CN108025477A - 聚合物产品及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了聚合物产品和制备该聚合物产品的方法，其包括由包含至少一种聚合物和至少一种交联剂的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品。在某些实施方式中，交联剂包含至少一种儿茶酚胺或至少一种多酚，其中该方法包括(i)使用包含聚合物和至少一种儿茶酚胺或至少一种多酚的纺丝原液溶液静电纺丝生物相容性聚合物产品，和(ii)将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。本发明的纺丝原液溶液和聚合物产品还可以包括抗微生物剂、金属离子和其它物质。

Description

聚合物产品及其制备

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年7月7日提交的新加坡专利申请号10201505350V；于2015年7月7日提交的新加坡专利申请号10201505351Q；和于2015年7月7日提交的新加坡专利申请号10201505355T的优先权；这些申请通过引用整体并入本文。

关于在政府资助的研究和开发下完成的发明的权利声明

本发明是在新加坡国立医学研究委员会授予的批准号为NMRC/CBRG/0048/2013和NMRC/TCR/008-SERI/2013的政府支持下完成的。

背景技术

本发明涉及聚合物产品及其制备。聚合物纤维具有多种应用，包括在医疗保健和医药(药物递送、组织工程、再生医学、植入物、伤口敷料、人造器官组件、生物传感器等)、结构、重建(recreation)、纺织、光学、电、能源和环境(空气污染控制和水处理)中的应用。特别是在医疗保健和医药领域，聚合物纤维的大表面积/长宽比可潜在地用来开发有价值的用于官能化或添加具有特定性质的分子的产品。

静电纺丝(electrospinning)是制造聚合物纤维的通用方法。聚合物纤维的特征通常在于纤维直径的范围从几微米低至100nm或更小。这些聚合物纤维可以用于进一步制造不同复杂性和不同三维形状的产品。

然而，使用亲水性或水溶性聚合物制造的静电纺丝(ES)纤维在水性环境中具有高溶胀度，这限制了其效用，特别是在医疗保健、医药以及纳米装置中的效用。这些聚合物纤维和随后制造的产品具有较差的物理和/或机械性能，例如强度和稳定性。已有使用纺丝后交联方法来增强此种静电纺丝亲水或水溶性聚合物纤维的性能。交联方法包括加热、UV处理和化学方法(例如暴露于水性或有机溶剂)。然而，所有这些方法都有局限性。热方法在真空中使用高温，但不一定提供足够的机械稳定性改进。UV处理较弱，局限于表面，并且不能渗透到聚合物纤维毡(mat)中。化学交联方法也有许多实际的限制。这些方法需要多个步骤，费时，具有低结合效果，其导致聚合物在水性环境中的稳定性不足，并且还可能改变聚合物的性质。例如，现有的化学交联剂可能在水解时释放细胞毒性化合物、减少细胞生长、引起组织钙化、并增加聚合物的抗原性。可能需要额外的步骤，例如去除存在的任何细胞毒性残留物。例如，探索最多的交联剂如甲醛、戊二醛、甘油醛、(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺)(EDC)连同N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和京尼平是细胞毒性的，或者还需要不利的pH/温度条件进行交联。所有这些缺点都会降低聚合物的应用。因此，仍然需要开发用于制备或制造聚合物产品以改善其物理和/或机械性能的方法。

发明内容

根据第一方面，本发明提供了一种制备聚合物产品的方法，其包括由包含至少一种聚合物和至少一种交联剂的纺丝原液(dope)溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品。

根据其中交联剂包含至少一种儿茶酚胺的实施方式，该方法包括(i)由包含至少一种聚合物和至少一种儿茶酚胺的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品，和(ii)将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

根据第二方面，本发明提供了一种制备包含至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂的聚合物产品的方法，其包括(i)由包含至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺、至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品，和(ii)将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

根据第三方面，本发明提供了一种制备如上所述的聚合物产品的方法，其中纺丝原液溶液还包含至少一种金属离子，例如钙离子。

在纺丝原液溶液中可以使用任何合适的聚合物或聚合物的组合。聚合物可以是亲水性、水溶性和/或生物相容性聚合物。类似地，在纺丝原液溶液中可以使用任何合适的交联剂或交联剂的组合。交联剂优选为生物相容性交联剂。例如，交联剂可以包含儿茶酚胺或多酚。

纺丝原液溶液包含至少一种聚合物和至少一种交联剂。应当理解，在纺丝原液溶液中使用合适的溶剂。术语纺丝原液溶液或聚合物纺丝原液溶液可以互换使用。

在一些实施方式中，纺丝原液溶液包含至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺、至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂。

在一些实施方式中，纺丝原液溶液包含至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺和一价阳离子或二价阳离子。在一些实施方式中，阳离子是钙阳离子。

在纺丝原液溶液中可以使用任何合适的聚合物或聚合物的组合。聚合物可以是亲水性、水溶性和/或生物相容性聚合物。类似地，在纺丝原液溶液中可以使用任何合适的多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂。例如，多羟基抗微生物剂可以包含至少一种抗真菌剂和/或至少一种抗细菌剂。合适的多胺抗微生物剂的实例可以包括至少一种线性多胺抗微生物剂和/或至少一种支链多胺抗微生物剂。

本发明还包括可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的聚合物产品。在一些实施方式中，聚合物产品包含至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂。在一些实施方式中，聚合物产品包含至少一种金属离子。

聚合物产品可以是聚合物纤维的形式。随后可以使用聚合物纤维来制造具有不同复杂性和不同三维形状的产品。因此，聚合物产品包括由聚合物纤维制造的这些随后的产品。

附图说明

将参考以下附图更详细地讨论本发明。

图1显示了例示制备聚合物产品的方法的流程图。流程图中示出了两种纺丝原液溶液。

图2显示了通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂布的明胶的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图3显示了不同的儿茶酚胺涂布的明胶纤维毡和作为对照的不含儿茶酚胺的静电纺丝明胶纤维毡的SEM图像：(A)未暴露于源自碳酸铵的气态氨和二氧化碳，和(B)暴露于源自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后。指示了各自聚合物产品的聚合物纤维的平均直径φ。

图4显示了不同的儿茶酚胺涂布的胶原纤维毡和作为对照的静电纺丝胶原纤维毡的SEM图像：(A)未暴露于源自碳酸铵的气态氨和二氧化碳，和(B)暴露于源自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后。还指示了各自聚合物产品的聚合物纤维的平均直径。

图5显示了在以下盖玻片上培养的人皮肤成纤维细胞的共聚焦显微镜图像：(A)盖玻片，分别用(B)静电纺丝明胶、(C)静电纺丝多巴胺涂布的明胶[ES明胶+DA]、(D)暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶[ES明胶(ADM)]涂布的盖破片和(E)在培养基中存在5μg/mL诺考达唑的盖玻片；和(F)来自MTS测定的在各种纤维毡上培养的人皮肤成纤维细胞的活力图。

图6显示了(A)通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂布的明胶纤维毡[pDA-Tris-HCl]、暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后的聚多巴胺涂布的明胶纤维毡[pDA-ADM]和静电纺丝明胶[ES明胶]的ATR-FTIR，(B)20秒后静电纺丝明胶纤维毡上的水滴图像，(C)暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡上的“趋平(levelled-off)”水滴图像；和(D)(i)多巴胺、通过(ii)根据本发明的一个实施方式的碳酸铵扩散法和(iii)Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂层的RP-HPLC色谱图。

图7显示了(A)静电纺丝明胶纤维毡、(B)暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡的共聚焦显微镜图像(条代表10μm)；和(C)静电纺丝明胶纤维毡和暴露于碳酸铵之后的来自不同多巴胺浓度的纺丝原液溶液的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡的λ-扫描。

图8显示了例示制备包含多羟基抗微生物剂的聚合物产品的方法的流程图。流程图中示出了两种纺丝原液溶液。

图9显示了展示碳酸铵暴露后静电纺丝聚多巴胺交联明胶抗微生物纤维毡的形态的扫描电子显微镜图像。所使用的抗微生物剂是(A)两性霉素B、(B)卡泊芬净和(C)万古霉素。

图10显示了(A)(i)50μg/mL纯两性霉素B(AmB 50μg/mL)和(ii)显示由纺丝原液溶液进行静电纺丝并通过暴露于碳酸铵随后超声处理而交联的纤维毡(Gelatin_DA_AmB)所释放的两性霉素B的量的RP-HPLC曲线，所述纺丝原液溶液包含10％w/v明胶、多巴胺(纺丝原液溶液中明胶(聚合物)的2％w/w)和两性霉素B(纺丝原液溶液中明胶(聚合物)的0.5％w/w)；(B)由纺丝原液溶液进行静电纺丝的通过暴露于碳酸铵而交联后的纤维毡的达托霉素的释放曲线，所述纺丝原液溶液包含10％w/v明胶、多巴胺(纺丝原液溶液中明胶(聚合物)的2％w/w)和两性霉素B(纺丝原液溶液中明胶(聚合物)的0.5％w/w)；(C)25μg/mL卡泊芬净(CF)的RP-HPLC曲线；和(D)显示由纺丝原液溶液进行静电纺丝并通过暴露于碳酸铵随后超声处理而交联的纤维毡(gelatin_pDA_CF)所释放的卡泊芬净的量的RP-HPLC曲线，所述纺丝原液溶液包含10％w/v明胶、多巴胺(纺丝原液溶液中明胶(聚合物)的2％w/w)和两性霉素B(纺丝原液溶液中明胶(聚合物)的0.5％w/w)。

图11显示了暴露于碳酸铵之后的具有以下物质的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡的长期效力：(A)抗真菌剂(两性霉素B或卡泊芬净)；(B)抗细菌剂(达托霉素或万古霉素)；和(C)未暴露于碳酸铵(初纺(As-spun))和暴露于碳酸铵之后(XL)的具有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡的长效效力。

图12显示了展示浸入PBS中的静电纺丝纤维毡的形态的扫描电子显微镜图像：(A)浸入PBS中5小时的静电纺丝原始(pristine)明胶纤维毡；浸入PBS中(B)1周和(C)2周的暴露于碳酸铵之后的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡。

图13显示了展示浸入PBS中1、2、3、4和5周的暴露于碳酸铵之后的具有(A)-(E)两性霉素B；或(F)-(J)卡泊芬净的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡的形态的扫描电子显微镜图像。

图14显示了在各种条件下制备的静电纺丝毡的形态分析。(a)原始胶原垫。(b)和(c)分别含有10％DA和NE的胶原毡。(d)和(e)暴露于(NH₄)₂CO₃之后的(b)和(c)中所示的毡。比例尺＝1μm。毡的照片显示在底部图中。注意到在两种儿茶酚胺负载的毡中，ADM后焊接接头的数量增加且着色。CaCl₂对含有(f)DA和(g)NE的静电纺丝胶原形态的影响。注意到沿着毡的整个表面的聚儿茶酚胺的完整涂层以及毡中显著的颜色变化。(h)和(i)暴露于(NH₄)₂CO₃之后的(f)和(g)中的静电纺丝毡的形态。注意到含有DA的毡的强烈的棕色着色。(h)和(i)中的插图是显示ADM后CaCO₃颗粒形成的高分辨TEM图像。

图15显示了用于识别存在于(a)Coll_pDA_Ca和(b)Coll_pNE_Ca毡中的矿物相的选定区域电子衍射图案。插图显示了含有嵌入胶原基质内的电子致密CaCO₃颗粒的毡的TEM图像。

图16显示了通过动态接触角测量所确定的在各种条件下制备的静电纺丝胶原纳米纤维的表面润湿性(θ_静态)。

图17显示了在各种条件下制备的静电纺丝胶原毡的表面润湿性。(a)和(c)分别显示了含有DA和NE的毡的进展接触角的时间依赖性变化。符号表示每10秒的平均数据点，实线或虚线表示模型拟合。(b)和(d)比较了由动态接触角测量所确定的静态水接触角(θ_静态)。通过t检验或单因素方差分析，与原始胶原支架相比，^*p≤0.05，^**p<0.01，^***p<0.001和^****p<0.0001。

图18显示了在各种条件下制备的静电纺丝毡的XPS表征。(a)ES_Coll，(b)Coll_DA_Ca，(c)Coll_NE_Ca，(d)Coll_pDA_Ca和(e)Coll_pNE_Ca的高分辨C 1s谱。(f)ES_Coll，(g)Coll_DA_Ca，(h)Coll_NE_Ca，(i)Coll_pDA_Ca和(j)Coll_pNE_Ca的高分辨N 1s谱。(k)-(m)显示了静电纺丝毡的高分辨Ca 2p、Cl 2p和O 1s谱。

图19显示了静电纺丝胶原毡的机械性能。在含有(a)DA和(b)NE的各种条件下制备的静电纺丝毡的应力-应变曲线。含有(c)DA和(d)NE的毡的由曲线确定的峰值应力(σ)和抗拉刚度(E’)值示于条形图中。E’以log₁₀单位显示，以便更好地比较。显示了含有(e)DA和(f)NE的毡的断裂伸长率(ε_b)和韧性(J_lc)的增加。注意到采用聚儿茶酚胺交联的矿化胶原毡的弹性和刚度显著增加。

图20显示了胶原毡的断裂形态。静电纺丝毡在拉伸测试后的SEM图像。(a)ES_Coll，(b)Coll_DA，(c)Coll_NE，(d)Coll_pDA，(e)Coll_pNE，(f)Coll_DA_Ca，(g)Coll_NE_Ca，(h)Coll_pDA_Ca和(i)Coll_pNE_Ca。比例尺＝1μm。注意到矿化胶原毡(h)和(i)表现出大量的粗糙度和波纹，表明抗拉强度、刚度和韧性的显著增加。

图21显示了胶原毡的光致发光。显示胶原毡的光致发光特性的共聚焦荧光图像。(a)ES_Coll，(b)Coll_DA_Ca，(c)Coll_NE_Ca，(d)Coll_pDA_Ca和(e)Coll_pNE_Ca。所使用的激发波长是405nm(蓝色)和488nm(绿色)。比例尺＝10μm。(f)从各种静电纺丝胶原获得的平均蓝色和绿色荧光强度。

图22显示了胶原毡的细胞相容性。(a)在各种支架和TCP上培养的hFob细胞活力(定量自活/死细胞强度)。接种后3、6和9天后用钙黄绿素(calcein)FDA染色的各种胶原毡上培养的hFob细胞的共聚焦荧光图像：(b)ES_Coll，(c)Coll_DA_Ca，(d)Coll_NE_Ca，(e)Coll_pDA_Ca和(f)Coll_pNE_Ca。顶视图(xy-扫描)和侧视图(z-叠层(z-stack))分别用“t”和“s”表示。比例尺＝20μm。

图23显示了在各种胶原毡上培养的hFob细胞的共聚焦荧光图像，其中接种后3、6和9天采用远红染料染色F-肌动蛋白：(a)ES_Coll，(b)Coll_DA_Ca，(c)Coll_NE_Ca，(c)Coll_pDA_Ca和(e)Coll_pNE_Ca。顶视图(xy-扫描)和侧视图(z-叠层)分别用“t”和“s”表示。比例尺＝20μm。黑色比例尺＝44.2μm。

图24显示了通过MTT测定(A)监测的hFOB细胞增殖和通过ALP活性(B)监测的细胞分化测定。

图25显示了在各种复合胶原毡上的hFob细胞增殖和ALP活性。(a)通过MTS测定在各个时间点评估的hFob细胞的代谢活性。数据报告为平均值±标准偏差(n＝5)。(b)通过pNPP测定在各个点评估的hFob细胞的细胞内ALP活性。通过细胞数标准化并ALP活性(hFob细胞的对硝基苯酚μmol/h/细胞数)并报告。数据报告为平均值±标准偏差(n＝3)。注意到含有聚儿茶酚胺的矿化毡上的成骨细胞增殖和分化的显著增加。

图26显示了静电纺丝聚合物产品上的成骨细胞增殖和分化。图26(a)显示了以各种时间间隔在各种静电纺丝胶原毡上接种后的hFob增殖。图26(b)显示了以各种时间间隔在各种静电纺丝胶原毡上接种后的hFob分化。

图27显示了以各种时间间隔在各种ES胶原毡上培养的成骨细胞上的钙沉积物。注意到气态氨处理后用儿茶酚胺和钙掺杂的ES胶原上的广泛染色(用白色圆圈表示)。

图28显示了胶原毡上的钙沉积的ARS染色。通过ARS染色测定各种胶原毡上的钙沉积。(a)TCP，(b)ES_Coll，(c)Coll_DA_Ca，(d)Coll_NE_Ca，(e)Coll_pDA_Ca和(f)Coll_pNE_Ca。比例尺＝50μm。(g)通过溴化十六烷基吡啶测定定量估计接种后14天时的钙沉积。数据报告为来自三次独立实验的平均值±标准偏差。

图29显示了培养时间第三和第九天后在各种ES胶原上培养的成骨细胞的形态。

图30显示了接种在各种胶原毡上的hFob的形态。显示接种后9天后hFOb特征的代表性SEM照片：(a)TCP，(b)ES_Coll，(c)Coll_DA_Ca，(d)Coll_NE_Ca，(e)Coll_pDA_Ca和(f)Coll_pNE_Ca。比例尺＝10μm。

图31显示了接种在各种胶原毡上的hFob的关键成骨蛋白的表达。代表性的免疫染色图像显示接种后11天后骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和骨基质蛋白(BMP)的表达：(a)TCP，(b)ES_Coll，(c)Coll_DA_Ca，(d)Coll_NE_Ca，(e)Coll_pDA_Ca和(f)Coll_pNE_Ca。比例尺＝20μm。(g)通过Western印迹定量表达OPN。

图32显示了接种在各种支架上的hFob中成骨标记的平均荧光(紫色)强度的量化。(a)OPN和(b)OCN和(c)BMP-2。每个条代表平均值±SD(n＝3)。

图33显示了在碱性pH下Ca²⁺对多巴胺聚合的影响。(A)多巴胺Tris-HCl pH 8.5和(B)在含有25mM CaCl₂的Tris-HCl中的多巴胺的UV光谱。

