KR20130138861A - 암 화학요법제의 산에 불안정한 친유성 전구약물 - Google Patents

암 화학요법제의 산에 불안정한 친유성 전구약물 Download PDF

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Abstract

본 출원은 암 치료가 필요한 환자에게 환자에게 암 화학요법제의 투여와 연관된 화학요법의 부작용을 감소시키거나 실질적으로 제거하기 위한 암 화학요법제의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체 및 방법을 개시한다

Description

암 화학요법제의 산에 불안정한 친유성 전구약물{ACID―LABILE LIPOPHILIC PRODRUGS OF CANCER CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 본원에 그 전문이 참조로서 포함되어 있는 2011년 6월 6일자로 출원된 미국 가출원 제 61/493,827 호 및 2011년 6월 13일자로 출원된 미국 가출원 제 61/496,367 호의 우선권을 청구한다.
기술 분야
일반적으로, 본 발명은 환자를 치료하는데 사용되는 화학적 화합물 및 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 분자 결합체에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 산에 불안정한, 친유성 결합체, 이의 형성 이의 형성에 유용한 방법 및 중간체, 및 관련 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
현재, 다양한 암의 치료를 위한 수많은 항암 약물이 시판되고 있다. 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀은 유방암 및 난소암을 치료하기 위해 사용되는 전도유망한 항암 약물이며, 이는 피부암, 폐암 및 두경부암과 같은 다양한 다른 암의 치료에서도 전망이 밝다. 이들 암 또는 다른 암의 치료를 위한 다른 전도유망한 화학요법제가 개발되거나 시험중에 있다. 파클리탁셀, 도세탁셀 및 기타 탁산, 캠프토테신, 에포틸론 및 쿠아시노이드와 같은 화합물뿐만 아니라 암 치료에 효능을 나타내는 다른 화합물들이 상당히 주목받고 있다. 특히 주목받고 있는 것은 생체 내 및 시험관 내에서 항암 활성을 나타내는 천연 생성물 약제 및 이의 합성 유사체이다.
그러나, 확인된 많은 항암 화합물은 화학치료 계획에 있어서 이의 사용에 관련된 많은 어려움이 존재한다. 암 치료에 있어서 이러한 화학요법제의 사용과 관련된 주된 문제는 건강한 정상 조직에 악영향을 미치지 않으면서 암 조직을 표적화하는 어려움에 있다. 예를 들어, 파클리탁셀은 유사분열 및 세포분열 과정을 중단시킴으로써 이의 항종양 활성을 발휘하는데, 이는 정상 세포보다 암 세포에서 더욱 빈번히 발생하게 된다. 그럼에도 불구하고, 화학요법 치료를 받는 환자는 건강한 정상 세포에서의 유사분열이 중지되는 것과 연계된 다양한 부작용을 겪을 수 있다.
생체 내에서 암 세포를 선택적으로 죽이고 다른 세포를 해치지 않는 표적화 암 치료가 암의 임상적 치료에 있어서 주로 개선되어야 할 점이다. 항체를 이용한 표적화 약제는 1958 년 이래로 문헌에서 보고되고 있다. 선택적으로 암세포로 전달되기 위한 항체에 접합되는 표적화 약물은, 항체의 크기 (MW = 125-150 킬로달톤) 가 커서 고체 종양을 관통하는데 상대적으로 무능하다는 점으로 인해 제한적 성공을 거두었다.
대안적인 전략은, 종양 세포 상에서 과다발현되거나 종양 세포에 대한 특이적 수용체를 인식하는 더 작은 크기의 표적화 리간드 및 펩티드를 표적화 벡터로서 사용하는 것이다. 이러한 구축물은 2-6 킬로달톤의 분자량을 가지며, 이는 고체 종양을 용이하게 관통하는 크기이다.
따라서, 암 치료 계획에 있어서 화학요법제로 직접 암세포를 표적화하는데 이용되는 신규한 화합물 및 방법의 개발이 매우 요망되고 있다. 이는 표적화 부위의 감소 또는 제거를 야기할 수 있고, 표적화 부위로의 약물 전달을 더욱 효과적으로 하며, 건강한 세포에 대한 독성을 감소시키고 화학요법 계획의 비용을 감소시킬 수 있다.
특히 관심 접근법은 종양 분자에 접합되는 항암 약물을 사용하는 것이다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,191,290 호 (Safavy) 는 종양 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 수용체 리간드 펩티드에 접합된 탁산 분자의 형성 및 사용을 논의하고 있다. 특히 Safavy 는 이러한 수용체 리간드 펩티드가 봄베신/가스트린-관련 펩티드 (BBN/GRP) 수용체-인식 펩티드 (BBN [7-l3]), 소마토스타틴 수용체-인식 펩티드, 표피 성장 인자 수용체-인식 펩티드, 모노클로날 항체 또는 수용체-인식 카르보히드레이트임을 교시하고 있다.
이들 약물 분자 결합체를 합성하는데 있어서 중요한 점은, 원하는 특징적 및 생물학적 활성을 갖는 결합체, 특히 체순환에서는 안정적이나 일단 암세포로 들어가거나 국지적으로 산성 종양 환경에서 농축되면 세포독성 작용제를 방출하는 결합체를 제공하는 링커(들)과 이들 2 개의 단위체를 연결하는 것이다. 이러한 작용제는 정상 조직에 대해서는 더욱 낮은 독성을 나타낼 것으로 예상된다. 또한, 생성되는 결합체는 이들이 표적 조직에 도달할 때까지 충분히 안정적이어야 하고, 따라서 건강한 정상 조직에 대해선 감소된 독성을 가지며 표적화 효과를 최대로 내야 한다.
혈뇌장벽 (BBB) 은 체순환으로부터 뇌를 분리하는 전문화된 물리적 및 효소적 장벽이다. BBB 의 물리적 부분은 임의의 현저한 부세포적 수송을 저해하는 밀착연접의 복합 시스템에서 배열되는 내피세포로 이루어져 있다. BBB 는 지질 용해도, 분자 크기 및 전하를 기반으로 하는 물질 트랜스사이토시스에 대해 선택적으로 구별하여 통과시키는 확산 억제제로서 기능하므로 뇌로의 약물 전달에 있어서 문제가 된다. 또한 BBB 를 통과하는 약물 전달은, 고농도의 약물 유출 수송체 (예를 들어, P-당단백질, 다중-약물 내성 단백질, 유방암 내성 단백질) 의 존재로 인해 문제가 된다. 이들 수송체는 심지어 약물 분자들이 뇌를 통과하기 전에 내피 세포질로부터 약물 분자를 활발히 제거한다.
현재 악성 뇌종양의 치료에 있어서 약물 전달에 사용되는 방법은 일반적으로 비특이적인 방법이고 비효율적이다. 종양 또는 관련 조직을 통과하는 비히클 내에서의 약물의 확산이 뇌 질환을 치료할 때 고려해야 하는 추가적인 과제이다. 대부분, 이러한 뇌로의 약물 전달에 현재 사용되고 있는 비히클의 생리학적 특징 뿐 아니라 크기가 질환 조직을 통해 약물이 효율적으로 확산되는 것을 방해한다. 효율적인 약물 확산의 결핍은 치료 효능에 영향을 미치게 된다.
뇌로의 약물 전달을 위한 담체 분자로서 펩티드가 광범위하게 연구되어 왔으며, 이들은 약물 전달 비히클로서 사용될 수 있었다. 그러나, 펩티드는 생물학적 이용가능성이 제한적이기 때문에 문제가 된다. 이러한 분자의 생물학적 이용가능성을 증가시키기 위한 방법이 집중적으로 연구되었음에도 불구하고, 이들은 최선의 효과를 내는 대성공을 거두지 못했다.
증가된 세포 증식 및 성장은 암의 트레이드마크이다. 세포 증식에서의 증가는 세포 콜레스테롤의 높은 회전율과 연계되어 있다. 막 합성 및 성장을 위해 콜레스테롤을 요구하는 세포는 혈장 저밀도 지단백질 (LDL) (혈액에서 콜레스테롤의 주요 수송체) 의 수용체 중재된 엔도사이토시스에 의해 콜레스테롤을 획득할 수 있거나, 또는 데노보(de novo) 합성에 의해 콜레스테롤을 획득할 수 있다.
LDL 은 LDL 수용체 (LDLR) 로서 공지된 수용체에 의해 세포 내로 흡수될 수 있고; 수용체와 함께 LDL 은 세포내섭취되고 엔도솜에서 세포로 수송된다. 엔도솜은 산성화되고 이는 LDL 로부터 LDL 수용체를 방출시키고; LDL 수용체는 LDL 입자의 추가의 흡수에 참여할 수 있도록 표면으로 재순환된다. 다양한 조직에서의 종양이 혈장 LDL 이 없어질 정도로 LDL 을 매우 요구한다는 증거가 있다. 이들 종양에서 암세포의 증가된 수입은 상승된 LDL 수용체 (LDLR) 로 인한 것으로 생각된다. 다수의 LDLR 을 발현하는 것으로 공지되어 있는 몇몇 종양에는 몇몇 형태의 백혈병, 폐 종양, 결장직장 종양 및 난소 암이 포함된다.
