KR20140031489A

KR20140031489A - 쥐손이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20140031489A
Application number: KR1020120097031A
Authority: KR
Inventors: 이복희
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-09-03
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2014-03-13
Also published as: KR101501806B1

Abstract

본 발명은 쥐손이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과를 나타내는 쥐손이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 약제학적 조성물을 제공한다. 쥐손이풀 추출물은 폴리페놀, 플라보노이드, DPPH 소거능 측정을 통해 항산화 활성이 있음을 확인하고, 생체 내(in vivo)와 시험관 내(in vitro) 실험 및 세포독성평가를 실시하여 탈모 또는 발모에 탁월한 효과가 있음을 나타냈다.

Description

쥐손이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물{Composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising extract of Geranium sibiricum L}

본 발명은 쥐손이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

탈모(alopecia)는 비정상적으로 머리카락이 많이 빠져 정상적으로 모발이 존재해야 할 부위에 모발이 없는 상태로 머리숱이 적어지거나 부분적으로 많이 빠져 대머리가 되는 것을 말한다. 현대인의 탈모는 노화나 유전적 요인뿐 아니라 각종 환경오염, 업무의 스트레스, 식생활 변화에 따른 호르몬 분비의 이상 등 후천적 요인의 영향이 증가하고 있다. 우리나라의 경우 탈모를 경험한 사람은 700만 명을 넘어섰고, 실제 탈모증 인구는 약 8만 명 이상으로 추산되고 있다. 이처럼 탈모인구의 증가로 탈모 시장은 급팽창하고 있으며 탈모 관련 산업은 성장기에 들어섰다. 또한 최근 보고에 따르면 여러 환경적, 심리적 요인으로 인해 20세 이상의 남성 중 80% 정도가 탈모로 고민하고 있으며 20~30대 젊은 층의 탈모 환자들이 크게 증가하고 여성 및 초등학생에 이르는 탈모 환자도 점차 늘어나고 있는 등 남녀노소를 불문하고 연령층도 점차 낮아지면서 탈모증이 나타나고 있는 추세이다.

기존의 탈모 치료제로 사용되어 왔던 약물에는 FDA의 승인을 받은 미녹시딜(minoxidil)과 피나스테리드(finasteride)가 있다. 이 두 약물은 사용 시 다양한 부작용을 나타내는데 미녹시딜(minoxidil)의 경우 체중 증가, 부종, 심장 박동 증가, 협심증, 피부염, 가려움증이 나타나고 피나스테리드(finasteride)의 경우에는 남성의 성기능 장애, 기형아 출산 등의 심각한 부작용을 일으키는 것으로 보고되고 있다. 이에 따라 부작용이 적은 천연물질로 구성된 탈모 치료제제의 개발이 매우 필요한 상황이다.

모낭은 매우 작고 독특한 기관으로 면역 특권을 갖는다. 모낭은 성장기, 퇴화기, 휴지기의 주기를 갖는데 모낭의 면역 특권이 무너져 면역작용이 일어나게 되면 염증 반응이 발생하게 되면서 주기가 퇴화기로 이전되어 탈모가 발생하게 된다.

플라보노이드(flavonoid)는 폴리페놀의 일종으로 3개의 고리구조를 기본구조로 하는 생리활성 물질이다. 여러 연구에서 밝혀진바 플라보노이드(flavonoid)는 세포의 면역과 항염증 작용에 효과가 있는 것으로 밝혀졌고, 항산화 및 항균 효과를 나타낼 뿐만 아니라 심혈관계 질환, 뇌혈관계질환, 암, 및 당뇨 등 다양한 만성질환에서도 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

쥐손이풀(Gerinium sibiricum L)은 쥐손이풀(Geraniaceae)과에 속하는 식물로 중국, 일본, 한국 그리고 유럽의 몇몇 국가에 널리 분포되어 있다. 한국과 불가리아에서는 설사, 장염, 세균 감염, 암 등을 치료하는데 사용되어 왔으며, 실험 결과 높은 항산화능을 나타냈고, 쥐손이풀 추출물이 항염증 작용을 하여 사람의 비만세포에서 염증관련 인자들을 감소시킨다는 연구결과가 있다. 이러한 효과들은 쥐손이풀에 다량 함유된 플라보노이드(flavonoid)에 의한 것으로 해석되며 실제로 생물학적, 약리학적으로 여러 가지 기능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 점들을 종합해 볼 때 높은 플라보노이드(flavonoid) 함량을 띄는 쥐손이풀은 항염증, 항산화 및 항균 작용 등에 의해 모낭의 면역 특권 붕괴로 발생하는 염증작용을 방지할 것으로 기대된다.

