KR20140002827A - 비수리 추출물을 함유하는 피부 과색소성 질환 치료 및 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비수리(Lespedeza cuneata)추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비수리 추출물을 유효성분으로 함유하여 글루코시다아제 효소의 활성을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌의 생합성을 막아 피부 미백 활성이 우수하고, 멜라닌의 과잉 형성을 억제함으로써 그로 인한 피부 과색소성 질환을 예방, 치료 또는 개선시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

비수리 추출물을 함유하는 피부 과색소성 질환 치료 및 피부 미백용 조성물{Composition for treating hyperpigmented skin diseases and skin whitening containing Lespedeza cuneata extracts}

본 발명은 비수리(Lespedeza cuneata) 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비수리 추출물을 유효성분으로 함유하여 글루코시다아제 효소의 활성을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌의 생합성을 막아 피부 미백 활성이 우수하고, 멜라닌의 과잉 형성을 억제함으로써 그로 인한 피부 과색소성 질환을 예방, 치료 또는 개선시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색소침착은 피부세포 내에 있는 멜라닌색소생성세포(melanocyte)에서, 어떤 요인에 의해 멜라닌 생성활동이 증가되고, 이로 말미암아 만들어진 다량의 멜라닌이 각질형성세포(keratinocyte)로 전달되어, 피부 표피층(epidermis)에 축적된 결과이다.

인체 피부에서 색소 침착이 발생되는 과정을 보면, 멜라닌색소가 만들어지는 과정이 가장 중요한 단계이다. 멜라닌은 피부에 존재하는 멜라닌색소생성세포에서 만들어지는데, 타이로신으로부터 타이로시나아제라는 효소에 의해 만들어진다. 이렇게 만들어진 멜라닌은 주변의 각질형성세포로 전달되고 각질형성세포의 피부 턴오버에 의해 각질층으로 전달되며 마침내 때와 함께 피부에서 떨어져 나가게 된다. 그러므로 일정한 피부색을 나타내려면 일정한 양의 멜라닌이 만들어지고 일정량이 피부 각질을 통해 없어져야 한다. 반면 색소 침착은 멜라닌이 너무 많이 만들어지거나, 피부 각질로 잘 떨어져 나가지 못해 일어나는 현상에서 기인된 것이라 볼 수 있다.

멜라닌색소생성세포에서 색소침착과정은 멜라닌 합성 전, 멜라닌 합성 및 멜라닌 합성 후 단계로 나누어 볼 수 있다. 이 중 멜라닌 합성 전 단계에서는 멜라닌색소생성세포내 멜라노좀이 멜라닌을 합성할 수 있도록 변형되며, 타이로시나아제 전구체의 당기를 트리밍하는 반응을 통해 성숙된 타이로시나아제가 멜라닌을 합성 및 분비한다. 즉, 상기 타이로시나아제 전구체는 여러개의 만노오스와 글루코오스가 글라이코실화되어 있으며, 이러한 타이로시나아제 전구체에서 α-글루코시다아제 효소가 글라이코실화되어 있는 당기를 제거함으로써 타이로시나아제 자체의 활성을 갖게 되고 멜라닌 색소를 형성하게 된다.

이렇게 형성된 타이로시나아제는 특이적 효소반응을 하여 세포 내 타이로신과 산화 효소반응을 하고 그로부터 생성된 도파퀴논으로 또 다시 산화시키고, 상기 도파퀴논은 계속해서 엷은 황색/적색 화합물인 페오멜라닌(pheomelanin)과 연갈색 내지 흑색인 유멜라닌(eumelanin)으로 전환된다. 따라서 멜라닌 색소의 형성에 있어서 산화반응은 매우 중요하다. 피부에서, 멜라닌은 색소형성에 영향을 주고, 피부를 자외선과 다른 피부 질환의 원인들로부터 보호하지만, 반면에 멜라닌의 비정상적인 축적은 기미와 주근깨를 형성시킬 수도 있다.

멜라닌 과잉 형성에 기인한 피부 과색소성 질환으로는 유전적피부 질환, 예를 들어, 백반, 바덴부르그 증후군, 후천적 피부 질환, 예를 들어, 후염증성 백색 비강진, 원인불명 물방울 멜라닌 저하증, 기미, 약물치료에 기인한 피부 질환, 예를 들어, 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판, 지도부딘, 및 감염을 통해 전이된 피부 질환, 예를 들어, 어루러기 등이 있다.

