KR20180101125A

KR20180101125A - 마유 및 애기수영 추출물을 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20180101125A
Application number: KR1020170044152A
Authority: KR
Inventors: 김미진; 나명일; 임철원
Original assignee: (주)유앤아이제주
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-04-05
Publication date: 2018-09-12
Also published as: KR101922637B1

Abstract

본 발명은 마유 및 애기수영 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 마유 및 애기수영 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 우수한 피부 미백 및 주름 개선 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 정제마유, 애기수영 추출물 및 이들의 혼합물은 천연물 유래의 물질이며, 세포 독성을 일으키지 않으므로 화장료 조성물로 활용도가 높다.

Description

마유 및 애기수영 추출물을 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening and improving skin wrinkle comprising horse oil and Rumex acetosella L. extracts}

본 발명은 마유 및 애기수영 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데, 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 이러한 피부에서의 노화의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다.

피부 진피층 기질을 이루는 중요한 성분의 하나인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로써 세포 외 간질에 존재하고, 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱 등이 알려져있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선과 같은 외부 자극에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져있다. 노화가 되면 콜라겐 자체의 합성이 줄어들 뿐 아니라 콜라겐을 포함한 결합조직을 분해하는 MMPs(기질금속 단백질 분해 효소, matrix metalloproteinases)의 활성이 증가하여 피부조직 내의 콜라겐 분해를 촉진시켜 콜라겐의 함량이 저하되는 원인이 되는 것으로 알려져있다. 이러한 MMPs를 억제하는 내재성 억제제인 TIMP(Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinase)가 존재하는데 MMPs와 TIMP의 활성이 균형을 이루어 적절히 조절이 될 때에 생리적인 조직의 재구성과 항상성이 잘 유지되게 된다.

한편, 사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 피부 표피층에 있는 멜라노사이트에서 합성되는데, 멜라노사이트 내 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시킨다. 따라서, 피부 내의 티로시나제 활성을 저해하여 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 미백효과 및 주름개선 효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 새로운 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 마유 및 애기수영 추출물이 세포 독성이 없으면서도 미백효과뿐만 아니라 주름 개선효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1668154호 한국등록특허 제10-1700105호

따라서, 본 발명의 목적은 마유(horse oil) 및 애기수영(Rumex acetosella L.) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마유(horse oil) 및 애기수영(Rumex acetosella L.) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마유는 말의 지방육을 녹인 후 정제한 기름인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 애기수영 추출물은, 애기수영 잎, 줄기 또는 전초를 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 다가 알코올, 탄화수소계 용매 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매를 사용하여 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마유는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10중량% 포함되는 것일 수 있고, 상기 애기수영 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 페이스트, 패치, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌저, 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 왁스 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제형인 것일 수 있다.

본 발명의 마유 및 애기수영 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 세포내 멜라닌 생성을 억제할 수 있어 피부 미백 효과를 가질 뿐만 아니라 콜라겐 생합성 촉진 효과가 우수하여 주름 개선 효과를 가진다. 또한 본 발명의 정제마유, 애기수영 추출물 및 이들의 혼합물은 천연물 유래의 물질이며, 세포 독성을 일으키지 않으므로 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 마우스 멜라노마(Murine melanoma) 세포(B16F10)에서 시료 처리에 따른 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 도이다; α-MSH 100nM, 멜라졸브(Melasolv) 40μM, 정제마유 0.05%, 애기수영 추출물 50μg/mL, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물.
도 2는 마우스 멜라노마 세포에서 시료 처리에 따른 멜라닌 생성 저해 효과를 측정한 결과를 나타낸 도이다; α-MSH 100nM, 멜라졸브(Melasolv) 40μM, 정제마유 0.05%, 애기수영 추출물 50μg/mL, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물.
도 3은 인간 섬유아세포(Human dermal fibroblast)에서 시료 처리에 따른 콜라겐 생성 증가 효과를 측정한 결과를 나타낸 도이다; 시료무처리군(Control), 형질전환성장인자(TGF-β) 10ng/mL, 정제마유 0.05%, 애기수영 추출물) 50μg/mL, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물.