한편, 한국공개특허 제10-2002-0009929호는 쥐손이풀(Geranium), 금잔화(Calendula) 및 질경이(Plantago) 추출물과 자하거 가수분해물을 포함하는 항암제, 특히 간암 치료 및 예방용 의약 조성물에 관한 것으로, 각 성분들을 단독으로 사용한 경우에 비해 월등히 우수한 상승적 간암 치료 효과를 제공할 뿐만 아니라 기존의 항암 치료제 투여시 불가피하게 나타나는 부작용이 거의 없는 신규의 간암 치료 및 예방용 의약 조성물이라고 개시하고 있으나, 탈모 방지 또는 발모 촉진에 대한 언급은 없다.

본 발명의 목적은 쥐손이풀(Geranium sibiricum L) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과를 나타내는 쥐손이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 쥐손이풀의 다양한 활성을 토대로 쥐손이풀 추출물이 인체 발모에 미치는 영향을 검토하기 위해 폴리페놀(polyphenol), 플라보노이드(flavonoid), DPPH 소거능을 통한 항산화능을 측정하였으며, 생체 내(in vivo)와 시험관 내(in vitro) 실험 및 세포독성평가를 실시하여 쥐손이풀 소재의 발모 및 탈모 치료제로서의 이용가능성을 평가하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 쥐손이풀(Geranium sibiricum L) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 쥐손이풀 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 쥐손이풀 추출물을 0.1 내지 50 중량부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물에서 선택된 다양한 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등으로 제형화 될 수 있다. 한편, 상기 약학적 조성물은 상기 쥐손이풀 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 탈모의 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물에서 사용되는 쥐손이풀 추출물은 천연물로서, 독성 및 부작용이 거의 없어 예방 목적으로 장기간 투여 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 쥐손이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 쥐손이풀 추출물은 높은 플라보노이드 함량을 가지므로, 항염증, 항산화 및 항균 작용 등에 의해 모낭의 면역 특권 붕괴로 발생하는 염증작용을 방지할 것으로 기대된다. 따라서, 이를 통해 쥐손이풀 추출물의 탈모 방지 또는 발모 촉진 효과를 밝혀내고, 발모 및 탈모 치료제로서 활용가능성을 확인하였다.