정상 뇌 및 악성 뇌종양 조직의 비교 연구는 LDLR 이 악성 및/또는 신속하게 자라는 뇌 세포 및 조직과 매우 연관되어 있음을 보여준다. 몇몇 연구는, 뇌 종양의 초기 발전 단계 및 공격적 성장 단계에서 보여지는 바와 같이 신속하게 성장하는 뇌세포는 이들의 콜레스테롤에 대한 증가된 요구로 인해 LDLR 의 증가된 발현을 나타낸다는 것을 제시한다.
문제가 되는 비효율적으로 치료되는 뇌암은 교모세포종 (GBM) 이다. 이는 파괴적인 뇌종양으로 치사율이 100%이다. 더욱이, 총 뇌암 관련 사망에서 85% 이상이 GBM 으로 인한 것이다. 현재의 연구는 신경외과, 방사선 요법 및 화학요법을 포함하는 다양한 접근법에 의존하고 있다. 이들 접근법을 이용한 최선의 노력에도 불구하고 상기 종양을 앓고 있는 환자의 생존률은 그다지 높지 않은 정도로만 증가하였다.
GBM (가장 악성인 신경교종) 은 제어가 안되는 공격적인 세포 증식을 특징으로 하며 통상적인 요법에는 내성이 있다. 배양액에서 GBM 세포는 다수의 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR) 를 갖는다. 이러한 수용체가 뉴런 세포 및 정상 교질 세포에서 거의 부재하기 때문에, 세포독성 또는 방사성 의약품과 같은 치료제의 전달에서 이상적인 표적을 나타낸다. 기존 요법을 개선시키려는 노력이나 신규한 요법을 개발하려는 노력이 모두 성공적이지 못했고 악성 신경교종 치료에 대한 결과는 평균 생존률 (중간값) 을 대략 10 개월 연장시키는 정도였다.
LDL 수용체가 거의 없는 정상 뇌세포와는 달리, 배양액에서의 GBM 세포는 이의 표면 상에 다수의 LDL 수용체를 갖는다. 또한, 다른 암도 콜레스테롤 회전율에 요구되는 암 조직의 매우 증식성 있는 특성 으로 인해 LDLR 을 고도로 발현하기 쉽다. 이는, LDL 수용체가 GBM 및 기타 악성 종양에서 LDL 입자를 통해 항종양 약물의 전달을 위한 잠재적인 유일한 분자 표적임을 제시한다.
Maranhao 외 연구자들은, 콜레스테롤-풍부한 마이크로에멀젼 또는 나노입자 제제 (LDE) 를 혈류로의 주입 후 암 조직에서 농축시키는 것을 입증하였다. 문헌 [D. G. Rodrigues, D. A. Maria, D. C. Fernandes, C. J. Valduga, R. D. Couto, O. C. Ibanez and R. C. Maranhao. Improvement of paclitaxel therapeutic index by derivatization and association to a cholesterol-rich microemulsion: in vitro and in vivo studies. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 55: 565-576 (2005)]. 동물에 대한 세포독성, 약물동태학, 독성 및 LDE 에 연계된 파클리탁셀 친유성 유도체의 치료 작용을 시판되는 파클리탁셀과 비교하였다. 그 결과, LDE-파클리탁셀 올리에이트는 안정적이었다. 착물에서 약물의 세포증식억제 활성은 시판되는 제형에서 사용되는 비히클 Cremophor EL 의 세포독성으로 인해 시판 파클리탁셀과 비교시 감소되었다. Maranhao 외 연구자들은 LDE-파클리탁셀 올리에이트가 파클리탁셀과 비교시 안정적인 착물이고, 독성이 상당히 감소되었으며 활성이 증강되어 있음 (이는 임상 사용에서 개선된 치료 지수를 야기할 수 있음) 을 보여주었다.
체순환으로부터 LDL 수용체의 과다발현 및 이로 인한 LDL 입자의 고 흡수를 통한 화학요법 화합물의 암 조직으로의 선택적이고 특이적인 전달을 잠재적으로 가능하게 하는 것은, 암 화학요법제가 매우 친유성이여서 LDL 입자의 지질 코어에 포획되어 유지되고 정상 조직이 작용제에 노출되는데 있어서 독성 부작용을 야기하지 않도록 혈장으로 확산되지 않는 것이 요구된다. 또한, 일단 화학요법제가 적재된 LDL 입자가 LDL 수용체 중재 흡수를 통해 암세포 내에 엔도솜의 산성 환경으로 들어가면, LDL 수용체는 LDL 입자로부터 분리되고 세포 표면으로 재순환되고 LDL 입자는 이의 지질 내용물 및 이의 친유성 화학요법제를 엔도솜의 효소 및 산성 환경으로 방출한다. 암 화학요법제는 LDL 입자의 지질 코어 내에서 적절히 보유되도록 고유적으로 충분히 친유성이 아니다. 정상 체순환에서 높은 안정성을 갖고 LDL 입자의 지질 코어에서 보유되며 엔도솜의 산성 환경에서 활성인 화학요법제를 용이하게 방출하는 적합한 친유성 유도체가 요구되고 있다. 본 발명의 화합물은 이러한 필요성에 대해 접근하고 있다.
정의:
본원에 사용되는, 용어 "알킬" 단독 또는 조합은 1 내지 22 개의 탄소 원자 (예, C1-C22 알킬 또는 C1 -22 알킬) 를 갖는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 알킬 라디칼을 지칭한다. 일칼 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, tert-아밀, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 알킬기, 예컨대 C1-C22 알킬 또는 C5-C22 알킬은 또한 알킬기 내에서 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있고 C1-C22 알케닐 또는 C5-C22 알케닐기로서 지칭될 수 있다.
용어 "알케닐" 단독 또는 조합은 하나 이상의 탄소-탄소 이중-결합 및 2 개 내지 약 22 개의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알케닐 라디칼의 예는 에테닐, 프로페닐, 1,4-부타디에닐 등을 포함한다.
용어 "알콕시" 는 알킬 에테르 라디칼을 지칭하고 여기서 용어 알킬은 상기 정의된 바와 같다. 알콕시 라디칼의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시 등을 포함한다.
용어 "부분입체이성질체" 는 2 개 이상의 비대칭 탄소 원자를 함유하는 화합물에서 발생하는 4 개 이상의 이성질체의 임의의 군을 지칭한다. 서로 입체이성질체이지만 거울상이성질체는 아닌 화합물들을 부분입체이성질체로 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "보호기" 는 원하지 않는 화학적 변환으로부터 잠재적 반응성 관능기를 보호하는 임시 치환기를 의미한다. 이러한 보호기의 예는 카르복실산의 에스테르, 알코올의 실릴 에테르, 및 알데히드 및 케톤의 아세탈 및 케탈을 각각 포함한다. 보호기 화학은 [Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, 4th ed.; Wiley: New York, 2007] 에 나타나 있다. 히드록실기의 보호를 위한 실릴기의 예는 TBDMS (tert-부틸디메틸실릴), NDMS (2-노르보르닐디메틸실릴), TMS (트리메틸실릴) 및 TES (트리에틸실릴) 을 포함한다. NH-보호기의 예는 벤질옥시카르보닐, t-부톡시카르보닐 및 트리페닐메틸을 포함한다.
용어 "탁산" "탁산 유도체" 및 "탁산 유사체" 등은 주목나무, 주목속으로부터 직접 또는 반-합성적으로 유도된 항암제 부류와 연관된 화합물을 의미하는 것을 상호교환적으로 사용된다. 그러한 탁산의 예는 파클리탁셀 및 도세탁셀 및 이들의 천연 유도체뿐만 아니라 이들의 합성 또는 반-합성 유도체를 포함한다.
본원에 사용되는 "약학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약학적으로 허용가능한 염" 은 약학적으로 허용가능하고 원하는 약물학적 활성을 제공하는 본원에 개시된 화합물의 부형제 또는 염을 의미한다. 이러한 부형제 및 염은 염산, 브롬화수소산, 인산 등과 같은 무기산과 함께 형성된 산 부가염을 포함한다. 상기 염은 또한 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 글리콜산, 락트산, 숙신산, 말산, 시트르산, 벤조산 등과 같은 유기산과 함께 형성될 수 있다.
"치료학적 유효량" 은 명세서에 나열된 임의의 생물학적 효과를 끌어내는 약제의 양을 의미한다.