본 발명의 마유(馬油, horse oil)는 말의 지방 조직에서 추출한 지방성분 중국의 고전의학서 명의별록(名醫別錄) 및 본초강목(本草綱目)에는 마유 크림의 효능으로‘머리카락을 나게 한다’,‘손발이 트는 것을 낫게 한다’,‘혈액순환을 도와준다’등의 기록이 전해지며, 5~6세기경 중국에서 의약품으로 사용된 기록이 있을 정도로 예로부터 아시아 지역에서 화상이나 아토피 피부염 치료제로 널리 사용되어 왔다. 마유의 주요 성분으로는 팔미톨레산과 세라마이드 등이 있으며, 사람의 피지와 매우 흡사하여, 사람 피부와 친화성이 높으며 불포화지방산이 약 60% 이상 포함되어 있어 피부에 불포화지방산을 공급할 수 있는 화장품 원료로 각광받고 있다.

본 발명의 애기수영(Rumex acetosella L.)은 마디풀과 (Polygonaceae)의 다년생 초본식물로 높이가 20~50cm 정도로 자란다. 뿌리줄기가 옆으로 뻗으면서 번식하고 줄기는 곧게 서며 털 모양의 돌기가 있으며 모가 난 세로줄이 있고 자줏빛이 돌며 잎과 더불어 신맛이 난다. 뿌리에서 나온 잎은 뭉쳐나고 잎자루가 길며 창 모양이고 끝이 뾰족하며 밑 부분에 귀 같은 돌기가 좌우로 퍼진다. 애기수영은 애기괴싱아, 애기승아, 애괴승아, 소산모(小酸模)라고 불리우며 크리소패닉 산(Chrysophanic acid), 크리소파놀(Chrysophanol), 아스코르빈 산(Ascorbic acid), 루틴(Rutin), 아데노신(Adenosine)등의 성분을 포함한다. 한방에서는 애기수영의 잎과 줄기를 소산모(小酸模)라는 약재로 쓰며, 항암 효과가 있고, 폐결핵으로 인한 각혈에 지혈 효과가 있다. 민간에서 통경. 옴. 비듬. 피부병 등에 약재로 쓰인다. 전초 추출액은 방부약, 괴혈병 치료약, 지혈제, 이뇨제, 치질, 폐결핵 등에 쓰며 잎 추출액은 열병, 두통, 간질병에 쓰고 골절과 종양에 진통제로도 쓰인다(약초의 성분과 이용, 일월서각. 1994. 과학백과사전 출판사편, 중약 대사전, 도서출판 정담, 중약 대사전 편찬위원회,1997).

본 발명자들은 이러한 마유 및 애기수영 추출물을 화장료 조성물로 개발하기 위하여 연구한 결과, 상기 마유 및 애기수영 추출물이 세포 독성이 없으면서도 미백효과뿐만 아니라 주름 개선효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

특히, 본 발명에서는 마유, 애기수영 추출물 및 이들의 혼합물이 세포내 멜라닌 생성 저해 효과 및 콜라겐 생합성 촉진 효과를 나타내며, 마유 또는 애기수영 추출물을 단독으로 사용하는 경우보다 혼합물을 사용할 경우 상기 효과가 현저하게 향상된다는 사실을 실험적으로 입증하였다(실시예 2 내지 7 참조).

따라서, 본 발명은 마유(horse oil) 및 애기수영(Rumex acetosella L.) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 상기 마유는 말의 지방육을 녹인 후 정제한 기름(정제마유)일 수 있다. 바람직하게는 말의 지방육을 잘게 잘라 전열기(hot plate)를 60~100℃에 맞춰 녹인 후 드라이 오븐 안에서 여과지를 이용하여 여과할 수 있다. 상기 과정을 통해 여과된 마유는 셀라이트와 활성탄이 혼합된 여과지를 이용하여 추가적으로 여과할 수 있다. 상기 추가 여과 과정을 통해, 말의 특유취가 보다 완벽하게 제거되며, 백색에 가까운 마유를 제조할 수 있다. 또한, 상기 추가 여과 과정은 반복적으로 수행될 수도 있다. 도축된 말의 지방육은 말의 상태와 나이, 지방육 부위에 따라 색과 냄새가 상당히 다르기 때문에, 지방육을 고를 때 이점을 충분히 숙지하여 선택하여야 한다. 색이 노란색에 가깝고, 냄새가 심한 말의 지방육을 선택할 경우에는, 여과 과정을 마쳐도 노란색이 남아있으며 악취가 심해 약학 조성물이나 화장료로 선택하기에 적합하지 않다. 이때, 마유를 채취하기에 적합한 말은 생후 6년 이내의 말이 적합하며, 생후 6년이 넘은, 특히, 7~10년생 정도의 말을 사용할 경우에는 마유를 정제하여도 특유취가 심해 약학 조성물이나 화장료로 사용하기에 적절하지 않다.

