KR20140021789A - 프로바이오틱스 유산균을 활용한 발효유 제조방법 - Google Patents
프로바이오틱스 유산균을 활용한 발효유 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 및 그 제조방법에 관한 것으로, 원유를 이용한 발효유 제조방법에 있어서, 프로바이오틱스 유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 및 ABT-5 유산균을 동시에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 제조방법을 개시한다.
Description
본 발명은 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 및 그 제조방법에 관한 것으로, 원유를 이용한 발효유 제조방법에 있어서, 프로바이오틱스 유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 및 ABT-5 유산균을 동시에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 제조방법에 관한 것이다.
현재 건강과 장수에 대한 관심증가로 인해 소비자들의 건강기능성 소재나 제품에 대한 수요가 많아지고 있는 실정이며, 연구가 이루어지고 있는 기능성 분야도 매우 다양화되고 있는 추세인데, 그중 면역활성 증진 소재 발굴 및 제품 개발 연구도 한 부분을 차지하고 있다.
발효 유제품은 최근 신세대 식품문화 서구화에 힘입어 소비증대 탄력성이 높고 새로운 미래 식량으로 자리잡아 가고 있다. 하지만 최근 한미 및 한EU간 FTA 체결로 인하여 국내 낙농산업에 미치는 영향을 보면 국산 원유가격이 국제 가격보다 2~3배 높고, 이로 인해 유제품의 제조원가도 수입 유제품 가격보다 2배 이상 높아지기 때문에 많은 영향을 받을 것으로 전망하고 있다.
따라서, FTA 대비 국산 발효유제품의 제품 경쟁력을 위해서는 기능성, 원가 절감, 소비자 기호성 부응으로 극복해야 한다.
현재 프로바이오틱스 유산균은 건강을 추구하는 현대인에게 성인병 관련 질병 예방 및 치료 측면에서 각광을 받고 있다. 프로바이오틱스란 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 미생물을 말한다. 프로바이오틱스로 이용되는 미생물의 현재까지 알려진 유형을 보면 유산균이 Lactobacillus , Leuconostoc , Pediococcus , Streptococcus, Bifidobacterium 속으로 프로바이오틱스 미생물중 가장 높은 비율을 차지하고 있고, 효모 Saccharomyces , Tornlopsis 속, 곰팡이 Aspergillus 속, 세균 Bacillus , Clostridium 속 등이 프로바이오틱스 효과가 있다고 보고되어 있다.
프로바이오틱 유산균은 면역 증강능을 비롯해 병원성 세균 억제능, 콜레스테롤 저하능, 항돌연변이원성 및 항암 효과가 있는 것으로 보고되어 있다. 또한 감염증 치료 및 예방, 소화기능 증진, 항콜레스테롤 작용, 항암작용, 숙주 면역기능자극, 질 감염증 억제, 항알레르기 작용, 비타민 섭취 증진, 변비예방 등에 다양한 효능이 있는 것으로 밝혀지고 있는 실정이다.
이에 따라 본 연구를 통하여 면역기능을 가지는 프로바이오틱스를 이용한 기능성 발효유를 개발하여 유가공 분야의 저변 확대를 도모하고, 유가공 업체의 경쟁력을 향상시킬 수 있는 토대를 마련하고자 하는데 그 목적이 있다.
유럽과 일본에서는 L. rhumnosus GG (Valio, Finland), L. casei Shirota (Yakult, Japan) 등의 유산균을 분리하여 우수한 기능을 가진 프로바이오틱스로 개발하였으며, L. brevis, L. reuteri, L. sali - varius, L. gallinarum 등의 균주를 대상으로 다양한 기능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 국내에서도 마찬가지로 김치 등의 발효식품, 동물, 인체 유래 균주를 분리하여 프로바이오틱스로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행 중이며, 기능성 유제품 개발 또한 연구가 이루어지고 있는 실정이다.
2008년 프로바이오틱스(probiotics) 시장은 159억 달러로 2013년까지 196억 달러로 연평균 4.3% 성장이 예상되고 있다. 이 중 일본이 전 세계 프로바이오틱스 시장의 39.5%를 점유하고 있으며 위궤양 원인균 감소 요구르트, 충치균 억제 유산균 첨가 과자, 알러지 감소 음료 등을 개발하였다. 유럽, 일본 등 선진국에서는 유전자 재조합에 의한 기능성 강화 프로바이오틱 유산균를 이용한 식품 개발 및 의학적 적용을 집중적으로 추진 중에 있고, 특히 유럽은 프로바이오틱스와 항산화제가 기능성식품 시장을 주도하고 있으며 90년대부터 60여 개 연구소가 참여, 프로바이오틱스 유산균을 집중 연구하는 프로젝트를 진행 중에 있다. 이렇게 프로바이오틱스 시장이 점차 커지고 있는 실정에 맞춰 본 연구팀 또한 프로바이오틱스 제품 개발을 통해 시장 경쟁력을 갖추고자 한다.