발명의 개요
하나의 구현예에서, 히드록실-포함 암 화학요법제 (HBCCA) 의 분자 결합체의 신규하고 유용한 조성물이 제공된다. 또다른 구현예에서, 암을 치료하는데 사용되는 암 화학요법제의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체의 조성물이 제공된다. 또다른 구현예에서, 암을 치료하는데 사용되는 분자 결합체, 예컨대 산에 불안정한, 친유성 전구약물 결합체를 형성하는데 사용되는 중간체 화합물이 제공된다. 또다른 구현예에서, 산에 불안정한, 친유성 약물 결합체의 효율적인 제조 방법이 제공된다. 또다른 구현예에서, 암 환자가 통상적으로 겪는 부작용을 감소시키거나 실질적으로 없애는 화학요법제를 환자에게 투여하는 방법이 제공된다. 또다른 구현예에서, 환자의 암 세포에서 화학요법제를 농축시키는 방법이 제공된다.
하나의 구현예에서, 화학식 1 , 화학식 1.1 또는 화학식 2 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체 (ALLMC), 및 이의 단리된 거울상이성질체, 부분입체이성질체 또는 이의 혼합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다:
Figure pct00001
[식 중:
R 은 히드록실 포함 암 화학요법제이고;
화학식 1 또는 1. 1 에서: R1 은 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고; R2 는 C5-C22 알킬이고; Y 는 O, NR' 또는 S 로부터 선택되고, 이때 R' 는 수소 또는 C1-C6 알킬이고; Z 는 O 또는 S 이고; Q 는 O 또는 S 이고; T 는 O 또는 S 이고;
화학식 2 에서: R2 는 C1-C22 알킬이고; T 는 O 또는 S 이고; X 는 수소 또는 메실레이트, 술포네이트 및 할로겐 (Cl, Br 및 I) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이탈기임].
화합물 1.1 은 순수 신(syn)-이성질체, 순수 안티(anti)-이성질체 및 신- 및 안티-이성질체의 혼합물, 및 이의 부분입체이성질체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 상기 화학식 1 또는 화학식 1. 1 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체가 제공되며, 식 중: R 은 히드록실 포함 암 화학요법제이고; R1 는 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고; R2 는 C5-C22 알킬이고; Y 는 O 또는 S 이고; Z 는 O 이고; Q 는 O 이고; 및 T 는 O 이다. 화학식 2 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체의 하나의 양태에서, 식 중: R2 는 C5-C22 알킬이고; T 는 O 이고; X 는 수소이거나 또는 Cl, Br 및 I 로 이루어진 군에서 선택된다. 또다른 변형에서, R2 는 C9-C22 이다.
또다른 양태는 화학식 1a , 화학식 1b 또는 화학식 2a 를 포함하는 상기 산에 불안정한 친유성 분자 결합체이다:
Figure pct00002
[식 중: R 은 히드록실 포함 암 화학요법제 (HBCCA) 이고;
화학식 1a 또는 1b 의 경우: R1 는 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고; R2 는 C5-C22 알킬이고;
화학식 2a 의 경우: R2 는 C1-C22 알킬이고; X 는 수소이거나 또는 Cl, Br 및 I 로 이루어진 군에서 선택됨].
화학식 1a 또는 1b 의 카르보네이트 (즉, -OC(O)O-) 인 화합물의 하나의 변형에서, 화합물은 카르보네이트기가 술포네이트기에 의해 대체된 화학식 1a 의 술포네이트 (즉, -OS(O)O-) 에 상응한다. 화합물 1b 는 순수 신-이성질체, 순수 안티-이성질체 및 신- 및 안티-이성질체의 혼합물, 및 이의 부분입체이성질체를 포함한다.
화학식 1 , 2 , 1a 및 2a 의 화합물의 또다른 변형에서, R1 는 수소 또는 C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고, R2 는 에이코센산의 C19 잔기 (시스-이성질체, 트랜스-이성질체 및 이성질체 혼합물 포함), 올레산의 C17 잔기 및 엘라이드산의 C17 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소 잔기와 같은 불포화 지방산의 탄소 잔기이다. 본원에 사용되는 바와 같이 지방산의 "탄소 잔기" (예를 들어, C17 잔기, C19 잔기 등 ...) 는 카르복실 탄소를 제외한 지방산의 탄소 사슬을 의미한다.
상기 산에 불안정한 친유성 분자 결합체의 또다른 양태에서, 히드록실 포함 암 화학요법제는 탁산, 아베오탁산, 캠프토테신, 에포틸론, 쿠쿠르비타신, 쿠아시노이드, 안트라시클린 및 이의 유사체 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 산에 불안정한 친유성 분자 결합체의 또다른 양태에서, 히드록실 포함 암 화학요법제는 아클라루비신, 캠프토테신, 마소프로콜, 파클리탁셀, 펜토스타틴, 암루비신, 클라드리빈, 시타라빈, 도세탁셀, 겜시타빈, 엘리프티늄 아세테이트, 에피루비신, 에토포시드, 포름에스탄, 풀베스트란트, 이다루비신, 피라루비신, 토포테칸, 발루비신 및 빈블라스틴으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 산에 불안정한 친유성 분자 결합체의 또다른 양태에서, 결합체는 도 18, 19 및 20 에서의 화합물로부터 선택된다. 하나의 변형에서, -ALL1, -ALL2, -ALL3 … 내지 -ALLn 기 중 오직 하나만이 -ALL 기이고 다른 것들은 수소이다. 또다른 변형에서, -ALL1, -ALL2, -ALL3 … 내지 -ALLn 기 중 2 개가 -ALL 기이다.
또다른 구현예에서, 하기를 포함하는 약학 조성물이 제공된다: a) 단일 부분입체 이성질체의 형태의, 상기 화합물의 치료적 유효량; 및 b) 약학적으로 허용가능한 부형제. 또다른 양상에서, 약학 조성물은 경구 투여에 적합화되거나; 액체 제형으로서 비경구 투여에 적합화된다. 또다른 양상에서, 조성물은 경구, 비경구, 복강내, 정맥내, 동맥내, 경피, 근육내, 직장내, 비강내, 리포좀적, 피하내 및 척수내로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로에 의한 투여에 적합화된다. 또다른 구현예에서, 암 치료가 필요한 환자에게 상기 화합물 또는 조성물 중 어느 하나의 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 암 치료 방법이 제공된다. 방법의 한 양상에서, 암은 백혈병, 신경아 세포종, 교아 세포종, 자궁경부암, 직장암, 췌장암, 신장암 및 흑색종으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 방법의 또다른 양상에서, 암은 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암 및 두경부암으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 방법의 또다른 양상에서, 방법은 비-공액 히드록실 포함 암 화학요법제와 비교했을 때, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 적어도 50% 감소된, 암 세포에 의해 발현된 저항도를 제공한다.
또다른 구현예에서, 환자에게 암 화학요법제의 투여와 연관된 화학요법의 부작용을 감소시키거나 실질적으로 제거하기 위한 방법이 제공되는데, 상기 방법은 하기 화학식 1 , 1.1 또는 화학식 2 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체; 및 이의 단리된 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 이의 혼합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다:
Figure pct00003
[식 중: R 은 히드록실 포함 암 화학요법제이고; 화학식 1 또는 1. 1 의 경우: R1 은 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고; R2 는 C5-C22 알킬이고; Y 는 O, NR' 또는 S 로부터 선택되고, 여기서 R' 은 수소 또는 C1-C6 알킬이고; Z 는 O 또는 S 이고; Q 는 O 또는 S 이고; T 는 O 또는 S 이고; 화학식 2 의 경우: R2 는 C1-C22 알킬이고; T 는 O 또는 S 이고; X 는 수소 또는 메실레이트, 술포네이트 및 할로겐 (Cl, Br 및 I) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이탈기임].
화합물 1.1 은 순수한 신 이성질체, 순수한 안티 이성질체 및 신 및 안티 이성질체의 혼합물, 및 이의 부분입체 이성질체를 포함한다. 상기의 한 변형에서, R2 는 C9-C22 알킬이다. 한 양상에서, 방법은 암 화학요법제의 더 높은 농도를 환자의 암 세포에 제공한다. 또다른 양상에서, 방법은 환자에 대한 비-공액 암 화학요법제의 투여와 비교했을 때, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 적어도 50% 로 암 화학요법제의 높은 농도를 암 세포에 전달한다.
또다른 구현예에서, 하기 화학식 3a 또는 3b 의 화합물이 제공된다:
Figure pct00004
[식 중: R1 은 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고; R2 는 C5-C22 알킬이고; Y 는 O, NR' 또는 S 로부터 선택되고, 여기서 R' 은 수소 또는 C1-C6 알킬이고; Z 는 O 또는 S 로부터 선택되고; Q 는 O 또는 S 이고; T 는 O 또는 S 임].