图34显示了Gel_pDA毡的生物相容性和微生物学评价。显示接种在(a)原始ES_Gel，(b)Gel_DA和(c)Gel_pDA上的原代人真皮成纤维细胞(hDF)的形态的共聚焦图像。比例尺＝20μm。(d)确认接种在各种ES毡和盖玻片(CS)上的hDF的代谢活性的MTS测定。显示载有万古霉素(e)和卡泊芬净(f)的Gel_pDA毡的功效的盘扩散测定的照片。比例尺＝1cm。万古霉素(g)和卡泊芬净(h)抗生素负载的Gel_pDA毡对于浸出的耐久性。注意到当与银基伤口敷料Ag相比时，载有抗生素的Gel_pDA垫表现出优异的耐久性。

图35显示了ADM暴露之前和之后含有DA的载有抗生素的ES明胶毡的形态。(a)和(c)含有万古霉素，而(b)和(d)含有卡泊芬净作为抗生素。负载的抗生素的量是0.5％(聚合物的w/w)。注意到由于溶剂条件的差异，载有万古霉素的毡中的纤维直径显著降低。

图36显示了Vanco_Gel_pDA毡在猪烧伤模型中的体内伤口愈合功效。数字照片显示治疗过程中的伤口闭合。(a)未处理，(b)ES_Gel，(c)Vanco_Gel_pDA毡，和(d)Ag伤口敷料。为了清楚起见，仅显示处理之前和之后的伤口照片。(e)整个研究过程中各种处理后伤口闭合区域的时间变化。(f)定量评估处理和未处理伤口的伤口闭合区域。注意到当与原始和银基敷料相比时，Vanco_Gel_pDA毡的伤口愈合增加。

图37显示了原始ES_Gel和Vanco_Gel_pDA毡在深度真皮猪烧伤模型中的伤口愈合性质的体内评估。

具体实施方式

概述

本发明提供了静电纺丝生物相容性聚合物的新方法。例如，该方法可用于生成用于高级伤口敷料和骨组织工程的耐用抗微生物或矿化支架。该方法利用聚儿茶酚胺涂层和相对温和的条件来制备静电纺丝纳米纤维支架。该方法不使用有机溶剂、毒性添加剂或极端温度，因此容易适用于制造实践。此外，该方法赋予所获得的纳米纤维支架另外的益处，包括优异的表面光滑度、理想的机械性能、将肽抗生素锚定到纳米纤维表面较长时间的能力、固有的纳米纤维光致发光(photoluminescent)特性，以及体外和体内生物相容性。聚儿茶酚胺涂层还可以经矿化以生成骨传导支架。

定义

如本文所用，术语“静电纺丝”是指其中使用高电压来产生诸如聚合物溶液的聚合物流体的带电射流的过程，所述聚合物流体干燥或固化以生成聚合物纤维。用于静电纺丝的系统通常包括注射器、喷嘴、泵、高压电源和接地收集器(grounded collector)。高压电源一端连接到针的孔口(orifice)，另一端连接到接地收集器。

如本文所用，“生物相容性”物质(例如聚合物或交联剂)通常不会对细胞、组织、器官或整个生物体引起显著的不良反应(例如毒性或抗原反应)，例如无论其是否与细胞、组织、器官或整个生物体接触，例如无论其是否与细胞、组织、器官接触或在生物体内定位，无论是否在生物体内降解，是否残留较长的时间，或者是否全部排出体外。生物相容性物质(例如，生物相容性聚合物)可为选择性地相容，在于它表现出与某些细胞、组织、器官或甚至某些生物体的生物相容性。例如，生物相容性物质可选择性地与脊椎动物细胞、组织和器官生物相容，但对来自病原体或致病生物体的细胞有毒性。在某些情况下，生物相容性物质也可能对源自肿瘤和/或癌症的细胞有毒性。

如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包括(including)”应被解释为指定所提及的所述特征、整数、步骤或组件的存在，但未排除存在或添加一个或多个特征、整数、步骤或组件或其组合。然而，在本公开的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由...组成(consisting of)”。单词“包含(comprising)”的变体诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”以及“包括(including)”的变体诸如“包括(include)”和“包括(includes)”相应地具有不同含义。

如本文所用，术语“纺丝原液溶液”和“聚合物纺丝原液溶液”可互换使用，是指静电纺丝过程中使用的材料。静电纺丝“来自纺丝原液溶液”的物质是指静电纺丝过程开始之前，该物质存在于纺丝原液溶液中。

如本文所用，“微纤维”是指直径不超过1000微米的纤维。

如本文所用，“纳米纤维”是指直径不超过1000纳米的纤维。

如本文所用，“多羟基抗微生物剂”是指在其化学结构内具有两个或更多个羟基的抗微生物剂。两个或更多个羟基可以优选地是不可离子化的羟基。

制备复合聚合物产品的静电纺丝方法

根据第一方面，本发明提供了一种制备聚合物产品的方法，其包括由包含至少一种聚合物和至少一种交联剂的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品。

纺丝原液溶液包含在合适的溶剂中的至少一种聚合物和至少一种交联剂。应当理解，在某些情况下，溶剂不应当是水性的，特别是对于亲水性和/或水溶性聚合物产品。在此类情况下，溶剂可以是有机溶剂。合适的溶剂的实例包括但不限于2,2,2-三氟乙醇(TFE)和六氟异丙醇(HFIP)。

在一些实施方式中，纺丝原液溶液包含聚合物、诸如儿茶酚胺的交联剂、诸如TFE和HFIP的有机溶剂以及水。可以包括水以促进金属盐、亲水性抗生素和如下更为详细描述的其它物质的溶解度。在一些此类实施方式中，使用含有至少约80％(v/v)的量的溶剂和至多约20％(v/v)的量的水的混合物形成纺丝原液溶液。该混合物可以含有例如约5、10、15或20％(v/v)的水和诸如TFE或HFIP的有机溶剂。作为一个非限制性实例，可以使用水:HFIP(5％:95％)或水:HFIP(10％:90％)的混合物形成纺丝原液溶液。

可以在纺丝原液溶液中使用任何合适的聚合物或聚合物的组合。聚合物可以是亲水性、水溶性和/或生物相容性聚合物。聚合物的实例包括但不限于明胶、胶原、牛血清白蛋白、酪蛋白、玉米蛋白、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸和壳聚糖。也可以使用其它合成的生物相容性聚合物，例如聚丙交酯(PLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。纺丝原液溶液可以包含聚合物的组合。特别地，纺丝原液溶液可以包含明胶和/或胶原。

类似地，可以在纺丝原液溶液中使用任何合适的交联剂或交联剂的组合。交联剂优选为生物相容性交联剂。例如，交联剂可以包含儿茶酚胺、多酚或其组合。

应当理解，交联剂分布在整个聚合物产品中并交联聚合物纤维。应当进一步理解，这改善了聚合物产品的物理和/或机械性能。

应当进一步理解，本发明的方法不需要任何苛刻和/或不利的pH、热或压力条件。

在根据本发明的第一方面的方法中可以使用任何合适的多酚作为交联剂，并且在根据本发明的任何方面的方法中可以使用任何合适的儿茶酚胺作为交联剂。例如，合适的多酚包括但不限于氢醌、间苯三酚、连苯三酚、没食子酸、去甲二氢愈创木酸、γ-倒捻子素和α-倒捻子素。在一些实施方式中，多酚选自氢醌、间苯三酚和α-倒捻子素。

另外，合适的儿茶酚胺的实例包括但不限于肾上腺酮、卡比多巴、可尔特罗(colterol)、L-或D-二羟基苯丙氨酸(多巴)、二甲基多巴、二羟非君(dioxifedrine)、二羟西君(dioxethedrin)、多巴胺、5-羟基多巴胺盐酸盐、多巴酚丁胺、多巴金刚、多培沙明、屈昔多巴(droxydopam)、去甲肾上腺素、α-甲基去甲肾上腺素、乙基去甲肾上腺素、乙左旋多巴(etilveodopa)、异他林(isoetharine)、海索那林(hexaprenaline)、N-甲基肾上腺酮、诺布君(norbudrine)、异肾上腺素(nordefrin)、羟多巴胺(oxidopamine)和肠杆菌素(enterobactin)。

在一些实施方式中，儿茶酚胺选自肾上腺酮、卡比多巴、可尔特罗、二羟基苯丙氨酸(多巴)、二甲基多巴、二羟非君、二羟西君、多巴胺、多巴酚丁胺、多巴金刚、多培沙明、屈昔多巴、去甲肾上腺素、α-甲基去甲肾上腺素、乙基去甲肾上腺素、乙左旋多巴、异他林、海索那林、N-甲基肾上腺酮、诺布君、异肾上腺素、羟多巴胺和肠杆菌素。

根据其中交联剂包含至少一种儿茶酚胺的一个具体方面，该方法包括(i)由包含至少一种聚合物和至少一种儿茶酚胺的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品，和(ii)将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

聚合物产品可经处理以在将聚合物产品暴露于气态碱性溶液之前基本上从纺丝原液溶液中除去任何残留溶剂。例如，处理可以包括在环境压力下或在真空减压下干燥聚合物产品。

应当理解，儿茶酚胺在静电纺丝后分布在整个聚合物产品中。在暴露于气态碱性溶液的情况下，儿茶酚胺在整个聚合物产品中形成交联。示例该方法的流程图在图1中示出。应当理解，暴露于气态碱性试剂相比于未暴露于气态碱性试剂导致聚合物产品中的交联程度更高。

应当进一步理解，因为交联过程是在未将聚合物产品暴露于水性环境的情况下进行的，所以该过程可以应用于源自亲水性和/或水溶性聚合物的任何纳米纤维。

将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂可以在缓冲剂的存在下发生。缓冲剂用于防止pH的快速增加。作为一个非限制性实例，缓冲剂可以是可溶性铵盐(例如，碳酸铵、氯化铵、硫酸铵等)。

可以使用任何合适的气态碱性试剂。例如，气态碱性试剂可以包含但不限于气态氨。气态氨可以源自任何合适的来源。例如，气态氨可以源自碳酸铵固体、氢氧化铵和/或液氨。特别地，碳酸铵固体包含碳酸铵粉末。为了方便起见，通过静电纺丝包含聚合物和儿茶酚胺的纺丝原液溶液并随后暴露于气态氨来制备聚合物产品的方法被称为氨扩散法(ADM)。

固体碳酸铵分解以形成气态氨(NH₃)和二氧化碳(CO₂)。即使在已经干燥聚合物产品之后，一些液体仍将保留在聚合物产品内。NH₃和CO₂溶解在液体中。溶解的NH₃增加液体的pH值，而CO₂的溶解产生碳酸，碳酸在氨的存在下去质子化以形成碳酸氢根/碳酸根离子。碳酸氢根/碳酸根离子的形成也防止了由于氨的存在而造成的pH的突然升高。

氨扩散法可以通过将聚合物产品与固体碳酸铵一起置于密封容器(例如，干燥器或其它容器)中足以使儿茶酚胺聚合的时间来进行。通常，聚合物产品将在约20℃至约40℃范围的温度下与碳酸铵一起储存几分钟至几小时或更长的时间。例如，聚合物产品可以与固体碳酸铵一起储存6小时，或12小时，或24小时。储存步骤可以例如在20℃或25℃下进行。

根据第二方面，本发明提供了一种制备包含至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂的聚合物产品的方法，其包括(i)由包含至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺、至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品，和(ii)将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

纺丝原液溶液包含在合适的溶剂(该溶剂如上所述)中的至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺、至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂。在纺丝原液溶液中可以使用如上所述的任何合适的聚合物或聚合物的组合。间静电纺丝聚合物产品暴露于气态碱性试剂可以如上所述进行。

儿茶酚胺和多羟基/多胺抗微生物剂(一种或多种)变为分布在整个聚合物产品中并交联聚合物纤维。应当理解，这改善了聚合物产品的物理和/或机械性能。应当理解，与不含多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂的聚合物产品相比，具有多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂的聚合物产品在聚合物产品中包含更高程度的交联。多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂在暴露于气态碱性溶液时在整个聚合物产品中形成交联，因此聚合物产品能够经适当或期望的时间段持续递送多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂。

可以使用任何合适的儿茶酚胺和任何合适的聚合物，例如上述那些。根据本发明的任何方面，可以使用任何合适的多羟基抗微生物剂或多羟基抗微生物剂的组合。多羟基抗微生物剂可以包含至少一种抗真菌剂和/或至少一种抗细菌剂。例如，合适的抗真菌剂包括但不限于纳他霉素、制霉菌素、两性霉素B或卡泊芬净。此外，合适的抗细菌剂的实例包括但不限于万古霉素、多粘菌素B、达托霉素、雷莫拉宁(ramoplanin)A2、瑞斯托霉素(ristomycin)单硫酸盐、硫酸博莱霉素、腐草霉素、阿米卡星、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿奇霉素、地红霉素(dirtythromycin)、利福平、利福霉素、利福喷汀、利福昔明、克拉霉素、克林霉素、恩多霉素(kendomycin)、巴弗洛霉素(bafilomycin)、氯四环素、阿霉素、多西环素、四环素、1-脱氧野尻霉素、1-脱氧甘露糖野尻霉素和N-甲基-1-脱氧野尻霉素。

根据本发明的任何方面，可以使用任何合适的多胺抗微生物剂或多胺抗微生物剂的组合。多胺抗微生物剂可以是线性的或支链的。例如，合适的多胺抗微生物剂包括但不限于ε-聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸以及线性和支链聚乙烯亚胺。在一些实施方式中，多胺抗微生物剂选自ε-聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸。

根据第三方面，本发明提供了一种制备包含至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂的聚合物产品的方法，其包括(i)由包含至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺、至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备和/或制造聚合物产品，和(ii)将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

纺丝原液溶液包含在合适的溶剂(该溶剂如上所述)中的至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺和至少一种金属离子。在纺丝原液溶液中可以使用如上所述的任何合适的聚合物或聚合物的组合。将静电纺丝聚合物产品暴露于气态碱性试剂可以如上所述进行。在一些实施方式中，纺丝原液溶液还包含至少一种多羟基抗微生物剂和/或至少一种多胺抗微生物剂。

可以使用任何合适的儿茶酚胺和任何合适的聚合物，例如上述那些。在本发明的方法中可以使用任何可溶性金属盐。在一些实施方式中，金属离子是阳离子(例如，一价阳离子、二价阳离子或三价阳离子)。在一些实施方式中，金属离子是过渡金属离子。过渡金属离子包括例如钛离子(例如，Ti^3+/Ti⁴⁺)、锰离子(例如，Mn²⁺)、铁离子(例如，Fe²⁺或Fe³⁺)、钴离子(例如，Co²⁺)、镍离子(例如，Ni²⁺)、铜离子(例如，Cu²⁺)、锌离子(例如，Zn²⁺)、钌离子(例如，Ru³⁺)、铑离子(例如，Rh³⁺)、钯离子(例如，Pd²⁺)、铂离子(例如，Pt³⁺)、金离子(例如，Au³⁺)、银离子(例如，Ag⁺)等。在一些实施方式中，金属离子以碱土金属的可溶性盐的形式提供。碱土金属离子包括例如镁离子(例如，Mg²⁺)、钙离子(例如，Ca²⁺)、锶离子(例如，Sr²⁺)、钡离子(例如，Ba²⁺)等。在一些实施方式中，金属离子以碱金属的可溶性盐的形式提供。碱金属离子的实例包括例如锂离子(例如，Li⁺)、钠离子(例如，Na⁺)、钾离子(例如，K⁺)等。在一些实施方式中，金属离子选自Ca离子、Zn离子、Fe离子、Co离子、Mg离子、Ni离子、Ag离子、Au离子、Cu离子、Mn离子及其组合。在一些实施方式中，离子是钙离子(即，Ca²⁺离子)。金属离子通常在本发明的纺丝原液溶液中以可溶性盐的形式提供。例如，钙阳离子可以以氯化钙(CaCl₂)或碳酸氢钙(Ca(HCO₃)₂)的形式在纺丝原液溶液中提供。作为另一个非限制性实例，锂阳离子可以以碳酸锂(Li₂CO₃)的形式在纺丝原液溶液中提供。

本发明方法中的纺丝原液溶液可以包括任何合适量的聚合物。应当理解，可以改变聚合物的量，例如为了优化静电纺丝过程。例如，纺丝原液溶液可以包含2-30％w/v聚合物。对于包含壳聚糖或PVA作为聚合物的纺丝原液溶液，纺丝原液溶液可以包含小于5％w/v聚合物。

在一些实施方式中，纺丝原液溶液含有约5-15％w/v，例如5-10％w/v明胶范围的量的明胶。在一些实施方式中，纺丝原液溶液含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％w/v明胶。在一些此类实施方式中，纺丝原液溶液还包含TFE。

在一些实施方式中，纺丝原液溶液含有约5-15％w/v，例如5-10％w/v胶原范围的量的胶原。在一些实施方式中，纺丝原液溶液含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％w/v胶原。在一些此类实施方式中，纺丝原液溶液还包含HFIP。在一些此类实施方式中，纺丝原液溶液还包含水(例如，约1-20％w/v水，或约1-10％w/v水)。

胶原的类型不限于任何特定类型的胶原。例如，本文中可以使用I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、VIX或X型胶原等。胶原可以是重组的或天然存在的胶原。在一些实施方式中，胶原可以是脊椎动物胶原。在一些实施方式中，胶原是哺乳动物胶原，例如人胶原。所使用的胶原类型可以根据聚合物产品旨在如何使用而变化。例如，当使用聚合物产品来培养破骨细胞或破骨细胞前体时，可以使用I型胶原。I型胶原的来源包括鼠尾胶原、牛真皮胶原和人胎盘胶原。