본 발명에 따른 상기 애기수영 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 애기수영을 대상으로 추출물을 분리 및 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 추출물은 적절한 용매를 이용하여 애기수영 잎, 줄기 또는 전초로부터 추출할 수 있다. 이때 추출물을 수득하기 위해 사용할 수 있는 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 애기수영 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 애기수영 추출물은 상기한 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 원심분리, 여과, 농축후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 그대로 사용할 수도 있고, 상기 1차 추출물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 애기수영 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 마유를 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함할 수 있으며, 상기 애기수영 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함할 수 있다. 상기 마유 또는 애기수영 추출물이 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 10중량%를 벗어나서 포함되게 되면, 주름개선 또는 피부재생 촉진효과가 줄어들 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만 피부 외용제의 제형인 것이 바람직하며, 상기 피부 외용제 제형의 하나의 바람직한 형태는 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 에센스, 클렌저, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물을 들 수 있고, 다른 바람직한 형태로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 들 수 있다. 또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 바람직하게는 화장품학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 바이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있으며, 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

본 발명의 조성물은 액제, 에어로졸제, 멸균 주사용액 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.

[제형예 1]

정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 보습 및 주름 개선용 클렌저

번호	성 분	함량(%)
1	소듐라우레스 설페이트	12.00
2	메칠퍼플루오로부틸에텔	3.10
3	메칠퍼를루오로이소부틸에텔	3.10
4	코카미토프로필베타인	6.20
5	피이지-7글리세릴코코에이트	1.85
6	글리세린	1.85
7	아크릴레이트코폴리머	1.50
8	아크릴레이트/베헤네스-25메타크릴레이트코폴리머	0.45
9	에칠헥실이소나노에이트/이소노닐이소노나노에이트	0.24
10	포타슘하이드록사이드	0.13
11	폴리하이드록시스테아릭애씨드	0.12
12	소듐코카미도프로필피지-디모늄클로라이드포페이트	0.03
13	잔탄검	0.10
14	디소듐코코암포디아세테이트	0.20
15	마유	0.02
16	애기수영 추출물	0.10
17	방부제, 향료	미량
18	증류수	잔량

[제형예 2]

정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 보습 및 주름 개선용 기능성 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	6.00
2	디프로필렌글라이콜	6.00
3	글리세레스-26	2.50
4	나이아신아마이드	2.00
5	애기수영추출물	1.00
6	마유	0.20
7	트레할로스	0.10
8	베타인	0.10
9	알란토인	0.10
10	소듐하이알루로네이트	0.02
11	아데노신, 세라마이드3	미량
12	트로메타민	0.30
13	하이드로제네이티드레시틴	미량
14	아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머	0.15
15	폴리글리세릴-10미리스테이트	0.10
16	클로페네신	0.28
17	1,2-헥산디올	0.02
18	카프릴릴글라콜	0.10
19	향료	미량
20	증류수	잔량

[제형예 3]

정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 보습 및 주름 개선용 팩

번호	성 분	함량(%)
1	아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머	17.00
2	글리세린	11.00
3	암모늄아크릴로일디메칠타우레이트/브이피코폴리머	10.00
4	부틸렌글라이콜	7.00
5	세틸에칠헥사노에이트	3.00
6	사이클로메치콘	2.00
7	소듐하이알루로네이트	2.00
8	마유	0.20
9	애기수영추출물	1.00
10	세테아릴올리베이트/소르비탄올리베이트	0.80
11	디메치콘	0.50
12	베타인	0.50
13	1,2-헥산디올	0.50
14	에탄올	0.50
15	하이드록시아세토페논	0.30
16	트로메타인	0.24
17	디소듐이디티에이, 향료, 식물성 추출물	미량
18	증류수	잔량

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 정제마유 및 애기수영 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 제조

말의 지방육을 녹인 후 정제한 기름(정제마유)을 0.05% 농도로 희석시켜 사용하였다.