종래에 기능성 재료를 함유한 발효유가 개발되었는바, 등록특허공보 제10-064139호에는 칡 추출물을 이용한 소플라본이 강화된 기능성 칡 유산균 발효유의 제조방법이 개시되어 있고, 공개특허공보 제10-2010-0137918호에는 인삼 분말을 이용한 식초분해 인삼을 활용한 기능성 발효유 제조방법이 개시되어 있으며, 공개특허공보 제10-2007-0109185호에는 브로콜리 새싹추출물을 이용하여 헬리코박터 파이로리균 저해능을 가진 유산균 발효유의 제조방법이 개시되어 있고, 공개특허공보 제10-2007-0087786호에는 흰털오가피 추출물을 함유하는 발효유 및 그 제조방법이 개시되어 있다.
본 발명은 프로바이오틱스 유산균의 면역활성 효과를 측정하고, 이를 유산균 발효유에 적용하여 면역활성 기능성 유제품을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 유가공 분야의 저변 확대를 도모하고, 유가공 업체의 경쟁력을 향상시킬 수 있는 토대를 마련하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 제조방법은 발효유 제조방법에 있어서, 프로바이오틱스 유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 및 ABT-5 유산균을 동시에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서 접종되는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5 유산균의 첨가량은 원유 100중량부에 대하여 0.01중량부인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서 상기 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5는 혼합비율은 중량비로 0.3~0.7 대 0.7~0.3인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 프로바이오틱스 유산균을 활용하여 산면역활성 증진 발효유를 제공할 수 있다는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 가공 분야의 저변 확대를 도모하고, 유가공 업체의 경쟁력을 향상시킬 수 있다는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 면역력 약화로 인한 다양한 질병에 노출된 현대인에게 면역활성 증진 발효유를 이용하여 편리하고 부담 없는 소비로 면역력 증진을 기대할 수 있다는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 본 발명에 따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 첨가한 발효유 제조공정.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액에 대한 RAW 264.7 세포의 증식 정도를 알아본 결과를 나타낸 그래프.
도 3은 배양액의 농도변화에 따른 RAW 264.7 세포의 형태 변경 사진.
도 4는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 RAW 264.7 세포에 배양액을 0~2.5 mg/mL의 농도로 처리하여 2시간 미리 반응시킨 후 LPS 1 ug/mL의 농도로 24시간 더 자극하여 농도에 따른 NO의 생성량을 측정한 결과 그래프.
도 5a 내지 5c는 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 의하여 염증성사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)이 생성되는 과정에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의 효과를 ELISA법으로 확인한 결과.
도 6은 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 RAW 264.7 세포에서 heme oxygenase-1의 발현에 관여하는지 확인하기 위해 배양액을 농도별(0~2.5 mg/mL)로 처리하여 heme oxygenase-1의 발현 여부를 ELISA법으로 측정한 결과.
도 7은 도 7은 RAW 264.7 세포에서 농도의존적으로 heme oxygenase-1의 발현을 유도함으로써 NO 및 염증성사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 생성 억제 모델.
도 8은 본 발명에 따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 첨가한 발효유의 발효과정에서의 pH 변화를 나타낸 그래프.
도 9는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 발효 중 총산 함량 측정 결과.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액에 대한 RAW 264.7 세포의 증식 정도를 알아본 결과를 나타낸 그래프.
도 3은 배양액의 농도변화에 따른 RAW 264.7 세포의 형태 변경 사진.
도 4는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 RAW 264.7 세포에 배양액을 0~2.5 mg/mL의 농도로 처리하여 2시간 미리 반응시킨 후 LPS 1 ug/mL의 농도로 24시간 더 자극하여 농도에 따른 NO의 생성량을 측정한 결과 그래프.
도 5a 내지 5c는 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 의하여 염증성사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)이 생성되는 과정에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의 효과를 ELISA법으로 확인한 결과.
도 6은 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 RAW 264.7 세포에서 heme oxygenase-1의 발현에 관여하는지 확인하기 위해 배양액을 농도별(0~2.5 mg/mL)로 처리하여 heme oxygenase-1의 발현 여부를 ELISA법으로 측정한 결과.
도 7은 도 7은 RAW 264.7 세포에서 농도의존적으로 heme oxygenase-1의 발현을 유도함으로써 NO 및 염증성사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 생성 억제 모델.
도 8은 본 발명에 따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 첨가한 발효유의 발효과정에서의 pH 변화를 나타낸 그래프.
도 9는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 발효 중 총산 함량 측정 결과.