도 1은 세포독성 시험 결과, 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L)의 생존율을 나타낸다.
도 2는 발모 효과를 비교하여 알아보기 위해서, 털이 제거된 C57BL/6 마우스에 용매(DMSO), 20mg/20ml/DMSO 농도의 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 및 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD)을 처리한 직후의 사진이다.
도 3은 발모 효과를 비교하여 알아보기 위해서, 털이 제거된 C57BL/6 마우스에 용매(DMSO), 20mg/20ml/DMSO 농도의 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 및 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD)을 처리하고 1주일 후의 사진이다.
도 4는 발모 효과를 비교하여 알아보기 위해서, 털이 제거된 C57BL/6 마우스에 용매(DMSO), 20mg/20ml/DMSO 농도의 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 및 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD)을 처리하고 2주일 후의 사진이다.
도 5는 발모 효과를 비교하여 알아보기 위해서, 털이 제거된 C57BL/6 마우스에 용매(DMSO), 20mg/20ml/DMSO 농도의 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 및 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD)을 처리하고 3주일 후의 사진이다.
도 6은 용매(DMSO), 20mg/20ml/DMSO 농도의 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 및 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD)을 처리하고 3주일 후, C57BL/6 마우스에서 H&E 염색을 통해 모낭의 형태와 깊이를 관찰한 결과이다.
도 7은 용매(DMSO), 20mg/20ml/DMSO 농도의 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 및 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD)을 처리하고 3주일 후, C57BL/6 마우스에서 비만세포를 관찰한 결과이다.
도 8은 용매(DMSO), 20mg/20ml/DMSO 농도의 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 및 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD)을 처리하고 3주일 후, C57BL/6 마우스에서 줄기세포 인자(stem cell factor; SCF) 항원의 면역조직화학분석(immunohistochemistry) 결과를 나타낸다.
도 9는 DMSO, MXD 및 GSE을 각각 처리하고 3주일 후, RT-PCR을 통한 케라틴세포 성장 인자(keratinocyte growth factor; KGF)의 상대정량 값을 나타낸다.
도 10은 DMSO, MXD 및 GSE을 각각 처리하고 3주일 후, RT-PCR을 통한 인슐린 유사 성장 인자-1(insulin like growth factor-1; IGF-1)의 상대정량 값을 나타낸다.
도 11은 DMSO, MXD 및 GSE을 각각 처리하고 3주일 후, 실시간 PCR(real time PCR)을 통한 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)의 상대정량 값을 나타낸다.
도 12는 DMSO, MXD 및 GSE을 각각 처리하고 3주일 후, 실시간 PCR(real time PCR)을 통한 형질전환 성장 인자 β1(transforming growth factor-β1; TGF-β1)의 상대정량 값을 나타낸다(a, b, c p< 0.05 vs each groups).
도 13은 DMSO, MXD 및 GSE을 각각 처리하고 3주일 후, 실시간 PCR(real time PCR)을 통한 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor; HGF)의 상대정량 값을 나타낸다(a, b, c p< 0.05 vs each groups).

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 쥐손이풀 추출물 제조

한국식물추출물은행에서 증류수(Distilled Water; D.W.) 추출된 시료를 구입하여 사용하였다. 시료 20 mg에 50% 메탄올(Methanol; MeOH) 10mL을 가하여 24 시간 동안 37℃에서 추출한 후 0.2㎛ 시린지 필터(Syringe filter; PALL, Life Sciences)로 여과하였다. 여과한 시료를 각각 2,000 및 4,000배 희석하여 빛을 차단한 후 냉장보관하였다.

< 실시예 2> 쥐손이풀 추출물의 항산화능 측정

1. 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 폴린-데니스(Folin-Denis)법을 약간 변형하여 측정하였다. 50% MeOH 쥐손이풀 추출물의 2,000배 희석액을 각각 0.5 mL씩 준비하고 여기에 폴린-데니스 시약(Folin-Denis reagent; Fluka, Switzerland)을 0.5 mL씩 가한 후 혼합하고 3분간 실온에 방치하였다. 정확히 3분 후 10% 소듐 카보네이트 용액(sodium carbonate solution; Samchun, Korea)를 가하여 혼합한 후 1시간 방치하였고, 그 후 상징액을 취하여 UV-VIS 분광광도계(spectrophotometer; 7315, JENWAY, Bibby Scientific Ltd, UK)로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 타닉산(tannic acid; Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd, Japan)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 폴리페놀 함량을 구하였다. 타닉산(tannic acid) 표준곡선은 70% 메탄올 10 mL에 타닉산(tannic acid) 0.01g을 녹이고 최종 농도가 0.1%, 0.05%, 0.025%, 0.0125%, 0.00625%가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 760 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.

2. 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해 50% MeOH로 추출하여 2000배 희석한 시료를 각각 0.5 mL 준비하고 여기에 디에틸렌 글리콜(diethylene glycol; Junsei Chemicals, Japan)을 5 mL씩 가하여 혼합하였다. 그 후 1N NaOH (Duksan Pure Chemicals, Korea)를 0.5 mL 가하여 다시 한번 잘 혼합한 후, 37℃ 수조(water bath)에서 1시간 방치하였다. 정확히 1시간 후 UV-VIS 분광광도계(spectrophotometer; 7315, JENWAY, Bibby Scientific Ltd, UK)로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 값은 나린진(naringin; Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd, Japan)을 이용하여 표준검량곡선을 작성하였다. 나린진(naringin) 0.01 g에 99.8% EtOH 10 mL을 가하여 0.1%를 만든 후에 0.05%, 0.025%, 0.0125%로 반씩 희석하여 위와 같은 방법으로 420 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이를 이용하여 시료의 흡광도를 % 나린진 당량(naringin equivalent)으로 환산하였다.