화합물의 한 양상에서, R1 은 수소 또는 C1-C4 알킬이고; R2 는 C5-C22 알킬이고; Y 는 O 또는 S 이고; Z 는 O 이고; Q 는 O 이고; T 는 O 이다. 화학식 3a 또는 3b 의 활성화 화합물은, 활성화 화합물이 히드록실 포함 암 화학요법제 (HBCCA) 에 의해 축합되었을 때 산에 불안정한 친유성 결합체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이, HBCCA 는 일반적으로 예를 들어 화학식 1 , 1a , 1b , 1.1 , 2 및 2a 에서 잔기 또는 기 "R" 과 함께 나타내어지고, HBCCA 가 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 형성하기 위해 커플링되지 않는 경우, HBCCA 는 또한 일반적으로 화학식 "R-OH" 를 갖는 것으로 나타내어질 수 있는데, 이는 HBCCA 가 하나 이상의 히드록실 (-OH) 기로 관능화될 수 있기 때문이다. 유사하게, 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 형성하기 위해 HBCCA 에 의해 축합될 수 있는 산에 불안정한 친유성 기 (즉, 활성화 화합물의 "-ALL" 기) 는 일반적으로 "R-O-ALL" 로 나타내어진다. 이에 따라, 하나 초과의 -ALL 기가 HBCCA 기에 의해 축합 또는 공액되는 경우, 각각의 -ALL 기는 독립적으로 -ALL1, -ALL2, -ALL3 ... 내지 -ALLn (식 중, n 은 -ALL 기와 공액 또는 커플링될 수 있는 암 화학요법제에서 이용가능한 히드록실 기의 수임) 으로 나타내어 질 수 있다. 화학식 1 및 2 의 화합물에 대한 예로서, 예를 들어 명시된 HBCCA 및 -ALL 기는 아래 나타내어져 있다.
Figure pct00005
HBCCA 기가 2 개의 -ALL 기를 갖는 파클리탁셀인 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체 (ALLMC) 의 예는 아래 도시되어 있다:
Figure pct00006
파클리탁셀의 산에 불안정한 분자 결합체의 상기 대표적 예에서, -ALL1 및 -ALL2 각각은 독립적으로 수소 또는 본원에 정의된 -ALL 기이다. 하나 초과의 히드록실 기, 접근 불가능한 히드록실 기(들)를 갖는 HBCCA 기의 경우, 산에 불안정한 친유성 기가 형성될 수 없어서, -ALL 기(들) 로 명시된 기는 수소이다.
또다른 구현예에서, 암 환자의 치료에 사용하기 위한 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체의 제조 방법이 제공된다. 한 양상에서, 방법은 화학식 4 의 화합물을 형성하기 위한 알데히드 또는 케톤에 의한 솔케탈 (2,2-디메틸-4-히드록시메틸-1,3-디옥솔란) 의 트랜스-케탈화를 포함한다. 화합물 4 는 화학식 3 의 화합물을 형성하기 위한 산 할라이드 (여기서 X 는 할라이드임) 에 의해 축합될 수 있다. 화학식 3 의 화합물의 한 변형에서, p-니트로페녹시 기는 이탈기 예컨대 2-할로-페녹시, 2,4-할로-페녹시, 2,4,6-트리할로-페녹시, 2,6-디할로-페녹시로 대체될 수 있고, 여기서 할로는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
HBCCA (R-OH) 에 의한 3 의 축합은 암 화학요법 화합물 1 의 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 제공하고, 여기서 R, R1 및 R2 는 본원에 정의된 바와 같다.
Figure pct00007
또다른 구현예에서, 화학식 2a 의 화합물을 형성하기 위한 에놀 에테르 또는 비닐 에테르와 HBCCA 의 축합 반응을 포함하는, 화학식 2a 의 화합물의 제조 방법이 제공된다:
Figure pct00008
[식 중, R-OH 는 HBCCA 이고, R3 은 C2-C23 알킬이고, X 는 수소 또는 Cl, Br 또는 I 로부터 선택되는 할로겐임].
또다른 구현예에서, LDL 입자 또는 "의사(pseudo)-LDL 입자" 를 닮은 나노미립자 지질 에멀전 중 본 출원의 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 사용하여, 환자의 선택된 목표 세포에 암 화학요법제를 집중시키는 방법이 제공된다. 또다른 구현예에서, 방법은 의사-LDL 입자의 지질 코어에 용해된 암 화학요법제의 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체의 치료적 유효량의 선택된 투여량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
또한 상기 구현예, 양상 및 변형에 포함되는 것은, 아미노산 예컨대 아르기네이트 등의 염, 글루코네이트 및 갈락투로네이트이다. 본 발명의 화합물 중 일부는 내부 염 또는 쯔비터이온을 형성할 수 있다. 본 발명의 특정 화합물은 수화 형태를 포함하여 용매화 형태 및 비용매화 형태로 존재할 수 있고, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 특정 상기 화합물은 또한 하나 이상의 고체 또는 결정질 상 또는 다형체로 존재할 수 있고, 상기 다형체 또는 상기 다형체의 혼합물의 다양한 생물학적 활성은 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 또한 약학적으로 허용가능한 부형제 및 본 발명의 화합물 하나 이상의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물 또는 이의 유도체의 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 용액 또는 동결 분말로서 제형화될 수 있다. 분말은 사용하기 전에 적합한 희석제 또는 기타 약학적으로 허용가능한 담체의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 액체 제형은 일반적으로 완충, 등장성, 수용액이다. 적합한 희석제의 예는 통상적 염류 용액, 수중 5% 덱스트로스 또는 완충 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이다. 상기 제형은 특히 비경구 투여에 적합하지만, 또한 경구 투여에 사용될 수 있다. 부형제, 예컨대 폴리비닐피롤리디논, 젤라틴, 히드록시셀룰로오스, 아카시아, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 나트륨 클로라이드 또는 나트륨 시트레이트가 또한 첨가될 수 있다. 대안적으로, 이러한 화합물은 경구 투여를 위해 캡슐화되거나, 정제화되거나, 에멀젼 또는 시럽으로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 담체가 조성물을 강화 또는 안정화시키기 위해 또는 조성물의 제조를 용이하게 하기 위해 첨가될 수 있다. 액체 담체는 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 글리세린, 식염수, 알코올 또는 물을 포함한다. 고체 담체는 전분, 락토오스, 황산칼슘, 디히드레이트, 백토, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴을 포함한다. 담체는 또한 서방출 물질 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 그러나, 고체 담체의 양은 바람직하게는 투약 단위 당 약 20 mg 내지 약 1 g 사이에 있을 것이다. 약학적 제제는 필요한 경우 정제 형태를 위해서는 분쇄, 혼합, 과립화 및 압축; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태를 위해서는 분쇄, 혼합 및 충전을 포함하는 통상적 제약 기술에 따라 이루어진다. 액체 담체가 사용되는 경우, 제제는 시럽, 엘릭시르, 에멀젼 또는 수성 또는 비수성 현탁액의 형태일 것이다. 상기 액체 제형은 직접 경구에 투여될 수 있거나, 연질 젤라틴 캡슐에 충전될 수 있다. 이러한 투여 방법 각각에 적합한 제형은 예를 들어 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, ed., 20th edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa] 에서 찾을 수 있다.
본 발명의 이러한 및 기타 목적은, 첨부된 도식 및 도면과 함께 취해질 때 본 발명의 예시적 구현예의 하기 상세한 설명을 고려하여 더 쉽게 인식 및 이해될 것이다. 본 출원 전체에 언급된 모든 문헌의 전체 개시 내용이 본원에서 참조 인용된다.
도 18, 19 및 20 은 대표적 산에 불안정한 친유성 분자 결합체를 도시한다.
하기 과정이 본 발명의 화합물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 제조에 사용된 출발 물질 및 시약은 시판 업체 예컨대 Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Bachem (Torrance, Calif.), Sigma (St. Louis, Mo.) 로부터 입수되거나, [Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols. 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991]; [Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supps., Elsevier Science Publishers, 1989]; [Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991]; [March J.: Advanced Organic Chemistry, 4th ed., John Wiley and Sons, New York, N.Y.]; 및 [Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, New York, 1989] 와 같은 참조 문헌에 기재된 과정을 따라, 당업자에게 익히 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 경우에서, 보호기가 도입되고 마지막으로 제거될 수 있다. 아미노, 히드록시 및 카르복시 기에 적합한 보호기는 [Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, John Wiley and Sons, New York, 1991] 에 기재되어 있다. 표준 유기 화학 반응은 예를 들어 [Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, New York, 1989] 에 기재된 바와 같이 많은 상이한 시약을 사용하여 달성될 수 있다.
암 화학요법제의 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체의 합성을 위한 일반적 과정.
활성화 중간체 화합물의 형성:
암 화학요법제의 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 형성하는데 사용하기에 적합한 화합물은 본원에 개시된 일반적 방법에 따라 제조될 수 있다. 한 양상에서, 솔케탈은 알데히드 솔케탈 (아세탈) 유도체 또는 케톤 솔케탈 (케탈) 유도체 각각을 형성하기 위해 산 촉매작용 및 유기 용매의 존재 하에 알킬 알데히드 또는 디알킬 케톤과 반응된다. 본 발명의 방법에 따르면, 5-원 및 6-원 시클릭 아세탈이 제조될 수 있고, 크로마토그래피에 의해 실질적으로 순수한 형태로 단리될 수 있다. 한 양상에서, 용매는 톨루엔이고, 반응은 상승된 온도, 예컨대 약 60 내지 80 ℃ 에서 수행된다. 아세탈 또는 케탈 솔케탈 유도체는 이후 염기 촉매작용의 존재 하의 산 할라이드 예컨대 4-니트로페닐 클로로포르메이트와의 반응에 의해 활성화되어, 상응하는 활성화 유도체, 예컨대 화학식 3 의 4-니트로페닐 카르보네이트 중간체 화합물을 형성한다. 한 양상에서, 4-니트로페닐 카르보네이트 중간체는 HBCCA 와 축합되어, 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 형성할 수 있다.
