KR20140020487A - 카테콜화 나노섬유, 그 제조방법 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리에스테르계 고분자 화합물에 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 카테콜화 폴리에스테르계 화합물을 포함하는 나노섬유, 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-암(multi-arm) 폴리에틸렌글리콜(cPEG)을 포함하는 나노섬유로서 상기 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유, 이들의 제조방법, 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

카테콜화 나노섬유, 그 제조방법 및 그 용도{Catecholated nanofiber, a process for the preparation thereof, and its use thereof}
본 발명은 카테콜 단분자가 공유결합된 폴리에스테르계 화합물을 포함하는 나노섬유, 그 제조방법, 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴리에스테르계 화합물을 포함하는 나노섬유에 카테콜 단분자를 도입함으로써 세포와의 결합능이 증가되거나 나노섬유의 강도가 증가되는 등의 개질된 나노섬유, 그 제조방법, 및 그 용도에 관한 것이다.
나노섬유는 지름이 수십에서 수백 나노미터에 불과한 초극세실로서, 폴리락틱글리콜산(PLGA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(ε-카프롤락톤) 및 폴리에틸렌글리콜의 블록 공중합체(PCL-PEG 블록 공중합체) 등을 포함한 폴리에스테르계 고분자 화합물을 이용하여, 자기결합방법(self-assembly), 상분리방법(phase separation), 및 전기방사법(electrospinning) 등를 이용하여 제조할 수 있는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1).
나노섬유는 넓은 표면적과 높은 다공도를 가지고 있고(비특허문헌 2), 넓은 표면적은 습윤상태를 충분히 조성할 뿐만 아니라 그 구조는 세포외기질의 구조와 유사한 삼차원적인 구조를 가지고 있기 때문에 세포가 붙어서 성장하기에 충분한 면적을 공급해주어 상처부위의 세포재생에 효과적이어서(비특허문헌 3), 상처치유를 위한 드레싱제로서 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 나노섬유의 세포접착 유도를 위한 세포와의 결합능을 증가시키기 위해 나노섬유의 표면을 카테콜로 개질시키는 방법이 알려져 있다(비특허문헌 4 및 5). 이 방법에 따르면, 고농도(2 mg/ml 이상)의 염기성 조건의 카테콜 용액 중에 나노섬유를 12시간 이상 담가 두면, 나노섬유의 표면에 폴리카테콜(polymerized catechol)을 형성하면서 불규칙적인 폴리카테콜 파티클들(particles)이 형성된다. 그리하여 형성된 폴리카테콜로 개질된 나노섬유는 친수성 증가에 의해 고소수성 물질 표면 위에 세포의 접착이 유도 가능하지만, 고농도의 카테콜은 세포독성을 유발하게 된다(비특허문헌 6-9).
한편, 수술 후, 조직이 치유되는 과정에서 창상부위와 정상 조직간의 원하지 않는 조직부착을 방지하기 위한 조직부착방지막(anti-adhesive barrier)이 필요하다. 나노섬유는 다공도가 높고, 표면적이 넓어 산소나 영양분의 투과도가 좋아 조직공학용 지지체로써 매우 적합하지만, 물리적 강도가 낮아 조직부착방지막으로써 이용할 경우, 인체의 움직임에 따른 전단응력(shear stress)를 견디기 힘들다.
1. L.A. Smitih et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 39 (2004) 125-131 2. S. R. Bhattarai et al., Biomaterials 25 (2004) 2595-2602 3. W. J. Li et al., Biomaterials 26 (2005) 599-609 4. Langmuir 2010, 26, 15104-15108 5. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2012, 91, 2012 6. Biochemistry J., 1992, 281, 377-380 7. Neuron, 2004, 43, 301-304 8. Eur. J. Neurosci., 2005, 21, 637-646 9. Nat. Med., 2005, 11(11), 1214-1221
본 발명의 목적은 세포와의 접착능이 증가된 표면이 개질된 나노섬유를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 표면이 개질된 나노섬유의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표면이 개질된 나노섬유를 세포의 접착 속도 또는 세포의 증식을 촉진시키기 위해 사용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표면이 개질된 나노섬유를 포함하는 상처치유용 드레싱제 및 세포배양용 플라스틱웨어(plastic wares)의 코팅막을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인체의 움직임에 따른 전단응력을 견디기에 충분한 물리적 강도를 갖는 조직부착방지막으로서 사용될 수 있는 표면이 개질된 나노섬유를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 조직부착방지막으로서 사용될 수 있는 나노섬유의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노섬유를 포함하는 조직부착방지막을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은 폴리에스테르계 고분자 화합물에 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 카테콜화 폴리에스테르계 화합물을 포함하는 나노섬유를 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 폴리에스테르계 고분자 화합물을 포함하는 나노섬유를 카테콜 단분자 화합물과 반응시켜 나노섬유에 카테콜 단분자 화합물을 공유결합시키는 것을 포함하는, 나노섬유를 개질하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은
상기 아민화 PCL-PEG 블록 공중합체를 나노섬유로 제조하는 단계; 및
상기 나노섬유를 카테콜 단분자 화합물 및 커플링제와 유기용매 상에서 반응시켜 카테콜 단분자를 아민기에 결합시키는 단계를 포함하는 상기 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 나노섬유를 세포의 접착 속도 또는 세포의 증식을 촉진하기 위해 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 나노섬유를 포함하는 상처 치유용 드레싱제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 나노섬유를 포함하는 세포배양용 플라스틱웨어(plastic wares)의 코팅막를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-암(multi-arm) 폴리에틸렌글리콜(cPEG)을 포함하는 나노섬유로서, 상기 카테콜 및 티올의 교차결합 및 카테콜과 카테콜간의 교차결합을 포함하고, 상기 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)은 락타이드:글리콜라이드의 비율이 1:0 ~ 0:1인 나노섬유를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유를 포함하는 조직부착 방지막을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-arm 폴리에틸렌글리콜(cPEG)의 혼합용액을 전기방사법에 의해 나노섬유로 제조하는 단계; 및
상기 나노섬유를 교차결합 시약으로 처리하여 나노섬유 중의 티올기와 카테콜기를 서로 교차결합시키는 단계를 포함하는 상기 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다.
본 발명자들은 세포와의 접착능이 증가된 표면이 개질된 나노섬유를 개발하기 위해 연구한 결과, 나노섬유에 카테콜 단분자 화합물을 공유결합킴으로써 종래 나노섬유의 표면 개질방법인 폴리카테콜을 형성하는 방법에서의 폴리카테콜에 의한 세포독성 효과도 피할 수 있으면서 세포와의 접착능을 증가된 나노섬유를 개발하게 되었다.
따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 카테콜화 폴리에스테르계 고분자 화합물을 포함하는 나노섬유를 제공한다.
상기 폴리에스테르계 고분자 화합물이란 나노섬유를 제조할 수 있는 것으로 공지된 임의의 폴리에스테르계 고분자 화합물을 의미하며, 바람직하게는 생체 적합성의 폴리에스테르계 고분자 화합물을 의미한다. 구체적으로는 폴리글라이콜라이드 (PGA), 폴리락틱산 (PLG), 폴리하이드록시발러레이트 (PHV), 폴리하이드록시부틸레이트 (PHB), 폴리하이드록시알카노에이트 (PHBV), 폴리하이드록시프로피오닉산 (PHPA), 폴리비닐알코올 (PVOH), 폴리다이옥사논 (PDO), 폴리언하이드라이즈 (PAH), 폴리트리메틸렌 카보네이드 (PTMC), 폴리포스파젠 (PPZ), 폴리우레탄 (PU) 및 이들의 조합 중에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 폴리락틱글리콜산(PLGA), 폴리에틸렌글리콜 및 폴리(e-카프롤락톤)(PCL)의 블록 공중합체, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
상기 카테콜 단분자 화합물은 오르토-1,2-디히드록시페닐기가 결합된 탄소수 1 내지 8의 탄화수소 화합물을 의미하며, 예를 들어 C1-8알킬, C2-8알키닐, C2-8알케닐, C1-8알콕시 등을 포함하며, 상기 카테콜 단분자 화합물은 오르토-디히드록실 페닐기를 제외한 부분이 상기 폴리에스테르계 고분자 화합물과 공유결합이 가능한 임의의 작용기를 가질 수 있다. 이러한 작용기로는 예를 들어, 카르복실기, 아민기, 티올기, 에폭시, 아크릴레이트, 석신이미드 등이 있다.