본 발명은 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 제조방법에 관한 것으로, 원유에 프로바이오틱스 유산균과 ABT-5를 혼합 첨가하여 발효시켜 제조되는 발효유 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발효유의 제조는 원유 100중량부에 대하여 정백당 5중량부와 탈지유 3중량부를 혼합(Mixing)하여 95℃, 5분간 살균 후 43℃로 냉각한 다음 프로바이오틱스 유산균인 Probacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 널리 사용되고 있는 상용균주인 ABT-5(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus, Chr. Hansen, Denmark) 균주를 각각 0.1g:0g, 0.03g:0.07g, 0.05g:0.05g, 0.07g:0.03g 및 0g:0.1g 비율로 0.01%(0.1g/kg)씩을 접종하여 37℃~ 43℃에서 5시간 배양하여 제조하였다. 이후 15~20℃까지 냉각하고 4℃에서 보관한다.
본 발명에 따른 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 개발이라는 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서의 개발 범위는 다음과 같다.
1. 프로바이오틱스 유산균 배양액 면역활성 평가(in - vitro)
(1) Nitric acid 생성 억제능을 측정한다.
(2) 염증성 사이토카인 생성 억제능을 측정한다.
(3) Heme oxygenase-1의 발현여부를 측정한다.
2. 프로바이오틱스 유산균을 첨가한 발효유의 최적 제조 조건 확립
(1) 상업적 균주 ABT-5와 프로바이오틱스 유산균의 혼합비율에 따른 발효유를 제조한다.
(2) 혼합비율에 따른 발효유의 최적 제조 조건을 확립한다.
3. 프로바이오틱스 유산균을 첨가한 발효유의 품질 분석
(1) 혼합 비율에 따른 발효유의 pH, 적정산도, 점도 등을 측정하여 품질특성을 확인한다.
(2) 혼합 비율에 따른 발효유의 유산균수를 측정하여 프로바이오틱스 유산균의 배양 상태를 확인한다.
4. 발효유의 영양 성분 분석 및 기준규격 검사
(1) 발효유의 영양성분을 분석한다.
(2) 발효유의 기준규격 검사를 실시한다.
5. 발효유의 관능평가
(1) 발효유에 대한 관능평가를 실시한다.
본 발명에 따른 면역활성 증진 발효유 개발에 사용한 프로바이오틱스 유산균은 전남대학교 동물자원학과에서 분리한 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 사용하였고(특허 제10-0979917호), 상업용 균주는 ABT-5(Lactobacillus acidophilus , Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus , Chr. Hansen, Denmark)를 사용하였다. 발효유 제조에 사용된 우유는 임실지역 목장형 유가공업체에서 착유한 우유를 사용하였으며, 면역 활성 효과 측정에 사용된 재료로는 HO-1 발현은 EIAab (China), 염증성 사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 발현은 R&D system (USA) ELISA kit를 각각 구입하여 정량에 사용하였다. 세포배양에 사용된 RPMI 1640 배지, FBS와 PrestoBlueTM cell viability reagent는 Gibco (USA), NO 측정을 위한 Griss reagent system은 Promega (USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 발명에 사용되는 Lactobacillus sp YH는 특허 제10-0979917호에 개시된 미생물 수탁번호 KCCM 10887P로 기탁된 미생물이며. 그 상세한 내용은 특허 제10-0979917호의 특허공보에 기재되어 있다.
본 발명을 위하여 연구진행의 개요는 다음과 같다.
1. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 면역 활성 증진 효능 평가
가. 배양액 조제
프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액 조제는 5 mL MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 정치하면서 전배양하였다. 100 mL MRS 액체 배지에 1%의 전배양액을 접종하고 37℃에서 24시간 동안 본배양한 후 배양액을 4℃에서 원심분리(9,500×g, 15 min)하여 얻은 상등액을 0.45㎛ membrane filter(Advantec MFS, Inc., Japan)로 제균한 후 상등액을 동결 건조하였다. 동결건조 후 4℃에 보관하며 필요시 덜어 활성 측정용으로 사용하였다.
나. 세포 배양
실험에 사용한 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 형태를 관찰하며 10회 이하로 계대배양한 세포를 실험에 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5%의 CO2 인큐베이터에서 2~3일마다 계대배양하며 실험에 사용하였다.
다. 세포 증식능 측정
프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액이 RAW 264.7 세포 성장에 미치는 영향을 판정하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4×105 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액을 농도별 (0~10 mg/mL)로 처리하여 24시간 반응 후 PrestoBlueTM 시약을 10㎕씩 첨가하였다. 반응 20분 후 ELISA reader (DYNEX, USA)로 570 nm (reference 600 nm)에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식 정도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타냈다.
라. NO 생성량 측정
프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을 통해 생성되는 NO를 억제할 수 있는지 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4×105 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시킨다. 세포독성실험을 통해 독성을 보이지 않는 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액을 농도별 (0~2.5 mg/mL)로 희석하여 처리하고 2시간 후 1 μg/mL의 농도로 LPS를 처리하여 24시간 더 반응시켰다. 반응 종료 후 세포배양액 100 μL와 동량의 Griess reagent를 첨가하여 20분 후 ELISA reader (DYNEX, USA)로 530 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도는 sodium nitrite를 이용하여 64 μM까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.