相对于聚合物的量，纺丝原液溶液可以包括任何合适量的诸如儿茶酚胺的交联剂。应当理解，可以改变诸如儿茶酚胺的交联剂的量以在聚合物产品中达到期望的交联水平。例如，交联剂的量小于纺丝原液溶液中聚合物的量。

通常，相对于聚合物的量，交联剂将以0.1％至约20％w/w范围的量存在于纺丝原液溶液中。纺丝原液溶液中交联剂(例如，儿茶酚胺或多酚)的浓度可以在例如约0.1％至约0.25％w/w，或约0.25％至约0.5％w/w，或约0.25％至约0.75％w/w，或约0.75％至约1％w/w，或约1％至约2.5％w/w，或约2.5％至约5％w/w，或约5％至约7.5％w/w，或约7.5％至约10％w/w，或约10％至约12.5％w/w，或约12.5％至约15％w/w，或约15％至约17.5％w/w，或约17.5％至约20％w/w的范围内。纺丝原液溶液中交联剂(例如，儿茶酚胺或多酚)的浓度可以在约5％至约15％w/w，或约1％至约30％w/w的范围内。在一些实施方式中，纺丝原液溶液中交联剂的浓度为相对于聚合物的量的约10％w/w。在一些此类实施方式中，纺丝原液溶液包含约10％w/w的量的多巴胺。在一些此类实施方式中，纺丝原液溶液包含约10％w/w的量的去甲肾上腺素。

在一些实施方式中，交联剂的量为纺丝原液溶液中聚合物的约1-10％w/w。在一些实施方式中，儿茶酚胺的量为纺丝原液溶液中聚合物的约1-10％w/w。

更进一步地，相对于聚合物的量，纺丝原液溶液可以包括任何合适量的多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂。应当理解，可以改变多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂的量以在聚合物产品中获得所需的多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂水平。例如，多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂的量少于纺丝原液溶液中聚合物的量。

通常，抗微生物剂将以0.01％至约10％w/v范围的量存在于纺丝原液溶液中。纺丝原液溶液中抗微生物剂(例如，多羟基或多胺抗微生物剂)的浓度可以在例如约0.01％至约0.05％，或约0.05％至约0.1％，或约0.1％至约0.5％，或约0.5％至约1％，或约1％至约5％，或约5％至约10％的范围内。纺丝原液溶液中抗微生物剂(例如，多羟基或多胺抗微生物剂)的浓度可以在约0.25％至约2.5％，或约0.1％至约5％，或约0.05％至约10％的范围内。在一些实施方式中，纺丝原液溶液中抗微生物剂的浓度为约0.5％w/v。在一些此类实施方式中，纺丝原液溶液包含约0.5％w/v的量的两性霉素B、卡泊芬净、万古霉素、多粘菌素B或达托霉素。

在某些实施方式中，多羟基抗微生物剂和/或多胺抗微生物剂的量可以是纺丝原液溶液中聚合物的约0.1-10％w/w。

纺丝原液溶液可以包括任何合适量的金属离子。通常，金属离子将以0.1mM至约100mM范围的量存在于纺丝原液溶液中，这取决于金属盐在溶剂混合物中的溶解度。纺丝原液溶液中金属离子(例如，Ca²⁺或Li⁺)的浓度可以在例如约0.1mM至约0.25mM，或约0.25mM至约0.5mM，或约0.25mM至约0.75mM，或约0.75mM至约1mM，或约1mM至约25mM，或约25mM至约50mM，或约50mM至约75mM，或约75mM至约100mM的范围内。纺丝原液溶液中金属离子(例如，Ca²⁺或Li⁺)的浓度可以在约15mM至约25mM，或约10mM至约40mM，或约5mM至约50mM的范围内。在一些实施方式中，纺丝原液溶液中金属离子的浓度为约20mM。在一些此类实施方式中，纺丝原液溶液包含约20mM的量的氯化钙。

如以下更为详细描述的，本发明的方法通常包括在纺丝过程中使用外部电场来雾化聚合物纺丝原液溶液。当将外部静电场施加到纺丝原液溶液时，在溶液源(例如，用于将纺丝原液溶液注入纺丝装置中的针)处形成悬浮的圆锥形液滴。最初，液滴的表面张力与电场平衡。当静电场强到足以克服液体的表面张力时发生静电雾化。然后液滴变得不稳定，并从液滴表面喷出微小的射流。材料最终到达一个接地的目标，其在那里被收集为含有细纤维的互连网(interconnected web)。

可以在本发明的方法中使用任何合适的电场。通常，在本发明的方法中使用范围为约100V至约100kV的电场。电场可以在例如500V至50kV，或1kV至25kV，或5kV至15kV的范围内。电场可以是5kV、5.5kV、6kV、6.5kV、7kV、7.5kV、8kV、8.5kV、9kV、9.5kV、10kV、10.5kV、11kV、11.5kV、12kV、12.5kV、13kV、13.5kV、14kV或15kV。可以根据用于静电纺丝方法的特定纺丝原液溶液的组成使用其它场强度。

可以使用任何合适的流速将纺丝原液溶液从源引入电场中。通常，流速将在约0.1mL/小时至约5mL/小时的范围内。流速可以在例如0.1mL/小时至0.5mL/小时，或0.5mL/小时至1mL/小时，或1mL/小时至1.5mL/小时的范围内。流速可以在0.5mL/小时至1.5mL/小时，或0.5mL/小时至1mL/小时的范围内。流速可以是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5mL/小时。可以根据包括纺丝原液溶液的组成和在该方法中使用的电场的强度在内的因素使用其它流速。

用于纤维收集的目标表面可以放置在相对于纺丝原液溶液源的任何合适的位置。纺丝原液溶液源和目标表面之间的距离通常在约5cm至50cm的范围内。该距离可以在例如5至10cm，或10cm至15cm，或15cm至20cm，或20cm至25cm的范围内。该距离可以在5cm至30cm，或10cm至20cm的范围内。纺丝原液溶液源和目标表面之间的距离可以是约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15cm。可以根据包括纺丝原液溶液的组成、电场的强度和在该方法中使用的纺丝原液溶液流速在内的因素采用其它距离。

本发明提供了通过根据本发明的任一方面的方法可获得的聚合物产品。通常，聚合物产品是亲水性的、水溶性的和/或生物相容性的。在一些实施方式中，聚合物产品包含具有多酚化合物、儿茶酚胺化合物、聚合儿茶酚胺化合物或其组合的交联的聚合物纤维。在一些实施方式中，聚合物产品包含具有多羟基抗微生物剂、多胺抗微生物剂、儿茶酚胺化合物、聚合儿茶酚胺化合物或其组合的交联的聚合物纤维。在一些实施方式中，聚合物产品还包括如上所述的金属离子。

本发明的聚合物产品包括根据需要由静电纺丝聚合物纤维制造的任何形状或尺寸的任何产品。聚合物产品的聚合物纤维可以是纳米纤维或微纤维。在某些实施方式中，聚合物产品包含纤维毡。

在一些实施方式中，聚合物产品包含用于细胞和/或组织培养的底物。可以将聚合物产品掺入用于细胞培养的物品中，例如陪替氏培养皿(Petri dish)、多孔板、烧瓶、载玻片、烧杯或其它具有孔的容器。细胞培养物品的其它实例包括例如384孔微型板、96孔微型板、24孔培养皿、8孔培养皿、10cm培养皿和T75烧瓶。此类聚合物产品可用于培养诸如破骨细胞的细胞和诸如骨组织的组织。

在一些实施方式中，聚合物产品用作伤口敷料或伤口敷料的组分。聚合物产品可以形成在适合施用于人或其它动物的固体、半固体或液体伤口敷料载体材料上，或者以其它方式与其一体化。伤口敷料载体的特征通常在于高纯度水平和低毒性水平，所述水平足以使其适合施用于待治疗的人或动物。伤口敷料可以是任何形式，例如衬垫(pad)、纱布(gauze)、布、片(sheet)等。敷料可以单独使用或者与施用于其上或包含在其中的药物或其它物质结合使用，并且可以包含一层或多层。

伤口敷料可以包含一层或多层吸收和/或芯吸材料，其能够用于伤口敷料中以接收来自伤口的蛋白质渗出物。伤口敷料可以包含织造或非织造棉、纱布、聚合物网(net)或诸如聚乙烯、尼龙、聚丙烯或聚酯的网筛(mesh)，诸如聚氨酯或聚丁二烯弹性体的弹性体，或诸如开孔聚氨酯泡沫的泡沫。当伤口敷料包括一层非织造织物时，此种非织造可以是纺粘(spun-bonded)或水刺(spun-laced)结构。此外，可以使用湿法成网和气流成网的非织造织物。伤口敷料可以含有例如纺粘聚酯短纤维(staple fiber)织物或非织造乙酸纤维素。

另外，伤口敷料还可以包括甚至在吸收其渗出物重量的2至20倍之后仍能够保持其完整性的亲水性材料。此类亲水性材料包括但不限于羧甲基纤维素钠、各种聚丙烯酰胺、聚丙烯腈和丙烯酸聚合物、刺梧桐胶和多糖。未取代的或各种取代的丙烯酸和丙烯酸酯可用于吸收层中。

因此，本发明的一些实施方式提供了一种制备聚合物产品的方法，其包括

i)由包含至少一种聚合物和至少一种交联剂的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备聚合物产品，

其中交联剂包含至少一种儿茶酚胺，并且其中静电纺丝纤维可以收集在裸露的金属收集器上或诸如绷带纱布的非织造织物上，和

ii)将聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

本文所述的聚合物产品还可以包含一种或多种生物活性剂，其可促进细胞粘附至微纤维、促进细胞功能、促进细胞生长或调节其它细胞和组织功能。生物活性剂可以物理吸附在聚合物产品如纤维毡上，或者生物活性剂可以使用化学交联剂共价键合到聚合物产品上。这些生物活性剂刺激细胞生长、分化和未分化细胞的迁移，以及未分化细胞(例如，祖细胞和干细胞)向和在修复、再生或新生位点的分化。通常涉及的祖细胞包括内皮祖细胞(EPC)和间充质祖细胞(MPC)。用于包含在聚合物产品中的合适的生物活性剂包括刺激祖细胞和干细胞的细胞生长和分化的生长因子和分化因子。

合适的生长因子和细胞因子包括但不限于干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、基质细胞衍生因子-1、青灰因子、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGFβ)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素(Ang)、表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子(IGF-1)、白介素(IL)-3、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和IL-13、集落刺激因子、血小板生成素、促红细胞生成素、fit3-配体和肿瘤坏死因子α(TNFα)。

生长因子的实例包括EGF、bFGF、HNF、NGF、PDGF、IGF-1和TGFβ。这些生长因子可以与包含组合物的支架材料混合。生物活性剂还可具有促血管生成活性，例如VEGF、PDGF、突变蛋白-1多肽及其具有促血管生成活性(即促进新血管形成和血管生成)的变体。生物活性剂可以促进或刺激骨生长。例如，生物活性剂可以是骨形态发生蛋白(BMP)，其表现出促成骨特性。

现已大体上描述了本发明，通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，这些实施例是以说明的方式提供的，并不意在限制本发明。

实施例

实施例1.材料和方法

所有化学品都是分析级的，并且未经进一步纯化即使用。

制备纺丝原液溶液

通过在室温下伴随持续搅拌将明胶溶解在2,2,2-三氟乙醇(TFE)(Sigma-Aldrich)中24小时来制备所需浓度(例如10％w/v)的澄清均质明胶(来自猪皮，A型，300gBloom)溶液。

通过在室温下伴随持续搅拌将胶原溶解在六氟异丙醇(HFIP)(Sigma-Aldrich)中24小时来制备所需浓度(例如8％w/v)的胶原(纯化的I型牛真皮胶原)溶液。

儿茶酚胺(来自Sigma-Aldrich的多巴胺、去甲肾上腺素或α-甲基去甲肾上腺素)的量根据需要加入，并且可以是例如最终纺丝原液溶液中的1-10％(聚合物的w/w)。

静电纺丝

使用定制的静电纺丝装置(包括γ高压直流电源，USA)和注射泵(KDS 100，KDScientific，Holliston，MA)来制造静电纺丝聚合物纤维。

使用注射泵将制备的纺丝原液溶液以0.8ml/h的速率加入连接至27G平头不锈钢针的5ml标准塑料注射器(由聚丙烯制成)中。在针的孔口处会形成小滴，并通过施加11.5KV的高电压将这些小滴拉伸并张开成连续的长纤维。将纤维收集在置于与针大约12cm距离处的不同基底(例如铝箔、玻璃盖玻片等)的接地目标上。

所有静电纺丝在室温下进行，空气湿度为大约25％。

通过氨扩散法(AMD)制备静电纺丝聚儿茶酚胺涂布的明胶或胶原纤维

静电纺丝多巴胺涂布的明胶或胶原纤维毡通过静电纺丝含有确定的明胶或胶原含量(2％至30％w/v)的不同浓度(纺丝原液溶液中1％至10％w/w的明胶或胶原)的多巴胺(Sigma-Aldrich)的纺丝原液溶液来制备。

在真空干燥48小时以从静电纺丝多巴胺涂布的明胶或胶原纤维毡中除去残留溶剂后，将纤维毡暴露于密封干燥器中的适量(例如5g)的碳酸铵粉末(Sigma-Aldrich)大约24小时。

通过Tris-HCl法制备多巴胺涂布的明胶或胶原纤维

将静电纺丝明胶或胶原纤维浸入20mg/mL多巴胺盐酸盐(Sigma-Aldrich)的pH8.5的溶液中5小时。涂布后，用蒸馏水漂洗聚多巴胺涂布的明胶或胶原纤维并冷冻干燥。

扫描电子显微镜和透射电子显微镜

使用场发射扫描电子显微镜(FEI-QUANTA 200F，荷兰)以分析静电纺丝纤维的形态，并研究不同多巴胺浓度对明胶/胶原纤维直径及其表面特性的影响。在用铂(JEOL JSC-1200精细涂布机，日本)溅射涂布样品之后，所有的SEM测量均在15KV的加速电压下进行。然后使用图像分析软件(Image J，National Institute of Health，USA)分析不同静电纺丝明胶/胶原纤维样品的SEM图像以计算平均纤维直径。测量大约100个随机选择的纳米纤维的直径以获得每个明胶/胶原纤维样品中的平均纳米纤维直径。已经使用JEOL JEM-3010仪器进行了不同的静电纺丝明胶/胶原纤维样品的透射电子显微镜检查。

纤维机械性能

使用台式拉伸测试仪(Instron 5345，USA)在环境条件下使用10N容量的测力传感器进行静电纺丝纤维的拉伸测试。切割(使用样品框架)10×20mm尺寸的矩形样品并从在铝箔上旋转的纳米纤维片上剥离，并以5mm/分钟的十字头速度进行测试。在本研究中，针对每种类型的静电纺丝纤维或纤维毡测试五个样品。基于所生成的每种静电纺丝纤维或纤维毡类型的应力-应变曲线，计算所有的力学特性(拉伸强度、失效应变、杨氏模量和失效功(Work of Failure))。测试前，将样品真空干燥48小时，然后在65％相对湿度下静置一周。

衰减全反射-傅里叶变换红外(ATR-FTIR)光谱

采用AVATAR 380FTIR光谱仪(Thermo Electron，Waltham，MA)在400–4000cm^-1的范围内分析所有静电纺丝纤维毡的ATR-FTIR光谱。光谱记录为使用空的附件作为空白在25℃下以1cm^-1分辨率平均扫描200次。

反相高压液相色谱(RP-HPLC)

为了鉴定使用两种不同的方法(即碳酸铵扩散法和Tris-HCl法)形成的聚多巴胺组成的差异，分别对通过碳酸铵扩散法和Tris-HCl法制备的聚多巴胺进行RP-HPLC。使用具有C18分析柱(Phenomenex，CA，USA)的Waters HPLC分析仪进行RP-HPLC。流动相(A＝含有1％三氟乙酸的蒸馏水，B＝含有1％三氟乙酸的乙腈)的程序设计如下：0-5分钟为95:5(A:B，v:v)的静态模式，5-35分钟为10:90的梯度模式，35-40分钟为5:95的梯度模式，40-43分钟为95:5的梯度模式且43-45分钟为95:5的静态模式。使用UV可见检测器，检测器波长为280nm(100μl样品注射)。

接触角测量

通过使用VCA Optima表面分析系统(AST products，Billerica，MA)的静滴水接触角测量来测量静电纺丝纤维毡的亲水性/疏水性性质。使用蒸馏水用于形成液滴。

细胞培养和处理

根据Biomacromolecules，2005，6(5)，pp 2583–2589中所述的程序培养人真皮成纤维细胞。简言之，在37℃和5％CO₂的潮湿培养箱中，在补充有10％(v/v)胎牛血清、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养细胞。所有细胞培养试剂均获自Life Technologies Corporation(新加坡)。对于生物相容性实验，将细胞接种在预先用支架覆盖的盖玻片上，并以10×10⁴个细胞/孔的密度置于12孔板的底部，并使其生长24小时，然后进行分析。对于阴性对照孔，在培养基中加入诺考达唑至最终浓度为5μg/mL。

共聚焦荧光显微镜

对于共聚焦显微术，在支架覆盖的玻璃盖玻片上培养真皮成纤维细胞24小时，然后将细胞固定在3％多聚甲醛中。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后，将细胞染色并用FITC缀合的α-微管蛋白(Sigma-Aldrich)和Alexa Fluor 569鬼笔环肽(Molecular)进行荧光标记以显现细胞骨架系统，并用Hoechst(Sigma-Aldrich)进行荧光标记以显现核。使用Flouromount^TM水性装置(Sigma-Aldrich)将盖玻片安装在载玻片上。通过激光扫描显微镜(Zeiss LSM710-Meta，Carl Zeiss Microimaging Inc.，NY，USA)使用×40油浸物镜进行共焦成像。所使用的激发波长为405nm、488nm和561nm，发射滤光片分别为BP 420-480nm、BP 505-530nm和572-754nm。每个样品分析至少20个不同的显微镜视野。