3. DPPH 라디칼 소거능 측정(전자공여능 측정)

전자공여능의 측정을 위해 시료를 50% 메탄올에 25 mg/100 ㎖ 농도가 되도록 희석했다. DPPH 시약은 빛을 차단한 상태에서 0.1 mM 농도가 되도록 에탄올에 녹여 준비하였다. 시료 0.5 ㎖과 DPPH 시약 3 ㎖를 넣고 20분 동안 빛을 차단하고 반응시킨 후 분광광도계(spectrophotometer; 7315, JENWAY, Bibby Scientific Ltd, UK)로 517 nm에서 흡광도를 다음과 같은 식을 이용해 전자공여능(electron donating ability; EDA, %) 값으로 산출하였다.

전자공여능(EDA, %) = [(Blank 흡광도 - 시료 흡광도) / Blank 흡광도] × 100

4. 결과

쥐손이풀 추출물의 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 전자공여능 측정 결과는 표 1과 같다. 쥐손이풀 추출물의 총 폴리페놀 함량은 305.86±13.29 mg/g으로 나타났는데, 다른 연구결과를 살펴보면 하수오의 폴리페놀 함량은 6.5±1.1 mg/g, 산수유는 35.25±0.08 mg/g 및 인삼은 3.97±0.01 mg/g의 값을 보인 것과 비교하여(Korean J Food Sci Technol. (2004) 36(2):333-338), 쥐손이풀 추출물의 총 폴리페놀 함량이 상기 식물 추출물과 비교했을 때 매우 높은 것으로 나타났다. 총 플라보노이드의 함량은 104.44±2.72 mg/g의 값을 보였다. 쥐손이풀의 전자공여능 측정 결과, 25mg/100ml 농도에서 76.55±0.11%로 나타났는데, 이는 선행연구결과와 비교하여 높은 값을 나타냈다.

쥐손이풀 추출물의 총 폴리페놀 함량

품명	총 폴리페놀 (mg/추출물 무게, g)	총 플라보노이드 (mg/추출물 무게, g)	전자공여능(%) (25mg/100ml)
쥐손이풀	305.86±13.29	107.44±2.72	76.55±0.11

< 실시예 3> 시험관 내( in vitro ) 시험

1. 세포독성 시험(CCK-8 분석)

세포독성을 확인하는 데에는 CCK-8(Cell Counting Kit, Sigma, USA) 분석을 사용하였다. 96-웰 플레이트에 웰당 5000개의 세포가 들어가도록 HFDPC(Promocell, Germany)를 분주한 뒤 24시간 동안 37 ℃의 배양기(5%, CO₂)에서 전-배양(pre-incubaiton) 시킨다. 다양한 농도로 희석한 추출물을 각 웰당 10 ㎕씩 분주한다. 추출물 분주 후 24시간 동안 동일한 조건에서 배양한 뒤 37 ℃의 온도로 맞춰진 CCK-8시약을 각 웰당 10 ㎕씩 분주한다. 1시간에서 4시간 사이에 배양 후 육안으로 대조군과의 발색 차이가 가장 클 때를 택하여 450 nm(시험 파장; test wavelength), 650 nm(참조 파장; reference wavelength)에서 흡광도를 측정한다.