생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져나갈 때, 멜라닌과 함께 피부에서 떨어져나가는 것으로 제거된다. 하지만 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 또한 레져 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 더욱 늘어나게 되었다. 이에 과도한 멜라닌 생성을 막는 미백제 개발이 필요하게 되었고 그 동안 많은 노력들이 이루어 졌다.

이제까지의 미백제 개발은 주로 멜라닌 생합성에서 없어서는 안될 기본적이면서도 가장 중요한 역할을 하는 효소인 타이로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해하는 것을 통해 멜라닌 양을 줄이는 물질을 찾는 것으로 이루어져왔다. 합성 미백제에 대한 최근의 연구에서 알콕시 벤조에이트 및 알콕시 신나메이트 유도체, 및 하이드록삼산의 용도가 탐색된 바 있다. 다른 연구들은 공지된 티로시나아제 저해제의 유도체, 예를 들어 5-[(3-아니노프로필)포스피노옥시]-2-(하이드록시메틸)-4H-피란-4-온{5-[(3-aminopropyl) phosphinooxy]-2-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4-one}, 및 N-하이드록시신나모일펜알킬-아미드(Nhydroxycinnamoylphenalkyl-amide) 유도체의 합성에 초점이 맞추어져 있었다.

이렇게 개발된 미백제로 코직산, 알부틴, 글루타치온, 비타민A, 비타민 C 등이 있지만 소비자들이 만족할 만한 미백효과를 갖지 못하고 있으며 부작용 때문에 그 사용량에 제한이 따른다. 따라서, 기존의 미백제보다 효능이 뛰어나고 좀 더 안전한 미백제를 개발하는 것이 절실한 시점이 되었다.

멜라닌을 생합성 하는 효소인 타이로시나아제는 당단백질로써, 생체 내 당단백질 합성 과정인 글라이코실레이션(glycosylation) 과정을 통해 만들어진다. 이 글라이코실레이션 과정에 문제가 생겨 타이로시나아제의 당부분에 이상이 생기면 타이로시나아제는 세포내 멜라닌 생합성 장소인 멜라노좀(melanosome)으로 이동하지 못하고 따라서 멜라닌 생성이 이루어질 수 없게 된다.

상기 글라이코실레이션 과정에는 많은 효소가 관여하는데 그 중 중요한 효소가 글루코시다아제(glucosidase)이다. 만약 이 효소의 효소 활성을 억제할 수 있다면 멜라닌의 생합성을 억제할 수 있고, 따라서 미백 효과를 가져올 수 있을 것이다.

또한 이 뿐만 아니라, 제대로 형성된 타이로시나아제가 정상적인 산화반응을 거치지 못하도록 항산화 물질이 작용하여 그 산화반응을 효과적으로 억제할 수 있다면 그 또한 멜라닌의 생합성을 억제할 수 잇고, 따라서 미백 효과를 가져올 수 있을 것이다.

이와 관련하여 종래 대한민국 공개특허공보 제10-2005-0099839호 '방선균 배양물 추출물을 함유하는 피부 미백용 조성물'에는 방선균 (Actinomycetes) 균주 또는 방선균(Actinomycetes) 배양물 추출물이 멜라닌 생합성에 관여하는 효소인 타이로시나아제(tyrosinase)를 합성하는 글라이코실레이션(glycosylation)의 과정에 관여하는 중요한 효소인 베타-글루코시다아제(betaglucosidase)의 효소 활성을 억제함으로써, 타이로시나아제의 글라이코실레이션을 억제하여 멜라닌 생성을 저해함으로써 미백 효과를 나타낸다는 사실이 개시되어 있다.

한편, 앞에서 설명한 바와 같이 멜라닌 생합성에는 매우 여러가지로 복잡한 메커니즘들에 의해 형성되는 반면 이제까지의 미백제 개발은 주로 멜라닌 생합성에서 없어서는 안될 기본적이면서도 가장 중요한 역할을 하는 효소인 타이로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해하는 것을 통해 멜라닌 양을 줄이는 물질을 찾는 것으로 이루어져왔다.