완전 건조 시킨 애기수영 100g을 각각 70% 에탄올(EtOH) 수용액을 사용하여, 용매추출법을 이용하여 추출하였다. 추출 시 효율을 높이기 위해 교반기를 이용하여 48시간 이상 교반시켰다. 이를 50℃ 이하에서 감압 농축 후 동결건조하여 분말상의 애기수영 추출물을 얻었으며, 상기 애기수영 추출물은 50μg/mL의 농도로 용해시켜 사용하였으며, 정제마유와 애기수영 추출물을 1:5(V/V)로 혼합하여 혼합 조성물로 제조하였다.

< 실시예 2> 정제마유 및 애기수영 추출물을 포함하는 혼합 조성물의 세포 독성 분석

마우스 멜라노마(Murine melanoma) 세포(B16F10)를 1×10⁵/mL 농도로 96 well plate 에 200μL씩 분주하여 24시간 배양 한 다음 α-MSH 100nM, 멜라졸브(Melasolv) 40μM, 마유 0.05%, 애기수영 50μg/mL, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물을 각각 첨가하여 처리한 후 24시간 뒤 상기 각 시료를 제거하고 각 well 당 새 배지 100μL와 MTT 용액 10μL를 넣은 후 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 Dimethylsulfoxide 용액 100μL를 첨가하고 shaker에서 10분간 흔들어 준 후 ELISA reader로 570nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, α-MSH(자극제), Melasolv(양성대조군), 정제마유, 애기수영 및 정제마유 및 애기수영 추출물 모두 세포독성이 관찰되지 않았다(도 1).

< 실시예 3> 멜라닌 생성 저해 효과 분석

Murine melanoma 세포(B16F10) 또는 이와 유사한 세포를 적량의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1×10⁵개로 접종한 후 5% CO₂, 37℃하에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 시료가 적당 농도로 희석된 배지로 교체한 후 5% CO₂, 37℃하에서 일정시간 배양하였다. 상기 배양이 완료된 세포에서 배양배지를 제거한 뒤 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였으며, 회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 5,000～10,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다. 상기 세포 pellet은 60℃에서 건조한 뒤 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100㎕ 또는 적량의 cell lysis buffer를 넣어 80℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 수득하였으며, 상기 멜라닌 액에 대하여 microplate reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌량을 측정하였다.

그 결과, 정제마유(0.05%)의 경우 α-MSH(100nM) 처리에 의해 유도된 멜라닌 생성을 15%, 애기수영 추출물(50μg/mL)은 22% 저해하는 효과를 보여주었고, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물을 처리한 경우 58%의 멜라닌 형성을 저해 효능을 나타냄을 확인하였다(도 2). 따라서, 정제마유 또는 애기수영 추출물을 단독으로 사용한 경우보다, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물을 사용할 경우 멜라닌 생성 억제 효과가 훨씬 우수함을 확인하였다.

< 실시예 4> 생체외 티로시나아제 억제 활성 측정을 통한 마유 및 애기수영 혼합 추출물의 미백 효능 분석

실시예 1에서 얻어진 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 티로시나아제(tyrosinase) 효소 활성 억제 효과를 확인하기 위해, 머쉬룸 티로시나아제 억제 분석(mushroom tyrosinase inhibition assay) 방법을 이용하였다.

1 mM L-티로신(Ltyrosine), 50 mM 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer)(pH 6.5), 및 증류수를 10:10:9의 비율로 혼합한 반응 혼합액 170 ㎕에 10 ㎕의 시료와 20 ㎕의 머쉬룸 티로시나아제 수용액(1000 units/mL)을 첨가한 반응액을 25℃에서 30분간 배양하였다. 그런 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 490 nm 에서 생성된 도파크롬(dopachrome)의 양을 흡광도로 측정하였다. 양성 대조군으로는 티로시나아제 효소 활성 억제 물질로 알려진 코직산(kojic acid)을 사용하였다. 티로시나아제 효소 활성 억제의 백분율 공식은 다음과 같았다.