상기 "알킬"은 모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 포화, 분기된 또는 직쇄 1가 탄화수소기를 지칭한다. 전형적인 알킬기는, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로판-1-일, 프로판-2-일, 및 시클로프로판-1-일과 같은 프로필, 부탄-1-일, 부탄-2-일, 2-메틸-프로판-1-일, 2-메틸-프로판-2-일, 시클로부탄-1-일, tert-부틸과 같은 부틸 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 상기 알킬기에 존재하는 하나 이상의 수소원자는 할로겐, 히드록시, 저급알킬기 등으로 치환될 수 있다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기를 지칭한다.
상기 용어 "알케닐"은 모 알켄의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하여 유도된 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 분기된, 직쇄 또는 시클릭 알킬기를 지칭한다. 상기 기는 이중 결합 근처에서 Z- 또는 E-형태(또는 시스 또는 트랜스 입체형태)일 수 있다. 전형적 알케닐 기는, 예를 들어, 에테닐; 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 프로프-2-엔-2-일, 시클로프로프-1-엔-1-일과 같은 프로펜일; 시클로프로프-2-엔-1-일; 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 시클로부트-1-엔-1-일, 시클로부트-1-엔-3-일, 시클로부타-1,3-디엔-1-일과 같은 부테닐 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서, 알케닐기는 2 내지 6개 탄소 원자를 가지며, 즉 "저급 알케닐"이다.
상기 용어 "알키닐"은 모 알킨의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유도된 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 분기된 또는 직쇄를 지칭한다. 전형적인 알키닐 기는, 예를 들어, 에티닐; 프로피닐; 부티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에서, 알키닐 기는 2 내지 6개 탄소 원자(즉 "저급 알키닐")를 갖는다.
상기 용어 "알콕시"는 라디칼 -OR을 지칭하며, 이때 R은 알킬이다. 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 시클로헥실옥시 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 본 발명에 따른 나노섬유는 상기 카테콜 단분자 화합물의 오르토-1,2-디히드록시페닐기를 제외한 부분이 상기 폴리에스테르계 고분자 화합물로 이루어진 나노섬유의 표면에 공유결합된 형태이며, 상기 공유결합을 위해, 상기 카테콜 단분자 화합물에 결합된 작용기와 공유결합할 수 있는 작용기를 가진 폴리에스테르계 고분자 화합물로 나노섬유를 제조한 다음 카테콜 단분자 화합물과 반응시킴에 따라, 상기 공유결합이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 카테콜 단분자 화합물에 결합된 작용기가 카르복실기인 경우에 대해서는 아민기, 아민기에 대해서는 히드록실기 또는 카르복실기, 티올기에 대해서는 티올기, 에폭시에 대해서는 아민기, 아크릴레이트에는 아크릴레이트, 석신이미드에 대해서는 아민기 등이 있으며, 이러한 작용기의 짝은 유기화학 분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다. 상기 카테콜 단분자 화합물은 예를 들어, 3,4-디히드록실-페닐알라닌(DOPA), 3,4-디히드록실-페닐-프로피온산(DHPP), 3,4-디히드록실-페닐-시나믹산 (DPCA), 3,4-디히드록실벤즈알데하이드 (DHBA), 3,4-디히드록시페닐-1-옥소-2-프로페닐-옥시-3-3,4-디히드록시페닐-프로패오닉산 (DHOPDHPA), 3,4-디히드록시스틸-4-히드록시-2-피론 (DHHP), 및 이들의 조합에서 선택될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 나노섬유는 그 나노섬유에 공유결합된 상기 카테콜 단분자 화합물의 오르토-1,2-디히드록시페닐기는 공유결합에 관여하지 않고 그대로 보존되므로, 카테콜이 지닌 고유의 접착능은 유지될 수 있다. 또한, 상기 본 발명에 따른 나노섬유는 적은 양의 카테콜 화합물을 이용하여 제조되어도 종래의 폴리카테콜로 개질된 나노섬유에 비해 세포에 대한 부착력 및 부착속도가 현저히 높다(시험예 1 및 2).
본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 상기 폴리에스테르계 고분자 화합물을 포함하는 나노섬유를 상기 카테콜 단분자 화합물과 반응시켜 카테콜 단분자 화합물을 공유결합시키는 것을 포함하는, 나노섬유를 개질하는 방법을 제공한다. 상기 폴리에스테르계 고분자 화합물은 카테콜 단분자 화합물과 공유결합이 가능하도록, 미리 작용기를 결합시킨 다음 나노섬유로서 제조될 수 있다. 상기 개질하는 방법에 의해 얻어진 나노섬유는 앞서 설명한 바와 같이, 나노섬유에 공유결합된 상기 카테콜 단분자 화합물의 오르토-1,2-디히드록시페닐기는 공유결합에 관여하지 않고 그대로 보존되므로, 카테콜이 지닌 고유의 접착능은 유지될 수 있으며, 상기 개질방법에 의해 나노섬유는 세포에 대한 부착력 및 부착속도가 현저히 높아질 수 있다.
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서,
PEG 말단에 작용기가 있는 PCL-PEG 블록 공중합체를 나노섬유로 제조하는 단계; 및
상기 나노섬유를 카테콜 단분자 화합물 및 커플링제와 유기용매 상에서 반응시켜 카테콜 단분자를 상기 작용기에 결합시키는 단계를 포함하는 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
상기 작용기는 예를 들어 아민기, 히드록실기, 카르복실기, 티올기, 아크릴레이트, 또는 석신이미드 일 수 있다.
상기 PCL-PEG 블록 공중합체는 폴리(e-카프롤락톤)-폴리(에틸렌 글리콜) (PEG-PCL-PEG, block copolymer)로서, 분자량은 40-100 kDa 일 수 있다. 아민화 PCL-PEG 블록 공중합체를 나노섬유로 제조하기 위해서는 당해 기술분야 공지된 폴리에스테르계 고분자 화합물을 이용한 나노섬유의 제조방법에 따라 이루어질 수 있으며, 예를 들어 자기결합방법(self-assembly), 상분리방법(phase separation), 및 전기방사법(electrospinning) 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 전기방사법을 이용할 수 있다. 그리하여 제조된 나노섬유는 표면에 아민기가 노출된 형태를 가지며, 그 나노섬유를 아민기와 공유결합 가능한 작용기를 갖는 카테콜 화합물 및 커플링제와 유기용매 상에서 반응시킴으로써, 카테콜 화합물이 결합된 나노섬유를 제조할 수 있다. 상기 카테콜 단분자 화합물은 앞서 설명한 바와 같은 화합물이 이용될 수 있으며, 예를 들어 DHPP, DOPA, DPCA, DHBA, DHOPDHPA, DHHP 및 이들의 조합에서 선택될 수 있다. 상기 커플링제는 예를 들어 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), HOBt (hydroxybenzotriazole), 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC), 디아이소프로필카보디이미드 (DIC) 벤조트라이졸-1-일록시-트리-디메틸아미노-포스포니움-헥사플루오로포스페이트 (BOP) 및 이들의 조합에서 선택될 수 있으며, 반응물의 종류에 따라 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
상기 제조방법에서, 카테콜 단분자 화합물이 DHPP 이고, 커플링제가 NHS 및 EDC 인 경우의, 상기 제조방법의 일 구현예의 반응식을 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면, (1)은 아민화 PCL-PEG 블록 공중합체로 형성된 나노섬유가 수상 중에 존재하는 형태를 나타낸다. 수상 중에서 나노섬유 중의 아민기는 아민기가 결합된 PEG의 친수성으로 인해 외부로 노출된다. 그 노출되어 있는 아민기를 카테콜 단분자 화합물로서 DHPP 및 커플링제로서 NHS 및 EDC와 반응시키면, 아민기와 DHPP의 카르복실산과의 아미드 결합을 통해 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 본 발명의 일 구현예에 따른 카테콜화 나노섬유(2)가 제조된다. 이러한 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 나노섬유는 염기성 조건 하에서 오르토디히드록실 페닐 형태가 퀴논 형태로 변환(3)되면서 티올 화합물(R-SH)과 마이클 부가 반응(Michael-type addition)이 이루어져 티올 화합물이 용이하게 결합될 수 있다(4). 단백질을 구성하는 아미노산 중에서 시스테인에 티올기가 존재하므로, 카테콜 단분자 화합물이 공유 결합된 본 발명에 따른 나노섬유는 세포막을 구성하는 단백질과 용이하게 결합할 수 있다. 따라서, 상기 본 발명에 따른 나노섬유는 세포에 대한 접착력, 접착속도를 증진시키거나 세포의 증식을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 나노섬유는 세포에 대한 접착력이 높아 상처부의의 세포재생에 효과적이므로, 보다 탁월한 상처치유용 드레싱제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노섬유를 세포의 접착 속도 또는 세포의 증식을 촉진하기 위해 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노섬유를 포함하는 상처치유 드레싱제를 제공한다.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노섬유를 포함하는 세포배양용 플라스틱웨어(plastic wares)의 코팅막을 제공한다.