荧光光谱(λ-扫描)扫描一式三份进行用于静电纺丝明胶纤维，以及暴露于气态氨之后的每种多巴胺负载的明胶纤维。使用Synergy^TM H1酶标仪(BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA)，以360nm的固定激发，以10nm增量在400-600nm的发射范围内扫描所有样品。使用Gen5^TM数据分析软件(BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA)收集数据。孔的表面积被聚多巴胺涂布的样品完全覆盖，并且用于测量的读取高度调整为4.8mm。将所述值减去使用扫描空白孔的背景荧光。

基于MTS的细胞活力测定

根据制造商的说明书(Promega Corporation，Madison，WI)，并根据Kim BJ等，Reinforced multifunctionalized nanofibrous scaffolds using mussel adhesiveproteins,Angew Chem Int Ed Eng，2012；51:675-8中所述的程序，使用CellTierAqueous One溶液细胞增殖测定试剂盒确定细胞活力。该测定通过测量活细胞减少MTS((3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓))转化成可定量的蓝色、不溶性的甲臜(formazon)产物的能力来评估线粒体功能。简言之，在处理期结束时，将放置在含有500μL细胞培养基的12孔板中的支架覆盖的盖玻片上生长的细胞与50μLMTS四唑鎓溶液(由制造商提供)一起在37℃下培育2小时。随后，使用酶标仪(InfiniteM200Pro，Tecan，Mannedorf，Switzerland)在490nm处测量吸光度，然后计算相对细胞活力。每个处理一式三份进行。

统计分析

将数据表示为平均值±平均值的标准误差。为了比较两组，通过双尾不成对的student t检验计算p值。在所有情况下，p值≤0.05被认为是统计学上显著的。

实施例2.儿茶酚胺作为交联剂

纤维毡的扫描电子显微镜结果

通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂布的静电纺丝明胶纤维毡的扫描电子显微镜图像显示纤维毡具有粗糙的表面，并且涂层完全遮蔽了纤维毡的纤维形态(图2)。这一结果与以下报道是一致的：通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂层的组成是复杂的，并且含有低聚物种类的混合物(Dreyer等，2012；Vacchia等，2013)，并且这种寡聚物的高聚集倾向和涂层的不均匀性是聚多巴胺涂层中观察到的表面粗糙度的原因(Hong等，2011和2013)。

相比之下，在暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之前和之后，由具有多巴胺和不同的儿茶酚胺的纺丝原液溶液进行静电纺丝所制备的各种儿茶酚胺涂布的明胶纤维毡的扫描电子显微镜图像显示，纤维毡的大孔结构即使在暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后也得到保持(图3)。

在暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之前和之后，由具有胶原和不同的儿茶酚胺的纺丝溶液进行静电纺丝所制备的儿茶酚胺涂布的胶原纤维毡观察到类似的结果(图4)。

在两种情况下，在暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳之后，涂层发生在静电纺丝明胶和胶原纤维的整个长度上。

当与制备聚多巴胺涂布的静电纺丝聚己内酯(PCL)、聚-L-乳酸(PLA)、聚(L-丙交酯-共-ε-己内酯)(PLCL)和PCL-明胶混合纳米纤维的Tris-HCl或碱溶液法相比时，碳酸铵扩散法在静电纺丝明胶纳米纤维上产生相对平滑的聚多巴胺涂层的膜或表面(参见表I中的参考文献)。

表I.通过碱溶液途径制备的聚多巴胺静电纺丝纤维的性质

物理和/或机械性能

当与静电纺丝聚合物纤维毡或未暴露于气态氨的静电纺丝多巴胺涂布的聚合物纤维毡相比时，在暴露于气态铵和二氧化碳之后，在聚多巴胺涂布的聚合物纤维毡中观察到关键的物理和/或机械性能如极限拉伸强度、杨氏模量和韧度的增加(表II)。从表II还注意到，与静电纺丝聚合物纤维毡相比，未暴露于气态氨的静电纺丝多巴胺涂布的聚合物纤维毡也显示出这些物理和/或机械性能的增加。

表II.在暴露于源自碳酸铵的氨和二氧化碳之前和之后，静电纺丝纤维和多巴胺涂布的静电纺丝纤维的机械性能

通过ATR-FTIR表征静电纺丝明胶

使用衰减全反射傅立叶变换红外光谱学(ATR-FTIR)研究静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纳米纤维。图6(A)显示了静电纺丝明胶纤维、通过氨扩散法制备的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维和通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂布的明胶纤维的ATR-FTIR。

静电纺丝明胶纤维毡的ATR-FTIR显示在1640cm^-1、1540cm^-1和1240cm^-1附近的吸收峰，其分别归属于酰胺I(C＝O拉伸)、酰胺II(N-H弯曲&N-H拉伸)和酰胺III(C-N拉伸&N-H同相弯曲)峰。如图6(A)所示，以3300cm^-1为中心的宽带归属于由于N-H拉伸而产生的酰胺A和酰胺B峰的组合。通过氨扩散法制备的聚多巴胺涂布的明胶纤维毡导致显著的变宽，并且在横跨3200–3500cm^-1范围的谱带强度增加，由此表明由于聚多巴胺的存在而存在额外的羟基官能团。

值得注意的是，在暴露于来自碳酸铵的气态氨和二氧化碳的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡中仍然观察到明胶的所有固有光谱特征。然而，对于通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂布的明胶纤维毡，由于聚多巴胺涂布而掩盖了明胶的峰。在多巴胺聚合后观察到的吲哚或吲哚啉结构(1605cm^-1和1515cm^-1)与明胶的酰胺I和酰胺II峰重叠，导致该区域内的强烈的宽带。

RP-HPLC以评估通过Tris-HCl法和氨扩散方法制备的聚多巴胺涂布的明胶纤维毡 的组成

为了鉴定使用Tris-HCl法和碳酸铵扩散法制备的聚多巴胺的组成的差异，针对以下物质进行反相色谱(RP-HPLC)：

(i)多巴胺单体；

(ii)通过ADM制备的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡；和

(iii)通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂布的明胶纤维毡。

然后比较获得的结果。从图6(D)的(ii)可见，通过ADM制备的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡的多巴胺单体峰(约6分钟处)几乎不可见，而在约25分钟处仅观察到一个单峰，表明多巴胺单体的完全转化和多巴胺的均相聚合。然而，对于基于溶液的Tris-HCl聚合，如图6(D)的(iii)中所见，除了少量的单体多巴胺外，还观察到许多峰。这些结果与以下报道一致：通过Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂层的组成是复杂的并且含有低聚物种的混合物(Dreyer等，2012；Vacchia等，2013)；这种低聚物的高聚集趋势和涂层的非均质性是聚多巴胺涂层中观察到的表面粗糙度的原因(Hong等，2011和2013)。

另一方面，RP-HPLC结果表明，当与通过溶液途径的非均相聚合相比，暴露于气态氨后，存在明胶纤维毡中多巴胺的受控聚合，因此促进了纤维间的均匀融合和交联剂的平滑表面涂层。

接触角测量

为了确定静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡的润湿性(亲水性/疏水性性质)，对水接触角(θ_静态)进行测定。对于静电纺丝明胶纤维毡和未暴露于气态氨的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡，水滴被迅速吸收到纤维网络中，在40秒内导致零接触角。图6(B)显示了在其完全吸收之前20秒时静电纺丝明胶纤维毡上的水滴。相比之下，对于通过氨扩散法制备的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡，接触角逐渐降低，并在64.7±1.2°至72.8±0.3°之间趋于平稳，如图6(C)中所示。这些结果表明，通过氨扩散法的聚多巴胺涂层使得明胶表面比静电纺丝明胶纤维毡更为疏水。该结果也与其它基底上的聚多巴胺涂层的报道的结果一致(Wei Q等，2010)。

包括细胞毒性在内的细胞培养研究

共聚焦显微镜术显示，与静电纺丝明胶纤维毡和未暴露于气态氨的多巴胺涂布的明胶纤维毡相比，在通过ADM制备的聚多巴胺涂布的明胶纤维毡上培养的真皮皮肤成纤维细胞的形态和细胞骨架结构中没有显示可观察到的差异[图5(B)-(D)]。当与在玻璃盖玻片上培养的细胞(对照，图5(A))相比时，在任何一种静电纺丝明胶纤维毡上生长的细胞中没有观察到核形态或核染色强度的显著变化。细胞和细胞核的整体形状和大小在正常的变化范围之内，并且没有显著的细胞或核异常(例如，缩合或泄露)、膜结合的囊泡、细胞质的收缩或细胞破裂的迹象。

MTS测定还证实，聚多巴胺涂布的明胶纤维毡对细胞活力没有任何不利影响[图5(F)]。

共聚焦显微镜术和MTS测定显示出诺考达唑对照显著的细胞死亡。

纤维毡的共聚焦荧光显微镜术

对静电纺丝明胶纤维毡和暴露于气态氨之后的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡进行共聚焦荧光显微镜成像。

静电纺丝明胶纤维毡在A360nm处激发时显示弱荧光(图7A)。然而，在通过氨扩散法制备的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡中，强烈的蓝色纳米纤维清晰可见(图7B)。还观察到，荧光强度随着纺丝原液溶液中存在的多巴胺浓度的增加而增加(图7C)。

静电纺丝明胶纤维毡的λ-扫描显示出在415-440nm附近的宽带，并且没有观察到特征性发射最大值。通过氨扩散法制备的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡显示出在457nm附近的发射最大值。此外，观察到发射强度随着多巴胺浓度而增加，这与显微镜结果一致。当与未暴露于气态氨的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡相比时，通过氨扩散法制备的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡也显示出更高的荧光强度，进一步证实了聚多巴胺结构的形成。

概述

实施例2中的数据显示，儿茶酚胺涂布的聚合物纤维毡通过氨扩散法氧化聚合，在聚合物纤维毡上形成聚儿茶酚胺的平滑且无细胞毒性(因此具有生物相容性)的涂层，同时保持聚合物纤维毡的多孔结构。此外，与使用Tris-HCl法制备的聚多巴胺涂布的聚合物纤维毡相比，使用氨扩散法制备的聚多巴胺涂布的聚合物纤维毡改善了物理和/或机械性能。

实施例3.抗微生物纳米纤维聚合物产品

在抗微生物递送和伤口敷料的领域中，需要在感染部位高浓度的抗微生物剂以达到临床效果。一些抗微生物递送平台如聚合物和肽水凝胶、纳米颗粒、微乳、脂质体、泡囊或者醇质体(ethnosome)可以用作贮库以在感染部位递送抗微生物剂。然而，这些制剂通常需要频繁应用以维持药物的持续释放。已经报道了将抗微生物剂掺入含水稳定聚合物和静电纺丝纤维毡(Abrigo等，2014；Joshi等，2014；Lakshiminarayanan等，2014；US 2014/0142025)。尽管如此，还是希望进一步改善抗微生物剂在适当时期内的稳定性和持续递送。

材料和方法

所有的化学品都是分析级的，并且未经进一步纯化即使用。

制备纺丝原液溶液

应当理解，对于不同的聚合物纺丝原液溶液，可以相应地使用不同的合适溶剂。还应当理解，可以使用不同的聚合物、不同的儿茶酚胺和不同的多羟基抗微生物剂来组成纺丝原液溶液。如上所述，应当进一步理解，可以使用不同量的聚合物、儿茶酚胺和抗微生物剂来相应地组成纺丝原液溶液。同样如上所述，每种聚合物纺丝原液溶液可以包含一种或多种聚合物、一种或多种儿茶酚胺和一种或多种多羟基抗微生物剂。

通过将明胶溶解在2,2,2-三氟乙醇(TFE)(Sigma-Aldrich)中制备所需浓度(例如10％w/v)的澄清均质明胶(来自猪皮，A型，300g Bloom)溶液。这用作用于静电纺丝原始明胶纤维毡的基本纺丝原液溶液。这用作用于静电纺丝原始明胶纤维毡的基本纺丝原液溶液。

加入纺丝原液溶液中明胶的0.5％w/w的抗微生物剂(两性霉素B、卡泊芬净、万古霉素、多粘菌素B或达托霉素，来自Sigma Aldrich Pte Ltd，新加坡)，以产生用于静电纺丝明胶抗微生物纤维毡的单独的纺丝原液溶液。

加入多巴胺(Sigma-Aldrich)至纺丝原液溶液中聚合物的2％w/w的浓度，以产生用于静电纺丝多巴胺涂布的明胶抗微生物纤维毡的单独的纺丝原液溶液。

在静电纺丝之前，在室温下伴随连续搅拌保持每种纺丝原液溶液24小时。

静电纺丝

使用定制的静电纺丝装置(包括γ高压直流电源，USA)和注射泵(KDS 100，KDScientific，Holliston，MA)来制造静电纺丝聚合物纤维。

使用注射泵将制备的纺丝原液溶液以0.8ml/h的速率加入到连接至27G平头不锈钢针的5ml标准塑料注射器(由聚丙烯制成)中。在针的孔口处会形成小滴，并通过施加11.5KV的高电压将这些小滴拉伸并张开成连续的长纤维。将纤维收集在置于与针大约12cm距离处的不同基底(例如铝箔、玻璃盖玻片等)的接地目标上。

所有静电纺丝在室温下进行，空气湿度约为25％。

氨扩散法

在真空干燥48小时以去除残留溶剂之后，然后将每个静电纺丝纤维毡暴露于密封的干燥器中适量的碳酸铵粉末(5g)(Sigma-Aldrich)大约24小时。

扫描电子显微镜(SEM)

使用场发射扫描电子显微镜(FEI-QUANTA 200F，Oregon，USA)观察纤维毡的形态。在用铂(JEOL JSC-1200精细涂布机，日本)溅射涂布样品之后，在15KV的加速电压下进行所有SEM测量。然后使用图像分析软件(Image J，National Institute of Health，USA)分析不同静电纺丝明胶/胶原纤维样品的SEM图像以计算平均纤维直径。测量大约100个随机选择的纳米纤维的直径以获得每个明胶/胶原纤维样品中的平均纳米纤维直径。

接触角测量

通过使用VCA Optima表面分析系统(AST products，Billerica，MA)的静滴水接触角测量来测量静电纺丝纤维毡的亲水性/疏水性性质。使用蒸馏水用于形成液滴。

多羟基抗微生物剂的释放曲线

如下测定由具有多羟基抗微生物剂的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡释放的抗微生物剂的量。将10mg各自的纤维毡(基于计算含有50μg抗微生物剂)浸入24孔板中的1mL PBS缓冲液(pH 7.5)中。以预定的时间间隔，使用UV-分光光度计(UV1800双光束分光光度计，Shimadzu，Kyoto，日本)通过UV吸光度(280nm)监测溶液，并使用已知的标准溶液通过校准方法估计释放的抗微生物剂的量(图10B)。

上述方法仅适用于达托霉素。对于装载两性霉素B和卡泊芬净的静电纺丝纤维毡，使用上述方法不能确定所释放的抗微生物剂的量，因为这些药物最有可能与纤维毡共价连接。例如，为了测定结合的两性霉素B的量，在1mL水中超声处理含有50μg(计算值)两性霉素B的10mg静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡30分钟以从纤维毡中释放两性霉素B。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定含有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺纤维毡超声处理后释放到上清液中的两性霉素B的量(图10A)。对于卡泊芬净，在1mL水中超声处理含有25μg(计算值)卡泊芬净的5mg静电纺丝聚多巴胺涂布的纤维毡30分钟以从纤维毡中释放两性霉素B。通过RP-HPLC通过与25μg卡泊芬净的RP-HPLC曲线(图10C)比较测定含有卡泊芬净的静电纺丝聚多巴胺纤维毡超声处理后释放到上清液中的卡泊芬净的量(图10D)。

使用具有C18分析柱(Phenomenex，CA，USA)的Waters HPLC分析仪进行RP-HPLC。流动相(A＝含有1％三氟乙酸的蒸馏水，B＝含有1％三氟乙酸的乙腈)的程序设计如下：0-5分钟为95:5(A:B，v:v)的静态模式，5-35分钟为10:90的梯度模式，35-40分钟为5:95的梯度模式，40-43分钟为95:5的梯度模式，且43-50分钟为95:5的静态模式。使用紫外可见检测器，检测器波长为280nm(100μl样品注射)。

50μg/mL两性霉素B(AmB)与超声处理时从具有两性霉素B的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡(明胶_DA-AmB)释放的两性霉素B的RP-HPLC曲线下面积的差值提供了超声处理时从纤维毡释放的两性霉素B的估计量(参见图10A)。

径向盘扩散测定

在9cm直径的陪替氏培养皿中使用棉签将真菌或酵母细胞培养物(浓度为0.5McFarland标准物)铺展在无菌Sabouraud葡萄糖琼脂板的表面上。将每个纤维毡(1cm×1cm)的样品置于擦拭的培养物的顶部，并在37℃下培育。对于念珠菌(Candida)菌株，纤维毡的抗真菌活性可视化为在黑暗中培育板48小时后的抑制区域直径，对于镰刀菌(Fusarium)和曲霉菌(Aspergillus)菌株，则为72小时后的抑制区域直径。测定以两个独立的重复进行，并报告平均值。

在9cm直径的陪替氏培养皿中使用棉签将革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌培养物(浓度为0.5McFarland标准物)铺展在无菌Muller和Hinton琼脂(MHA)板的表面上。将每种待测试的静电纺丝多巴胺涂布的明胶抗菌纤维毡(1cm×1cm)置于单独陪替氏培养皿中的擦拭培养物的顶部，并在37℃下培育。这些静电纺丝垫的抗细菌活性观察为在黑暗中培育陪替氏培养皿24小时后的抑制区域(以cm计)。测定以两个独立的重复进行，并报告平均值。