마. 염증성 사이토카인 생성량 측정
프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액이 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극을 통해 생성되는 염증성 사이토카인(IL-1, IL-6 및 TNF-α)을 억제할 수 있는지 확인하기위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4×105 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시켰다. 세포독성실험을 통해 독성을 보이지 않는 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액을 농도별 (0~2.5 mg/mL)로 희석하여 처리하고 2시간 후 1 μg/mL의 농도로 LPS를 처리하여 24시간 더 반응시켰다. 반응 종료 후 ELISA kit를 이용하여 염증성사이토카인의 발현량을 측정하였다. IL-1β의 농도는 400 pg/mL, IL-6의 농도는 250 pg/mL, 그리고 TNF-α의 농도는 700 pg/mL까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.
바. Heme oxygenase-1 발현
RAW 264.7 세포 내에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액에 의한 heme oxygenase-1의 발현 여부를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 4×105 cells/well의 수로 계대배양하고 24시간 안정화시킨다. 세포독성실험을 통해 독성을 보이지 않는 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 배양액 시료를 농도별 (0~2.5 mg/mL)로 희석하여 처리하고 18시간 반응 후 ELISA kit를 이용하여 heme oxygenase-1의 발현량을 측정하였다. Heme oxygenase-1의 농도는 5 ng/mL까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다.
발효유 제조
가. 발효유 제조용 스타터 균 제조
발효유 제조용 스타터 균 제조는 전남대에서 분양 받은 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 100 mL MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 정치하면서 1차 배양하고, 1 L MRS 액체 배지에 1차 배양액을 접종하여 37℃에서 24시간 동안 계대 배양하였다. 배양된 액을 원심 분리하여 상등액을 제거한 다음 남은 균체를 멸균된 0.85% saline 용액을 사용하여 현탁시켜 세척하였다. 동일한 방법으로 세척과정을 반복한 후 마지막 원심 분리된 균체를 동결건조기를 사용하여 동결 건조하였다. 동결 건조된 시료의 스타터 균 제조용으로 적합성 유무를 판별하기 위해 0.1 g을 사용하여 균수 측정 결과 1.0×1011/g으로 요구르트 제조용 스타터 균주로 사용 가능함을 확인하였다. 동결 건조된 균을 초저온 냉동고(-80℃)에 보관하여 발효유 제조에 사용하였다.
나. 프로바이오틱스 유산균과 시판 스타터(Starter) 첨가 비율에 따른 발효유 제조 조건 확립
1) 발효유 제조 방법
발효유의 제조는 원유 1000g에 정백당 50g와 탈지유 30g를 혼합(Mixing)하여 95℃, 5분간 살균 후 43℃로 냉각한 다음 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 ABT-5(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacteria, Streptococcus thermophilus, Chr. Hansen, Denmark) 균주를 각각 0.1g:0g, 0.03g:0.07g, 0.05g:0.05g, 0.07g:0.03g 및 0g:0.1g 비율로 0.01%(0.1g/kg)씩을 접종하여 43℃에서 5시간 배양하여 제조하였다. 이후 15℃까지 냉각하고 4℃에서 보관하였다.
본 발명에 따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 첨가한 발효유 제조공정이 도 1에 도시되어 있다.
2) 발효유의 품질 특성 확인
가) pH 측정
pH는 pH meter [iSTEK. Co. Ltd, Model pH-200L, Korea]를 이용하여 측정하였다.
나) 적정 산도(Titratable Acidity) 측정
적정산도는 발효유 10 g에 증류수 10 mL를 혼합하여 현탁액을 만든 후 이 현탁액을 NaOH를 첨가하여 pH 8.3까지 적정하고 사용된 NaOH의 적정량을 0.05 mL까지 정밀하게 기록하여 적정 산도 측정법(산업자원부 기술표준원)의 계산식에 의한 방법으로 NaOH의 소비량에 유산의 환산계수인 0.9를 곱한 후 검체의 무게(g)를 나누어 나타낸 값을 적정 산도(%)로 하였다.
다) 점도 측정
발효유의 점도 측정은 Brookfield-Viscometer (DVⅡ+pro, Brookfield Engineering, U. S. A)를 사용하여 spindle No. 63, speed 30 rpm조건으로 3분간씩 3반복 측정하였다.
라) 유산균 수의 측정
유산균수 측정은 발효유 전후 시료를 십진 희석법으로 희석하여 평판배양법으로 BCP 한천배지(Difco, U.S.A.)에 1 mL씩 분주하고 37℃에서 48시간 동안 배양하여 노랑색 콜로니를 계수하여 유산균수로 표시하였다.