상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노섬유는 폴리에스테르계 고분자 화합물로서 폴리락틱글리콜(PLGA)산 및 멀티-암 폴리에틸렌글리콜(multi-arm PEG)을 이용하고, 폴리락틱 글리콜산의 말단에 티올기를 결합시키고, 멀티-암 폴리에틸렌글리콜의 말단에 카테콜을 결합시킨 다음, 나노섬유로서 제조된 나노섬유 일 수 있다. 그리하여 제조된 나노섬유는, 나노섬유의 표면에 카테콜이 존재하여, 세포에 대한 결합력이 높은 특징을 가질 뿐만 아니라 나노섬유 내부에서 카테콜과 티올기가 교차결합을 수행하여 나노섬유의 물리적 강도가 높아지는 특징을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일 측면은 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-암(multi-arm) 폴리에틸렌글리콜(cPEG)을 포함하는 나노섬유로서, 상기 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유를 제공한다.
상기 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)은 분자량 100,000 이하일 수 있으며, 카테콜화 멀티-암(multi-arm) 폴리에틸렌글리콜(cPEG)은 분자량 1,000 ~ 40,000 일 수 있다. 상기 범위를 넘어설 경우에는 분해가 지연되거나, 나노섬유 제조가 불가능할 수 있다.
상기 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)에서 락타이드:글리콜라이드의 비율은 1:0 ~ 0:1 일 수 있다. 락타이드:글리콜라이드의 비율은 필요로 하는 생분해성의 정도에 따라 적절히 선택할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 생체 내에서 분해속도가 빠른 50:50~75:25의 비율이 될 수 있다.
상기 카테콜화 멀티-암 폴리에틸렌글리콜은 카테콜화 4 내지 8-암 폴리에틸렌글리콜일 수 있으며, 상기 멀티-암 폴리에틸렌글리콜을 통상의 방법에 따라 카테콜화 하여 제조될 수 있다. 상기 4 내지 8 - 암 폴리에틸렌글리콜은은 통상의 기술자가 적절히 합성하거나, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 상기 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)은 통상의 PLGA를 통상의 방법에 따라 티올화 하여 제조될 수 있다.
상기 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)의 카테콜화 멀티-암 폴리에틸렌글리콜(cPEG)에 대한 질량비율이 9:1 ~ 1:9가 되도록 할 수 있다. 상기 교차결합는 카테콜의 비율은 특별히 한정되는 것은 아니나, 상기 카테콜의 50% 이상이 티올과 교차결합 되는 것이 충분한 강도의 나노섬유의 제조를 위해 바람직하다. 또한, 충분한 강도의 나노섬유의 제조를 위해서는 카테콜기의 티올기에 대한 몰비가 1:1 ~ 10:1 인 것이 바람직하다. 이론적으로 카테콜은 티올기와 1:1 몰비로 반응하기 때문에, 나노섬유 내의 티올기 기준으로 카테콜의 양이 적으면, 나노섬유에 충분한 강도를 부여할 정도로 카테콜과 티올기간의 교차결합이 일어나지 않고, 카테콜의 양이 티올기보다 많으면, 카테콜-티올간의 교차결합뿐만아니라 카테콜-카테콜간의 교차결합도 충분히 일어나기 때문에 나노섬유의 물성을 현저히 증가시킬 수 있기 때문이다.
상기 본 발명에 따른 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유는 나노섬유를 구성하는 티올화 PLGA의 티올기가 카테콜화 PEG의 카테콜 그룹 간에 교차결합이 이루어져, 높은 물리적 강도를 가질 수 있다. 따라서, 나노섬유가 다공도가 높고 표면적이 넓어 산소나 영양분의 투과도가 좋아 조직 공학 지지체로서 적합하지만 물리적 강도가 낮아 조직 부착 방지막으로서 사용하기 어려웠던 종래기술의 문제점을 해결할 수 있게 되었다. 또한, 상기 나노섬유로부터 노출된 PEG는 원하지 않는 조직 부착을 방지하는 역할을 하고, 교차결합에 참여하지 않고 남아 있는 카테콜 분자는 조직 부착성을 유발하여 부착부위에 피팅시키는 역할을 수행할 수 있어, 조직 부착 방지막으로서 사용하기에 더욱 유리하다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유를 포함하는 조직부착 방지막을 제공한다. 또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유를 조직부착 방지막의 제조에 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서,
티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-암 폴리에틸렌글리콜(cPEG)의 혼합 용액을 전기방사법에 의해 나노섬유로 제조하는 단계; 및
상기 나노섬유를 교차결합 시약으로 처리하여 나노섬유 중의 티올기와 카테콜기를 서로 교차결합시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명에 따른 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유의 제조방법을 제공한다.
상기 나노섬유를 제조하는 단계에서 혼합용액의 용매는 나노섬유의 제조를 저해하지 않는 임의의 용매가 사용될 수 있으며, 예를 들어 탄소수 1 ~ 5의 탄화수소계 유기용제일 수 있다. 구체적으로는, 디클로로메탄, 메탄올, 클로로포름, 디메틸포름아마이드, 또는 테트라하이드로퓨란 등이 이용될 수 있다. 상기 전기 방사법은 니들과 그라운드 사이의 거리가 5 ~ 30 cm, 전압 0.1 ~ 30 kv, 유속 0.1 ~ 100 mL/h의 범위로 수행할 수 있다.
상기 교차결합시키는 단계에서 사용되는 교차결합시약은 과요도드산나트륨(NaIO4), 질산은 (silver nitrate), 바이신 버퍼 (bicine buffer), 카테콜 옥시다아제 (catechol oxidase), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 질산구리 (cupper nitrate), 타이로시나아제 (tyrosinase) 및 이들의 조합에서 선택될 수 있다.
상기 본 발명의 따른 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유의 제조방법의 일 구현예의 반응 모식도를 도 2에 나타내었다. 도 2에 따르면, PLGA-SH 및 cPEG의 혼합물을 전기방사법에 의해 나노섬유를 제조하여, 전기방사 PLGA-cPEG 나노섬유(PLGA-cPEG NF)를 제조한 다음, 교차결합제로서 NaIO4를 이용하여 교차결합반응시켜 PLGA에 결합된 티올과 PEG에 결합된 카테콜 간의 교차결합이 일어나 교차결합 PLGA-cPEG 나노섬유(교차결합 PLGA-cPEG NF)가 완성된다. 교차결합 PLGA-cPEG NF에서, 티올화 PLGA 및 카테콜화 PEG의 티올기와 카테콜 그룹 간에 교차결합이 이루어져, 높은 물리적 강도를 가질 수 있고, 나노섬유로부터 노출된 PEG는 원하지 않는 조직 부착을 방지하는 역할을 하고(anti-fouling effect), 교차결합에 참여하지 않고 남아 있는 카테콜 분자는 조직 부착성(tissue adhesiveness)을 유발하여 부착부위에 피팅시키는 역할을 수행할 수 있어, 조직 부착 방지막으로서 사용하기에 더욱 유리하다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 카테콜화 폴리에스테르계 고분자 화합물을 포함하는 나노섬유는, 종래의 폴리카테콜로 개질된 나노섬유에 비해 세포에 대한 부착력 및 부착속도가 현저히 높아, 상처 치유용 드레싱제 또는 세포배양용 플라스틱웨어(plastic wares)의 코팅막으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-암(multi-arm) 폴리에틸렌글리콜(cPEG)을 포함하는 나노섬유로서, 상기 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유는 교차결합의 존재로 인해 종래 나노섬유에 비해 물리적 강도가 현저히 높고, 나노섬유로부터 노출된 PEG는 원하지 않는 조직 부착을 방지하는 역할을 하고, 교차결합에 참여하지 않고 남아 있는 카테콜 분자는 조직 부착성을 유발하여 부착부위에 피팅시키는 역할을 수행할 수 있어, 효과적인 조직 부착 방지막으로서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 카테콜화 폴리에스테르계 화합물을 포함하는 나노섬유의 제조방법의 일 구현예의 반응 모식도이다.