대한민국 공개특허공보 제10-2005-0099839호

이에, 본 발명자들은 기존의 미백제보다 효능이 뛰어나고 안전한 미백 물질을 개발하고자 여러 식물 추출물에서 글루코시다아제 효소 활성 억제능을 검색해본 결과, 비수리(Lespedeza cuneata)추출물이 매우 우수한 글루코시다아제 효소 활성 억제능을 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 멜라닌 과잉 생성에 기인한 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인체에 안전하면서 피부 미백 효과가 우수한 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비수리(Lespedeza cuneata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 비수리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 비수리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 사용되는 비수리(Lespedeza cuneata)는 전국 각처의 산과 들에서 자라는 다년생 초본 혹은 초본성 아관목이다. 생육환경은 햇볕이 잘 드는 곳이면 어디든지 자라며 키는 약 1m이고, 잎은 어긋나고 잎 표면에는 털이 없으며 뒷면에 잔털이 있다.

상기 비수리 추출물의 추출은 당업계의 통상의 추출방법에 의해 제조될 수 있으며, 바람직하게는 80℃ 이상의 고온 추출, 25℃ 이하의 저온 추출, 초음파추출, 침지추출에 의할 수 있으며, 보다 바람직하게는 벤젠 또는 에탄올과 같은 유기용매를 이용한 침지추출에 의할 수 있다.

본 발명에 따른 비수리 추출물은 피부 세포에서 멜라닌을 생합성하는 효소인 타이로시나아제 합성 과정인 글라이코실레이션(glycosylation) 과정에 관여하는 글루코시다아제(glucosidase)의 효소 활성을 효과적으로 억제하여 멜라닌의 생합성을 억제하여 피부 미백 활성을 증가시킬 수 있는 동시에, 멜라닌의 과잉 형성을 억제함으로써 그로 인한 피부 과색소성 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있으며, 타이로시나아제 활성을 억제하며, 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 멜라닌 과잉 형성에 기인한 피부 과색소성 질환으로는 유전적 피부 질환, 예를 들어, 백반, 바덴부르그 증후군, 후천적 피부 질환, 예를 들어, 후염증성 백색 비강진, 원인불명 물방울 멜라닌 저하증, 기미, 약물치료에 기인한 피부 질환, 예를 들어, 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판, 지도부딘, 및 감염을 통해 전이된 피부 질환, 예를 들어, 어루러기 등이 있다

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 및 피부에 직접 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 비수리 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 비수리 추출물은 약제학적 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20중량%로 포함될 수 있다. 이는 0.001중량% 미만이면 그 효과가 미미하고, 20 중량% 초과이면 함량의 증가에 비해 효과의 차이가 크지 않다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화 될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 스킨, 스킨토너, 스킨소프트너, 스킨로션, 아스트린젠트, 로션, 영양로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양크림, 맛사지크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 세럼, 컨센트레이트, 팩, 마스크, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디클렌저, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 파운데이션, 메이크업베이스, 팩트, 루스파우더, 프레스드 파우더, 콤팩트, 아이섀도우, 아이라이너 또는 립스틱 등의 형태로 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 비수리 추출물 외에 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 상기 피부 보호 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 함유할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 비수리 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함될 수 있다. 이는 0.001중량% 미만이면 그 효과가 미미하고, 10중량% 초과이면 제형 안정성에 문제가 발생하거나 피부 자극이 있을 수 있기 때문이다.

본 발명에 따른 비수리(Lespedeza cuneata)추출물을 함유하는 조성물은 글루코시다아제 효소의 활성 억제 효과와 타이로시나아제의 활성억제, 항산화효과를 동시에 가져 멜라닌 생성 억제 효과가 우수하여 멜라닌 과잉 생성으로 인한 피부 과색소성 질환을 예방, 치료 또는 개선시킬 수 있다. 또한, 피부 미백 활성에도 매우 효과적이므로 제약산업상 및 화장품 산업상 매우 유용한 발명이다.

도 1은 비수리추출물의 알파-글루코시다아제 활성 억제 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 비수리추출물의 B16 흑색종 세포(melanoma cell)를 이용하여 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비수리추출물의 멜란-a 내의 타이로시나아제 활성 억제 평가 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예, 비교예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예, 비교예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예, 비교예 및 시험예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1] 비수리 추출물 제조

비수리의 잎을 정제수로 세척하고 2~3cm 크기로 분쇄하여 건조시킨 다음 실온에서 에탄올:비수리 잎을 10:1의 중량비로 70% 에탄올에 3일간 침지하여 그 추출액을 0.45um 필터를 이용하여 여과 하였다.