长期抗微生物效力测定

通过修改的ASTM方案(ASTM)评估具有抗微生物剂的静电纺丝多巴胺涂布的明胶纤维毡(未暴露于碳酸铵)和暴露于碳酸铵之后的具有抗微生物剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡的长期抗微生物功效。简言之，将每种抗微生物纤维毡浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.0中并不断摇动。在预定的间隔将垫取出，用水漂洗，并如上所述通过盘扩散法测定抗微生物活性。为了评估抗真菌活性，使用白色念珠菌(C.albicans)ATCC 10231。为了评估抗细菌活性，使用MRSA9808R。

水性稳定性

在各种确定的时间段内将静电纺丝纤维毡浸泡在PBS中，并如上所述通过SEM观察浸泡后每种纤维毡的形态。

实施例2：结果

静电纺丝纤维毡的性能

扫描电子显微镜。具有各种抗微生物剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后显示出静电纺丝纤维的紧密融合(图8)，表明纤维在连接处稳定。

接触角测量。测量具有各种抗微生物剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡暴露于碳酸铵之后的水接触角(θ_静态)，以确定毡的润湿性。结果表明，与没有抗微生物剂的静电纺丝聚多巴胺涂布的纤维毡相比，静电纺丝多巴胺涂布的抗微生物纤维毡增加了纤维表面的疏水性(表1)。与其它抗微生物剂相比，具有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺交联纤维毡在碳酸铵暴露后显示出最低的接触角。

表1.含有各种抗微生物剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡暴露于碳酸铵之后的水接触角测量

通过RP-HPLC评估的释放曲线。暴露于碳酸铵之后，具有可适用的抗真菌剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡所释放的两性霉素B或卡泊芬净的量非常低，且无法定量。这些结果表明这两种多羟基抗真菌剂可以共价连接到纤维毡上。通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定具有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡超声处理后自上清液释放的两性霉素B的量。上清液的色谱分析表明，在超声处理后释放大约49.5±3％的两性霉素B(图10A)，这意味着～50％的两性霉素B保持与纤维毡结合。

在卡泊芬净的情况下，在上清液中检测到甚至更少的经释放卡泊芬净(约35％)，表明在超声处理后约65％的卡泊芬净保持与纤维毡结合(图10C和10D)。

在达托霉素的情况下，释放研究表明在5h内释放>60％的达托霉素，且在30小时内释放～80％的达托霉素(图10B)。观察到与卡泊芬净和两性霉素B相比具有更少羟基的达托霉素所释放的量更大。这些结果表明了多个羟基基团在稳定药物-基质相互作用中的可能作用。

抗微生物活性-径向扩散测定。针对一组致病的革兰氏阳性细菌和酵母/真菌进行径向扩散测定。具有两性霉素B或卡泊芬净的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后保留其抗致病性酵母和真菌的抗真菌特性(表2)。所报告的值是两个独立测量的平均值。

表2.通过径向扩散测定测量的具有两性霉素B或卡泊芬净的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后的抗微生物特性。

类似地，观察到具有万古霉素或达托霉素的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后针对革兰氏阳性细菌菌株的清晰的抑制区(表3)。

表3.通过径向扩散测定测量的具有万古霉素或达托霉素的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后的抗微生物特性。

MRSA-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

ND-未测定

*没有从重复中观察到标准偏差。

表2和表3中的结果表明聚多巴胺交联未影响纤维毡中抗微生物剂的抗微生物特性。另外，在毡的顶部以及底部都没有检测到菌落，表明完全抑制了微生物。

长期抗微生物功效。通过如上所述经修改的ASTM方案评估各种纤维毡的长期抗微生物功效。具有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后保留了至少20天的长期抗真菌活性(图11A)。同样地，含有卡泊芬净的静电纺丝聚多巴胺涂布的明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后也保留了20天时段的抗真菌活性(图11A)。观察到具有万古霉素的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后的长期抗微生物活性持续至少15天(图11B)。然而，具有达托霉素的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡自第一天后就未显示出清晰的抑制区域。这些结果与早前的观察一致，即在24h内发生达托霉素自纤维毡的快速释放，因为这将导致残留在纤维毡中的达托霉素的量低并因此丧失抗细菌活性。

此外，观察到具有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之前(初纺)的抗微生物活性仅持续15天，而暴露于碳酸铵之后交联的那些(XL)显示出抗微生物活性达到20天并可能超过20天(图11C)。当与暴露于碳酸铵之前的具有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡相比时，还观察到暴露于碳酸铵之后的具有两性霉素B的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡的更大的抑制区域。该结果表明暴露于碳酸铵改善了纤维毡在抗微生物剂递送方面的临床和长期效力。

在该研究中，观察到具有多羟基抗真菌剂(两性霉素B和卡泊芬净)和万古霉素(抗细菌剂)的静电纺丝聚多巴胺交联明胶毡的抗微生物活性持续至少15天，这可能是由于多羟基抗真菌剂和纤维之间的强相互作用外加聚多巴胺的“胶状”性质。

水性稳定性。通过将静电纺丝原始明胶纤维毡、暴露于碳酸铵之后的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡和暴露于碳酸铵之后的具有抗真菌剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡浸入PBS中并观察形态变化来研究其水性稳定性。静电纺丝原始明胶纤维毡容易形成清澈透明的凝胶，并在浸入PBS中后5h内观察到纤维结构的损失(图12A)。浸入PBS中1周的暴露于碳酸铵之后的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡显示出晶须状结构(图12B)。随着培育时间发展至2周，晶须状结构的平均直径减小并聚结以形成具有不规则形态的膜状结构(图12C)。

对于碳酸铵暴露之后的具有两性霉素B或卡泊芬净的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡，个体纤维保持完整，虽然在PBS中1周后出现卷曲(图13A和图13F)。培育2周后，在具有两性霉素B的纤维毡中明显可见相当大的纤维融合(图13B)，且在培育时间达到3周或以上时纤维形态完全消失(图13C-13E)。

然而，具有卡泊芬净的纤维毡保持完整，尽管当培育时间达到4和5周时，个体纤维的平均纤维直径和聚结的降低是显而易见的。应当注意，两性霉素B和卡泊芬净都含有显著数量的游离–OH和–NH₂基团，其可以增强聚多巴胺涂布期间的交联密度。

结果表明，当与没有抗真菌剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡相比时，具有抗真菌剂的静电纺丝聚多巴胺交联明胶纤维毡在暴露于碳酸铵之后具有较高的水性稳定性(图13A和图13F对比图12B)。

讨论

如上所述，静电纺丝纤维可以通过儿茶酚胺或多酚化合物交联。本发明通过包括多羟基抗微生物剂进一步延伸。结果表明，暴露于碳酸铵之后，具有儿茶酚胺和多羟基抗微生物剂的静电纺丝明胶毡耐用且具有显著的生物学性质。具有抗微生物剂的纤维毡抑制病原微生物的生长并长时期保留纳米纤维的结构。

实施例4.静电纺丝胶原和复合纳米纤维以及形态表征

试剂：来自牛真皮的去端肽胶原粉末(I型胶原，产品编号CLP-01)是Koken(Tokyo，日本)的产品，并购自Unison Collaborative Pte Ltd。多巴胺盐酸盐(DA)、去甲肾上腺素盐酸盐(NE)、1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)、氯化钙(CaCl₂)和碳酸铵获得自Sigma-Aldrich(新加坡)。化学品是分析级的，并且未经进一步纯化即使用。

静电纺丝胶原和复合纳米纤维。原始胶原毡制备自六氟异丙醇(HFIP)中的8％w/v纺丝原液溶液，并将溶液转移到具有27G不锈钢钝针的聚丙烯塑料注射器中。以来自高压电源(Gamma High Voltage Research,Inc.，FL，USA)的13kV的施加电压将该溶液挤出，并将针和收集器(平整铝箔)之间的距离设定为17cm，进料速率为1ml/h(KD 100ScientificInc.，MA，USA)。使用相同的条件来制备含有10％(w/w)儿茶酚胺的毡。然而，为了制备含有儿茶酚胺和CaCl₂的毡，将胶原溶解在含有CaCl₂的90％HFIP和10％H₂O中(最终浓度为20mMCa²⁺)。17kV/13cm的电压/距离和0.8mL/h的进料速率产生了无珠纳米纤维。所有的静电纺丝实验均在室温下在约25％的湿度下进行，并将收集的静电纺丝毡真空干燥48小时以除去任何残留的HFIP，然后储存在干燥的橱柜中进行碳酸铵暴露和表征。将具有或不具有Ca²⁺的儿茶酚胺负载毡置于含有～5g(NH₄)₂CO₃粉末的密封干燥器中24小时以诱导氧化聚合和CaCO₃的沉淀。对于SEM、光致发光和细胞培养研究，将纤维收集在显微镜盖玻片(15mm)上和用于TEM的镀金铜网上。为了简单起见，将毡进行如下标记：原始胶原毡–ES_Coll；具有DA或NE的初纺胶原毡-Coll_DA或Coll_NE；(NH₄)₂CO₃暴露后的胶原毡-Coll_pDA和Coll_pNE；含有DA或NE和20mM Ca²⁺的初纺胶原毡-Coll_DA_Ca或Coll_NE_Ca；(NH₄)₂CO₃暴露后的含有DA或NE和20mM Ca²⁺的胶原毡-Coll_pDA_Ca或Coll_pNE_Ca。

通过扫描和透射电子显微镜(SEM/TEM)的形态表征。通过场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)研究胶原毡的形态学分析以推断i)在胶原支架内掺入儿茶酚胺的影响，ii)在儿茶酚胺负载的毡中整合Ca²⁺离子的影响，iii)交联处理对静电纺丝胶原纳米纤维形态的影响，和iv)研究单轴拉伸测试后各种支架的断裂形态。还进行SEM研究以检查接种到各种支架上的细胞粘附和细胞形态。在用铂(JEOL JSC-1200精细涂布机，日本)溅射涂布样品之后，在FE-SEM(FEI-QUANTA 200F，荷兰)上以15KV的加速电压进行SEM分析。使用图像分析软件(Image J，National Institute of Health，USA)软件来估计各种支架的平均纤维直径。为了计算每个样品的平均直径，从它们各自的SEM图像(3-4个聚焦不同区域的显微照片)随机选择～100个纳米纤维，并用于测量它们的直径。使用JEOL JEM-3010仪器进行选区电子衍射(SAED)图案和TEM研究。

结果。通过电子显微镜研究具有或不具有儿茶酚胺和儿茶酚胺/Ca²⁺的ES胶原支架的形态特征。由HFIP中10％纺丝原液溶液静电纺丝的原始胶原毡的扫描电子显微镜(SEM)揭示存在平均直径为900±150nm的平滑、无珠和均匀的纤维形态(图14A)。

添加10％(w/w)的儿茶酚胺在静电纺丝胶原毡中引起了两个值得注意的形态变化：i)值显著降低(～3倍)(COLL_DA为331±46nm，且COLL_NE为323±43nm)，和ii)儿茶酚胺的存在使两根纤维合并，并消除接触点处个体纤维的特性，从而形成焊接或焊合接头(图14B、14C和右上角的插图)。由于静电纺丝是在促进分子内氢键键合的低氢键合溶剂中进行的，因此在接触点处存在较高浓度的儿茶酚胺可促进纤维间的粘附，从而形成焊接接头。参见，Vidal2014；He 2011。

先前的研究表明，由氟代醇制备的静电纺丝胶原毡缺乏足够的机械强度和水性稳定性，因此可能不适合通过常规碱性Tris-HCl(pH8.5)法进行儿茶酚胺的氧化聚合。参见，Zeugolis 2008；Matthews 2002。为了避免碱性溶液对胶原纳米纤维的有害影响，我们将儿茶酚胺负载毡暴露于(NH₄)₂CO₃以诱导儿茶酚胺的氧化聚合。此后，该方法被称为碳酸铵扩散法(ADM)。由于整个反应在固体-蒸气界面进行，可以预期静电纺丝胶原的形态特征保持完整。实际上，在将儿茶酚胺负载毡暴露于(NH₄)₂CO₃之后，观察到焊接接头形成的大幅增加(图14D、14E)。在含NE毡的情况下，该效果是显著的，因为大量的纤维间粘附和焊接接头导致ADM后不连续的多孔涂层(图14E)。ADM后支架的褐色着色进一步证实了儿茶酚胺的氧化产物的形成(图14E、14D左下角的插图)。

值得注意的是，与不具有Ca²⁺的静电纺丝毡相比，添加20mM Ca²⁺到胶原-儿茶酚胺纺丝原液溶液中显著增加了焊接接头的形成(图14F、14G和右上角的插图)。添加20mM Ca²⁺后，毡的颜色从白色变为棕色(DA)/浅粉色(NE)(图14F、14G和左下角的插图)。这些结果表明可能的阳离子诱导的儿茶酚胺电化学氧化为具有固有粘合性质的聚儿茶酚胺，由此促进纤维间的粘附。参见，Chai 2014。由于含有儿茶酚胺和Ca²⁺的纺丝原液溶液的颜色在静电纺丝之前没有变化，因此可能是由于在静电纺丝过程中DA和NE的电化学电位诱导的氧化引起的毡的棕色着色。参见，Robinson 2003；Li 2010。在ADM后，儿茶酚胺-Ca²⁺负载的胶原毡表现出更强烈的着色而没有形态上的明显变化(图14H、14I)。高分辨TEM图像显示沿着个体纤维长度的亚nm大小的纳米颗粒的分布，表明CaCO₃的形成(图14H、14I右上角的插图)。选定区域衍射图案中的扩散环的出现证实了颗粒的无定形性质(图15)。由于我们不能通过FTIR、拉曼(Raman)或XRD方法检测清楚的信号，因此颗粒的详细矿物学表征是困难的。尽管如此，利用(NH₄)₂CO₃分解形成气态氨和CO₂的优点，我们报道了一个简单策略以同时进行ES胶原纤维的交联和矿化。

实施例5.复合纳米纤维聚合物产品的润湿性研究。

接触角测量：为了评估不同静电纺丝胶原纤维毡的亲水性/疏水性特征，使用VCAOptima表面分析系统(AST products，Billerica，MA)进行静滴静态和动态水接触角测量。将1μL蒸馏水滴置于纤维毡上，并且每隔10秒连续拍摄60秒。将接触角-时间曲线的非线性下降的线性部分外推至0时以确定θ_静态值。所报告的值由两个独立的一式三份实验确定。

静电纺丝胶原毡的润湿性：通过动态水接触角测量评估毡的润湿性，并报告θ_静态值。图16显示了在各种条件下制备的静电纺丝胶原的接触角的变化。对于原始胶原毡(ES_Coll)，水接触角(WCA)在60秒内从初始值74.4±0.1°达到59.3±1.4°(图17A)。

DA的掺入(Coll_DA)使初始WCA降低约20°，表明毡的润湿性增加，并在1分钟后达到最终值40.6±0.1°。ADM处理后(Coll_pDA)，初始WCA从92.1±4.5°急剧下降至最终值52.5±0.1°。纺丝原液溶液中Ca²⁺的存在(Coll_DA_Ca)对初始WCA有显著影响，其值呈指数下降并达到76.7±3.9°的值。有趣的是，ADM暴露后，对于Coll_pDA_Ca没有观察到WCA的明显变化。

为了进一步了解WCA测量，我们通过将曲线的线性部分外推到零时来确定静态WCA(θ_静态)。结果表明，当与原始胶原毡相比时，在ADM之前或之后含有DA的胶原毡具有减少的θ_静态(图17B)。相比之下，Coll_DA_Ca毡的值显著增加，并在ADM之后保持不变(图17B)。这些结果证实了我们先前的观察，即Ca²⁺与DA一起存在可以触发静电纺丝过程中的氧化聚合，从而产生具有与Coll_pDA毡相似的表面润湿性的毡。在含有NE的ES胶原毡的情况下，观察到类似的时间依赖性WCA趋势(图17C)和θ_静态(图17D)。

实施例6.复合纳米纤维聚合物产品的XPS分析。

X-射线光电子能谱。通过利用单色Al-KαX射线源(1486.71eV)，在～10^-9托的超高真空(UHV)条件下使用Kratos AXIS UltraDLD(Kratos Analytical Ltd)进行XPS研究。记录一般扫描和不同的高分辨率光谱，以深入分析制造样品的各种化学状态。在分析过程中，使用各种以Shirley模式减去背景的Gaussian-Lorentzian组分将高分辨率光谱解卷积。

通过XPS表征胶原复合物。接下来，我们将注意力集中在所形成的复合结构的表征上。为了推断掺入儿茶酚胺(DA和NE)与CaCl₂后进行ADM的胶原纤维的碳和氮周围化学键合环境的变化，我们进行了XPS测量。高分辨率C 1s和N 1s核级谱的形状表明静电纺丝毡中存在多个键合组分(图18)。C 1s谱的解卷积揭示每个样品中存在四个峰；即分别对应于C-C/C-H、C-N、C-O和C＝O键合的C₁、C₂、C₃和C₄(图18A-18J)。类似地，N 1s光谱的解卷积揭示每个样品中存在两个峰；即分别指定为R₂NH和RNH₂键合的N₁和N₂。表4中提供了这些键合的峰位置，并且发现与所报道的文献较好地一致。参见，Zangmeister 2013；He 2014。

表4.对应于C1s和N1s峰的各种键合状态的峰位置。

峰	峰位置(eV)	键类型
			C1	284.5±0.1	C-C/C-H
C2	285.65±0.05	C-N
			C3	286.5±0.1	C-O
C4	287.5±0.1	C＝O
			N1	399.42	R2NH
N2	400.9	RNH2

此外，使用面积比法来估计所有样品的每个峰的键合含量，结果汇总在表5中。Cal_DA_Ca和Coll_NE_Ca样品的C 1s和Nls谱揭示C-N键合强度和原子组成的显著增加，确证了静电纺丝过程中观察到的颜色变化。ADM之后C-N键合强度的增加更为明显，从而证实了儿茶酚胺转化为聚儿茶酚胺。