2. 결과

쥐손이풀의 세포독성 시험 결과는 도 1과 같다. 양성대조군인 미녹시딜(minoxidil)의 경우 1.86%로 가장 낮은 생존율(survival rate; %)를 보였고 쥐손이풀의 경우 낮은 농도에서는 오히려 음성대조군인 배지보다 높은 생존율(survival rate; %)인 117.30%를 나타내었다. 쥐손이풀의 농도가 높아질수록 세포에 나타내는 독성이 커져 세포 생존율은 감소하였다(도 1). 이러한 결과는 맥문동을 이용하여 만든 맥문동탕의 세포 독성을 실험한 선행연구와 비교했을 때(Kor J Herbology (2009) 24(3): 161-167), 맥문동탕의 경우 25 ㎍/㎕의 낮은 농도에서도 세포 생존율이 100%를 넘기지 못한 반면 쥐손이풀의 경우 1,250 ㎍/㎕의 농도에서 세포 생존율 100%를 넘겨 세포 독성이 매우 낮은 것으로 확인되었다.

< 실시예 4> 생체 내( in vivo ) 시험

1. 실험동물 및 처치

4주령 수컷 C57BL/6 마우스를 ㈜중앙실험동물로부터 구입하여 사육실에서 2주간 적응기간을 거친 후 일반증상을 관찰하여 휴지기인 6주째에 실험을 실시하였다. 실험군은 총 4개 군[실험군: 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 도포군, 양성대조군(PC): 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD) 도포군, 용매대조군(VC): 용매(DMSO)도포군]으로 나누어 3주간 경피 도포하였다. 실험기간 중의 실험동물은 케이지당 2마리씩 수용하고 사육실 환경조건은 실내온도 22±3℃, 상대습도 55±10%, 조명시간 12시간(오전 7시-오후 7시)으로 조절하였으며, 물과 사료는 자유로이 섭취하도록 하였다. 실험동물 처치는 실험 3주째 날에 CO₂ 마취 후 피부를 적출하고 즉시 액체질소에 동결 시킨 후 초저온 냉동고(deep freezer)에 냉동 보관하여 사용하였다.

2. 시료조제 및 도포

한국식물추출물은행에서 증류수(Distilled Water; D.W.)로 추출된 시료 20 mg에 DMSO 1mL을 가하여 24시간 동안 37℃에서 추출한 후 0.2㎛ 시린지 필터(syringe filter; PALL, Life Sciences)로 여과하였다. 여과한 시료를 1,000배 희석하여 빛을 차단한 후 냉장 보관하여 사용하였다.

발모의 효과를 관찰하기 위해 동물용 전기제모기를 이용하여 실험시작 1일 전 마우스(mouse)의 등부위 털을 제거하였고, 시료는 1일 1회, 주 6회, 매 회 200 ㎕씩 피펫(pipette)을 이용하여 3주간 경피도포 하였다. 양성대조군으로 5% 미녹시딜(minoxidil; Hyundai Pharm. Co., Ltd, Korea)을 사용하였고 정상군은 DMSO를 사용하였다.

3. 육안적 관찰

실험 시작 후 털이 자라난 상태를 육안적으로 관찰하기 위해 실험기간 동안 4회(0, 7, 14, 21일)에 걸쳐 에테르로 마취한 후 사진촬영 하였다. 각 군의 모발성장 효과는 각각의 동물을 육안적으로 판정하였다.

4. 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin and Eosin; H&E) 염색 후 광학현미경적 관찰

실험개시 후 3주째 최종일에 실험물질 도포 부위를 적출한 후 포르말린(formalin)으로 고정하였고, 일반적인 조직처리 과정에 따라 단계별로 수세, 알콜(alcohol)과 자일렌(xylene)으로 탈수시킨 후 파라핀에 포매하였다. 마이크로톰(Leica RM 2145, Germany)을 이용하여 3 ㎛의 조직절편을 만들고 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA)으로 염색하여 100배율 광학현미경(Leica light microscope, Leica DM 500, Germany)으로 모낭의 형태를 관찰하였고, 진피의 두께와 모낭 깊이의 변화는 현미경 프로그램의 스케일 바(scale bar)를 이용하여 측정하였다.

5. 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색 후 광학현미경적 관찰

조직 절편은 H&E 염색법과 같은 방식으로 제작하였고, 일반적인 처리 단계에 따라 알콜(alcohol)과 자일렌(xylene)으로 탈수과정을 거친 후 톨루이딘 블루(toluidine blue; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA)로 2분간 염색하고 바이올렛(violet)으로 염색된 진피 및 피하층 내 비만세포의 수를 200 배율 광학현미경으로 계수하였다.