도 2는 본 발명의 카테콜 및 티올의 교차결합을 포함하는 나노섬유의 제조방법의 일 구현예의 반응 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 PCL-PEG 블록공중합체의 나노섬유 표면을 카테콜로 개질시킨 후, 나노섬유의 모습을 주사전자현미경을 통해 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 카테콜로 표면 개질된 PCL-PEG 나노섬유에 대한 물방울 접촉각 시험을 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유에 대해, Cy3-SH 결합시험을 수행한 결과, 시간의 경과에 따른 Cy3-SH 결합율을 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유에 대해 Cy3-SH와의 결합반응을 완료한 다음 CLSM을 통해 Cy3-SH를 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유에 대해, NIH 3T3 섬유아세포의 배양 시험을 수행한 결과, 세포접착속도를 도시한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유에 대해, NIH 3T3 섬유아세포의 배양 시험을 수행한 결과, 배양시험을 수행한지 30 분이 경과한 시점의 나노섬유의 표면에서의 세포의 모습을 CLSM을 통해서 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명이 일 구현예에 따른 PLGA-SH의 합성 반응식이다.
도 10은 본 발명이 일 구현예에 따른 cPEG (8-arm PEG-catechol)의 합성 반응식이다.
도 11은 교차결합제 NaIO4에 의해 PLGA-SH의 티올기와 cPEG의 카테콜 간의 교차결합이 이루어지는 과정 및 카테콜기간의 자가 폴리머화(self-polymerization)가 이루어지는 과정을 나타낸 반응식이다.
도 12는 본 발명이 일 구현예에 따라 합성된 cPEG의 1H-NMR 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 나노섬유와 교차결합반응이 수행되지 않은 나노섬유의 시차주사열량을 측정한 결과를 나타낸 그래프 및 표이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 나노섬유의 수접촉각 시험 시 5초 후의 물방울을 촬영한 사진(A) 및 5 초 후의 수접촉각을 측정한 결과를 정리한 표(B)이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 교차결합 나노섬유(B)와 교차결합을 수행하지 않은 비교차결합 나노섬유(A)의 날짜의 경과에 따른 질량부식율를 도시한 그래프 및 FE-SEM 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 교차결합 나노섬유(B)와 교차결합을 수행하지 않은 비교차결합 나노섬유(A)의 시간의 경과에 따른 단백질 흡착율를 도시한 그래프 및 CLSM 사진이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 교차결합 나노섬유(B)와 교차결합을 수행하지 않은 비교차결합 나노섬유(A)의 시간의 경과에 따른 세포 흡착율를 도시한 그래프 및 CLSM 사진이다.
<도면의 기호에 대한 설명>
PCL: 폴리(e-카프롤락톤)
PEG: 폴리에틸렌글리콜
nanofiber (NF): 나노섬유
CNF 또는 카테콜-NF: 카테콜화 나노섬유
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 폴리(e-카프롤락톤)-폴리(에틸렌글리콜)(PCL-PEG) 나노섬유의 제조
메탄올과 클로로포름 혼합액(3:1, v/v) 10 ml에 0.8g PCL-PEG를 완전히 녹인 후, 전기방사에 사용하였다. 전기방사는 주사기 바늘의 직경은 27 G를 사용하였고, 토출속도 1 ml/h와 그라운드와 주사기바늘 사이의 전압과 거리는 각각 20 kV, 15 cm의 조건에서 진행하였다.
실시예 2: 카테콜로 표면 개질된 PCL-PEG 나노섬유(catechol-nanofiber, CNF)의 제조
카테콜을 표면개질하기 전, 나노섬유 표면에 노출된 아민을 정량하였다. PEG 체인의 말단에 아민기가 존재하기 때문에 나노섬유는 수상에서 친수성 고분자인 PEG에 의해 말단의 아민기가 노출되게 된다. 나노섬유 표면의 아민기를 정량하기 위해서 플루오르스카민 어세이(fluorescamine assay)를 사용하였다. 1 ml의 50% 에탄올에 담긴 나노섬유에 0.3 mg/ml 플루오르스카민 시약을 100 μl 첨가시킨 후, 상온에서 30 분간 반응시켰다. 그 후, 나노섬유를 디클로로메탄과 에탄올 혼합액(1:1, v/v)에 녹여서 형광(ex. 3990 nm, ex. 475nm)을 측정하였다.
나노섬유 표면을 카테콜(3,4-dihydroxyl-phenyl-propionic acid (DHPP))로 화학적으로 개질시켜주기 위하여 커플링제로서 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)를 사용하였다. 이때, DHPP는 나노섬유 표면에 노출된 아민기의 몰(mole)에 대해 0.5와 1배 넣어 주었으며, 커플링제는 DHPP의 mole에 대해 각각 5 배 넣어주었다. 반응은 50% 에탄올 상에서 진행되었으며, 상온에서 12시간 반응시킨 후, 반응하지 않은 DHPP를 제거해주기 위해서 50% 에탄올로 세척해 주었다.
하기 표 1은 PCL-PEG 나노섬유 표면의 아민기가 카테콜로 치환되는 정도(DS)를 나타낸 것이다. 나노섬유 표면에 노출된 아민기는 약 6.64 nmol/mg으로 정량되어 이 수치를 기준으로 카테콜은 아민기의 몰비에 0.5, 1, 그리고 3배에 해당되는 양으로 치환을 진행하였다. 그 결과, 몰비가 1:3일 때 DS는 약 100%로 치환효율이 우수한 것을 확인하였다. 하기 연구에서는 나노섬유 표면에 카테콜이 치환된 정도가 61%인 CNF와 91%인 CNF로 실험을 진행하였다.
[표 1]
Figure pat00001
상기 PCL-PEG 나노섬유 표면을 카테콜로 개질시킨 후, 나노섬유의 모습을 주사전자현미경을 통해 관찰한 결과를 촬영한 사진을 도 3에 나타내었다. 카테콜로 표면개질된 나노섬유는 나노섬유 특유의 모습인 다공도와 나노크기의 직경을 잃지 않고 유지하고 있는 것이 확인되였다. 특히, 고농도의 카테콜용액에 담가서 표면개질하는 기존의 방법을 통한 나노섬유의 경우 볼 수 있는 카테콜 파티클(particle)이 본 발명에 따라 CNF(61% CNF 및 91% CNF)의 표면에서는 보이지 않았다. 즉, 카테콜 단분자로 나노섬유 표면이 개질되었음을 알 수 있다.