表5.自C1s核级谱检查的各种键的定量分析。

为了探索钙离子周围的键合环境的变化，还记录了所有样品的Ca 2p和Cl 2p核级谱(图18K、18L)。对于Coll_DA_Ca和Coll_NE_Ca样品，在348.0eV处的Ca 2p_3/2峰和Cl 2p_3/2(在198.3eV处)和Cl 2p_1/2(在199.85eV处)峰表明钙或氯离子的键合环境在静电纺丝之后没有变化。参见，Hu 2006；Demri 1995；Baltrusaitis 2007。然而，两个重要的观察证实了ADM之后毡中CaCO₃的形成。首先，在Coll_pDA_Ca和Coll_pNE_Ca毡中Ca和Cl峰的强度都降低了，尽管在含有多巴胺的毡中效果是显著的。其次，当与Coll_DA_Ca或Coll_NE_Ca毡相比时，Ca 2p_3/2(347.6±0.05eV)和Cl 2p_3/2(在198.0eV处)峰移向较低的结合能。已经报道了CaCO₃的各种多晶型物在346.5-347.9eV范围内出现Ca 2p_3/2。参见，Blanchar 1992；Kouhi2013；Chu 2013。

为了进一步了解ADM之后毡中CaCO₃的形成，检查交联纳米纤维的O 1s核级谱。在ES_Coll中掺入DA/NE和Ca²⁺(即，对于Coll_DA/NE_Ca毡)时，观察到O 1s峰的位置从530.8eV至531.0eV的弱上移(图18M)。由于Ca 2p和Cl 2p谱在Coll_DA/NE_Ca毡的谱图中没有显示明显的变化，因此这些样品中O 1s峰的边缘上移可能是由于Ca²⁺与儿茶酚胺的弱相互作用。然而，在ADM之后，Coll_pDA/pNE_Ca毡的O 1s峰进一步上移至531.2eV，证实了这些毡中碳酸盐结构的形成。参见，Demri 1995；Baltrusaitis 2007；Blanchard1992。与TEM结果一起，这些观察证实了(NH₄)₂CO₃处理后毡中CaCO₃的形成。

实施例7.复合纳米纤维聚合物产品的机械表征。

机械性能的测定。根据ASTMD882-02方案，使用在环境条件下使用10N容量的测压元件的台式拉伸测试仪(Instron 5345，USA)进行静电纺丝纤维的拉伸测试。基于每个胶原毡产生的应力-应变曲线计算所有机械性能(拉伸强度、失效应变、杨氏模量和失效功)。将毡切成1cm×3cm的矩形条，并使用微米卡尺测量每个样品的厚度。最后，以5mm/分钟的十字头速度将样品垂直安装在拉伸测试仪的夹持单元上。平均结果报告自2-4个独立的测量。

胶原复合材料的机械性能。接下来，我们研究了掺入儿茶酚胺/Ca²⁺和随后的矿化和交联对胶原毡的机械性能的影响。通过单轴拉伸测试测量的各种胶原毡的典型应力-应变曲线显示在图19A和19B中。我们由应力-应变曲线确定了峰值应力(σ)、断裂伸长率(ε_b)、杨氏模量(E’)和失效功(J_lc)(表6)。表7中给出了各种毡的机械性能的详细统计分析。对于ES_Coll，观察到脆性样行为，σ值为4.9±0.5MPa且ε_b为6.0±1.3％。由应力-应变曲线估计拉伸模量为156.7±29MPa，且机械韧度为0.22±0.07MJm^-3(图19A)。

表6.在各种条件下制备的静电纺丝胶原毡的机械性能。显著性值：*，p≤0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001且ns，p>0.05，通过t检验或单因素方差分析。

添加10％DA增加了毡的弹性性能，表现为ε_b和J_lc值的增加(图19A)。ADM之后，观察到脆性样行为，表现为σ(15.1±3.8MPa)或E’(512.6±136.9MPa)的显著增加和低ε_b值(4.1±0.6％，图19C、19D)。然而，将Ca²⁺掺入含有DA的纺丝原液溶液中对拉伸性能具有深远的影响，因为由溶液制备的毡显示出σ、E’和ε_b值的显著增加(图19C、19D)。值得注意的是，Coll_DA_Ca的拉伸性能接近Coll_pDA所获得的值，证实纺丝原液溶液中Ca²⁺的存在触发了DA的氧化聚合。对于Coll_pDA和Coll_pDA_Ca，没有观察到σ和E’值的显著差异(p>0.05)，而在弹性性质上显著性差异是明显的。这些结果表明，CaCO₃的形成增加了复合材料的韧性，而不影响聚儿茶酚胺交联的胶原的抗拉刚度和强度。在含有NE的毡的情况下观察到类似的趋势(图19B、19E、19F)。事实上，Ca²⁺对含有NE的毡的机械性能的影响是如此显著，以致E’值接近亚GPa，具有比对于含有DA的毡所观察到的更高的弹性/韧性(表6)。这些结果表明，将Ca²⁺掺入含有儿茶酚胺的胶原和随后的矿化增加了弹性性能，同时增强了机械强度和刚度。与原始聚合物相比，复合材料的刚度和韧性的这种显著增强不能通过由他人报道的矿物和聚合物的直接混合所制备的复合材料毡所获得。参见，Fujihara 2005；Gao 2013；Kim 2005；Frohbergh 2012；Gupta 2009；Kharaziha 2013；Wutticharoenmongkol2006。

表7.对各种静电纺丝毡所测定的四种机械性能的统计比较。显著性值：*，p≤0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001且ns，p>0.05，通过t检验或单因素方差分析。

为了更深入地了解机械性能，我们通过SEM对各种毡的断裂表面进行了成像。ES_Coll和Coll_DA和Coll_NE毡的变形结构含有许多胶原原纤维(图20A-20C)。Coll_pDA的变形表面含有许多断裂步骤，表明对所施加的应力的抗力较弱(图20D)，证实了脆性样行为。参见，Tian 2007。对于Coll_pNE，由于形成焊接接头和光滑的聚儿茶酚胺涂层，断裂的表面表现为纤维增强的复合结构(图20E)。然而，如通过Coll_DA_Ca和Coll_NE_Ca毡的断裂表面上分支裂缝和河状线的显著增加所检测的，Ca²⁺的掺入显著改变了断裂形态(图20F、20G)。Coll_pDA_Ca和Coll_pNE_Ca毡的表面粗糙度显著增加(图20H、20I)。在Ca²⁺的存在下形成的焊接接头和涂层的高丰度可解释毡的机械性能的增加，而CaCO₃颗粒的形成增加了粗糙度，并防止了裂缝蔓延从而增强了复合材料的韧性。参见，Tian 2007。

实施例8.复合纳米纤维聚合物产品的光致发光性能。

纳米纤维支架的光致发光性能。使用配备有405、488、561和640nm激发激光器的共聚焦显微镜(Zeiss LSM 800Airyscan，Carl Zeiss Microimaging Inc.，NY，USA)进行荧光显微术。使用Plan-Apochromat 63×/1.4Oil DIC M27物镜(Carl Zeiss)，并将共聚焦针孔设置为1艾里单位用于绿色通道，并将其它通道调整为相同的光学层面厚度。对于每个激光通道，使用相同的激光百分比和数字增益获取来自不同样品组的图像。使用Zen 2.1litelite成像软件(Carl Zeiss)进行图形制备。

ES胶原毡的光致发光性能。最近的研究显示，在碱性氧化聚合过程中加入阳离子聚乙烯亚胺(PEI)得到荧光发射性能提高的PEI-pDA共聚物。参见，Zhao 2015。因此，我们通过荧光显微镜术和光谱学研究了儿茶酚胺交联毡的光学性质。原始ES_Coll毡显示处弱蓝色发射，而含有聚儿茶酚胺的毡显示处强烈的蓝色和绿色发射颜色(图21A-21C)。特别地，焊接接点处的荧光强度更强。对于含有多巴胺的胶原毡，矿化影响了荧光性质，因为Coll_pDA_Ca观察到蓝色和绿色荧光强度均显著降低(图21B、21D)。然而，对于含有NE的毡，矿化未改变蓝色荧光强度，而对于Coll_pNE_Ca则观察到绿色荧光强度的略微增加(图21C、21E)。平均荧光强度的定量估计进一步证实了来自图像的上述结果(图21F)。

光致发光性能差异的起因仍不清楚，可能是由于两种聚儿茶酚胺可与ADM后形成的无机矿物质不同地相互作用。具有优异的机械、光致发光和生物学(见下文)性质的复合结构的发展可以用作非侵入性的实时探针以及用于量化支架降解模式和组织整合而不牺牲动物。参见，Yang 2009；Xie 2014；Li 2016，并将为实现用于组织工程和再生医学的智能多功能支架开辟一个新的范例。

实施例9.用复合纳米纤维聚合物产品进行细胞培养。

杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、营养混合物F-12(HAM)、抗生素(批号#A5955)和Hoechst染料获自Sigma-Aldrich(新加坡)。人胎儿成骨细胞(hFob)获自美国模式培养物保藏所(ATCC，Arlington，VA)。对于细胞培养，胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶-EDTA购自GIBCOInvitrogen，USA。

人胎儿成骨细胞(hFob)细胞培养。在75cm²细胞培养瓶中，在补充有10％FBS和鸡尾酒抗生素的DMEM/F12培养基(1:1)中培养hFob细胞。在37℃下在潮湿的CO₂培养箱中培育hFob细胞1周，每3天用新鲜培养基喂养。使用胰蛋白酶-EDTA处理传代第三代后收获细胞，并在使用血细胞计数器用台盼蓝进行细胞计数后重新铺板。为了细胞接种，在15mm盖玻片上收集纳米纤维支架并在UV光下灭菌1小时。然后将支架置于具有不锈钢环的24孔板中以防止支架的提升。然后用10mM PBS(pH 7)洗涤支架三次15分钟以除去残留溶剂，最后在完全培养基中浸泡过夜。在COLL_DA_Ca、COLL_pDA_Ca、COLL_NE_Ca和COLL_pNE_Ca支架上以1×10⁴个细胞/孔的密度接种hFob细胞。将ES_Coll和TCP用作阳性对照。

细胞存活力分析：通过比色MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓，内盐)测定测试不同胶原支架上的细胞生长和增殖。用PBS冲洗细胞支架，并在无血清培养基中与MTS试剂培育3小时。代谢活性细胞与存在于MTS试剂中的四唑鎓盐反应，产生可溶性紫色甲臜(Formazan)染料。然后将等分试样转移到96孔板中，并使用分光光度读板仪(FLUOstar OPTIMA，BMG Lab Technologies，德国)在490nm下读取样品的吸光度。

钙黄绿素FDA是一种细胞穿透染料，容易被存在于活细胞中的细胞内酯酶裂解，从而产生荧光钙黄绿素。在细胞生长3、6和9天后，从24孔板中取出完全培养基，并用DMEM培养基喂养细胞。然后将支架与20μl CMFDA染料(25μM，在培养基中)在37℃下培育2小时。此后，去除CMFDA培养基，并将1ml完全培养基加入到细胞中并培育过夜。通过共聚焦显微镜成像之前，用Cytiva细胞健康试剂处理细胞1小时以报告细胞计数、细胞核形态和细胞活力/用Hoechst染料和碘化丙啶处理1小时以可视化所有的细胞核并鉴定死细胞。使用自动显微镜IN Cell Analyzer 2200(GE Healthcare)用×10物镜随机扫描9个场/细胞样品。使用INCell Investigator软件(GE Healthcare)进行所获图像的定量活/死细胞分析。使用ZeissLSM800Airyscan a Plan-Apochromat 40x/1.3油浸物镜激发405、488和561nm激光获得共聚焦图像和z-叠层。

为了可视化在不同支架上生长的细胞的形态和细胞骨架结构，在第3、6或9天时用4％(v/v)甲醛固定细胞。固定后，用远红荧光标记的细胞质染料，鬼笔环肽(Molecular)和Hoechst将细胞染色。使用Zeiss LSM800Airyscan a Plan-Apochromat 40x/1.3油浸物镜激发405、488和640nm激光获得共聚焦图像和z-叠层。使用Zen 2.1lite成像软件(Carl Zeiss)制备共聚焦图像。

结果。通过钙黄绿素荧光素二乙酸酯(钙黄绿素FDA)测定评估支架对hFob细胞的细胞毒性。将细胞接种在ES_Coll、Coll_DA_Ca、Coll_NE_Ca、Coll_pDA_Ca和Coll_pNE_Ca毡上。将接种在组织培养板(TCP)上的细胞用作对照。在各种支架上将hFob接种后(p.s.)3、6和9天后，用钙黄绿素FDA和PI染色细胞以获得活细胞/死细胞比率半定量信息。所有支架对hFob细胞都未显示出可辨别的细胞毒性，因为在不同的时间点的活细胞％保持>90％(图22A)，由此证实支架对于hFob具有优异的生物相容性。

在各种支架上培养的细胞的共聚焦图像示于三个不同时间点的图22B-22F中。有趣的是，在Coll_pDA/pNE_Ca毡中观察到增加的细胞群和扩散(图22E、22F)，如通过接种后9天后CellTracker Green CMFDA和细胞核(蓝色)的染色增加所指示的。这些结果表明在Coll_pDA/pNE_Ca毡上比在ES_Coll上更多的细胞扩散。共聚焦z-叠层成像使我们能够检查细胞渗透入各种胶原毡中的水平。在所有毡上观察到细胞穿透的时间依赖性增加，在Coll_pDA/pNE_Ca毡中渗透显著增加。与xy-扫描一起，这些结果表明在矿化支架上增加的细胞扩散和活性细胞迁移。

为了更好地了解细胞浸润到支架中，用远红细胞质染料染色hFob细胞，并自表面以及整个支架深度进行成像(图23A-23F)。顶视图图像表明在Coll_pDA_Ca和Coll_pNE_Ca毡上增强的细胞生长，与之前的结果一致。侧视图图像表明所有静电纺丝支架上细胞浸润的时间依赖性增加，如通过随着接种后时间的增加而增加的远红染色所表明的。正如在CM-FDA结果中观察到的，矿化毡(Coll_pDA_Ca和Coll_pNE_Ca)在接种后9天时表现出增强的细胞浸润，最大深度为30μm。

ES胶原基质上的成骨细胞增殖：为了研究钙掺杂的效果，通过MTS测定确定含有Ca²⁺负载的ES胶原的人胎儿成骨细胞(hFOB)细胞增殖。图24A比较了各种条件下hFOB的增殖速率。与原始胶原基质或玻璃盖玻片上的增殖速率相比，在纺丝原液溶液中掺入儿茶酚胺-Ca²⁺增加了细胞增殖速率，并且在延长的时间内效果显著。这些结果表明，与原始ES胶原相比，交联的胶原基质显示出增强的细胞响应。

用每个时间点的细胞数除以初始细胞密度之后的细胞增殖比表示数据。如图25A中所示，所有静电纺丝支架支持细胞附着和增殖直至接种后第9天，其由细胞增殖值的增加和接种后11天和14天后的水平所指示。由于胶原为hFob粘附和增殖提供活性细胞识别位点，我们在ES支架上观察到比TCP更高的细胞增殖速率。在各种胶原毡中，在接种后3天时没有观察到hFob增殖的统计学显著性差异(表8)。然而，儿茶酚胺负载的矿化毡(Coll_pDA/pNE_Ca)早在接种后6天时就表现出增殖增加。随着时间的进展，相比于ES_Coll，在所有儿茶酚胺/Ca²⁺毡(Coll_DA/NE_Ca和Coll_pDA/pNE_Ca)上培养的细胞显示出显著明显的代谢活性(图26A)。参见，Gupta 2009；Prabhakaran 2009。

表8.通过MTS测定确定的各种胶原支架和TCP的细胞增殖数据的统计比较。显著性值：*，p≤0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001且ns，p>0.05，通过t检验或单因素方差分析。

在两种儿茶酚胺中，NE负载的毡比含有DA的毡促进更高的增殖。钙黄绿素FDA和MTS分析结果揭示了以下结论：i)与TCP相比，对于毡而言，在所有时间点观察到hFob增殖的一致性增加。ii)将Ca²⁺掺入儿茶酚胺负载的胶原中并随后暴露于(NH₄)₂CO₃促进了细胞扩散和增殖增加，iii)在两种儿茶酚胺中，在掺入NE的毡，即COLL_NE_Ca(p<0.0001对比接种后11天的Coll_DA_Ca)和COLL_pNE_Ca(p<0.0001接种后11天的Coll_pDA_Ca)中的细胞增殖更为显著。这些结果表明，聚儿茶酚胺-CaCO₃复合结构对hFob无细胞毒性并刺激骨细胞的粘附和增殖，并且可通过适当选择儿茶酚胺来调节性质。

实施例10.复合纳米纤维聚合物产品的骨传导性质。

细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性：使用细胞的碱性磷酸酶活性的表达来评估它们在不同支架上的骨形成能力。用PBS洗涤细胞支架构建体15分钟并加入ALP(Sigma，新加坡)试剂。培育1小时后，使用2N NaOH停止反应。该测定使用对硝基苯基磷酸酯(pNPP)作为无色磷酸酯酶有机酯底物，其在去磷酸化时变成黄色，换言之，当被ALP催化时，形成对硝基苯酚和磷酸盐。将黄色产物等分在96孔板中，并使用酶标仪在405nm处测量反应吸光度。

碱性磷酸酶(ALP)是通过裂解有机磷酸酯提供游离磷酸根离子而负责矿物成核的重要酶类，且其表达与细胞分化有关。使用用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的碱性磷酸盐黄色液体替代系统(Sigma Life Science，USA)评估接种在各种支架上的hFob细胞的ALP活性。在该测定中，ALP催化无色的对硝基苯基磷酸酯(PNPP)水解成黄色产物对硝基苯酚和磷酸盐。在接种后3、6、9、11和14天时，从24孔板中取出培养基，并用PBS洗涤支架三次。然后用400μl PNPP溶液培育支架30分钟。通过加入200μl 2M NaOH溶液来完成反应。然后将得到的黄色溶液移液到96孔板中，并在微型板读数仪上在405nm下读取不同支架的吸光度。为了在不同时间点呈现细胞的ALP活性，用作为骨形成标记的细胞数标准化ALP活性。