3) 영양성분 분석과 기준규격 검사
가) 영양성분 분석
발효유의 영양성분은 식품공전에 준하는 분석법에 의해 열량을 포함한 9대 영양성분을 분석하였다. 표 3은 본 발명에 따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 첨가한 발효유의 영양성분 분석항목이다.
| 분석항목 | |
| 영양소 | 열량, 조지방, 조단백, 총탄수화물, 나트륨, 수분, 회분, 포화지방, 당류, 콜레스테롤, 트랜스지방 |
나) 기준규격 검사
발효유의 기준규격 검사는 식품공전 및 축산물 위생 시험법에 준하는 분석법에 의해 유고형분, 보존료, 살모넬라, 리스테리아 모노사이토제네스, 대장균에 대한 기준규격 검사를 실시하였다. 모든 검사는 식품공전 및 축산물 위생 시험법에 준하는 분석법에 의해 분석하였다. 표 4는 본 발명에 따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 첨가한 발효유의 기준규격 분석항목이다.
| 분석항목 | |
| 발효유 | 유고형분 유산균수 살모넬라 리스테리아 모노사이토제네스 대장균 |
4) 관능검사
발효유의 상품화를 위한 최적 공식(Formulation)을 선발하기 위하여 다음과 같은 발효유를 제조하여 관능검사를 실시하였다. 평가는 전북대학교, 순천대학교 학생과 임실군민을 대상으로 9점 척도 법을 사용하며 대단히 좋아함 9점, 아주 좋아함 8점, 보통 좋아함 7점, 약간 좋아함 6점, 좋지도 싫지도 않음 5점, 약간 싫어함 4점, 보통 싫어함 3점, 아주 싫어함 2점, 대단히 싫어함 1점으로 검사하였다. 결과의 통계처리는 SPSS program을 이용한 Duncan's multiple range test로 유의성을 검증하였다. 표 5는 본 발명에 따른 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 첨가한 발효유의 관능검사 분석항목이다.
| 샘플번호 | A100K0 | A70K30 | A50K50 | A30K70 | A0K100 |
| 1. 색감 (Color) | |||||
| 2. 향 미 (Flavor) | |||||
| 3. 맛 (Taste) | |||||
| 4. 조직감 (Texture) | |||||
| 5. 전체적인 선호도 (Overall) |
연구결과 및 고찰
1. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P의 면역 활성 증진 효능
가. RAW 264.7 세포 증식능
RAW 264.7 세포에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액에 대한 RAW 264.7 세포의 증식 정도를 알아본 결과는 도 2와 같다. 배양액을 0~10 mg/mL의 농도로 희석하여 RAW 264.7 세포에 24시간 동안 반응시킨 결과, 2.5 mg/mL의 농도까지는 대조군과 비교하여 세포의 성장에 영향을 미치지 않았으며 5 mg/mL 이상의 농도에서는 RAW 264.7 세포의 성장을 억제하였다. 또한 형태학적인 관찰에서도 배양액이 2.5 mg/mL 농도까지는 RAW 264.7 세포의 형태를 변화시키지 않은 반면, 5 mg/mL의 농도 이상에서는 RAW 264.7 세포의 성장을 둔화되고 형태가 변화됨을 확인할 수 있었다(도 3). 이에 RAW 264.7 세포에 대한 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의 면역관련 실험에 사용할 농도는 독성을 보이지 않는 안전한 농도인 최대 2.5 mg/mL까지로 결정하였다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액에 대한 RAW 264.7 세포의 증식 정도를 알아본 결과를 나타낸 그래프이다(Data shown are the means±SD. * p<0.05, **0.01 versus a media alone treated group. culture medium of probiotic lactic acid bacteria.).
도 3은 배양액의 농도변화에 따른 RAW 264.7 세포의 형태 변경 사진이다(확대율, ×200). 여기에서 (A): None, (B): 1 mg/mL, (C): 2.5 mg/mL, (D): 5 mg/mL, (E): 10 mg/mL이다.
나. NO 생성량
프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 RAW 264.7 세포에 배양액을 0~2.5 mg/mL의 농도로 처리하여 2시간 미리 반응시킨 후 LPS 1 ug/mL의 농도로 24시간 더 자극하여 농도에 따른 NO의 생성량을 측정한 결과는 도 4와 같다(* p<0.05, **p<0.01 versus a LPS alone treated group.). LPS를 단독 투여한 대조군에서 NO의 생성이 39.47±1.18 uM이었으나, 배양액을 0.25, 0.50, 1 및 2.5 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 각각 37.49±1.50 uM 33.79±3.93 uM, 34.96 ±0.56 uM, 21.69 ±0.91 uM로 측정되어 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 농도의존적으로 NO의 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 이는 LPS 자극으로부터 NO의 생성을 억제하는 것으로 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 외부 자극에 대한 산화 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있음을 알 수 있는 결과라 할 수 있다.