6. 줄기세포 인자(Stem cell factor; SCF)

모발 성장과 관련된 사이토카인(cytokine)을 관찰하기 위하여 줄기세포 인자(stem cell factor; SCF)를 1:50으로 희석한 1차 항체를 조직절편에 떨어뜨려 실온에서 12시간 동안 반응시켰다. 이때 1차 항체의 희석은 0.1M PBTS에 1% 정상 염소 혈청(normal goat serum; Vector Laboratories Ins., USA)을 섞어 사용하였다. 그 후 조직절편들은 실온에서 5분간 3회 0.1M PBTS로 수세과정을 거친 후 3% H₂O₂를 각 조직에 분주하고 5분방치 후 PBTS에 10분간 방치하였다. 2차 항체는 0.1M PBTS에 다중클론성 염소 항-마우스 면역글로불린 HRP(Polyclonal Goat Anti-Mouse Immunoglobulins HRP; D-2600, DAKO, Denmark)를 1:50으로 제작하여 조직에 분주하고 37℃에서 1시간 방치하였고, 그 후 PBTS에 5분간 3회 수세하였다. 3-3' 디아미노벤지딘(3-3' diaminobenzidine; Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 0.1M PBS에 녹인 용액에서 각각의 조직을 반응시키고 헤마톡실린(hematoxylin; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA)으로 20초간 대조염색 한 후 통상적인 방법에 따라 탈수와 투명화를 거친 후 봉입하여 광학현미경으로 모낭, 비만세포 및 진피에 염색된 정도를 관찰하였다.

7. 결과

각 군별 육안적 관찰에서 특별한 이상 증상이 관찰된 개체는 없었으나, 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD) 도포군과 DMSO 도포군 각 2개체와 1개체에서 피부 상흔이 관찰되었다. 이 증상은 개체 간 접촉으로 인한 것으로 실험 1주째에는 상처가 아물어 실험 결과에 영향을 끼치지 않은 것으로 사료된다. 각 군별로 제모 후 도포 7일째부터 피부가 푸른색으로 변하기 시작하였으며 솜털이 자라는 것이 관찰되었다(도 2). 용매(DMSO) 도포군과 5% 미녹시딜(minoxidil; MXD) 도포군 및 쥐손이풀 추출물(Gerinium sibiricum L extracts, GSE) 도포군에서 유의적으로 큰 차이가 나타나지는 않았으나 GSE 도포군의 개체에서 부분적으로 다발 형상의 발모 진행이 관찰되었다. 이러한 경향은 도포 10일째까지 관찰되었으며 실험 3주째에는 모든 군에서 발모효과가 나타났다(도 4).

한편, 도포 후 3주가 경과한 마우스(mouse) 조직의 H&E 염색을 통해 모낭의 형태와 깊이를 관찰한 결과, GSE군이 다른 군에 비해 우수한 결과를 나타냈다(도 6). 100배율 광학현미경(Leica light microscope, Leica DM 500, Germany)의 현미경 프로그램인 스케일 바(scale bar)를 이용하여 모낭의 깊이를 측정한 결과 DMSO군이 472.67±333.55 ㎛로 나타났고, MXD(5% minoxidil)군에서 423±199.52 ㎛로 두개의 군에서 비슷한 결과를 보였다. 한편 GSE(Gerinium sibiricum L extracts)군은 615.33±123.23 ㎛로 DMSO군, MXD군과 비교하여 유의하게 높은 결과를 나타냈다(표 2). 이를 통해 실험군의 모낭 깊이는 용매대조군과 양성대조군에 비교했을 때 가장 높은 결과를 보였으며, 육안으로 확인한 형태적 관찰에서도 실험군의 진피와 모낭이 다른 두 군에 비해 매우 튼튼하게 형성된 것을 관찰할 수 있었다(도 6).