当培养的hFob细胞接种在暴露于气态氨后的儿茶酚胺-Ca²⁺掺杂的ES纤维毡上时也显示增强的分化(图24B)。特别地，与原始胶原毡相比，暴露于气态氨后的含有钙的DA-/NE-负载的毡增加了>1.5倍的ALP活性。

ALP是骨基质囊泡的关键组分，其催化有机磷酸酯的裂解并在骨矿物质形成中发挥重要作用，并且是未成熟成骨细胞活性的早期指示剂。参见，Yang 2009。ALP活性也是早期成骨细胞分化和干细胞向成骨细胞表型定型(commitment)的标记。参见，Xie 2014。因此，我们通过在接种后第3、6、9、11和14天使用比色pNPP测定测量ALP活性来检查毡的成骨分化。ALP活性通过细胞数标准化，并在图25B中示出。接种后3天时，所有研究的胶原支架均未观察到ALP活性的显著变化(图25B和表9A)。然而，与原始胶原或TCP相比，在接种hFob 6天后，所有儿茶酚胺/Ca²⁺掺入的支架的ALP活性显著增加(p<0.0001)。在接种6-14天后，当在Coll_pDA/pNE_Ca毡上培养时，hFob比在Coll_DA/NE_Ca上培养的细胞稳定分化更长时间，表明矿化的支架也促进了细胞分化(图26B)。在两种儿茶酚胺中，在COLL_pNE_Ca上培养的细胞比在COLL_pDA_Ca毡上培养的细胞在早期观察到显著更高的ALP活性(表9A)，证实了去甲肾上腺素的氧化产物的成骨分化潜能的增加。与细胞增殖测定一起，这些结果证实COLL_pDA/pNE_Ca毡在成骨细胞生长、渗透和分化方面是优越的。

表9A.各种胶原支架和TCP的ALP活性数据的统计比较。显著性值：*，p≤0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001且ns，p>0.05，通过t检验或单因素方差分析。

纳米纤维支架上细胞矿化的检测：未分化的间充质干细胞(MSC)没有细胞外钙沉积，但是一旦MSC分化成成骨细胞，体内和体外就有更多的钙积聚。换言之，钙沉积的程度可以作为成骨细胞成功分化的指示。为了可视化由于成骨细胞分化而在支架上的矿化，使用茜素红S(ARS)染色。对于ARS染色，在每个时间点(第3天、第6天和第9天)，丢弃培养基后，用PBS洗涤支架三次，接着用70％乙醇处理1小时，再用蒸馏水洗涤两次。用40mM ARS将支架上的细胞染色30分钟后，拍摄显微镜图像以显示支架上钙沉积的程度。

茜素红-S(ARS)染色测定。使用ARS染色以定性和定量检测各种支架上的矿化程度。ARS是选择性结合钙盐并用于钙矿物组织化学的染料。首先使用PBS洗涤具有hFob细胞的纳米纤维支架三次，然后通过将它们处理至70％乙醇1小时来固定细胞。然后用去离子水洗涤细胞构建体三次，随后在室温下用ARS(40mM)染色20分钟。然后用去离子水洗涤支架几次，并在光学显微镜下可视化。为了定量评估，用10％氯化十六烷基吡啶洗脱染色60分钟。在Tecan读板器上在540nm下记录溶液的吸光度。

茜素红染色：为了测定细胞外矿物质沉积，使用ARS染色。图27显示了以不同间隔接种hFOB后染色的支架的光学显微镜图。含有儿茶酚胺-Ca²⁺的初纺毡比原始胶原显示处更高的矿物质沉积。与细胞分化和增殖测定一致，暴露于气态氨的儿茶酚胺-Ca²⁺掺杂的毡在第3天和第6天显示出最高的沉积。

在成骨细胞分化后，hFob细胞进入矿化阶段以沉积矿化的ECM。hFob沉积矿物质的能力是成骨效率的标记，并且可以通过在接种9天后在不同支架上培养的细胞的ARS染色来监测。图28显示了用ARS染色的各种样品的光学图像，其中亮红色染色指示由于ARS结合引起的钙矿化。当与TCP相比时，所有静电纺丝毡显示出大量的ARS染色，表明支架的矿化增加。在含有儿茶酚胺/Ca²⁺的毡中ARS染色增强，而在聚儿茶酚胺-CaCO₃复合毡中比在ES_Coll中更为显著，与在这些支架上观察到的ALP活性增加一致。ARS染色的光学图像进一步显示在Coll_DA/NE_Ca或Coll_pDA/pNE_Ca毡上培养的hFob细胞上的厚骨结节形成(图25C-25F)。这些结果表明，由聚儿茶酚胺-CaCO₃复合结构引起的生化线索刺激hFob粘附、增殖和分化。在接种后14天时通过氯化十六烷基吡啶测定定量估计各种毡上的着色剂进一步证实了Coll_pDA/pNE_Ca的增加的成骨能力(图25G)。与ALP活性观察到的趋势相似，Coll_pNE_Ca相比于Coll_pDA_Ca观察到更高的钙结节(p<0.0001)(表9B)。

表9B.接种后14天时各种胶原支架和TCP的ARS数据的统计学比较。显著性值：*，p≤0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001且ns，p>0.05，通过t检验或单因素方差分析。

成骨细胞在胶原纤维支架上的形态：在细胞培养3和9天后使用SEM进行体外培养的成骨细胞的形态学研究。去除未粘附的细胞后，将具有细胞的支架固定在3％戊二醛中。然后使用递增的乙醇浓度(30％、50％、75％、90％和100％)在各个浓度下将细胞–支架样品脱水15分钟，最后用六甲基二硅氮烷处理并空气干燥过夜以维持正常细胞形态。用金溅射涂布干燥的细胞构建体，并在SEM下在10kV的加速电压下观察。

细胞形态分析。在接种后11和14天时通过FE-SEM(FEI-QUANTA 200F)分析体外培养的hFob的细胞形态。用PBS洗涤接种细胞的支架以除去未粘附的细胞，并通过使用3％戊二醛在室温下固定。然后使用一系列分级的醇溶液将细胞支架脱水，最后干燥入HMDS过夜。然后用铂溅射涂布干燥的细胞构建体，并在FE-SEM下在10KV的加速电压下观察。

扫描电子显微镜：在各种ES支架上培养的hFOB的SEM图像在图29中示出。在ARS染色和ALP活性测试的增强下，在暴露于气态氨之后的含有儿茶酚胺-Ca²⁺的ES胶原中，在3天后观察到广泛的细胞粘附、铺展，并在9天后观察到广泛的矿化。

通过FE-SEM可视化接种在各种支架上的hFob的细胞形态(接种后9天)(图30A-30F)。结果表明了在形成矿物颗粒的各种胶原支架上增强的细胞附着和细胞铺展。接种在Coll_pDA_Ca和Coll_pNE_Ca支架上的细胞的形态表明存在通过板状伪足(lamellipodia)和ECM分泌相互连接的完全延伸的细胞的更加固结的层(图30E、30F)。细胞下方的大量纤维表明ECM的沉积，证实了细胞增殖和矿化。总体获得的结果表明，矿化支架促进细胞粘附、增殖、矿化的更好的生化线索，并且增加的骨特异性蛋白表达证明了在骨组织再生中的潜在应用。

骨钙蛋白(OC)、骨桥蛋白(OPN)和骨形态发生蛋白2(BMP-2)的免疫荧光染色和Western印迹分析。在接种后11天时对在不同的支架和CS上培养的hFob细胞进行蛋白质染色。在4％(v/v)甲醛中固定细胞10分钟，随后使用0.3％Triton X-100透化5分钟。然后用骨特异性标记物：抗骨钙蛋白(OCN)、抗骨桥蛋白(OPN)和抗骨形态发生蛋白2(BMP-2)抗体标记细胞。使用Hoechst以可视化核。如前所述使用Zeiss LSM800Airyscan 40x油浸物镜获得共聚焦图像。

进行Western印迹分析以定量评估在接种后11天时在不同支架类型上产生的骨桥蛋白。在含有Triton X-100(1％)和蛋白酶抑制剂的冰冷裂解缓冲液中裂解hFob细胞。通过在10000rpm下离心5分钟去除洗涤剂不溶性物质和核。通过Bio-Rad蛋白质测定法确定细胞裂解物的蛋白质含量。在SDS-PAGE凝胶上分离等量的细胞裂解物，随后将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在TBS-0.05％吐温20(TBST)中的5％奶粉中室温封闭1小时后，在TBST中洗涤膜三次。然后在4℃下用稀释的5％奶中的初级抗体在轻轻摇动下培育膜过夜。在TBST中洗涤三次后，在室温下将膜与HRP缀合的二级抗体培育1小时。在TBST中进一步洗涤三次后，将膜与化学发光检测系统(Cell Signaling Technology)一起培育并暴露于光敏膜各种次数。使用ImageJ软件进行Western印迹的光密度分析。

为了进一步了解支架-细胞相互作用的生物化学线索，我们通过免疫荧光标记来确定关键的骨特异性标记蛋白如骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)和骨形态发生蛋白(BMP)的表达(图31)。如在MTS/ALP测定和ARS染色中观察到的，与在TCP上培养的细胞相比，静电纺丝纤维中的所有标记蛋白都观察到增加的免疫荧光。免疫荧光研究进一步证实了OPN、OCN和BMP在儿茶酚胺交联纳米纤维毡上的水平高于TCP和ES_Coll支架(图31)。Coll_pDA_Ca和Coll_pNE_Ca中的成骨标记蛋白骨桥蛋白、骨钙蛋白和骨形态发生蛋白表达比在ES_Coll或Coll_DA/NE_Ca支架中增加(图31A-31F)。已经基于成骨标志物的染色强度进行了半定量分析。当与TCP、ES_Coll和其它静电纺丝毡相比时，OPN的表达在接种在Coll_pNE_Ca毡上的细胞上更为显著(图32A)。类似地，在接种在Coll_pNE_Ca毡上的细胞上观察到更高的BMP-2表达水平(图32B)。最后，我们使用Western印迹来确认接种在各种毡上的细胞表达OPN的差异。如图31G中所示，接种在Coll-NE_Ca或Coll_pNE_Ca毡上的细胞比接种在其它支架上的细胞显示出高1.8-2倍的OPN表达。与免疫染色一起，这些结果证实了去甲肾上腺素-Ca²⁺复合结构具有优异的骨传导特性。

Ca²⁺对多巴胺聚合的影响：通过监测多巴胺紫外光谱吸收的变化，通过分光光度法监测多巴胺向聚多巴胺的转化。简言之，将多巴胺溶于Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，并以预定的时间间隔记录光谱的变化。为了研究Ca²⁺对多巴胺聚合的影响，将氯化钙(25mM)加入到含有相同量多巴胺的Tris-HCl缓冲液中，并使用与之前相同的预定间隔记录光谱。

Ca²⁺的加入加速聚多巴胺形成：为了证实Ca²⁺离子对多巴胺聚合的影响，我们记录了Tris HCl缓冲液(pH 8.5)中的多巴胺以及含有25mM CaCl₂的Tris HCl缓冲液中的多巴胺的紫外吸收光谱的逐渐变化。如图33A和33B中所示，在含有Ca²⁺离子的缓冲液中在所有时间间隔观察到400nm附近的吸收增加，表明聚多巴胺中间体的形成加速。

实施例11.聚合物产品的细胞毒性分析和耐用抗微生物伤口敷料的制备。

在37℃和5％CO₂的潮湿培养箱中，在补充有10％(v/v)胎牛血清、50U mL^-1青霉素和50μg mL^-1链霉素的DMEM培养基中培养原代人皮肤成纤维细胞(hDF)。将细胞(1×10⁵个细胞/孔)接种于盖玻片上制备的ES纤维毡上，置于12孔板底部并使其粘附并生长24小时，然后进行分析。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后，将培养的细胞固定在3％多聚甲醛中，然后用FITC缀合的抗α-微管蛋白和Alexa Fluor 569鬼笔环肽(Molecular)进行荧光标记以使细胞形态可视化，并用Hoechst进行荧光标记以使核可视化。使用FlouromountTM将盖玻片安装在载玻片上。通过激光扫描显微镜(Zeiss LSM710-Meta，CarlZeiss Microimaging Inc.，NY，USA)使用40×油浸物镜进行共聚焦成像并如前所述进行成像。每个样品分析至少20个不同的显微镜视野。

根据制造商的说明，使用CellTier水性单溶液(Aqueous One solution)细胞增殖测定试剂盒测定细胞活力。简言之，在处理期结束时，将放置在含有500μL细胞培养基的12孔板中的支架覆盖的盖玻片上生长的细胞与50μL MTS四唑鎓溶液(由制造商提供)一起在37℃下培育2小时。代谢活性细胞与存在于MTS试剂中的四唑鎓盐反应，产生可溶性紫色甲臜染料，其在490nm下具有吸收最大值。随后，使用酶标仪(Infinite M200Pro，Tecan，Mannedorf，Switzerland)在490nm处测量吸光度，然后计算相对细胞存活力。每个处理以三个独立的一式三份进行。

结果

以前的研究已经证实，pDA涂层可以通过亚胺(immine)官能化或迈克尔加成反应用于固定具有细胞粘附肽、生长因子、骨基质蛋白-2和骨形成肽-1的静电纺丝纳米纤维的表面^43-46。通过ADM已经验证了pDA交联的产生和骨传导支架的形成，接下来我们评估了我们的方法在用于生物医学应用的耐久性伤口敷料的制备中的预期效用。我们为此目的而使用了ES_Gel毡，因为它们具有诸如良好的生物相容性、可生物降解性、吸收性和细胞粘附特性、易获得性和低成本的众多优点。我们首先研究了毡对原代人皮肤成纤维细胞(hDF)的细胞毒性，其是一种良好表征和广泛使用的用于确定敷料和植入物的皮肤生物相容性的模型系统。将hDF暴露于ES_Gel或Gel_pDA毡24小时未改变细胞或细胞核形态、细胞骨架结构或细胞粘附特性(图34A-34C)。基于MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基))-2H-四唑鎓)的显色测定进一步显示，明胶毡的pDA涂层未干扰hDF活力，证实了交联支架的生物相容性(图34D)。因此，通过ADM的DA负载的静电纺丝明胶纳米纤维的氧化聚合在纤维上产生了良性的、无细胞毒性的pDA涂层。

我们选择两种US FDA批准的脂肽抗生素万古霉素和卡泊芬净来评估pDA涂布的静电纺丝纳米纤维毡的抗微生物功效。万古霉素是用于治疗针对侵袭性感染“超级细菌”，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的主要治疗药物⁴⁷，而卡泊芬净被批准用于治疗侵袭性真菌感染以及对两性霉素B和伊曲康唑抗真菌药物过敏的患者⁴⁸。为了制备抗生素负载的毡，将万古霉素或卡泊芬净(凝胶的0.5％w/w)加入到Gel-DA纺丝原液溶液中。由于添加万古霉素引起实质性溶液混浊，因此在14KV下在80％TFE中进行静电纺丝。在明胶纳米纤维上掺入浓度为0.5％(w/w)的抗生素未改变ADM之前或之后的纤维形态(图35A-35D)。选择抗生素的浓度以使抗微生物组分维持在比商业Ag基伤口敷料Ag和所保持的抗微生物组分低50％。为了证实掺入后抗生素活性的保留，根据临床和实验室标准研究所的指南进行盘扩散测定。与Ag和敷料相比，万古霉素和卡泊芬净负载的Gel_pDA(分别为Vanco_Gel_pDA和Caspo_Gel_pDA)毡均表现出针对致病性革兰氏阳性金黄色葡萄球菌MRSA和各种白色念珠菌细菌菌株的优异的抑制区域，表明交联过程不会损害抗微生物性能。

为了确定粘附的pDA交联是否能够保持长期的抗微生物活性，我们根据美国材料试验学会(the American Society for Testing and Materials)对于抗微生物涂层医疗器械的指南⁴⁹测试了毡对于浸出(leaching)耐久性。简言之，伴随持续摇动将Vanco_Gel_pDA和Caspo_Gel_pDA毡浸入磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 7.0)中。在指定的间隔之后，将毡取出，用水洗涤，并通过盘扩散法进行测定。即使浸入PBS中20天后，在两种类型的抗生素负载的毡中都观察到完全保留的抗微生物活性(图34G、34H)。特别地，相对于商业Ag基伤口敷料Ag所显示的抗MRSA活性保留，万古霉素负载的毡显示出优异的抗MRSA活性保留(图34G)。以前的研究报道在用PBS培育的<5小时内戊二醛交联的静电纺丝明胶毡中出现～80–90％的重量损失，指示浸出⁵⁰。这些结果证实了pDA交联所赋予的抗生素负载的毡对于浸出所具有的优异的水性稳定性和耐久性。此外，整个固相交联过程的性能也允许抗生素的高包封效率。

实施例12.烧伤伤口愈合的体内猪皮肤模型。

通过直接接触预热至92℃的热水烧杯15秒，在麻醉条件下在猪皮肤上产生烧伤。在每只猪的胸肋上创建八处直至真皮层的二度烧伤。每侧各创建4处烧伤，即头端四处，尾端四处，两者之间距离为1cm。在创建烧伤期间，在动物周围使用具有吸收垫的手术单以避免燃烧过程中的溢出和泄漏。在环形燃烧设备的情况下，我们使用装有50ml无菌水(保持在92℃)的100ml烧杯(直径～4cm，表面积～12.57cm²)。使用装有300ml温水(温度～45℃)的500ml schott duran瓶诱导燃烧设备的压力。使燃烧设备与猪皮保持接触15秒的最佳时间以产生均匀的烧伤伤口。立即拍摄创建的伤口以估算每处烧伤的初始伤口面积。