시험예 1: 티올화 Cy-3(Cy3-SH)의 CNF에 대한 결합 시험
Cy3-SH를 만들기에 앞서, Cy3-NH2를 제조하였다. 1 μmol/ml의 에틸렌디아민에 25 μg/ml의 Cy3-NHS를 첨가한 후, pH 9.0의 탄산나트륨 용액 상에서 한시간 동안 반응 시켰다. Cy3-Cy3를 제거하기 위해서 투석(MWCO 1,000)을 진행하였으며, 투석막 밖의 용액 (Cy3-NH2)을 동결건조한 후 다음 실험에 사용하였다. 50 nmol/ml의 Cy3-NH2에 100 μg/ml의 트라우트 시약(Traut's reagent)를 첨가해 줌으로써 Cy3-SH를 제조하였으며, 이 때의 Cy3-NH2와 트라우트 시약의 몰비는 1:1.2로 진행하였다. HS-HS를 제조하기 위해서는 1 μmol/ml의 에틸렌디아민에 1 mg/ml의 트라우트 시약을 사용하였으며, 이 때의 에틸렌디아민과 트라우트 시약의 몰비는 1:1.2로 진행하였다. 두 티올화 반응은 모두 pH 7.4의 PBS에 2 mM EDTA를 섞은 용액 상에서 진행되었으며, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 티올기를 정량하기 위해서는 엘만 어세이(Ellman's assay)를 진행하였고, 그 결과를 가지고 이후 실험을 진행하였다.
CNF 표면에 Cy3-SH의 결합을 확인하기 위하기에 앞서, 상기 실시예 2에서 제조된 CNF를 10 mM의 바이신 버퍼(bicine buffer) (pH 8.5), 인산완충액(PBS)(pH 7.4), 그리고 시트레이트 버퍼(citrate buffer) (pH 5.4)에 각각 1시간 동안 담가 주었다(pre-soaking). 그 후, 두 개의 CNF를 형광용 큐벳에 넣고 Cy3-SH와 HS-SH가 1:9의 몰비로 섞인 티올용액을을 4 nmol/2ml 첨가해 주었다. 각 시간마다 ex. 550nm와 em. 56nm에서 형광을 측정하였다.
상기 실시예 1, 2 및 시험예 1에 따른, CNF의 제조 반응 및 CNF가 티올 화합물에 결합되는 양상의 모식도를 도 1에 나타내었다.
상기 실시예 2에서 제조된 CNF(블랭크 CNF, 61% CNF, 91% CNF) 이외에도, 상기 표 1의 종래 방법에 따른 폴리카테콜화 나노섬유인 6 nmol CNF, 11 μmol/ml CNF에 대해서도 동일한 Cy3-SH 결합시험을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유와 함께, Cy3-SH 결합시험을 수행한 결과, 시간의 경과에 따른 Cy3-SH 결합율을 도시한 그래프이다. 도 5의 (A)는 10mM 바이신 버퍼(pH 8.5), (B)는 PBS (pH 7.4), 그리고 (C)는 시트레이트 버퍼(pH 5.4)에서 진행한 결과이다. 각 값들은 블랭크 NF에 비특이적으로 붙은 티올기를 을 제외한 값이다.
종래 폴리카테콜화 나노섬유(6 nmol CNF 및 11 μmol/ml CNF)은 모든 pH 조건에서 낮은 Cy3-SH와의 결합을 보여주었다. 하지만, 본 발명의 일 구현예에 따른 61%와 91% CNF는 pH가 염기성으로 갈수록 Cy3-SH와의 2~5배 많은 결합양을 보여주었다. 특히, pH 7.4에서는 표면에 개질된 카테콜의 양이 많은 91% CNF가 61% CNF에 비해 2.6배의 많은 Cy3-SH 결합양을 보여주었다. 흥미롭게도, pH 8.5에서는 61% CNF가 91% CNF에 비해 1.2배 높은 결합양을 보여주었다. 이는 Cy3-SH와의 결합 실험을 진행하기 전, 실험에 사용할 CNF들을 미리 각각의 pH가 서로 다른 버퍼 상에서 1시간 동안 pre-soaking을 진행하였는데, 이 동안 표면에 가장 많은 카테콜이 있는 91% CNF 표면의 카테콜들이 인접한 카테콜들과 다이머화(dimerization)가 진행됨에 따라 Cy3-SH와 결합할 수 있는 이탈기(산화 퀴논 폼)의 수가 줄어들었기 때문이다. 반응이 끝난 후, CLSM을 통해 표면에 결합된 Cy3-SH을 관찰한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유에 대해 여러 pH 조건 하에서 Cy3-SH와의 결합반응을 완료한 다음 CLSM을 통해 Cy3-SH를 관찰한 결과를 촬영한 사진이다. 도 6은 도 5의 결과와 동일하게 pH 8.5상에서 티올기 결합을 진행한 61% CNF 표면에서 가장 많은 Cy3-SH를 확인할 수 있었다.
시험예 2: CNF 위에서의 NIH 3T3 섬유아세포의 배양 시험
섬유아세포는 접착세포로써 바닥에 접착한 후, 세포질을 뻗고 성장을 시작한다. 그래서 본 연구에서는 CNF의 세포 접착속도를 확인하였다. 실험은 모두 단백질의 영향을 배제하기 위하여 혈청(serum)이 없는 DMEM (pH 7.4)상에서 진행하였다.
CNF의 세포 접착능을 확인하기 위하여, CNF를 PBS(pH 7.4)에서 1 시간 동안 담갔다(pre-soaking). 이후, PBS를 제거한 CNF 위에 0.67x104cells/ml의 세포 용액 1.5 ml 를 첨가하였다. 그 후, 0.17, 0.5, 1, 2, 그리고 3시간 동안 혈청이 없는 DMEM (pH 7.4)에서 세포의 접착거동을 관찰하였다. 각 시간이 지난 후, CNF에 붙지 않은 세포를 제거해 주기 위해서 PBS를 첨가해 준 후, 250 rpm에서 3 분동안 진탕해주었으며 이 과정을 총 5 번 진행하였다. CNF 위에 접착한 세포를 형광현미경(Confocal laser scanning microscope, CLSM)으로 관찰하기 위하여, 먼저 2.5% 포름알데히드로 15 분 동안 세포를 고정해 주었다. 고정된 세포를 PBS로 세척한 후, 0.2% Triton X-100에 10 분 동안 두어서 세포막을 약하게 해주고 세척하였다. 세포의 F-액틴을 염색하기 위해서 200 유닛/ml의 Phalloidin 488을 5 μl와 세포의 핵을 염색해주기 위해서 0.5 mg/ml의 DAPI 2 μl를 함께 첨가 한 후 15분 동안 염색을 진행하였다. 염색에 참여하지 않은 염료(dyes)를 제거해 주기 위해서 PBS로 5 차례 세척해 준 후, CLSM을 통해서 세포의 수 및 모양을 관찰하였다. 이 때, Phalloidin 488을 관찰하는데 ex. 496nm을 사용하였고, DAPI를 관찰하는데 ex. 358nm를 사용하였다.
상기 실시예 2에서 제조된 CNF(블랭크 CNF, 61% CNF, 91% CNF) 이외에도, 상기 표 1의 종래 방법에 따른 폴리카테콜화 나노섬유인 6 nmol CNF, 11 μmol/ml CNF에 대해서도 동일한 NIH 3T3 섬유아세포의 배양 시험을 수행하였다. 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유와 함께, NIH 3T3 섬유아세포의 배양 시험을 수행한 결과, 세포접착속도를 도시한 그래프이다.
도 7에 따르면, 2시간 동안 카테콜이 없는 나노섬유에 비해 61% CNF와 91% CNF는 각각 4.7배와 5.5배의 빠른 접착속도를 보여주었다. 더군다나 91% CNF는 종래 방법(고농도 카테콜 용액에 담궈 표면개질시키는 방법)으로 표면개질시킨 11 μmol/ml CNF보다 약 2.4배의 빠른 접착속도를 보여주었다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 카테콜화 나노섬유 및 종래 방법(고농도의 카테콜 용액에 담구어 표면개질 시키는 방법)에 따른 폴리카테콜화 나노섬유와 함께, NIH 3T3 섬유아세포의 배양 시험을 수행한 결과, 배양시험을 수행한지 30 분이 경과한 시점의 나노섬유의 표면에서의 세포의 모습을 CLSM을 통해서 관찰한 결과를 촬영한 사진이다. F-actin(초록색)은 Alexa Fluor Phalloidin 488로 염색하였고, 핵(파란색)은 DAPI로 염색하였다.