다. 염증성사이토카인 생성량
RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 의하여 염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α)이 생성되는 과정에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의 효과를 ELISA법으로 확인한 결과는 도 5a 내지 5c와 같다. RAW 264.7 세포에 배양액을 0~2.5 mg/mL의 농도로 처리하여 2시간 미리 반응시킨 후 LPS 1 ug/mL의 농도로 24시간 더 자극하여 농도에 따른 염증성 사이토카인의 생성량을 측정하였다. LPS를 첨가한 RAW 264.7 세포에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생성량이 모두 유의적으로 증가하였다. 그러나 LPS와 함께 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액을 첨가한 경우에는 염증성사이토카인의 생성이 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 특히 IL-1β과 IL-6의 경우, 2.5 mg/mL의 농도에서 IL-1β는 45%, IL-6은 24%의 유의적인 감소를 보였다. 이는 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 염증성사이토카인의 생성을 감소시켜 세포를 보호한다는 것을 알 수 있는 결과라 할 수 있다. 그러나 염증성 사이토카인 억제에 관한 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의 보다 정확한 결과를 얻기 위해서 RNA 및 단백질 수준에서의 추가적 검증이 필요할 것으로 사료된다.
도 5a 내지 5c는 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 의하여 염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α)이 생성되는 과정에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액의 효과를 ELISA법으로 확인한 결과이며, (A): IL-1β, (B): IL-6, (C): TNF-α이다(Data shown are the mean±SD. * p<0.05, **p<0.01 versus a LPS alone treated group.).
라. Heme oxygenase-1 발현
프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액이 RAW 264.7 세포에서 heme oxygenase-1의 발현에 관여하는지 확인하기 위해 배양액을 농도별 (0~2.5 mg/mL)로 처리하여 heme oxygenase-1의 발현 여부를 ELISA법으로 측정한 결과는 도 6과 같다(Data shown are the mean±SD. * p<0.05, **p<0.01 versus a media alone treated group.). 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액을 농도별로 첨가하고 18시간 후 heme oxygenase-1의 농도는 시료를 첨가하지 않은 대조군 (1.54±0.11 ng/mL)에 비해 농도 의존적으로 발현이 증가하였다. 이상의 결과들을 종합하여 볼 때, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 프로바이오틱스 유산균 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 배양액은 2.5 mg/mL 이하에서 농도의존적으로 heme oxygenase-1의 발현을 유도함으로써 NO 및 염증성사이토카인 (IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 생성을 억제하는 것으로 판단되었다(도 7).
도 7은 RAW 264.7 세포에서 농도의존적으로 heme oxygenase-1의 발현을 유도함으로써 NO 및 염증성사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α)의 생성 억제 모델이다.
2. 발효유의 품질 특성
가. pH
Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 발효 중 pH 측정 결과는 도 8과 같다. 발효 시간에 따른 pH 변화를 보면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효한 발효유는 pH 변화가 보이지 않았고, 그 외 시료군에서는 발효가 진행 된 후 1시간째부터 급격히 감소하는 경향을 보였다. 발효가 완료되는 시점을 보면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효 시킨 시료를 제외한 4개 시료군은 발효 4시간 후 발효 종말점인 4.6이하에 도달 하였으나 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효 시킨 시료구는 발효 4시간 후에도 6.5로 종말점에 도달하지 못했고 발효 24시간째 종말점인 4.6이하에 도달하였다.
도 8은 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P를 첨가한 발효유의 발효과정에서의 pH 변화를 나타내며, 여기에서 A100K0는 ABT-5 0.1g을 첨가한 것이고, A70K30는 ABT-5 0.07g과 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.03g을 첨가한 것이며, A50K50는 ABT-5 0.05g과 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.05g을 첨가한 것이고, A30K70는 ABT-5 0.03g과 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.07g을 첨가한 것이며, A0K100는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 0.1g을 첨가한 것이다.
나. 적정 산도(%)
Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 발효 중 총산 함량 측정 결과는 도 9와 같다. 발효 시간에 따른 총산 함량 변화를 보면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효한 발효유는 총산 함량 변화가 보이지 않았고, 그 외 시료군에서는 발효 시간이 경과 할수록 높아졌다. 발효 4시간 후 시료구별 총산 함량은 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효시킨 시료구는 0.19%로 가장 낮은 함량을 보였고, Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효시킨 시료구를 제외한 4개 시료군은 0.56~0.59%로 유의적 차이를 보이지 않았다.
다. 점도
Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 점도(cps) 측정 결과는 표 8과 같다. 발효 전의 점도는 모든 시료구에서 유의적인 차이를 보이지 않았고 발효 4시간 후에는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효한 발효유를 제외한 4개의 시료군에서 점도가 급격히 증가하였다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 단일 균주로 발효한 발효유의 경우는 발효 전 점도와 발효 4시간 후의 점도가 비슷한 값을 나타냈다.