Figure pct00009
또다른 양상에서, 솔케탈은 먼저 염기 촉매작용의 존재 하에 산 할라이드 예컨대 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응되어, 솔케탈 니트로카르보네이트를 형성하고, 이는 이후 산 촉매작용 및 유기 용매의 존재 하에 알킬 알데히드 또는 디알킬 케톤과 반응되어, 알데히드 솔케탈 (아세탈) 유도체 또는 화학식 3 의 케톤 솔케탈 (케탈) 유도체를 각각 형성한다. 한 양상에서, 용매는 톨루엔이고, 반응은 RT 에서 수행된다. 한 양상에서, 4-니트로페닐 카르보네이트 중간체는 HBCCA 와 축합되어, 상응하는 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 형성할 수 있다.
Figure pct00010
또다른 양상에서, 알코올 예컨대 스테아릴 알코올은 전이 금속 촉매 예컨대 [Ir(cod)Cl]2 및 염기 첨가제 예컨대 Na2CO3 의 존재 하에 비닐 아세테이트와 반응되어, 상응하는 비닐 에테르를 형성한다. 한 양상에서, 용매는 톨루엔이고, 반응은 100 ℃ 에서 수행된다. 한 양상에서, 비닐 에테르 유도체는 HBCCA 와 축합되어, 상응하는 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 형성할 수 있다.
Figure pct00011
암 화학요법제의 대안적인 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체의 합성을 위한 일반적 과정:
한 구현예에서, HBCCA 는 실온 (RT) 에서 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄 (DCM) 중에 염기 예컨대 N,N-디메틸-4-아미노피리딘 (DMAP) 및 피리딘의 촉매량의 존재 하에 4-니트로페닐 카르보네이트 화합물과 반응되어, 원하는 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체를 형성할 수 있다.
Figure pct00012
아래 도식에 나타낸 바와 같이, 활성화 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체 중간체의 초기 합성은, 상응하는 천연 지방산으로부터 유래된 알데히드에 의한 솔케탈의 처리 이후 4-니트로페닐 클로로포르메이트와의 반응에 의해 얻어진다.
Figure pct00013
도식: 친유성 카르보네이트 분자 결합체 중간체의 합성: 조기 접근
그러나, 이러한 방법은 이의 상응하는 syn/anti 이성질체에 따라 5- 및 6-원 결합체의 형성을 산출한다. 비록 5- 및 6-원 아세탈 모두가 친유성 결합체 전구약물로서 작용할 수 있을지라도, 구조 이성질체 및 입체 이성질체의 3 개의 세트가 아세탈 형성 단계에서 단리된다. 한 구현예에서, 원하는 아세탈은 크로마토그래피에 의해 실질적으로 순수한 형태로 단리될 수 있다. 5-원 아세탈의 제조를 위한 대안적 반응 순서가 아래 나타나 있다. 이러한 경로는 5-원 아세탈을 제공하고, 다양한 후보 화학요법제의 친유성 결합체에 접근하는 방법을 제공한다. 활성화 카르보네이트 중간체는 또한 히드록실-포함 암 화학요법제에 의해 추가 처리되어, 관심 대상인 상응하는 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체 전구약물을 생성한다.
Figure pct00014
도식: 친유성 카르보네이트 분자 결합체 중간체 및 전구약물의 합성: 변형된 접근
암 화학요법제의 대안적인 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체는, 할로겐화제, 예컨대 NXS, 예컨대 DCM 중 N-브로모숙신이미드 (NBS) 의 존재 하에 HBCCA 와 알킬 비닐 에테르를 반응시켜 형성될 수 있다. 한 양상에서, 반응물질은 저온, 예컨대 약 -78 ℃ 에서 용액 중에 조합되고, 반응물이 교반되고, 천천히 RT 로 가온된다.
Figure pct00015
암 화학요법제의 기타 대안적 산에 불안정한, 친유성 분자 결합체는 산 촉매 예컨대 피리디늄 파라-톨루엔 술포네이트 (PPTS) 의 존재 하에 고급 알킬 비닐 에테르 (천연 지방산으로부터 유래됨) 와 HBCCA 를 반응시켜 형성될 수 있다. 한 양상에서, 반응물은 상응하는 산에 불안정한 친유성 아세탈 전구약물을 합성하기 위해 RT 에서 용액 중에 조합된다.
Figure pct00016
산에 불안정한 친유성 결합체의 형성:
방법 A: 무수 디클로로메탄 (1 ml) 중 화학식 3 의 4-니트로페닐 카르보네이트-솔케탈 결합체 (0.21 mmol) 의 용액이 무수 디클로로메탄 (2 ml) 중 HBCCA (0.2 mmol) 및 DMAP (0.3 mmol) 의 용액에 첨가되고, 반응 혼합물은 질소 분위기 (N2) 하에 RT 에서 교반되었다. 반응 진행은 TLC/HPLC 로 모니터링되고, 완료시, 반응 혼합물은 메틸렌 클로라이드 (DCM) 로 희석되고, NH4Cl(s), 물 및 염수로 세척되었다. 유기층이 분리되고, 황산나트륨으로 건조시키고, 증발시켰다. 미정제 잔여물은 실리카 겔 플래시 크로마토그래피 (SGFC) 에 의해 정제되어, 결합체 전구약물이 수득되었다.
방법 B: 알킬 비닐 에테르 (1.2 mmol, 6 eq.) 및 HBCCA (0.2 mmol, 1 eq.) 의 무수 DCM (8 mL, 0.025M) 중 용액에, NBS (1 mmol, 5 eq.) 를 -15℃ 에서 N2 하에 첨가했다. 반응 혼합물을 -15℃ 내지 0℃ 에서 교반하고, 반응의 진행을 TLC/HPLC 로 모니터링했다. 완료시, 반응 혼합물을 DCM 로 희석하고, 반응 혼합물을 NaHCO3(sat.), 물 및 식염수 용액으로 세척했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 SGFC 로 정제하여 공액된 전구약물을 수득했다.
방법 C: 알킬 비닐 에테르 (1.2 mmol, 6 eq.) 및 HBCCA (0.2 mmol, 1 eq.) 의 무수 DCM (8 mL, 0.025M) 중 용액에, PPTS (0.02 mmol, 10 mol%) 를 첨가하고, 반응 혼합물을 RT 에서 N2 하에 교반했다. 반응 진행을 TLC/HPLC 로 모니터링했다. 완료시, 반응 혼합물을 DCM 으로 희석하고, 반응 혼합물을 NaHCO3(sat.), 물 및 식염수 용액으로 세척했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 SGFC 로 정제하여 공액된 전구약물을 수득했다.
산에 불안정한 친유성 결합체의 특징분석:
산에 불안정한 친유성 결합체를 HPLC 및 고해상도 질량 분광계의 조합으로 특징분석했다. 각각의 화합물에 대한 상세설명을 제공한다.
ART 449 의 제조
도코사헥사엔 알콜의 4-니트로페닐 카르보네이트 (0.5 g) 의 무수 DCM 중 용액을 ART 273 (0.522 g) 및 DMAP (0.140 g) 의 무수 DCM (18 mL) 중 용액에 RT 에서 N2 하에 첨가하고 교반했다. 완료시, 반응물을 DCM 으로 희석하고, 포화 암모늄 클로라이드 용액 (NH4Cl(s)), 물 및 식염수로 세척했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 449 을 백색 고체로 수득했다. -TOF MS: m/z 1003.4859 (M+CF3CO2)-
Figure pct00017
ART 448 의 제조
5-헥센-1-올의 4-니트로페닐 카르보네이트 (0.1 g) 의 무수 DCM 중 용액을 ART 273 (0.207 g) 및 DMAP (0.051 g) 의 무수 DCM (5 mL) 중 용액에 RT 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 반응물을 DCM 으로 희석하고, NH4Cl(s), 물 및 식염수로 세척했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 448 를 백색 고체로 수득했다. -TOF MS: m/z 789.2928 (M+CF3CO2)-
Figure pct00018
ART 473 의 제조
시클로헥실 비닐 에테르 (0.24 mL) 를 ART 273 (0.230 g) 및 NBS (0.282 g) 의 무수 DCM (5 mL) 중 용액에 -78℃ 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 용액을 증발시키고, 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 473 을 백색 고체로 수득했다.