도 8에 따르면, 세포의 접착 실험을 진행한지 30분이 경과한 시점의 나노섬유 표면에서의 세포의 모습이다. 61% CNF와 91% CNF는 다른 그룹들에 비해서 매우 빠른 세포질의 뻗음현상을 보여주고 있다. 91% CNF의 표면에 개질된 카테콜의 양이 약 6 nmol인 것을 생각하면, 이는 매우 적은 양의 카테콜로 표면을 개질시킨 나노섬유가 세포의 접착속도를 증가시켜 세포의 증식을 촉진시킬 수 있다고 사료된다.
시험예 3: CNF의 친수성 정도 평가
상기 실시예 2에서 제조된 나노섬유의 친수성을 평가하기 위해 수접촉각(water-contact angle)을 측정하였다. 물방울을 나노섬유 표면에 떨어뜨린 뒤, 1초와 30초 후의 물방울의 접촉각을 측정하였다.
그 결과를 하기 표 2 및 도 4에 나타내었다. 도 4에서 CNF 표면의 친수성이 클수록 물방울과 나노섬유가 이루는 접촉각이 작다.
[표 2]
Figure pat00002
카테콜은 두 개의 히드록실기가 존재하기 때문에 소수성 물질의 표면을 개질시켰을 경우, 그 물질의 표면은 친수성의 성질로 개질시켜준다. 하지만 본 시험결과(표 2 및 도 4)에 따르면, 91% CNF는 blank NF보다 약 14% 표면 접촉각이 줄어 약간 친수성이 증가하였지만 61% CNF는 큰 차이를 보여주지 않는다. 이는 종래의 방법(고농도의 카테콜 용액에 담가두어 표면개질시키는 방법)에서 사용한 11 μmol/ml의 카테콜 용액에 비해 현격히 적은 4 와 6 nmol의 카테콜들이 나노섬유 표면에 개질되어 있기 때문이다.
실시예 3: 카테콜 및 티올의 교차결합 포함 나노섬유의 제조
(1) PLGA-SH와 cPEG의 합성
PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid), lactic:glycolic acid=75:25, MW 20,000)를 디클로로메탄에 녹인 후, 디클로헥실카르보디이미드(DCC)와 N-히드록시숙신이미드(NHS)를 5 배의 몰비로 넣어주어 PLGA의 카복실기말단을 활성화 시켰다. 여기에 에틸렌디아민(ethylenediamine)을 2 배 몰비로 넣어 펩티드 결합을 통해 PLGA에 연결시킨 후, 트라우트 시약(traut's reagent)을 5 배 몰비로 넣어 아민그룹 말단을 티올(thiol)기로 치환시켜 최종적으로 티올화 PLGA를 얻었다. 합성 후, 엘만 어세이(Ellman's assay)를 진행하여 티올화 정도를 알아보았다. 상기 PLGA-SH의 합성 반응식을 도 9에 나타내었다.
cPEG는 먼저 아민기 말단을 갖는 8-암 PEG(8-arm PEG)를 디메틸포름아미드(DMF)와 클로로포름 2:1 혼합물에 완전히 녹인 후, 3, 4-디히드록시페닐아민(DHPA)과 O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-유로늄-헥사플루오로-포스페이트(HBTU)를 1.2배 몰비로 첨가하였다. 여기에 트리에틸아민(Et3N)을 2.2 배 몰비로 첨가한 후, 1 시간동안 교반하여 반응시켰다. 반응한 혼합물을 냉 에틸에테르에 침전시켜 말린 후, 침전물을 메탄올에 녹여 투석(dialysis)를 시켜 cPEG을 얻었다. 1H-NMR과 UV-Vis 스펙트로스코피를 이용해 카테콜의 결합과 합성률을 확인하였다. 상기 cPEG (8-arm PEG-catechol)의 합성 반응식을 도 10에 나타내었으며, 1H-NMR 결과를 도 12에 나타내었다.
(2) 전기방사를 이용한 PLGA/cPEG 나노섬유의 제작
PLGA-SH와 cPEG을 PLGA-SH/cPEG (용액중 중량농도%)가 100/0(40%), 90/10(41%), 70/30(43%) 50/50(48%)의 다양한 비율로 디메틸클로로메탄(dichloromethane, DCM)에 녹여 고분자 용액을 제조하였다. 상기 고분자 용액을 0.5 ml/h로 27G needle을 통해 흘려주고, 여기에 20 kV의 전하를 가해 그라운드(ground)에 증착되도록 하는 전기방사법을 이용하여 나노섬유를 제조하였다. 이때 교차결합제로서 3 mM의 과요오드산나트륨(NaIO4)을 처리하였다.
상기 PLGA-SH와 cPEG가 전기방사법에 의해 나노섬유를 형성하는 과정 및 교차결합제 NaIO4에 의해 교차결합이 이루어지는 과정의 모식도를 도 2에 나타내었다.
또한, 교차결합제 NaIO4에 의해 PLGA-SH의 티올기와 cPEG의 카테콜 간의 교차결합이 이루어지는 과정 및 카테콜기간의 자가 폴리머화(self-polymerization)가 이루어지는 과정을 도 11에 나타내었다. 이러한 교차 결합 및 자가 폴리머화에 의해 나노섬유의 물리적 강도가 증가하며, 노출된 PEG는 원하지 않는 조직 부착을 방지하는 역할을 하고(anti-fouling effect), 교차결합에 참여하지 않고 남아 있는 카테콜 분자는 조직 부착성(tissue adhesiveness)을 유발하여 부착부위에 피팅시키는 역할을 수행할 수 있어, 조직 부착 방지막으로서 사용하기에 더욱 유리하다.
NaIO4 처리 후, cPEG의 카테콜과 PLGA-SH의 티올기 간의 교차결합을 확인하기 위해 시차주사열량법을 수행하였다. 2주기 가열법(Two heating cycles)으로 주기 1은 30℃에서 100℃까지 20℃/분으로 온도를 높여주고, 주기 2는 다시 100℃부터 -50℃까지 10℃/분으로 냉각시킨다. 주기 3에서 -50℃부터 100℃까지 10℃/분으로 다시 가열하면서 유리전이온도(glass transition temperature: Tg)와 녹는점(Tm)을 확인하였다.
그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13은 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 나노섬유와 교차결합을 수행하지 않은 나노섬유의 시차주사열량을 측정한 결과를 나타낸 그래프 및 표이다.
전기방사나노섬유를 제작한 후, 과요오드화 나트륨을 처리해 교차결합을 진행한 그룹을 교차결합 NF (cross-linked nanofier의 약칭), 아무런 처리를 하지 않은 컨트롤 그룹을 비교차결합 NF라고 명명하였다. PLGA는 무결정형 고분자(amorphous polymer)로 특정 유리상전이온도(glass transition temperature, Tg)는 보이지만, 녹는점(melting temperature, Tm)을 보이지 않는다. 반면, PEG는 결정형 고분자(crystalline polymer)로 Tg는 나타나지 않지만, Tm을 보인다. 따라서 이 실험에서 교차결합 유무와 혼합비율에 따른 PLGA-SH와 cPEG 각각의 고분자 특성의 변화를 관찰하였다. 도 13의 결과에 따르면, 비교차결합 NF에서는 혼합비가 증가할수록 즉, cPEG의 함량이 증가할수록 Tg가 낮아지는 현상이 관찰되었다. 이는 물리적으로 섞여있는 cPEG이 가소제(plasticizer) 역할을 하여 PLGA간의 상호작용을 방해하기 때문에 생긴 현상이다. 반면, 교차결합 NF는 혼합비가 증가할수록 Tg가 높아지는데 이 이유는 교차결합에 의해 PLGA-SH와 cPEG간 혹은 cPEG-cPEG간의 결합이 생기면서 전반적인 고분자 체인의 길이가 길어져 생기는 것이다.
순수 cPEG(powder)의 경우, 2개의 뚜렷한 녹는점 피크가 보인다. 나노섬유 형태로 제작된 후에는 교차결합의 유무에 관계없이 Tm이 약간 증가되었다. 그럼에도 불구하고 비교차결합 NF에서는 여전히 2개의 Tm peak가 관찰된다. 반면, 교차결합 NF는 1 개의 Tm 피크만 나타내는 것으로 보아 교차결합에 의해 PLGA-SH와 cPEG간의 결합이 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있었다.