[수학식 1]

티로시나아제 활성 억제 효과(%) = {1-(A-B)/C}×100

(상기 식에서, A: 샘플 흡광도, B: 색상 대조군 흡광도, C: 대조군 흡광도)

상기 수학식을 통해 계산된 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 티로시나아제 효소 활성 저해능은 하기 표 1에 나타내었다.

시료	IC₅₀(ug/ml)
애기수영 추출물	110
정제마유	100<
마유 + 애기수영 추출물 혼합 조성물	201.0
알부틴	160
코직산	4.5

상기 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, IC₅₀ 값이 애기수영 추출물의 경우 110 ㎍/mL, 정재 마유는 100 이하, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물 201.0 ㎍/mL로 나타나는 바, 양성대조군으로 사용한 알부틴(165.3 ㎍/mL)과 유사한 수치를 보였으며, 높은 효소 활성저해능을 보였다.

이와 같은 결과는 본 발명의 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물이 정제마유 또는 애기수영 단독의 추출물이 효과적으로 티로시나아제 발현을 억제하며, 결과적으로 멜라닌 합성을 저해하여 미백 효과뿐 아니라, 멜라닌 침착에 의해 발생되는 질병을 치료할 수 있음을 확인한 것이다.

< 실시예 5> 콜라겐 생성 증진 효과 측정

인간 유래의 섬유아세포(Human dermal fibroblast, pH 8~10)를 10% fetal bovine serum이 들어 있는 배양배지(DMEM 배지)에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후, 배양된 세포는 trypsin-EDTA을 이용하여 회수하였으며, 상기 회수된 세포를 24 well-plate에 5×10⁴cell/well로 분주하고 24시간 동안 안정화하였다. 이때, 형질전환성장인자(TGF-β, 양성대조군, 10ng/mL), 정제마유(0.05%), 애기수영(50μg/mL) 및 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물 시료 처리시에는 serum free 상태로 48시간 배양하여 이용하였고, 아무것도 첨가하지 않은 섬유아세포의 배양배지를 대조군(Control)으로 사용하였다. 배양 완료 후 배양액을 취하여 Procollagen type I C-peptide enzyme immunoassay(EIA) kit(MK101, Takara)를 사용하여 콜라겐 합성량을 정량하였다.

그 결과, 정제마유(0.05%)를 처리한 경우 콜라겐 생성을 2.6% 증가시켰고, 애기수영(50μg/mL)을 처리한 경우 5.1% 증가효과를 보여주었으며, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물을 처리한 경우 14.1%의 콜라겐형성 증대 효능이 나타났다. 따라서, 정제마유 또는 애기수영 추출물을 단독으로 사용한 경우보다, 정제마유 및 애기수영 추출물 혼합 조성물을 사용할 경우 콜라겐 생성 효과가 현저하게 향상되는 것을 확인하였다.

< 실시예 6> 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 MMP -1 생성 억제 분석

정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과를 측정하였다.

구체적으로, 인간 정상 피부 세포인 섬유아세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1× 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 정제마유 단독 첨가, 애기수영 추출물 단독 첨가, 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물을 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.

배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 2에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[수학식 2]

시료	저해율(%)
애기수영 추출물	60
정제마유	58
정제마유 + 애기수영 추출물 혼합 조성물	90
레티놀	30

상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물이 애기수영 추출물이나 정제마유 각각을 처리하는 것보다 MMP-1의 생성을 억제(MMP-1 활성 억제)시키는 것을 확인할 수 있었다.

< 제형예 1> 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물을 함유하는 화장료 조성물의 제조

정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물을 포함하는 화장료는 제형예 1로 제조하였으며, 효능의 비교를 위해 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물 대신에 정제마유, 애기수영 추출물을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 1 및 비교제형예 2), 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물 대신에 보습제로서 글리세린 및 1,3부틸렌글리콜을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 3), 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물 대신에 주름개선 원료로서 아데노신을 포함하는 화장료 조성물(비교제형예 4), 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물이나 보습제를 모두 포함하지 않는 화장료 조성물(비교제형예 5)을 하기 표 3에 나타내었다.