| Fermentation time(hrs) | A100K0 | A70K30 | A50K50 | A30K70 | A0K100 |
| 0 | 320 | 320 | 480 | 160 | 320 |
| 4 | 16,796 | 18,876 | 17,916 | 18,556 | 240 |
라. 유산균 수
발효유에서 유산균수는 품질을 평가하는데 핵심적으로 작용하는 요인 중에 하나로서 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 발효 중 유산균수(CFU/mL) 측정 결과는 표 9와 같다. 발효 전의 유산균수를 보면 1.8×104~6.7×104 CFU/mL로 유의적인 차이를 보이지 않았으나 발효 4일째의 시료구별 유산균수는 유의적인 차이를 보였다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 단독 배양한 시료구의 경우 3.4×105 CFU/mL 로 발효 전의 유산균수와 비교해 큰 차이를 보이지 않았다. 이는 pH 및 적정산도 측정에서도 정상적인 값을 보이지 않아 발효가 정상적으로 진행되지 않았거나 발효 진행 속도가 늦어짐을 알 수 있었다. 정상적으로 발효된 4개의 시료군 중 상용 균주(ABT-5) 100%를 사용한 시료구의 경우 1.8×107 CFU/mL 를 나타난 반면 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)를 혼합 배양한 시료구의 경우는 2.5×109~2.9×109 CFU/mL 로 상용 균주(ABT-5) 100%를 사용한 시료구 보다 오히려 높은 유산균수를 보였다. 이러한 결과를 볼 때 면역활성 증진 효과가 있는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주 단독 배양만으로는 발효유 제조가 다소 어려울 것으로 판단되지만 상용 균주와의 적절한 혼합 비율을 찾아 제조한다면 상용균주 만을 사용해 제조한 발효유보다 품질이 향상될 뿐만 아니라 기능성 또한 부여될 것으로 판단된다.
| Fermentation time(hrs) | A100K0 | A70K30 | A50K50 | A30K70 | A0K100 |
| 0 | 4.8×104 | 6.7×104 | 5.4×104 | 5.6×104 | 1.8×104 |
| 1 | 9.3×104 | 5.0×105 | 9.7×105 | 7.7×105 | 4.5×104 |
| 2 | 1.4×105 | 5.5×106 | 3.4×106 | 7.5×106 | 3.3×104 |
| 3 | 6.5×106 | 8.5×108 | 7.9×108 | 8.8×108 | 5.1×104 |
| 4 | 1.8×107 | 2.5×109 | 2.8×109 | 2.9×109 | 3.4×105 |
마. 영양성분과 기준규격
1) 9대 영양성분
Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 영양성분을 측정한 결과는 표 10과 같다. 앞서 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 단독 배양한 시료구의 경우 발효가 정상적으로 진행 되지 않아 영양 성분 검사 및 품질 기준 규격 검사에는 제외를 시켰다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 단독 배양한 시료구를 제외한 4개의 시료군에 대한 9대 영양성분을 측정한 결과 100 g을 기준으로 열량 86~88 kcal, 수분 81.40~82.04 g, 조지방 3.35~3.56 g, 포화지방 2.39~2.54 g, 조단백 3.54~4.19 g, 회분 0.78~0.80 g, 탄수화물 9.90~10.24 g, 콜레스테롤 11.01~12.32 mg이었고, 비중은 1.062~1.063 이었으며, 시료군에 대한 유의적인 차이를 보이지 않았다.
Table 10. Nutritive components of yogurt added Lactobacillus sp YH KCCM 10887P
| 검사항목 | A100K0 | A70K30 | A50K50 | A30K70 |
| 열량(Kcal/100g) | 86 | 87 | 87 | 86 |
| 수분(g/100g) | 82.04 | 81.91 | 82.02 | 81.97 |
| 회분(g/100g) | 0.78 | 0.79 | 0.80 | 0.78 |
| 탄수화물(g/100g) | 10.13 | 10.08 | 9.90 | 10.11 |
| 조단백질(g/100g) | 3.54 | 3.70 | 3.72 | 3.79 |
| 조지방(g/100g) | 3.52 | 3.56 | 3.56 | 3.35 |
| 트랜스지방(g/100g) | 0.0918 | 0.0926 | 0.0945 | 0.0882 |
| 당류(g/100g) | 8.4731 | 8.1953 | 8.5272 | 8.1617 |
| 포화지방(g/100g) | 2.5152 | 2.5460 | 2.5453 | 2.3980 |
| 콜레스테롤(mg/100g) | 11.0184 | 12.3244 | 12.1645 | 11.4920 |
| 비중 | 1.063 | 1.062 | 1.062 | 1.062 |
2) 품질 기준규격
Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유가 식품 공전상의 품질 기준규격에 적합한지를 판정하기 위해 무지고형분, 유산균수, 대장균군, 살모넬라, 리스테리아모노사이토제네스 총 5개 항목에 대하여 검사를 실시한 결과는 표 11과 같다. 무지고형분은 10.08~10.90%로 공전규격상 3.0%보다 3배%가량 많았으며, 유산균수 역시 모든 샘플이 기준규격인 107 이상이었다. 또한 살모넬라, 리스테리아 모노사이토제네스 및 대장균에서도 음성으로 나타나 발효유 제품에 대한 기준규격을 만족하였다. 이러한 결과를 볼 때 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 첨가 하여 제조한 발효유는 제품화함에 적합하다고 판단된다.