[시험예 1] 알파 글루코시다아제 활성의 억제 효능 평가

알파-글루코시다아제가 p-니트로페닐(PNP) 알파-D-글루코사이드의 글루코사이드 부분을 기질로 인식하여, PNP와 알파-D-글루코사이드를 효소반응으로 끊어주기 때문에 여기서 나온 PNP의 양을 405nm에서 흡광도를 측정하여 알파-글루코시다아제 활성을 간접적으로 측정하였다.

데옥시노지리마이신(Deoxynojirimycin, DNJ) 100ppm을 양성 대조군으로 사용하고, DMSO(디메틸설폭사이드; dimethyl sulfoxide)를 대조군으로 사용하고, 실시예 1~3은 각각 상기 제조예 1에 따른 비수리 추출물을 각각 200ppm, 100ppm, 50ppm의 농도로 사용하였다.

50 mM 인산염 완충액(pH 6.8)에 시료물질과 알파-글루코시다아제(0.6unit/ml)을 넣어주고, 10 mM의 PNP 알파-D-글리코사이드 용액을 첨가하여 37℃에서 30분 동안 효소 반응 시킨 후, 1M의 Na₂CO₃를 3배 넣어 반응을 정지시켰다. 효소반응에서 생성된 PNP의 양을 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 하기 수학식 1에 따라 알파-글루코시다아제의 활성 저해율을 계산하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과에서, 비수리 추출물은 농도에 비례하여 알파-글루코시다아제의 활성을 낮추는 결과를 나타내었다. 특히, 양성대조군으로 사용한 데옥시노지리마이신보다 낮은 농도에서도 높은 알파-글루코시다아제의 활성 저해 효과를 나타내었다.

별도로 비수리 추출물 및 데옥시노지리마이신의 농도가 100ppm일 경우, IC₅₀(half maximal inhibitory concentration: 효소 활성 50% 저해 농도)를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다. IC₅₀ 농도는 실험을 통해 결과를 토대로 농도에 따른 활성억제율에 대한 추세선과 그 식을 구한 후 억제율 50%이 되도록 하는 물질의 농도를 산출하였다

비수리 추출물은 건조감량을 통해 그 농도를 산출한 후 ppm단위로 농도를 환산하여 실험하였다.

물질	IC50 (ppm)
실시예 1	57.6
실시예 2	56.6
실시예 3	89.5
데옥시노지리마이신	100.0

또한 상기 표 1에서 알 수 있듯이, 본 발명의 비수리 추출물은 데옥시노지리마이신 보다 더 낮은 IC₅₀ 농도를 갖는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 비수리 추출물은 알파-글루코시다아제의 활성을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌의 생합성을 억제하여 피부 미백 효과가 우수하다.

[시험예 2] 흑색종 세포를 이용한 멜라닌 합성 저해 평가

<세포주 및 세포배양>

흑색종 세포(melanoma cell)는 ATCC(CRL-6323)에서 분양한 B16F1을 사용하였고, 세포배양에 사용된 배지는 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS)과 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco BRL 사. 미국)이었으며, 1일 1회 배지를 교환하였다. 우태아혈청은 잔존하는 보체성분을 불활성화시키기 위하여 실온에서 녹인 후 56℃ 수조에서 30분간 가열하여 사용하였으며 세포에 각 조건 별로 48웰 플레이트의 웰 당 500 ㎕로 배지를 넣어 주었고, 세포를 회수할 때는 트립신-EDTA 1 ml를 가하여 37℃에서 1분간 반응시킴으로써 부착된 세포를 분리한 다음 배지 4 ml를 넣고 1,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 세척한 후 실험에 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

<멜라닌 생성 억제 효과>

비수리 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 알아보기 위하여 호세이 등의 방법(Hosoi J, et al.,Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1,25-dehydroxyvit amin D3 and retinoic acid. Cancer Res 45, pp.1474-78, 1985)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

상기에서 배양한 B16F1 세포를 48웰 플레이트에 2x10⁴ 세포/ml의 농도로 48웰 플레이트에 넣고 24시간 배양하여 플레이트에 부착한 다음, 시료로서 상기 제조예 1에 따른 비수리 추출물을 각각 50ppm, 100ppm 및 200ppm의 농도 및 α-MSH 1 μM를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 음성대조군은 비처리군을 사용하였고, 양성대조군으로는 각각 강력한 미백물질인 코직산 200ppm과 데옥시노지리마이신 100ppm을 사용하였다. 비수리 추출물은 건조감량을 통해 그 농도를 산출 한 후 ppm단위로 농도를 환산하여 실험하였다.