도포 후 3주 경과 후 C57BL/6 마우스에서의 모낭 깊이 측정

주차	DMSO	MXD	GSE
3	472.67±333.55 ㎛	423±199.52 ㎛	615.00±123.23 ㎛

또한, 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색을 통해 도포 3주차의 각 군 마우스(mouse) 조직에 있는 비만세포를 관찰한 결과는 도 7과 같다. 광학현미경(Leica light microscope, Leica DM 500, Germany)을 이용하여 200 배율로 비만세포를 관찰하였을 때 DMSO군 및 MXD군에서 모낭 주위에 푸른색으로 염색된 비만세포가 나타난데 반해 GSE군에서는 조직은 관찰되었으나 비만세포는 유의하게 낮은 분포를 나타냈다.

마지막으로, 면역조직염색법에 의한 줄기세포 인자(stem cell factor; SCF)의 발현은 모낭, 비만세포 및 진피층 부위에서 나타났다(도 8). 100 배율 광학현미경(Leica light microscope, Leica DM 500, Germany)을 이용하여 각 군을 관찰한 결과, SCF에 대한 면역 반응은 DMSO군 및 MXD군의 경우 진피층과 모낭에서 중등도의 면역반응을 나타냈고, 비만세포에서 미약한 반응을 나타냈다. 반면 GSE군에서는 모낭과 비만세포, 피지선 및 비만세포에서 강한 면역반응을 나타냄을 관찰하였다.

< 실시예 5> 사이토카인 분석

1. RT-PCR

C57BL/6 마우스의 해부한 등 조직 50 mg에서 RNA를 추출하여 PCR 기기(PTC-150 MB, MJ Research, USA)을 이용하여 역전사(reverse transcription) 과정을 거친다. 합성된 cDNA를 이용하여 PCR을 진행한다. 하우스키핑(Housekeeping) 유전자로 사용되는 GAPDH[forward primer: TGC ACC ACC AAC TGC TTAG(서열번호 1), reverse primer: GGA TGC AGG GAT GAT GTTC(서열번호 2)]의 프라이머 세트와 분석 지표인 IGF-1[forward primer: AGA GAC CCT TTG CGG GGC TGA(서열번호 3), reverse primer: CTT CTG AGT CTT GGG CAT GT(서열번호 4)], KGF[forward primer: AGG GTG AGA AGA CTG TTC TG(서열번호 5), reverse primer: CTT TCC ACC CCT TTG ATT GC(서열번호 6)]의 프라이머 세트를 Bioneer(Korea)에서 100 pmmol의 농도로 주문한 뒤 12.5 pmmol로 희석하여 사용하였다. PCR 결과물을 전기 영동한 다음 gell doc XR(UV transilluminator, Bio-Rad, USA)으로 이미지를 수치화하여 사용하였다.

2. 실시간 PCR(real-time PCR)

C57BL/6 마우스의 해부한 등 조직 50 mg에서 추출한 RNA를 PCR 기기를 이용하여 cDNA를 합성한 뒤 실시간 PCR(real-time PCR; Thermo Fisher Scientific Inc, TCR00096, USA) 과정[변성(denaturation), 15 s at 95 ℃; 결합(annealing), 15 s at 60 ℃; 및 연장(extension), 40 s at 72 ℃]을 진행한다. VeriQuest사의 SYBR green을 master mix로 사용하여 진행하였다. 하우스키핑(Housekeeping) 유전자로 사용되는 GAPDH[forward primer: TGT GAT GGG TGT GAA CCA CGA GAA(서열번호 7), reverse primer: GGA TGC AGG GAT GAT GTTC(서열번호 8)]의 프라이머 세트와 분석 지표인 VEGF[forward primer: TGC TTA TAG GCT GTT GTG GGC TCT(서열번호 9), reverse primer: ACA CAC CTT GAC TCT TCA CCT GCT(서열번호 10)], TGF-β1[forward primer: ATG GCA GCG ACC ATA CTC CTC TTT(서열번호 11), reverse primer: AAA GAC AGC CAC TCA GGC GTA TCA(서열번호 12)], HGF[(forward: TTG AGA CCA GCC AGA GGT GAA CAA(서열번호 13), reverse: TTG TTC ACC TCT GGC TGG TCT CAA(서열번호 14)]의 프라이머 세트를 Bioneer(Korea)에서 100 pmmol의 농도로 주문한 뒤 10 pmmol로 희석하여 사용하였다.