Figure pct00019
ART 471 의 제조
Tert-부틸 비닐 에테르 (0.24 mL) 를 ART 273 (0.250 g) 및 NBS (0.307 g) 의 무수 DCM (5 mL) 중 용액에 -78℃ 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 용액을 증발시키고, 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 471 를 백색 고체로 수득했다.
Figure pct00020
ART 472 의 제조
옥타데실 비닐 에테르 (0.448 g) 를 ART 273 (0.208 g) 및 NBS (0.255 g) 의 무수 DCM (5 mL) 중 용액에 -78℃ 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 용액을 증발시키고, 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 472 를 백색 고체로 수득했다.
Figure pct00021
ART 470 의 제조
에틸 비닐 에테르 (0.11 mL) 를 ART 273 (0.150 g) 및 N-브로모숙신이미드 (NBS, 0.170 g) 의 무수 DCM (5 mL) 중 용액에 -78℃ 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 용액을 증발시키고, 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 470 를 백색 고체로 수득했다.
Figure pct00022
ART 489 의 제조
옥타데실 솔케탈-4-니트로페닐 카르보네이트 (0.750 g) 의 무수 DCM 중 용액을 ART 198 (0.754 g) 및 DMAP (0.238 g) 의 무수 DCM (30 mL) 중 용액에 RT 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 반응물을 DCM 으로 희석하고, NH4Cl(s), 물 및 식염수로 세척했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 489 를 고체로 수득했다. -TOF MS: m/z 1031.4645 (M+CF3CO2)-
Figure pct00023
ART 488 의 제조
옥타데실 솔케탈-4-니트로페닐 카르보네이트 (0.53 g) 의 무수 DCM 중 용액을 ART 273 (0.507 g) 및 DMAP (0.168 g) 의 무수 DCM (30 mL) 중 용액에 RT 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 반응물을 DCM 으로 희석하고, NH4Cl(s), 물 및 식염수로 세척했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 488 를 고체로 수득했다. -TOF MS: m/z 1003 4994 (M+CF3CO2)-
Figure pct00024
ART 332 의 제조
솔케탈-4-니트로페닐 카르보네이트 (1.1 g) 의 무수 DCM 중 용액을 ART 273 (1.30 g) 및 DMAP (0.36 g) 의 무수 DCM (30 mL) 중 용액에 RT 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 반응물을 DCM 으로 희석하고, NH4Cl(s), 물 및 식염수로 세척했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 332 를 백색 고체로 수득했다. -TOF MS: m/z 947.4601 (M+CF3CO2)-
Figure pct00025
ART 441 의 제조
DHA (0.2 g), DCC (0.157 g) 및 DMAP (0.006 g) 를 순차적으로 ART 273 (0.279 g) 의 무수 DCM (10 mL) 중 용액에 RT 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 반응물을 DCM 로 희석하고, NH4Cl(s), 물 및 식염수로 세척했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 441 (0.2 g) 를 백색 고체로 수득했다.
Figure pct00026
ART 467 의 제조
옥타데실 솔케탈-4-니트로페닐 카르보네이트 (1.75 g) 의 무수 DCM 중 용액을 파클리탁셀 (2.59 g) 및 DMAP (0.557 g) 의 무수 DCM (30 mL) 중 용액에 RT 에서 N2 하에 첨가했다. 완료시, 반응물을 DCM 으로 희석하고, NH4Cl(s), 물 및 식염수로 세척했다. 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켰다. 미정제 잔사를 실리카 겔 상에서 정제하여 ART 467 을 백색 고체로 수득했다. -TOF MS: m/z 1306.5445 (M+CF3CO2)-
Figure pct00027
ART 151 의 제조
ART 151 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 6.06, 방법: 탁산 결합체_MKG4 (C18 컬럼, MeOH/H2O/THF 95/3/2 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 14 분). +TOF MS: m/z 1239.6523 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00028
ART 152 의 제조
ART 152 를 방법 B 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 8.21, 방법: 탁산 결합체_MKG4 (C18 컬럼, MeOH/H2O/THF 95/3/2 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 14 분). +TOF MS: m/z 1228.5654 [M+1] (M+H+)
Figure pct00029
ART 153 의 제조
ART 153 을 방법 C 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 7.05, 방법: 탁산 결합체_MKG4 (C18 컬럼, MeOH/H2O/THF 95/3/2 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 14 분). +TOF MS: m/z 1150.6485 [M+1] (M+H+)
Figure pct00030
ART 161 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 4.88, 방법: 탁산 결합체_MKG6 (C18 컬럼, MeOH/H2O 95/5 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 16 분). +TOF MS: m/z 1235.6276 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00031
ART 207 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 6.06, 방법: 탁산 결합체_MKG17 (Synergy 컬럼, ACN/H2O 60/40 로부터 100% ACN 까지 10 분, 2 분 100% ACN, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 15 분). +TOF MS: m/z 1220.6156 [M+1] 및 m/z 1237.6382 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00032
ART 156 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 6.2, 방법: 탁산 결합체_MKG4 (C18 컬럼, MeOH/H2O/THF 95/3/2 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 14 분). +TOF MS: m/z 1176.6466 [M+1] 및 m/z 1193.6730 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00033
ART 162 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 8.96, 방법: 탁산 결합체_MKG16 (Synergy 컬럼, MeOH/H2O 75/25 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 15 분). +TOF MS: m/z 1189.6491 [M+18] 및 m/z 1172.6224 [M+1] (M+H+)
Figure pct00034
ART 208 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 7.4, 방법: 탁산 결합체_MKG19 (Synergy 컬럼, ACN/H2O 50/50 3 분, 80-100% ACN/H2O 10 분, 2 분 100% ACN, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 15 분). +TOF MS: m/z 1174.6306 [M+1] (M+H+)
Figure pct00035
ART 185 을 방법 C 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 6.42, 방법: 탁산 결합체_MKG15 (Synergy 컬럼, 70-100% ACN/H2O 10 분, 100% ACN 2 분, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 15 분). +TOF MS: m/z 1104.6648 [M+1] (M+H+) 및 m/z 1126.6447 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00036
ART 137 을 방법 C 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 10.63, 방법: 탁산 (C18 컬럼, ACN/H2O 50/50 로부터 100% ACN 까지 10 분, 2 분 100% ACNH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 16 분)
Figure pct00037
ART 164 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 7.73, 방법: 탁산 결합체_MKG6 (C18 컬럼, MeOH/H2O 95/5 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 16 분). +TOF MS: m/z 1255.7506 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00038
ART 163 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 7.56, 방법: 탁산 결합체_MKG6 (C18 컬럼, MeOH/H2O 95/5 로부터 100% MeOH 까지 10 분, 2 분 100% MeOH, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 16 분). +TOF MS: m/z 1251.7233 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00039
ART 209 을 방법 A 에서 개요했던 과정에 따라 제조했다. HPLC 체류 시간 9.6, 방법: 탁산 결합체_MKG18 (Synergy 컬럼, ACN/H2O 80/20 10 분, 100% ACN 2 분, 230 nm, 1.5 ml/분, 30℃, 15 분). +TOF MS: m/z 1253.7505 [M+18] (M+NH4 +)
Figure pct00040
특정 화합물들의 세포독성:
SK-N-AS 세포를 이용한 MTS 증식 검정
제 1 일 : SK-N-AS 세포를 Falcon 사의 96 웰 조직 배양 플레이트에 시험 약물마다 1 개의 플레이트로 하여 웰 당 5x103 로 적절한 생장 배지 100 ㎕ 중에 플레이팅했다. 컬럼 1 을 블랭크로 하여; 배지는 포함하지만 세포는 포함하지 않도록 했다. 플레이트를 밤새 37℃ 에서 5% CO2 중에 인큐베이션하여 부착되도록 했다.
제 2 일 : 배양 배지에 희석한 약물을 4 개씩으로 하여 0.005 nM 내지 10 μM 의 농도로 세포에 첨가했다. 48 내지 72 시간의 약물 노출 후, MTS 시약을 모든 웰에 첨가하고, CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS), Promega 에서 세포 유형에 따라 1 내지 6 시간 (37℃, 5% CO2) 인큐베이션했다. 플레이트를 Bio-Tek Synergy HT Multi-검출 미세역가 플레이트 검독기를 이용하여 490 나노미터 파장에서 가동시키고, 데이터는 KC4V.3 소프트웨어로 가공했다. 약물 농도 대 흡광도의 데이터 그래프를 그리고, 각각의 시험한 화합물에 대해 50% 저해를 야기하는 농도 (IC50) 를 외삽했다.
표 1 에 요약한 바와 같이, SK-N-AS 세포주에서 각 시험 화합물에 대한 IC50 값이 결정되었다. 임상 비교측정 약물인 파클리탁셀을 시험에 포함시켜 후보 화합물들의 결과를 탁산 계열의 임상적으로 관련있는 표준과의 비교할 수 있도록 만들었다.