清理伤口以除去烧伤的上皮碎片。将包括ES_Gel、vanco_Gel_pDA和Ag在内的测试伤口敷料施用在指定的伤口上，每种敷料类型两处伤口以完全覆盖伤口区域。将两处伤口保留未覆盖，并标记为未处理的对照烧伤伤口。为了防止伤口间交叉污染，使用Tegaderm薄膜覆盖伤口敷料区域。在麻醉条件下以每周两次的频率更换敷料。首先用40％氯胺酮/甲苯噻嗪的肌内剂量镇静动物以诱导麻醉(13mg/kg氯胺酮/1mg/kg甲苯噻嗪)并用1-2％异氟烷维持。为了减轻不适，在烧伤伤口之前和之后2天肌内施用丁丙诺啡(0.01mg/kg)。在更换敷料时，在放置新鲜敷料材料之前，用0.05％洗必泰溶液和棉纱布清洗伤口。检查伤口并记录伤口的临床描述。使用尼康D90数码单反相机自所有组的伤口拍摄照片。为了确保相机与伤口处于标准距离，使用模板在皮肤表面上标记四个点，并与相机取景器内的聚焦点对齐。将青色-品红-黄色-黑色(CMYK)色标放置在伤口旁边，以使照片中的颜色可相互标准化。使用SigmaScan Pro 5软件来计算不同伤口敷料以平方厘米计的总伤口面积。

猪深部真皮烧伤模型中万古霉素负载的pDA交联毡的伤口愈合功效。最后，我们使用猪深部真皮烧伤伤口愈合模型评估了原始ES_Gel和Vanco_Gel_pDA毡的伤口愈合性能。在解剖学和生理学特性方面，猪皮肤与人类皮肤非常相似，并且猪的伤口愈合性能被认为与人类相似⁵¹。在此，在麻醉条件下通过将预热至92℃的热水烧杯放置在动物的背部15秒来创建烧伤。在每只猪的胸肋上创建八处二度烧伤(直至真皮层)。将Ag处理和未处理的伤口分别用作阳性和阴性对照。用尼康D90数码单反相机拍摄伤口照片，并使用SigmaScan Pro 5软件处理图像。对于每个时间点的每处伤口，测量伤口大小并与未处理对照伤口的伤口大小进行比较。

图36A-36D显示了所有四个创伤组(ES_Gel、Vanco_Gel_pDA、Ag和未处理对照)在伤口愈合过程的开始(第0天)和结束(第46天)时的伤口面积。显示各组中伤口愈合事件进展的照片在图37中示出。将总伤口尺寸减小绘制为初始伤口尺寸的百分比(图36E、36F)。因此，用Vanco_Gel_pDA毡处理的伤口与未处理对照伤口(p≤0.01)或用原始ES_Gel毡处理的伤口相比，观察到伤口闭合增加(89.6％)(p≤0.05)。另外，在损伤后2周，观察到用Vanco_Gel_pDA毡处理的伤口比其它三组的伤口愈合率更快。而且，与商业Ag基敷料所提供的伤口闭合区域相比，最终的伤口闭合区域显示出改善。这些结果表明抗生素负载的pDA交联静电纺丝纳米纤维毡促进了烧伤伤口的快速上皮再生，并确立了支架的体内功效和生物相容性。

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Zeugolis等，Biomaterials 2008,29,2293-2305.

Zhao等，Macromol.Rapid Commun.2015,36,909-915.

尽管为了清楚和理解的目的，已经通过举例说明和实例的方式详细描述了前述内容，但是本领域技术人员将会理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的每篇参考文献通过引用整体并入，如同每篇参考文献通过引用单独并入一样。在本说明书中对任何明显在先公开的文件的任何列举或讨论不一定被视为承认该文件是现有技术状态的一部分或者是公知常识。

Claims (95)

1.一种制备聚合物产品的方法，其包括

i)由包含至少一种聚合物和至少一种交联剂的纺丝原液溶液进行静电纺丝以制备所述聚合物产品，

其中所述交联剂包含至少一种儿茶酚胺，和

ii)将所述聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述儿茶酚胺包含至少一种选自以下的儿茶酚胺：多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺酮、卡比多巴、可尔特罗、L-或D-二羟基苯丙氨酸(多巴)、二甲基多巴、二羟非君、二羟西君、5-羟基多巴胺盐酸盐、多巴酚丁胺、多培沙明、屈昔多巴、α-甲基去甲肾上腺素、乙基去甲肾上腺素、乙左旋多巴、异他林、海索那林、N-甲基肾上腺酮、诺布君、异肾上腺素、羟多巴胺和肠杆菌素。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述儿茶酚胺包含至少一种选自多巴胺和去甲肾上腺素的儿茶酚胺。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述静电纺丝纤维可以收集在裸露的金属收集器上或织物上。

5.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述静电纺丝纤维可以收集在裸露的金属收集器上或织物上。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述织物是非织造织物。

7.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述织物是绷带纱布。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联剂还包含至少一种多酚。

9.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述交联剂还包含至少一种多酚。

10.根据权利要求8所述的方法，其中所述多酚包含至少一种选自以下的多酚：氢醌、间苯三酚、连苯三酚、没食子酸、去甲二氢愈创木酸、γ-倒捻子素和α-倒捻子素。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述多酚包含至少一种选自以下的多酚：氢醌、间苯三酚、连苯三酚、没食子酸、去甲二氢愈创木酸、γ-倒捻子素和α-倒捻子素。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述纺丝原液溶液还包含至少一种多羟基抗微生物剂、至少一种多胺抗微生物剂或其组合。

13.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述纺丝原液溶液还包含至少一种多羟基抗微生物剂、至少一种多胺抗微生物剂或其组合。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述多羟基抗微生物剂包含至少一种抗真菌剂、至少一种抗细菌剂或其组合。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗真菌剂包含两性霉素B、纳他霉素、制霉菌素、卡泊芬净或其组合。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述多羟基抗微生物剂包含两性霉素B、纳他霉素、制霉菌素、卡泊芬净或其组合。

17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述抗细菌剂包含万古霉素、多粘菌素B、达托霉素、雷莫拉宁A2、瑞斯托霉素单硫酸盐、硫酸博莱霉素、腐草霉素、阿米卡星、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿奇霉素、地红霉素、利福平、利福霉素、利福喷汀、利福昔明、克拉霉素、克林霉素、恩多霉素、巴弗洛霉素、氯四环素、阿霉素、多西环素、四环素、1-脱氧野尻霉素、1-脱氧甘露糖野尻霉素、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、达托霉素、粘菌素、多粘菌素B或其组合。

18.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述多胺抗微生物剂包含ε-聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸、线性聚乙烯亚胺、支链聚乙烯亚胺或其组合。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述纺丝原液溶液还包含至少一种金属离子。

20.根据权利要求2至18中任一项所述的方法，其中所述纺丝原液溶液还包含至少一种金属离子。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述金属离子包含过渡金属离子。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述金属离子包含阳离子。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述金属离子包含一价、二价或三价阳离子。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述金属离子包含二价阳离子。

25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述金属离子包含至少一种选自Ca、Zn、Fe、Co、Mg、Ni、Ag、Au、Cu和Mn离子的金属离子。

26.根据权利要求19所述的方法，其中所述金属离子包含Ca离子。

27.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述金属离子包含Ca离子。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含亲水性聚合物、水溶性聚合物、生物可降解聚合物或其组合。

29.根据权利要求2至27中任一项所述的方法，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含亲水性聚合物、水溶性聚合物、生物可降解聚合物或其组合。

30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述聚合物包含明胶、胶原、牛血清白蛋白、酪蛋白、玉米蛋白、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、壳聚糖、聚丙交酯(PLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或其组合。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含明胶、胶原或其组合。

32.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含明胶、胶原或其组合。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纺丝原液溶液包含约2-30％w/v聚合物。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中交联剂的量小于所述纺丝原液溶液中聚合物的量。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中交联剂的量为所述纺丝原液溶液中所述聚合物的约1-10％w/w。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤ii)包括在缓冲剂的存在下将所述聚合物产品暴露于至少一种气态碱性试剂。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述气态碱性试剂包含气态氨。

38.根据权利要求1所述的方法，其包括将所述聚合物产品暴露于源自固体碳酸铵、固体硫酸铵、固体氯化铵、氢氧化铵、液氨或其组合的气态氨。

39.根据权利要求2至37中任一项所述的方法，其包括将所述聚合物产品暴露于源自固体碳酸铵、固体硫酸铵、固体氯化铵、氢氧化铵、液氨或其组合的气态氨。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将所述聚合物产品暴露于源自碳酸铵固体的气态氨。

41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述碳酸铵固体包含碳酸铵粉末。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合物产品包含纤维毡。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合物产品包含用于细胞和/或组织培养的底物。

44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括使用所述聚合物产品以培养细胞和/或组织。

45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述细胞包括破骨细胞。

46.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述组织包括骨组织。

47.通过根据权利要求1至43中任一项所述的方法可获得的聚合物产品。

48.通过根据权利要求13至18中任一项所述的方法可获得的聚合物产品，其包含至少一种多羟基抗微生物剂、至少一种多胺抗微生物剂或其组合。

49.通过根据权利要求19至27中任一项所述的方法可获得的用于培养细胞和/或组织的聚合物产品。

50.一种聚合物产品，其包含具有多酚化合物、儿茶酚胺化合物、聚合儿茶酚胺化合物或其组合的交联的聚合物纤维。

51.根据权利要求50所述的聚合物产品，其中所述聚合物产品是亲水性聚合物产品、水溶性聚合物产品、生物可降解聚合物产品和/或生物相容性聚合物产品。

52.根据权利要求50或权利要求51所述的聚合物产品，其包含纤维毡。

53.根据权利要求50或权利要求51所述的聚合物产品，其还包含至少一种多羟基抗微生物化合物、至少一种多胺抗微生物化合物或其组合的交联。

54.根据权利要求50或权利要求51所述的聚合物产品，其包含具有儿茶酚胺化合物的交联的明胶纤维，并且包含至少一种多羟基抗微生物剂、至少一种多胺抗微生物剂或其组合。

55.根据权利要求53或权利要求54所述的聚合物产品，其中所述多羟基抗微生物剂包含至少一种抗真菌剂、至少一种抗细菌剂或其组合。

56.根据权利要求55所述的聚合物产品，其中所述抗真菌剂包含纳他霉素、制霉菌素、两性霉素B、卡泊芬净或其组合。

57.根据权利要求55或56所述的聚合物产品，其中所述抗细菌剂包含万古霉素、多粘菌素B、达托霉素、雷莫拉宁A2、瑞斯托霉素单硫酸盐、硫酸博莱霉素、腐草霉素、阿米卡星、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿奇霉素、地红霉素、利福平、利福霉素、利福喷汀、利福昔明、克拉霉素、克林霉素、恩多霉素、巴弗洛霉素、氯四环素、阿霉素、多西环素、四环素、1-脱氧野尻霉素、1-脱氧甘露糖野尻霉素、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、达托霉素、粘菌素、多粘菌素B或其组合。

58.根据权利要求53至57中任一项所述的聚合物产品，其中所述多胺抗微生物剂包含ε-聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、线性聚乙烯亚胺、支链聚乙烯亚胺或其组合。

59.根据权利要求50至58中任一项所述的聚合物产品，其中所述聚合物产品的所述聚合物包含亲水性聚合物、水溶性聚合物、生物可降解聚合物、生物相容性聚合物或其组合。

60.根据权利要求59所述的聚合物产品，其中所述聚合物包含明胶、胶原、牛血清白蛋白、酪蛋白、玉米蛋白、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、壳聚糖、聚丙交酯(PLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或其组合。

61.根据权利要求50至60中任一项所述的聚合物产品，其中所述聚合物产品的所述聚合物包含明胶、胶原或其组合。

62.根据权利要求50至61中任一项所述的聚合物产品，其中所述聚合物产品的所述聚合物包含明胶。

63.根据权利要求50至62中任一项所述的聚合物产品，其中所述聚合物产品包含用于细胞和/或组织培养的底物。

64.根据权利要求50至62中任一项所述的聚合物产品，其中所述聚合物产品包含用于细胞和/或组织培养的支架。

65.根据权利要求63或权利要求64所述的聚合物产品，其中所述细胞包括破骨细胞。

66.根据权利要求63或权利要求64所述的聚合物产品，其中所述组织包括骨组织。

67.根据权利要求50至66中任一项所述的聚合物产品，其包含纤维毡。

68.一种聚合物纺丝原液溶液，其包含至少一种聚合物和至少一种交联剂。

69.根据权利要求68所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述交联剂包含至少一种多酚、至少一种儿茶酚胺或其组合。

70.根据权利要求69所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述儿茶酚胺包含至少一种选自以下的儿茶酚胺：多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺酮、卡比多巴、可尔特罗、L-或D-二羟基苯丙氨酸(多巴)、二甲基多巴、二羟非君、二羟西君、5-羟基多巴胺盐酸盐、多巴酚丁胺、多培沙明、屈昔多巴、α-甲基去甲肾上腺素、乙基去甲肾上腺素、乙左旋多巴、异他林、海索那林、N-甲基肾上腺酮、诺布君、异肾上腺素、羟多巴胺和肠杆菌素。

71.根据权利要求69所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述多酚包含至少一种选自以下的多酚：氢醌、间苯三酚、连苯三酚、没食子酸、去甲二氢愈创木酸、γ-倒捻子素和α-倒捻子素。

72.根据权利要求68至71中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含亲水性聚合物、水溶性聚合物、生物可降解聚合物、生物相容性聚合物或其组合。

73.根据权利要求72所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述聚合物包含明胶、胶原、牛血清白蛋白、酪蛋白、玉米蛋白、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、壳聚糖、聚丙交酯(PLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或其组合。

74.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含明胶、胶原或其组合。

75.根据前述权利要求中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其包含约2-30％w/v聚合物。

76.一种聚合物纺丝原液溶液，其包含至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺、至少一种多羟基抗微生物剂、至少一种多胺抗微生物剂或其组合。

77.根据权利要求76所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述儿茶酚胺包含至少一种选自以下的儿茶酚胺：多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺酮、卡比多巴、可尔特罗、L-或D-二羟基苯丙氨酸(多巴)、二甲基多巴、二羟非君、二羟西君、5-羟基多巴胺盐酸盐、多巴酚丁胺、多培沙明、屈昔多巴、α-甲基去甲肾上腺素、乙基去甲肾上腺素、乙左旋多巴、异他林、海索那林、N-甲基肾上腺酮、诺布君、异肾上腺素、羟多巴胺和肠杆菌素。

78.根据权利要求76或权利要求77所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含亲水性聚合物、水溶性聚合物、生物可降解聚合物或其组合。

79.根据权利要求78所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述聚合物包含明胶、胶原、牛血清白蛋白、酪蛋白、玉米蛋白、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、壳聚糖、聚丙交酯(PLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或其组合。

80.根据权利要求76至79中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含明胶、胶原或其组合。

81.根据权利要求76至80中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述多羟基抗微生物剂包含至少一种抗真菌剂、至少一种抗细菌剂或其组合。

82.根据权利要求81所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述抗真菌剂包含纳他霉素、制霉菌素、两性霉素B、卡泊芬净或其组合。

83.根据权利要求81或权利要求82所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述抗细菌剂包含万古霉素、多粘菌素B、达托霉素、雷莫拉宁A2、瑞斯托霉素单硫酸盐、硫酸博莱霉素、腐草霉素、阿米卡星、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿奇霉素、地红霉素、利福平、利福霉素、利福喷汀、利福昔明、克拉霉素、克林霉素、恩多霉素、巴弗洛霉素、氯四环素、阿霉素、多西环素、四环素、1-脱氧野尻霉素、1-脱氧甘露糖野尻霉素、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、达托霉素、粘菌素或多粘菌素B。

84.根据权利要求76至83中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述多胺抗微生物剂包含ε-聚赖氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-L-鸟氨酸、线性聚乙烯亚胺、支链聚乙烯亚胺或其组合。

85.一种聚合物纺丝原液溶液，其包含至少一种聚合物、至少一种儿茶酚胺和至少一种金属离子。

86.根据权利要求85所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述儿茶酚胺包含至少一种选自以下的儿茶酚胺：多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺酮、卡比多巴、可尔特罗、L-或D-二羟基苯丙氨酸(多巴)、二甲基多巴、二羟非君、二羟西君、5-羟基多巴胺盐酸盐、多巴酚丁胺、多培沙明、屈昔多巴、α-甲基去甲肾上腺素、乙基去甲肾上腺素、乙左旋多巴、异他林、海索那林、N-甲基肾上腺酮、诺布君、异肾上腺素、羟多巴胺和肠杆菌素。

87.根据权利要求85或权利要求86所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述金属离子包含过渡金属离子。

88.根据权利要求85或权利要求86所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述金属离子包含阳离子。

89.根据权利要求85至88中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述金属离子包含一价、二价或三价阳离子。

90.根据权利要求85至89中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述金属离子包含二价阳离子。

91.根据权利要求85至89中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述金属离子包含至少一种选自Ca、Zn、Fe、Co、Mg、Ni、Ag、Au、Cu和Mn离子的离子。

92.根据权利要求85至91中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述金属离子包含Ca离子。

93.根据权利要求85至92中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含亲水性聚合物、水溶性聚合物、生物可降解聚合物、生物相容性聚合物或其组合。

94.根据权利要求93所述的聚合物纺丝原液溶液，其中聚合物包含至少一种选自以下的聚合物：明胶、胶原、牛血清白蛋白、酪蛋白、玉米蛋白、层粘连蛋白、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、壳聚糖、聚丙交酯(PLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或其组合。

95.根据权利要求85至94中任一项所述的聚合物纺丝原液溶液，其中所述纺丝原液溶液中的所述聚合物包含胶原。