배양된 세포를 PBS로 2회 씻은 후 1N 수산화나트륨 100 ㎕를 넣어 60℃에서 2시간 동안 처리하여 얻은 세포 파쇄액을 실온에서 식힌 후, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 이 세포파쇄액을 BCA 단백질 정량법으로 단백질양을 구하여 단백질 당 멜라닌 함량을 구하였다. 하기 수학식 2에 따라 멜라닌합성 저해율을 계산하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 결과에서, 비수리 추출물을 72시간 처리한 후 측정한 멜라닌 생성 억제율이 코직산 및 데옥시노지리마이신을 처리한 경우보다 크게 높은 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 4] 멜란-a(melan-a) 세포를 이용한 타이로시나아제 활성 억제 평가

C57BL/6 마우스에서 유래한 불멸화 세포주인인 멜란-a(melan-a) 세포는 베넷 박사(Dr. Bennett; Cancer Research Center, London, England)로부터 분양받아 사용하였다. 멜란-a 세포는 10% 우태아혈청, 200nM 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트, 100mg/L의 스트렙토마이신, 100 IU/ml의 페니실린이 포함된 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 10% CO₂ 조건하에서 배양하였다.

멜란-a 세포가 배양기에서 유착되게(confluent) 자라면 0.25% 트립신/EDTA로 세포를 떼어내서 12 웰 플레이트에 웰 당 2x10⁵개를 주입한 후 24시간 동안 세포가 플레이트에 잘 부착하도록 기다렸다가 PBS로 한번 세척한 후, 배양배지에 시료로서 상기 제조예 1에 따른 비수리 추출물 200ppm, 100ppm, 50ppm 및 데옥시노지리마이신 100ppm을 세포에 처리하였다. 상기 비수리 추출물은 건조감량을 통해 그 농도를 산출 한 후 ppm단위로 농도를 환산하여 실험하였다.

상기 시료는 DMSO에 원하는 농도의 1000배가 되도록 녹인 후, 세포에 처리시 1000분의 1로 희석하여 사용하였다. 양성대조군은 DMSO를 시료와 같은 농도로 처리한 용액을 사용하였다.

위와 같은 방법으로 시료 물질을 3일간 처리한 후, 0.25% 트립신/EDTA으로 세포를 떼어내어 10000rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 이를 타이로시나아제 완충액(80mM PO₄ 완충액 + 1% 트리톤 X)를 100㎕ 처리하여 20분간 소니케이션(sonication)하고 얼음상에서 1시간 동안 분해(lysis)한 후, 12,500rpm에서 10분간 원심 분리하여 세포 파쇄액인 상등액을 얻었다. 상기 세포 파쇄액을 효소액으로 하고 5mM의 3,4-디히드록시페닐-L-알라닌(Dihydroxyphenyl-L-alanine)을 기질로 하여 30분간 효소반응을 한 뒤 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 나머지 세포 파쇄액으로 브래드포드 법으로 총 단백질 양을 구한 후, 단백질 당 타이로시나아제 효소의 활성으로 나타내었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과에서, 양성대조군인 데옥시노지리마이신과 비교하여 비수리 추출물은 저농도에서도 타이로시나아제의 활성 억제에 우수한 활성을 나타냄을 알 수 있다.

[제형예 1~3 및 비교제형예 1] 스킨 로션

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 제형예 1~3 및 비교제형예 1의 스킨로션을 제조하였다(단위: 중량%).

성분	제형예1	제형예2	제형예3	비교제형예1
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02
베타인(ICID), 트리메틸글리신(JSQI)	2	2	2	2
글리세린(농글리세린)	2	2	2	2
피이지/피피지-17/6 코폴리머	1	1	1	1
피이지-8	2	2	2	2
제조예 1의 비수리 추출물	0.001	1	10	-
에탄올	10	10	10	10
메틸파라벤, KP:파라옥시벤조산메틸(파라옥시안식향산에스테르)	0.1	0.1	0.1	0.1
폴리옥시에틸렌경화피마자유	0.3	0.3	0.3	0.3
옥틸도데세스-16	0.1	0.1	0.1	0.1
향	0.05	0.05	0.05	0.05

　

[제형예 4~6 및 비교제형예 2] 로션

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 제형예 3~4 및 비교제형예 2의 로션을 제조하였다(단위: 중량%).