표 1: SK-N-AS 에서의 IC50 (nM) 값
Figure pct00041
짝을 이룬 MDR+ 및 MDR- 세포주를 이용한 MTT 증식 검정
산에 불안정한 친유성 분자 결합체의 세포독성의 두번째 평가에 착수했다. 그러한 실험의 목적은 다중약물 내성 세포 및 그의 부모세대인 약물에 민감한 세포주에서의 결합체의 독성을 비교하여 해당 화합물의 하위군이 부모세대인 약물에 민감한 세포주에서 관찰되는 것과 유사한 수준의 독성이 약물 내성 주에서도 나타낸다는 가설을 시험하기 위한 것이다.
MTT-기반의 세포독성 검정은 인간 암 세포주 및 다중약물 내성을 나타내는 짝을 이룬 서브라인을 이용해 실행했다. 그러한 세포주들은 자궁 육종 세포주, MES-SA, 및 그의 독소루비신-내성 서브라인, MES-SA/Dx5 을 포함했다. 참고문헌은, [W. G. Harker, F. R. MacKintosh, and B. I. Sikic. Development and characterization of a human sarcoma cell line, MES-SA, sensitive to multiple drugs. Cancer Research 43: 4943-4950 (1983); W. G. Harker and B. I. Sikic. Multidrug (pleiotropic) resistance in doxorubicin-selected variants of the human sarcoma cell line MES-SA. Cancer Research 45: 4091 4096 (1985)].
MES-SA/Dx5 는 빈블라스틴, 파클리탁셀, 콜히친, 빈크리스틴, 에토포시드, 닥티노마이신, 미톡산트론 및 다우노루비신을 포함하는 다수의 화학요법제에 대한 유의할 교차 내성을 나타내고, 미토마이신 C 및 멜팔란에 대해서는 중간 정도의 교차 내성을 나타낸다. 그러나, 블레오마이신, 시플라틴, 카르무스틴, 5-플루오로우라실 또는 메토트렉세이트에 대한 내성은 관찰되지 않았다. MES-SA/Dx5 세포는 높은 수준의 ABCB1 (MDR1) mRNA 및 그의 유전자 생성물, P-당단백질을 발현한다. MES-SA 및 MES-SA/Dx5 은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) 에서 판매한다.
시험한 두번째 세포 셋트, CCRF-CEM 또는 단순히 CEM 은 급성 림프구성 백혈병 환자의 혈액에서 유도된 것이었다. [G. E. Foley, H. Lazarus, S. Farber, B. G. Uzman, B. A. Boone, and R. E. McCarthy. Continuous culture of human lymphoblasts from peripheral blood of a child with acute leukemia. Cancer 18: 522-529 (1965)]. 서브라인 CEM/VLB100 은 100 ng/ml 에서 빈블라스틴까지에 대해 내성이 되도록 개발했다. [W. T. Beck, T. J. Mueller, and L. R. Tanzer. Altered surface membrane glycoproteins in Vinca alkaloid-resistant human leukemic lymphoblasts. Cancer Research 39: 2070-2076 (1979)]. 약물 내성은 MDR1 유전자의 과발현에 의해 달성된다. 그러나, CEM 서브라인 정해진 CEM/VM-1-5 의 내성은 "이례적" 이다. [M. K. Danks, J. C. Yalowich, and W. T. Beck. Atypical multiple drug resistance in a human leukemic cell line selected for resistance to teniposide (VM-26). Cancer Research 47: 1297-1301 (1987)]. "고전적" 다중 약물 내성 표현형에 포함되는 약물의 계열은 빈카 알칼로이드 (Vinca alkaloids), 안트라싸이클린 (anthracyclines), 에피포도필로톡신 (epipodophyllotoxins) 및 항생제이다. 그러나, CEM/VM-1-5 세포는 에토포시드, 안트라싸이클린 및 미톡산트론에 대한 내성 및 교차-내성에도 불구하고 빈카 알칼로이드에 대한 감수성을 보유한다. [Danks, M. K.; Schmidt, C. A.; Cirtain, M. C.; Suttle, D. P.; Beck, W. T., Altered catalytic activity of and DNA cleavage by DNA topoisomerase II from human leukemic cells selected for resistance to VM-26. Biochemistry 1988, 27, 8861-8869]. CEM/VM-1-5 세포에서의 내성은 ABCC1 (MRP1) 유전자의 과발현에 의해 유효하게 된다. CEM, CEM/VLB100 및 CEM/VM-1-5 세포는 시카고 일리노이즈 대학의 Dr. WT Beck 로부터 입수했다.
표 2: 짝을 이룬 세포주에서의 시험 농도 개요
Figure pct00042
표 3: IC50 결과 (nM)
Figure pct00043
산 불안정, 친유성 분자 결합체에 대해 관찰된 세포독성은 그들이 강력한 화학요법제로서 유용성을 갖는데 필요한 항암 활성을 여전히 보유함을 입증한다. 저항성 세포주에 의해 발현되는 명백한 저항성의 정도가 산 불안정, 친유성 분자 결합체의 경우 20 ~ 50 % 만큼 감소됨이 특히 주목할 만하다. 이는 예상 밖의 결과였다.
혈장 중 산 불안정, 친유성 분자 결합체의 안정성:
혈장 중 가수분해에 대한 산 불안정, 친유성 분자 결합체의 안정성을 평가하여, 그들이 활성 암 화학요법제를 체순환 중에 방출하여 전신 오프 타겟 (off target) 독성 ("부작용") 을 야기할 가능성을 확인했다. 결합체를 마우스, 랫트 및 인간 기원의 혈장과 함께 인큐베이션했다.
Fisher (Fair lawn, NJ, USA) 로부터의 HPLC 등급 메탄올. Part No: A452-4 (074833). Fisher (Fair lawn, NJ, USA) 로부터의 HPLC 등급 물. Part No: W5-4 (073352). 무약물 (drug-free) 마우스, 랫트 및 인간 혈장을 Innovative Research Inc. (Southfield, MI, USA) 로부터 구입했다. Hospira, Inc. (Lake Forest, Illinois) 로부터의 Liposyn® I.V. 지방 에멀전.
혈장 인큐베이션의 준비:
각각의 약물 (ART 198, ART 273, ART 488 및 ART 489) 을 각각 마우스, 랫트 및 인간 혈장 중에 10 ㎍/㎖ 농도로 3 개씩 제조하고, 1 분 동안 볼텍싱하고, 1 분 당 진탕 속도 75 회의 37 ℃ 의 수조 내에 배치했다. 샘플을 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 210, 240, 300, 360 및 480 분의 시점에 채취했다.
혈장 중 ART 198, ART 273, ART 488 및 ART 489 분석을 위한 분석 방법:
화합물의 크로마토그래피 분리를 BEH C18 칼럼 (1.7 ㎛, 2.1×50 ㎜) 을 사용하여 Waters Acquity UPLCTM 로 수행했다. 이동상은 메탄올: 0.1 % 포름산 (80:20) 으로 구성되었다. 흐름 속도는 0.3 ㎖/분 이었고; 샘플 주입 부피는 5 ㎕ 였고, 이에 따라 실행 시간은 3 분이었다.
MS 장비는 Waters Micromass Quattro MicroTM 삼중-사극자 시스템 (Manchester, UK) 으로 구성되었다. MS 시스템은 MassLynx 소프트웨어의 4.0 버전으로 제어되었다. 이온화를 양성 전기분무 이온화 모드에서 수행했다. MS/MS 조건은 다음과 같았다: 모세관 전압 3.02 kV; 콘 전압 50 v; 추출기 전압 5 v; 및 RF 렌즈 전압 0.5 v. 공급원 및 탈용매화 온도는 각각 100 ℃ 및 400 ℃ 였고, 탈용매화 및 콘 기체 흐름은 각각 400 및 30 ℓ/hr 였다.
선택된 이온 모니터링 (SIM) 에서 사용된 ART 198 의 선택된 질량-대-전하 (m/z) 비 전이는: ART 198 의 경우, 617 (M+K)+, ART 273 의 경우, 589 (M+K)+, ART 488 의 경우, 913 (M+Na)+, 및 ART 489 의 경우, 957 (M+Na)+ 이었다. 체류 시간을 200 msec 로 설정했다. 메탄올 중에 제조되고 주사기 펌프에 의해 흐름 속도 20 ㎕/분 으로 전달되는 표준 용액의 직접 주입을 사용하여 MS 조건을 최적화했다.
혈장 샘플 제조:
100 ㎕ 의 샘플을 각각 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 165, 180, 210, 240, 300, 360 및 480 분의 시점에서 수집했고, 반응을 메탄올로 종료시켰다. 별도의 실험 세트에서 산 불안정, 친유성 분자 결합체를 소량의 에탄올 중에 용해하고, 지질 에멀전 (Liposyn®) 으로 희석하고, 인큐베이션 전에 마우스 및 인간 혈장에 첨가하고, 결합체의 가수분해를 유사하게 측정했다. 약물을 함유하는 100 ㎕ 의 수집된 혈장 샘플을 가공을 위한 별도의 에펜도르프 마이크로 원심분리 튜브 내에 배치했다. 단백질 침전 기술을 사용하여 메탄올 (200 ㎕) 을 첨가하여 약물을 추출했다. 마이크로 튜브를 그 후 10 분 동안 볼텍스 혼합하고, 15 분 동안 10,000 rpm 의 속도에서 원심분리했다 (에펜도르프 5415C 원심분리). 상청액을 수집하고, 분석 전에 0.45 ㎛ 필터 (Waters 13mm GHP 0.45 ㎛) 를 사용하여 여과했다.