구분	성분	제형예 1	비교제형예 1	비교제형예 2	비교제형예 3	비교제형예 4	비교제형예 5
A	정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물	5.0	-	-	-	-	-
	정제마유	-	5.0	-	-	-	-
	애기수영 추출물	-	-	5.0	-	-	-
	글리세린	-	-	-	5.0	-	-
	1,3부틸렌글리콜	-	-	-	5.0	-	-
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	adenosine	-	-	-	-	0.04	-
B	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100	to 100
	글리세레스-26	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
	베타인	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	알란토인	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	트로메타민	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2
	폴리글리세릴-10미리스테이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	클로페네신	1.4	1.4	1.4	1.4	1.4	1.4
	1,2-헥산디올	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
	카프릴릴글라콜	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
C	향	미량	미량	미량	미량	미량	미량

< 실시예 7> 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물의 보습 및 주름 개선 분석

상기 제형예 1의 화장료 조성물에 대한 임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 60 명을 무작위로 10 명씩 6개 그룹 (A, B, C, D, E 및 F)으로 나눈 후, A그룹에는 제형예 1의 화장료 조성물을, B그룹에는 비교제형예 1의 화장료 조성물을, C그룹에는 비교제형예 2의 화장료 조성물을, D 그룹에는 비교제형예 3의 화장료 조성물을, E 비교제형예 4의 화장료 조성물 및 F 그룹에는 비교제형예 5의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 안면에 도포하게 하였다. 보습 효과는 실사용 시험 시작 후부터 매 2간, 그리고 종료 후의 개선효과를 Corneometer CM 820 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 실험 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

그 결과, 일반 다른 보습제를 함유한 비교제형예 3과 비교하여도 본 발명의 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물을 함유한 화장료(제형예1)의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

구분	사용전	사용 2주후	사용 4주후
제형예 1	20.5	35	42.5
비교제형예 1	20	33.5	36
비제제형예 2	20	32	34.5
비교제형예 3	21.5	31	33
비교제형예 4	21	31.5	32
비교제형예 5	20	21	21.5

또한, 본 발명의 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물을 함유하는 화장료의 피부 주름 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 즉, 임상실험은 40-60세 여성 60 명을 무작위로 10 명씩 6개 그룹 (A, B, C, D, E 및 F)으로 나눈 후, A그룹에는 제형예 1의 화장료 조성물을, B그룹에는 비교제형예 1의 화장료 조성물을, C그룹에는 비교제형예 2의 화장료 조성물을, D 그룹에는 비교제형예 3의 화장료 조성물을, E 비교제형예 4의 화장료 조성물 및 F 그룹에는 비교제형예 5의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 안면에 도포하게 하였다. 8주 후의 주름 개선 효과를 육안으로 평가하여 주름 개선 정도를 확인하였다. 실험 완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 3개월간 사용 후의 각 피검자의 주름 개선 효과를 숙련된 의사의 육안 관찰 및 기기측정(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co.,Germany)을 통하여 평가하였으며, 실험 결과는 하기의 표 5에 나타낸 바와 같다.

그 결과, 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물을 함유하는 화장료 조성물은 정제마유 및 애기수영 추출물을 단독으로 함유하는 비교제형예에 비하여 높은 주름 개선 효과를 확인하였으며, 주름개선 효과가 있는 것을 알려진 아데노신 항유 비교 제형예 4의 화장료와 유사한 결과가 나타나므로 정제마유 및 애기수영 추출물의 혼합 조성물이 주름개선에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

구분	주름개선효과			유효율(%)
구분	우수	약간	없음	유효율(%)
제형예 1	18	6	1	96%
비교제형예 1	10	11	4	84%
비교제형예 2	8	10	7	72%
비교제형예 4	17	7	1	96%

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

마유(horse oil) 및 애기수영(Rumex acetosella L.) 추출물을 포함하는 혼합 조성물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선을 위한 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 마유는 말의 지방육을 녹인 후 정제한 기름인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 애기수영 추출물은 애기수영 잎, 줄기 또는 전초를 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 다가 알코올, 탄화수소계 용매 또는 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매를 사용하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 마유는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함되고, 상기 애기수영 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 페이스트, 패치, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌저, 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 왁스 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.