성분	제형예4	제형예5	제형예6	비교제형예2
글리세릴스테아레이트	0.8	0.8	0.8	0.8
스테아르산	0.5	0.5	0.5	0.5
세테아릴알코올	0.8	0.8	0.8	0.8
하이드로제네이티드레시친*C12-16알코올*팔미트산	0.6	0.6	0.6	0.6
하이드로제네이티드폴리이소부텐	3	3	3	3
세틸옥타노에이트	4	4	4	4
메틸파라벤	0.2	0.2	0.2	0.2
프로필파라벤	0.05	0.05	0.05	0.05
디메치콘	1.5	1.5	1.5	1.5
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
디소듐이디티에이	0.05	0.05	0.05	0.05
소듐메틸스테아로일타우레이트	0.05	0.05	0.05	0.05
글리세린 (농글리세린)	3	3	3	3
부틸렌글라이콜	2	2	2	2
제조예 1의 비수리 추출물	0.001	1	10	-
트리에탄올아민	0.13	0.13	0.13	0.13
페녹시에탄올	0.3	0.3	0.3	0.3
정제수	13	13	13	13
카보머	0.13	0.13	0.13	0.13
향	0.13	0.13	0.13	0.13

　

[제형예 7~9 및 비교제형예 3] 크림

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 제형예 7~9 및 비교제형예 3의 크림을 제조하였다(단위: 중량%).

성분	제형예7	제형예8	제형예9	비교제형예3
하이드로제네이티드폴리이소부텐	7	7	7	7
펜타에리스리틸테트라에틸헥사노에이트	2	2	2	2
2-옥틸도데칸올	1	1	1	1
식물성 스쿠알란	4.5	4.5	4.5	4.5
림난테스알바씨드오일	1	1	1	1
펜타에리스리틸테트라이소스테아레이트	3	3	3	3
아라키딜알코올*베헤닐알코올*아라키딜글루코사이드	1	1	1	1
친유형글리세릴스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5
글리세릴스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5
세테아릴알코올	0.5	0.5	0.5	0.5
메틸파라벤	0.2	0.2	0.2	0.2
프로필파라벤	0.1	0.1	0.1	0.1
쉐어버터	3	3	3	3
데카메틸사이클로펜타실록산	3	3	3	3
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02
농글리세린	6	6	6	6
부틸렌글라이콜	6	6	6	6
제조예 1의 비수리 추출물	0.001	1	10	-
암모늄아크릴로일디메틸타우레이트/브이피 코폴리머	0.5	0.5	0.5	0.5
페녹시에탄올	0.3	0.3	0.3	0.3
트리에탄올아민	0.06	0.06	0.06	0.06
향	0.23	0.23	0.23	0.23
정제수	10	10	10	10
카보머	0.1	0.1	0.1	0.1

　[시험예 5] 미백 효과 임상 실험

본 발명에 따른 미백효능을 확인하기 위하여 기미 주근깨 검은 반점이 생성되기 시작하거나 이미 생성된 30세 이상(평균 40.6±3.5세)의 여성 피험자 30명을 선정하여 12주간 제형예 1~9 및 비교제형예 1~3에 따른 제형을 통상 스킨, 로션 및 크림을 사용하는 방법에 따라 매일 아침, 저녁 동일양을 사용하게 하였다. 하기 표 5와 같이 피험자 30명을 10명씩 3개 군으로 나누어 1군은 얼굴을 좌우로 나누어 한쪽부위에 제형예 1, 4 ,7을, 반대쪽 부위에 비교제형예 1~3을 도포하였으며, 2군은 얼굴의 한쪽부위에 제형예 2, 5, 8을, 반대쪽 부위에 비교제형예1~3을 도포하였고, 3군은 얼굴의 한쪽부위에 제형예 3, 6, 9를, 반대쪽 부위에 비교제형예 1~3을 도포하였다.

시료 종류	1군		2군		3군
얼굴 부위	좌(우)	우(좌)	좌(우)	우(좌)	좌(우)	우(좌)
도포 시료	비교제형예 1~3	제형예 1, 4 및 7	비교제형예 1~3	제형예 2, 5 및 8	비교제형예 1~3	제형예 3, 6 및 9

<5-1. 전문가에 의한 관능평가>

상기 표 5에 따른 피험자들의 피부를 각각 사용 전, 사용 후 4주, 8주, 및 12주 후 시점에 전문가 5명의 육안에 의한 피부 검은 정도를 평가하여 결과를 하기 표 6에 나타냈다. 평가기준은 피부가 검은 정도를 가장 흰 것을 0 가장 검은 것을 9로 보아 0~9의 수치로 평가하였다.