시험예 4: CNF의 친수성 정도 평가
상기 실시예 3에서 제조된 나노섬유의 친수성을 평가하기 위해 수접촉각(water-contact angle)을 측정하였다. 물방울을 나노섬유 표면에 떨어뜨린 뒤, 5초 후의 물방울의 접촉각을 측정하였다.
그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 13은 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 나노섬유의 수접촉각 시험 시 5초 후의 물방울을 촬영한 사진(A) 및 5 초 후의 수접촉각을 측정한 결과를 정리한 표(B)이다.
도 14의 A(a)는 비교차결합 NF의 사진이고, A(b)는 교차결합 NF의 사진이다. PEG 성분이 증가하면 나노섬유의 친수성이 증가하게 된다. 하지만 도 14A(a)에서는 혼합비율에 관계없이 접촉각이 94~97 °로 cPEG을 함유하지 않는 순수 PLGA NF의 접촉각과 유사하다. PEG가 섞여 있음에도 불구하고 비교적 소수성의 성질을 나타내는 것은 수용성 PEG가 실험 전 세척 과정에서 모두 씻겨 내려갔기 때문인 것으로 보인다. 교차결합 NF는 자가 폴리머화 혹은 PEG의 카테콜과 PLGA의 티올기가 화학적으로 결합되어 있어 PEG이 나노섬유에 묶여있는 반면 비교차결합 NF는 PEG가 물리적으로만 섞여 있어 물에 금방 녹아 나오는 것이다. 따라서 도 14 A(b)와 같이 교차결합 NF의 경우, cPEG 함량이 증가함에 따라 친수성이 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 이는 나노섬유에 묶여져 있는(tethering 되어 있는) PEG에 의해 표면 성질이 친수성에 가까워지는 것이다.
시험예 5: CNF의 분해성 시험
상기 실시예 3에서 제조된 나노섬유의 교차결합 유무에 따른 물리적 강도의 향상을 측정하기 위해 분해속도를 측정하였다. 나노섬유를 1x PBS(pH 7.4)에 담군 후, 37℃에서 15 일동안 배양 하였다. 분해 후, 3, 7, 10, 15일째 되는 샘플을 d.w.로 세척한 후, 완전히 말려 무게를 측정하여 질량부식(mass erosion) (%)을 하기 식에 따라 계산하였다.
질량부식(Mass erosion) (%) = 100(%)-[(Wday0-Wdayx)/Wday0 x 100]
Wday0 =처음 나노섬유의 무게, Wdayx =분해 후, x 일째 무게
15일까지 분해 후, FE-SEM(field emission scanning electron microscope)을 통해 나노섬유의 모양변화를 관찰하였다.
그 결과 얻어진 질량부식율을 시간의 경과에 따라 기록한 그래프 및 FE-SEM을 통해 관찰한 결과를 촬영한 사진을 도 15에 나타내었다. 도 15는 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 교차결합 나노섬유(B)와 교차결합을 수행하지 않은 비교차결합 나노섬유(A)의 날짜의 경과에 따른 질량부식율를 도시한 그래프 및 FE-SEM 사진이다.
PLGA-SH/cPEG 나노섬유의 분해양상을 생리학적 조건 하에서 15일동안 모니터링한 결과, 비교차결합 NF는 교차결합 NF와 비교하였을 때, 모든 혼합비에서 빠른 분해속도를 보이며, 특히 cPEG 함량이 가장 높은 50/50이 가장 빠른 분해를 보인다. 도 14에서 우측의 SEM 이미지 또한 15일 후, 나노섬유의 구조가 거의 녹아 사라진 것을 보여주고 있다. 반면, 교차결합 NF 경우, 모든 혼합비율의 나노섬유가 100/0보다도 느리게 분해되었다. 흥미롭게도 50/50이 cPEG 함량가 가장 높음에도 불구하고 15일째 질량부식율이 86.9%로 비교차결합 NF의 50/50(24.5%)과 비교했을 때 분해속도가 4 배나 더 지연된 것으로 확인되었다. 또한, 15일이 지났음에도 불구하고 섬유구조를 유지하고 있는 것을 SEM이미지를 통해 확인하였다. 이로써 PLGA와 cPEG간 교차결합 혹은 cPEG 간의 교차결합이 성공적으로 이루어져, 물리적 강도가 증가하여 분해속도가 느려짐을 확인했으며, 나노섬유의 구조 또한 성공적으로 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 6: 조직부착 방지 효과(Anti-fouling effect) 시험
나노섬유표면에 대한 생체활성물질의 부착을 저해하는 효과(anti-fouling effect)를 측정하기 위해 단백질 흡착(protein binding)과 세포부착(cell attachment test)률을 측정하였다. 나노섬유를 1 ml의 BSA(Bovine serum albumin)용액 (10 μg/ml in d.w.)에 담군 후, 150 분동안 상층액을 수거하여 단백질 흡착을 모니터링 하였다. 상층액에 수거된 단백질양을 BCA(Bicinchoninic acid) 어세이를 통해 정량하여, 나노섬유에 붙은 단백질양을 역으로 정량하였다. 또한, 형광물질인 FITC(Fluorescein isothiocyanate)로 라벨링 된 BSA(FITC-BSA)를 이용하여 같은 방법으로 실험을 진행하여 CLSM(confocal laser scanning microscope)으로 나노섬유 표면에 붙은 FITC-BSA 정도를 관찰하였다. 세포부착률은 NIH 3T3세포를 5x104 cells/device 농도로 나노섬유에 시딩(seeding)한 후, 6 시간동안 모니터링하였다. 1, 3, 6시간째 나노섬유에 붙은 세포의 DNA를 TRIzol 시약을 이용해 추출하여 정량하여, 나노섬유 표면에 붙은 세포의 수를 측정하였다. 또한, 섬유 표면에 부착된 세포의 모양을 관찰하기 위해 세포골격과 핵을 Oregon green 488과 DAPI로 염색하여 CLSM을 통해 관찰하였다.
그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 교차결합 나노섬유(B)와 교차결합을 수행하지 않은 비교차결합 나노섬유(A)의 시간의 경과에 따른 단백질 흡착율를 도시한 그래프 및 CLSM 사진이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 따라 다양한 PLGA-SH/cPEG의 비율로 제조된 교차결합 나노섬유(B)와 교차결합을 수행하지 않은 비교차결합 나노섬유(A)의 시간의 경과에 따른 세포 흡착율를 도시한 그래프 및 CLSM 사진이다.
도 16의 결과에 따르면, 비교차결합 NF의 경우, 교차결합 NF의 단백질 흡착률보다 훨씬 많은 수준의 단백질이 흡착되는 것이 관찰되엇다(도 16A). 위에서 언급한 것처럼 교차결합 NF는 cPEG이 나노섬유에 묶여있는 (tethering) 상태라 비교차결합 NF에서 처럼 밖으로 녹아나오지 않고 표면에 노출되어 있다. 따라서, 나노섬유 표면으로의 단백질 흡착을 저해하는 조직부착방지 효과를 나타내는 것이다(도 16B). 비교차결합 NF의 50/50는 다른 혼합비율에 비해 약간 낮은 단백질 흡착률을 보이는데, 이는 50/50에 포함된 cPEG의 양이 다른 혼합비율에 비해 비교적 많아서 실험도중 상층액으로 녹아나가는 cPEG을 제외하고, 그래도 여전히 남아있는 cPEG 때문에 약간의 조직부착방지 효과를 나타내는 것으로 보인다. 도 16의 그래프 아래쪽에 CLSM 이미지를 통해서도 교차결합 NF에서 cPEG 함량이 높아짐에 따라서 단백질 흡착이 저해됨을 확인할 수 있었다.
도 17의 결과에 따르면, 동물세포의 부착률을 측정한 결과, 단백질 흡착실험과 유사하게 교차결합 NF에서 세포부착률이 현저하게 낮은 것으로 확인되었다. cPEG 함량이 높아짐에 따라 조직부착방지 효과가 증가하였으며, 이는 CLSM 이미지를 통해서도 알 수 있었다.
