시예 5. LC-MS/MS를 이용한 회수율 측정
LTQ Orbitrap Velos Pro 질량분석기 (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)에 연결된 Ultimate 3000 액체크로마토그래피 (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)을 이용하고, 실시예 2에서 알부민과 IgG가 제거된 샘플시료에 트립신 프로타아제를 넣어 분해된 펩타이드 혼합체를 LC-MS/MS로 분석하기 위해, 용매로 0.2 % formic acid가 포함된 90 % 증류수와 0.2 % formic acid가 포함된 90 % 아세토나이트릴 (J.T Baker, Center Valley, PA, USA)를 사용하였다. 아울러 컬럼-Aeris widepore 3.6 μm XB-C18, 100 x 4.6 mm는 SUNGMOON SYSTECH LTD., CO. (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 시간에 따른 용매조성과 용매속도는 다음 표 1에 나타내었다. 아울러, 4가지 표준물질의 회수율은 혈장시료 내에 존재하는 표준물질 피크의 넓이를 순수한 표준물질의 피크 중 가장 감도가 높은 피크의 넓이로 나눈 값 × 100 (%)으로 계산되었다.
[표 1] LC 분리를 위한 시간에 따른 용매의 조성(%)과 이동속도 (ml/min)
Figure pat00001
다시 말해, 액체크로마토그래피로 분리된 검출피크를 고분해능 질량분석기 (LTQ-Orbitrap)을 통해 분석하였으며, 추출된 표준물질의 피크의 면적(AUC, area under the curve)를 분석하여 첨가한 스탠다드의 오리지널 피크의 면적과 비교하여, 그 회수율을 계산하였다.
도 5는 ProteoExtract Kit와 ProteoPrep Kit를 이용하되 단백질 회수용 버퍼로서 (a) 산성(pH 1.8), (b) 중성(pH 5.6), (c) 염기성(pH 10)을 사용하여 추출하고 4가지 표준물질의 회수율을 나타낸 결과이다. ProteoExtract kit의 경우 pH 10의 염기성 버퍼에서 가장 회수율이 높았고, ProteoPrep Kit를 사용했을 때는 pH 1.8의 강산성에서 회수율이 가장 높음을 알 수 있다. 아울러, 도 6은 아세톤 침전법을 이용하여 얻은 상측액과 펠렛 내 4가지 표준물질의 회수율을 나타낸 결과이다.
실시예 6. 측정 조건에 따른 회수율 변화
도 7과 같이 측정 조건(Data-dependant parameter)을 변화시켜 LC-MS/MS를 이용하여 회수율을 측정하였다. 도 7의 결과, MS/MS scan analyzer를 FTMS에서 Ion Trap으로 바꾸었을 때와 Minimum (Min) Signal Threshold를 증가시켰을 때, 회수율이 증가함을 관찰할 수 있었다.
도 8은 80% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하여 알부민과 IgG를 제거한 샘플시료를 LTQ-Orbitrap 질량분석기로 분석한 후, 4개의 표준물질을 정량분석하고, 측정 조건(Data-dependant parameter)를 변화시켜 가면서 회수율 변화를 분석한 결과이고, 도 9는 70% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하여 알부민과 IgG를 제거한 샘플시료를 LTQ-Orbitrap 질량분석기로 분석한 후, 4개의 표준물질을 정량분석하고, 측정 조건(Data-dependant parameter)를 변화시켜 가면서 회수율 변화를 분석한 결과이다. 이 역시 FTMS를 Ion Trap으로 바꾸었을때와 Minimum (Min) Signal Threshold를 증가시켰을 때, 회수율의 증가가 관찰되었다.
실시예 7. 주단백질의 제거율 및 표준물질의 회수율 비교
실시예 5와 같이 LC-MS/MS를 이용하여 주단백질의 제거율 및 표준물질의 회수율을 측정하여 그 결과를 도 10 내지 도 12에 나타내었다. 도 10은 본 발명에 따른 아세톤 침전법 중에서 가장 좋은 회수율과 상업적인 키트를 사용하여 가장 좋은 회수율을 계산하여 나타낸 결과로서, 아세톤 침전법의 경우 50% 농도를 갖는 냉장 아세톤 수용액 투입하고 원심분리하여 얻은 침전물인 펠렛(pellet)이거나, 70% 농도를 갖는 냉장 아세톤 수용액 투입하고 원심분리하여 얻은 상층액(supernatant)에서 4가지 표준물질에 대해 가장 우수한 회수율을 나타내었다.
아울러, 도 11은 샘플시료 내 알부민과 IgG의 제거율을 나타낸 것으로, 70% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하면 상층액에서 거의 100% Albumin과 IgG가 제거되고, 50% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하면 펠렛에서 약 20% 정도의 알부민, 약 40% 정도의 IgG가 남아 있는 수준임을 알 수 있었다. 본 발명에 따른 아세톤 침전법은 약 80% 제거율을 보이는 상업적인 키트와 대비하여 동등 이상의 효과를 나타내고 있음을 알 수 있다.
또한 도 12는 상업적인 키트를 사용하거나, 70% 농도의 냉장 아세톤 수용액, 50% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용하였을 때, 샘플시료 내 인슐린과 비형 나트륨이뇨펩티드의 회수율을 분석한 결과이다. 70% 농도의 냉장 아세톤 수용액을 사용한 경우 인슐린을 거의 100% 수거하였으며, 50% 농도의 냉장 아세톤 수용액으로 비형 나트륨이뇨펩티드 약 70%를 회수하였고, 이는 상업적인 키트인 ProteExtract™와 유사하거나 ProteoPre® 보다 우수한 결과를 갖음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 추출법은 생체시료 내 알부민과 IgG 제거에 효율적이고 미량의 특정단백질을 효과적으로 추출할 수 있기에 신규 바이오마커 발굴에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심분리하여 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하고 특정단백질을 추출하는 단계를 포함하는 생체시료 내 특정단백질의 추출법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 특정단백질은 3000　~　13,000 dalton의 저분자량을 갖고 5 ~ 12 PI를 갖는 단백질로서, 비형 나트륨이뇨펩티드(B-type natriuretic peptide, 싸이토크롬 씨(Cytochrome C), 인슐린(Insulin), 유비퀴틴(Ubiquitin)인 것을 특징으로 하는 생체시료 내 특정단백질의 추출법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 특정단백질은 50 ~ 60% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 추출한 펠렛(pellet), 또는 70 ~ 90% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 추출한 상층액(Supernatant)에서 수득하는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 특정단백질의 추출법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 특정단백질은 50% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액 투입하고 원심분리하여 얻은 침전물인 펠렛(pellet), 또는 70% 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액 투입하고 원심분리하여 얻은 상층액(supernatant)에서 수득하는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 특정단백질의 추출법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 특정단백질은 바이오 마커 후보군이 되는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체시료 내 특정단백질의 추출법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 생체시료는 혈장(plasma), 뇨, 객담, 세럼(serum)인 것을 특징으로 하는 생체시료 내 특정단백질의 추출법.
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