시료 종류		1군		2군		3군
도포 시료		평균*	표준편차	평균*	표준편차	평균*	표준편차
측정	사용 전	0.01	0.11	0.14	0.13	0.11	0.13
	4주 후	-0.25	0.120	0.02	0.20	-0.29	0.15
	8주 후	-0.53**	0.06 **	-0.45	0.10	-0.31	0.09 **
	12주 후	-0.88**	0.02**	-0.54**	0.08 **	-0.47	0.14 **
* 평균: 시료 처치부위 값에서 대조군(비교제형예 1~3) 처치부위 값을 뺀 값의 평균, '-'값은 피부색이 희어진 것을 나타냄. ** 통계적으로 유의한 차(p<0.05)가 있음.

<5-2. 기기에 의한 멜라닌 인덱스 측정>

상기 표 5에 따른 피험자들의 피부를 각각 사용 전, 사용 후 4주, 8주, 및 12주 후 시점에 색차계 (DSMⅡ Color Meter Melanin index)를 이용하여 멜라닌 인덱스를 측정하여 결과를 하기 표 7에 나타냈다.

시료 종류		1군		2군		3군
도포 시료		평균*	표준편차	평균*	표준편차	평균*	표준편차
측정	사용 전	037	0.15	0.50	0.11	027	0.15
	4주 후	-0.91**	0.18**	0.02	0.42	-0.72**	0.18**
	8주 후	-1.13**	0.34**	-0.74**	0.21**	-1.09	0.42**
	12주 후	-2.16**	0.33	-1.60**	0.13**	-2.17**	0.37**
* 평균: 시료 처치부위 값에서 대조군 처치부위 값을 뺀 값의 평균, '-' 값은 피부색이 희어진 것을 나타냄. ** 통계적으로 유의한 차(p<0.05)가 있음.

[시험예 6] 피부 미백효과 및 부작용에 대한 설문 평가

본 발명에 따른 미백효능을 확인하기 위하여 기미 주근깨 검은 반점이 생성되기 시작하거나 이미 생성된 30세 이상(평균 40.6±3.5세)의 여성 피험자 30명을 선정하여 12주간 제형예 1~9 및 비교제형예 1~3에 따른 제형을 통상 스킨, 로션 및 크림을 사용하는 방법에 따라 매일 아침, 저녁 도포하게 하였다. 하기 표 8과 같이 피험자 30명을 10명씩 3개 군으로 나누어 4군은 제형예 1, 4 및 7의 스킨로션, 로션 및 크림을, 5군은 제형예 2, 5 및 8의 스킨로션, 로션 및 크림을, 6군은 제형예 3, 6 및 9의 스킨로션, 로션 및 크림을 사용하고, 사용 후 8주 시점에 피부의 검은 정도 개선 여부에 대하여 0~5단계로 설문평가를 하였으며(전혀개선되지 않음:0~매우 개선됨:5), 부작용 여부(유, 무)에 대하여 사용 후 12주 시점에 설문평가를 하여 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

시료 종류	4군	5군	6군
도포 시료	제형예 1,4 및 7	제형예 2,5 및 8	제형예 3, 6 및 9
검은정도개선(8주 후)	1.89 ± 0.45 (평균 ± 표준편차)	2.12 ± 0.42 (평균 ± 표준편차)	3.10 ± 0.30
부작용(12주 후)	없음	없음	없음

　

상기 시험예 5~6의 결과에서 보여지는 바와 같이, 전문가 관찰 평가, 기기 평가 및 설문 평가 모두에서 비수리 추출물을 함유하는 제형예의 경우 비교제형예보다 우수한 피부 미백 효과를 보였으며, 피부에 대하여 안전함을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

1. 비수리(Lespedeza cuneata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 과색소성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 비수리 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~ 20중량%로 함유하는 약제학적 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피부 과색소성 질환은 백반, 바덴부르그 증후군, 후염증성 백색 비강진, 원인불명 물방울 멜라닌 저하증, 기미, 미노사이클린, 블레오마이신, 부술판, 지도부딘 및 어루러기로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 글루코시다아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
5. 비수리(Lespedeza cuneata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 비수리 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10중량%로 함유하는 화장료 조성물.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 글루코시다아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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