| 검사항목 | 공전규격 | A100K0 | A70K30 | A50K50 | A30K70 |
| 무지고형분(%) | 3.0이상 | 10.30 | 10.18 | 10.25 | 10.42 |
| 유산균수 | 1ml당 107이상 | 2.0x107 | 1.6x109 | 1.8x109 | 1.7x109 |
| 대장균군 | n=5, c-=2, m=0, M=10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 살모넬라 | 음성이어야한다. | 음성 | 음성 | 음성 | 음성 |
| 리스테리아모노 사이토제네스 |
음성이어야한다. | 음성 | 음성 | 음성 | 음성 |
바. 관능검사
Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5)의 혼합 비율을 달리한 발효유의 관능검사 결과는 표 12와 같다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 단독 배양한 시료구의 경우 색, 향, 맛, 조직감 및 전체기호도 항목 모두 가장 낮은 기호도를 보였다. 이는 앞서 품질 측정 결과에서 언급 했듯이 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 단독 배양 했을 경우 발효가 정상적으로 이루어지지 않아 나타난 결과라 사료된다. Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 단독 배양한 시료구를 제외한 4개 시료군의 관능평가 결과를 보면 색은 유의적 차이를 보이지 않았고, 향, 맛, 조직감 및 종합기호도는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5) 0.07 g: 0.03 g (0.1 g/L) 비율로 첨가한 시료구가 가장 높은 기호도를 보였다. 이러한 결과를 통해 면역 활성 효과가 확인된 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주를 이용해 발효유를 개발할 경우 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주와 상용균주(ABT-5) 0.07 g: 0.03 g (0.1 g/L) 비율로 제조하는 방법이 적당한 방법이라 판단된다.
| Sample | Sensory evaluation | ||||
| Color | Flavor | Taste | Texture | Overall | |
| A100K0 | 7.2±0.791)b)2) | 7.0±1.15bc | 7.2±1.37bc | 6.8±1.43b | 7.0±1.53b |
| A70K30 | 7.2±0.85b | 6.8±1.16bc | 6.9±1.46bc | 6.6±1.40b | 6.8±1.45b |
| A50K50 | 7.2±0.97b | 6.6±1.06b | 6.6±1.65b | 6.5±1.49b | 6.5±1.43b |
| A30K70 | 7.4±1.00b | 7.2±1.28c | 7.4±1.36c | 7.5±1.47c | 7.7±1.35c |
| A0K100 | 6.5±1.29a | 4.8±1.50a | 4.1±1.57a | 4.0±1.47a | 4.4±1.43a |
1)All values are mean±SD.
2)Mean±SD with different superscript within a column are significantly different(p＜0.05) by Duncan's multiple range test. a<b<c.
본 발명은 관련분야에 다음과 같은 기여를 할 것으로 기대된다.
임실지역 유가공산업의 경쟁력을 강화시킬 수 있는 독자적인 면역 증진용 프로바이오틱스 유산균주를 확보하였고, 본 연구 결과물을 임실지역 목장형 유가공업체로 기술 이전을 통해 고부가가치 창출이 가능할 것으로 기대된다. 또한, 면역력 약화로 인한 다양한 질병에 노출된 현대인에게 면역활성 증진 발효유를 이용하여 편리하고 부담 없는 소비로 면역력 증진을 기대할 수 있다.
Claims (3)
- 발효유 제조방법에 있어서,
프로바이오틱스 유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 균주 및 ABT-5 균주를 동시에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 접종되는 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5 균주의 첨가량은 원유 100중량부에 대하여 0.01중량부인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P와 ABT-5 균주의 혼합비율은 중량비로 0.3~0.7 대 0.7~0.3인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 유산균을 활용한 면역활성 증진 발효유 제조방법.
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| KR (1) | KR101427830B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150099632A (ko) * | 2014-02-21 | 2015-09-01 | 재단법인 임실치즈과학연구소 | 갈락토올리고당 생성 유산균주를 이용한 발효유의 제조방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100979917B1 (ko) * | 2008-03-03 | 2010-09-03 | 전남대학교산학협력단 | 프로바이오틱 활성이 있는 락토바실러스 스피시스 ｙｈ 및그를 이용한 발효유제품 |
| KR20120003573A (ko) * | 2010-07-05 | 2012-01-11 | 대한민국(농촌진흥청장) | 장내 균총 정상화 효과를 갖는 엔터로코커스 패칼리스, 이를 포함하는 발효제품 및 그 제조방법 |
-
2012
- 2012-08-10 KR KR1020120087911A patent/KR101427830B1/ko active IP Right Grant
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| KR20150099632A (ko) * | 2014-02-21 | 2015-09-01 | 재단법인 임실치즈과학연구소 | 갈락토올리고당 생성 유산균주를 이용한 발효유의 제조방법 |
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| KR101427830B1 (ko) | 2014-08-11 |
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