3. 결과

케라틴세포 성장 인자(keratinocyte growth factor; KGF)와 인슐린 유사 성장 인자-1(insulin like growth factor-1; IGF-1)은 모발의 성장을 촉진하는 사이토카인으로 RT-PCR을 이용해 분석하였다. 각 사이토카인의 상대정량 값은 도 9 및 도 10과 같다. KGF의 분석에서는 DMSO군과 미녹시딜(minoxidil)군, 그리고 GSE군의 상대정량 값에서 유의적 차이를 확인할 수 없었다. 그러나 IGF-1의 분석에서는 세 그룹에서 모두 유의적 차이를 확인할 수 있었는데 음성 대조군인 DMSO군에서 가장 높은 값이 나왔으며 미녹시딜(minoxidil)군에서 가장 낮은 상대정량 값을 보였다. 미녹시딜(minoxidil)은 현재 시판되고 있는 탈모 치료제로써 양성 대조군으로 사용되었기 때문에 IGF-1의 발현정도에서 GSE군이 현저하게 높은 발현량을 보인 것은 의미가 있다.

한편, 모발 성장 관련 유전자인 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 형질전환 성장 인자 β1(transforming growth factor-β1; TGF-β1), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor; HGF)를 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 상대정량 하였다. VEGF와 HGF는 모발 성장 촉진 인자로 작용하며 TGF-β1은 모발성장 억제 인자로 작용한다. 각 유전자의 상대정량 값은 아래 도 11, 12 및 13과 같다.

VEGF의 경우 대조군인 DMSO 그룹과 양성 대조군인 미녹시딜(minoxidil) 그룹, GSE 그룹 사이에서 유의적 차이를 관찰할 수 없었다. 그러나 억제인자인 TGF-β1의 발현양에서는 GSE 그룹에서 가장 낮은 수치를 관찰할 수 있었으며, 미녹시딜(minoxidil) 그룹에서 TGF-β1이 가장 많이 발현된 것을 볼 수 있었다. TGF-β1의 경우 3가지 실험 그룹에서 모두 유의적 차이를 나타냈으며 TGF-β1의 발현양은 GSE, DMSO, 미녹시딜(minoxidil) 그룹 순으로 많은 것으로 나타났다. VEGF와 같이 모발성장 촉진 인자로 작용하는 HGF의 경우에는 미녹시딜(minoxidil) 그룹에서 가장 높게 나타났으며 GSE 그룹에서 가장 낮은 발현 양을 보였다. HGF의 경우 역시 세 가지 그룹 모두 유의적 차이를 보였으며 발현양은 미녹시딜(minoxidil), DMSO, GSE 그룹 순으로 높은 것으로 분석되었다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising extract of Geranium sibiricum L <130> DP-2012-0545 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(forward primer) <400> 1 tgcaccacca actgcttag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(reverse primer) <400> 2 ggatgcaggg atgatgttc 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1(forward primer) <400> 3 agagaccctt tgcggggctg a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1(reverse primer) <400> 4 cttctgagtc ttgggcatgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF(forward primer) <400> 5 agggtgagaa gactgttctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF(reverse primer) <400> 6 ctttccaccc ctttgattgc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(forward primer) <400> 7 tgtgatgggt gtgaaccacg agaa 24 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH(reverse primer) <400> 8 ggatgcaggg atgatgttc 19 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF(forward primer) <400> 9 tgcttatagg ctgttgtggg ctct 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF(reverse primer) <400> 10 acacaccttg actcttcacc tgct 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta1(forward primer) <400> 11 atggcagcga ccatactcct cttt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta1(reverse primer) <400> 12 aaagacagcc actcaggcgt atca 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF(forward primer) <400> 13 ttgagaccag ccagaggtga acaa 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF(reverse primer) <400> 14 ttgttcacct ctggctggtc tcaa 24

Claims

쥐손이풀(Gerinium sibiricum L) 추출물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 쥐손이풀 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 쥐손이풀 추출물을 0.1 내지 50 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.