상기 시험 결과에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 PLGA-SH/cPEG를 포함하는 교차결합 포함 나노섬유는 교차결합제를 처리함에 따라 PLGA-SH의 티올기와 cPEG의 카테콜간의 결합 또는 cPEG의 카테콜간의 자가 폴리머화가 성공적으로 이루어져 나노섬유의 전반적인 물리적 강도가 증가하는 것으로 확인되었으며, PEG 성분이 나노섬유에 묶여짐(tethering 됨)에 따라 표면의 친수성 또한 증가하였으며, 이에 따라 단백질과 동물세포에 대해 훌륭한 조직부착방지효과(anti-fouling effect)를 나타내는 것으로 보아 PLGA-SH/cPEG를 포함하는 교차결합 포함 나노섬유는 조직부착방지막(anti-adhesive barrier)으로써 매우 적합하다고 확인되었다.

Claims (25)

  1. 폴리에스테르계 고분자 화합물에 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 카테콜화 폴리에스테르계 화합물을 포함하는 나노섬유.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리에스테르계 고분자 화합물은 폴리락틱글리콜산(PLGA), 폴리(e-카프롤락톤) 및 폴리에틸렌글리콜의 블록 공중합체(PCL-PEG 블록 공중합체), 폴리글라이콜라이드 (PGA), 폴리락틱산 (PLG), 폴리하이드록시발러레이트 (PHV), 폴리하이드록시부틸레이트 (PHB), 폴리하이드록시알카노에이트 (PHBV), 폴리하이드록시프로피오닉산 (PHPA), 폴리비닐알코올 (PVOH), 폴리다이옥사논 (PDO), 폴리언하이드라이즈 (PAH), 폴리트리메틸렌 카보네이드 (PTMC), 폴리포스파젠 (PPZ), 폴리우레탄 (PU) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 나노섬유.
  3. 제1항에 있어서, 상기 카테콜 단분자 화합물은 3,4-디히드록실-페닐알라닌(DOPA), 3,4-디히드록실-페닐-프로피온산(DHPP), 3,4-디히드록실-페닐-시나믹산 (DPCA), 3,4-디히드록실벤즈알데하이드 (DHBA), 3,4-디히드록시페닐-1-옥소-2-프로페닐-옥시-3-3,4-디히드록시페닐-프로패오닉산 (DHOPDHPA), 3,4-디히드록시스틸-4-히드록시-2-피론 (DHHP), 및 이들의 조합으로부터 선택되는 나노섬유.
  4. 제1항에 있어서, PEG의 말단에 아민기가 존재하는 폴리(e-카프롤락톤)-폴리에틸렌글리콜 블록 공중합체(PCL-PEG 블록 공중합체)의 아민기에 카테콜 단분자 화합물이 공유결합된 나노섬유.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 나노섬유를 세포의 접착 속도 또는 세포의 증식을 촉진하기 위해 사용하는 방법.
  6. 폴리에스테르계 고분자 화합물을 포함하는 나노섬유를 카테콜 단분자 화합물과 반응시켜 나노섬유에 카테콜 단분자 화합물을 공유결합시키는 것을 포함하는, 나노섬유를 개질하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리에스테르계 고분자 화합물은 폴리락틱글리콜산(PLGA), 폴리(e-카프롤락톤)(PCL) 및 폴리에틸렌글리콜의 블록 공중합체, 폴리글라이콜라이드 (PGA), 폴리락틱산 (PLG), 폴리하이드록시발러레이트 (PHV), 폴리하이드록시부틸레이트 (PHB), 폴리하이드록시알카노에이트 (PHBV), 폴리하이드록시프로피오닉산 (PHPA), 폴리비닐알코올 (PVOH), 폴리다이옥사논 (PDO), 폴리언하이드라이즈 (PAH), 폴리트리메틸렌 카보네이드 (PTMC), 폴리포스파젠 (PPZ), 폴리우레탄 (PU) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 카테콜 단분자 화합물은 3,4-디히드록실-페닐알라닌(DOPA), 3,4-디히드록실-페닐-프로피온산(DHPP), 3,4-디히드록실-페닐-시나믹산 (DPCA), 3,4-디히드록실벤즈알데하이드 (DHBA), 3,4-디히드록시페닐-1-옥소-2-프로페닐-옥시-3-3,4-디히드록시페닐-프로패오닉산 (DHOPDHPA), 3,4-디히드록시스틸-4-히드록시-2-피론 (DHHP) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 나노섬유를 포함하는 상처 치유용 드레싱제.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 나노섬유를 포함하는 세포배양용 플라스틱웨어용 코팅막.
  11. PEG의 말단에 작용기가 도입된 아민화 PCL-PEG 블록 공중합체를 나노섬유로 제조하는 단계; 및
    상기 나노섬유를 카테콜 단분자 화합물 및 커플링제와 유기용매 상에서 반응시켜 카테콜 단분자를 PEG 말단의 작용기에 결합시키는 단계를 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 전기방사 나노섬유의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 작용기는 카르복실기, 아민기, 티올기, 에폭시, 아크릴레이트, 또는 석신이미드인 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 카테콜 단분자 화합물은 3,4-디히드록실-페닐알라닌(DOPA), 3,4-디히드록실-페닐-프로피온산(DHPP), 3,4-디히드록실-페닐-시나믹산 (DPCA), 3,4-디히드록실벤즈알데하이드 (DHBA), 3,4-디히드록시페닐-1-옥소-2-프로페닐-옥시-3-3,4-디히드록시페닐-프로패오닉산 (DHOPDHPA), 3,4-디히드록시스틸-4-히드록시-2-피론 (DHHP), 및 이들의 조합으로부터 선택되는 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 커플링제는 NHS(N-hydroxysuccinimide) 및 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), HOBt (hydroxybenzotriazole), 디사이클로헥실카보디이미드 (DCC), 디아이소프로필카보디이미드 (DIC) 벤조트라이졸-1-일록시-트리-디메틸아미노-포스포니움-헥사플루오로포스페이트 (BOP), 및 이들의 조합으로부터 선택되는 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-암(multi-arm) 폴리에틸렌글리콜(cPEG)을 포함하는 나노섬유로서, 상기 카테콜 및 티올의 교차결합 및 카테콜과 카테콜간의 교차결합을 포함하고, 상기 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)은 락타이드:글리콜라이드의 비율이1:0 ~ 0:1인 나노섬유.
  16. 제15항에 있어서, 상기 락타이드:글리콜라이드의 비율이 50:50~75:25 인 나노섬유.
  17. 제15항에 있어서, 상기 카테콜화 멀티-암 폴리에틸렌글리콜은 카테콜화 4 내지 8-암 폴리에틸렌글리콜인 나노섬유.
  18. 제15항에 있어서, 상기 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)의 카테콜화 멀티-암 폴리에틸렌글리콜(cPEG)에 대한 질량비율이 9:1 ~ 1:9인 나노섬유.
  19. 제15항에 있어서, 상기 카테콜의 50% 이상이 티올과 교차결합 되는 나노섬유.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 나노섬유를 포함하는 조직부착 방지막.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 나노섬유를 조직부착 방지막의 제조에 사용하는 방법.
  22. 티올화 폴리락틱글리콜산(PLGA-SH)과 카테콜화 멀티-arm 폴리에틸렌글리콜(cPEG)의 혼합용액을 전기방사법에 의해 나노섬유로 제조하는 단계; 및
    상기 나노섬유를 교차결합 시약으로 처리하여 나노섬유 중의 티올기와 카테콜기를 서로 교차결합시키는 단계를 포함하는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 나노섬유의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 교차결합시약은 과요도드산나트륨(NaIO4), 질산은 (silver nitrate), 바이신 버퍼 (bicine buffer), 카테콜 옥시다아제 (catechol oxidase), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 질산구리 (cupper nitrate), 타이로시나아제 (tyrosinase) 및 이들의 조합에서 선택되는 제조방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 혼합용액의 용매는 탄소수 1 ~ 5의 탄화수소계 유기용제인 제조방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 전기방사법은 니들과 그라운드 사이의 거리가 5 ~ 30 cm, 전압 0.1 ~ 30 kv, 유속 0.1 ~ 100 mL/h의 범위로 이루어지는 제조방법.
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