블랭크 마우스, 랫트 및 인간 혈장 샘플의 UPLC/MS/MS 분석은 ART 198, ART 273, ART 488 또는 ART 489 의 정량화에 대한 내생적 피크 간섭을 보이지 않았다.
가중 선형 최소-제곱 (1/x) 회귀를 수학적 모델로서 사용했다. 화합물에 대한 계수 (r) 는 0.9925 ~ 0.9999 범위었다. 보정 범위를 측정될 샘플 중 기대 농도에 따라 선택했다. 최종 보정 범위는 10-12,500 ng/㎖ 였고, 정량화의 최저 한계는 ng/㎖ 였다.
반복성 및 재현성 편향 (%) 은 낮은 농도에서 ±20 %, 다른 농도 수준에서 ±15 % 의 허용 한계 내이고, RSD 는 평가된 모든 농도에서 5% 미만이다.
혈장으로부터 방법의 평균 회수율은 시험 약물의 3 가지 상이한 농도에서 86.22 - 99.83% 범위였다. 이들 결과는 상이한 농도 수준에서 추출 회수율에 유의미한 차이가 존재하지 않았음을 시사했다.
ART 467 및 파클리탁셀의 인큐베이션:
ART 467 의 210.6 ㎍/㎖ 스톡 용액으로부터의 0.2 ㎖ 분취량을 15 분 (37 ℃) 동안 예비인큐베이션된 3.8 ㎖ 의 인간 혈장에 섞고, 37 ℃ 의 왕복 수조 내에서 인큐베이션했다. 샘플을 0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 24 시에 채취했다.
ART 467 및 파클리탁셀에 대한 분석 방법 (액체 크로마토그래피-직렬 질량 분광분석):
바이너리 펌프, 오토샘플러, 탈기기 및 칼럼 오븐으로 구성되는 ACQUITY UPLC 액체 크로마토그래프 (Waters Corporation, Milford, MA, USA) 를 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행했다. 메탄올-아세토니트릴 (50:50, v/v) 의 이동상을 25 ℃ 로 유지되는 ACQUITY UPLC BEH C18 칼럼 (1.7 ㎛, 2.1×50 ㎜ i.d., Waters Corporation) 을 통하여 0.4 ㎖/분 의 흐름 속도로 펌핑했다. 10 ㎕ 의 샘플을 주입했고, 실행 시간은 3.0 분이었다. LC 용리액을 전기분무 이온화 (ESI) 이온 공급원을 갖춘 ESCi 삼중-사극자 질량 분광계에 직접 연결했다. 사극자를 양성 이온 모드에서 작동시켰다. MassLynx 버전 4.1 소프트웨어를 사용하는 정량화에 다중 반응 모니터링 (MRM) 모드를 사용했다. m/z 876.2, 307.9; 882.2, 313.9; 및 1216.5, 647.8 의 질량 전이가 각각 파클리탁셀 Na+ 부가생성물, l3C6-파클리탁셀 부가생성물 및 ART 467 부가생성물에 대해 최적화되었다 (체류 시간 0.5 s). 질소를 분무 기체 (30 ℓ/h) 및 탈용매화 기체 (300 ℓ/h) (탈용매화 온도 250 ℃) 로 사용했고, 아르곤은 충돌 기체였다. 모세관 전압을 3.5 kV 로, 콘 전압을 90 V 로 설정했다. 공급원 온도를 100 ℃ 로 설정했다.
혈장 샘플 제조:
상이한 시간 (0, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 및 24 h) 에, 샘플의 200 ㎕ 분취량을 취하는 즉시 1.3 ㎖ 의 냉 TBME 에 첨가했고, 그 후 20 ㎕ 의 내부 표준 스톡 용액 (메탄올 중 80.7 ㎍/㎖) 을 첨가했다. 각각의 튜브를 약 2 분 동안 볼텍스 혼합한 후, 13000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리했다. 1.0 ㎖ 의 결과적인 상청액을 또다른 튜브에 옮기고, 35 ℃ 의 질소 기체의 흐름 하에 건조시켰다. 각각의 건조된 잔류물을 200 ㎕ 의 메탄올로 재구성하고, 0.5 분 동안 볼텍스 혼합했다. 13000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리 후, 상청액을 HPLC 오토샘플러 바이알에 옮기고, 각 샘플의 10 ㎕ 분취량을 LC-MS-MS 내에 주입했다.
샘플을 다양한 시점에 수집하고, 암 화학요법제의 산 불안정, 친유성 분자 결합체의 남은 퍼센트를 결합체의 가수분해로부터 방출된 화학요법제의 퍼센트와 함께 측정했다. 결과가 표 형식 및 그래프로 제시되어 있다.
혈장 중 미결합 ART 273 의 안정성:
마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 미결합 ART 273 의 내인성 안정성을 측정했다. 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 273 의 약 30%, 54%, 및 67% 가 남는 것으로 보인다.
표 4: 37 ℃ 의 혈장 중 ART 273 의 안정성
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
혈장 중 ART 273 결합체, ART 488 의 안정성
마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 ART 273 결합체, ART 488 의 내인성 안정성을 측정했다. 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 488 의 약 36%, 33%, 및 44% 가 남는 것으로 보인다. 또한 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 488 의 약 36%, 32%, 및 37% 에 등가인 ART 273 의 형성이 존재하는 것으로 보인다.
표 5: 37 ℃ 의 혈장 중 ART 488 의 안정성
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
지질 에멀전으로 첨가되었을 때 혈장 중 ART 273 결합체, ART 488 의 안정성:
마우스 및 인간 혈장 중 ART 273 결합체, ART 488 의 내인성 안정성을 측정했다. 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 488 의 약 89 % 및 88% 가 남는 것으로 보인다.
표 6: 지질 에멀전으로 첨가되었을 때 37 ℃ 의 혈장 중 ART 488 의 안정성
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
혈장 중 미결합 ART 198 의 안정성:
마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 미결합 ART 198 의 내인성 안정성을 측정했다. 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 198 의 약 26%, 30%, 및 34% 가 남는 것으로 보인다.
표 7: 37 ℃ 의 혈장 중 ART 198 의 안정성
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
혈장 중 ART 198 결합체, ART 489 의 안정성
마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 ART 198 결합체, ART 489 의 내인성 안정성을 측정했다. 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 489 의 약 34%, 34%, 및 66% 가 남는 것으로 보인다. 또한 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스, 랫트 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 489 의 약 35%, 32%, 및 20% 에 등가인 ART 198 이 존재하는 것으로 보인다.
표 8: 37 ℃ 의 혈장 중 ART 489 의 안정성
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
지질 에멀전으로 첨가되었을 때 혈장 중 ART 198 결합체, ART 489 의 안정성:
마우스 및 인간 혈장 중 ART 198 결합체, ART 489 의 내인성 안정성을 측정했다. 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 각각 마우스 및 인간 혈장 중 480 분 후 초기 ART 489 의 약 73% 및 77% 가 남는 것으로 보인다.
표 9: 지질 에멀전으로 첨가되었을 때 37 ℃ 의 혈장 중 ART 489 의 안정성
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
혈장 중 파클리탁셀 결합체, ART 467 의 안정성:
인간 혈장 중 파클리탁셀 결합체, ART 467 의 내인성 안정성을 측정했다. 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 인간 혈장 중 1440 분 후 초기 ART 467 의 약 41% 가 남는 것으로 보인다. 또한 임의의 특정 동력학 모델에 관계 없이 인간 혈장 중 1440 분 후 초기 ART 467 의 약 16% 에 등가인 파클리탁셀이 존재하는 것으로 보인다.
표 10: 37 ℃ 의 인간 혈장 중 ART 467 의 안정성
Figure pct00066
Figure pct00067
혈장에 첨가하기 전에 지질 에멀전 중 산 불안정, 친유성 분자 결합체 ART 488 및 ART 489 의 용해는 혈장 배지에 의한 가수분해에 대한 결합체의 안정성을 극적으로 향상시켰다 (표 11 에 요약되어 있음). 산 불안정, 친유성 분자 결합체가 지질 에멀전 중에 남고 인큐베이션의 혈장 상으로 유출되지 않았음이, 결합체로부터 자유 약물이 방출되지 않는 것으로부터 분명하다. 인큐베이션 중 탐지가능한 농도의 자유 약물이 관찰될 수 없었으며, 여기서 결합체는 인큐베이션 배지에 첨가하기 전에 먼저 지질 에멀전 중에 용해시켰다 (표 6 및 표 9 참조).
표 11: 지질 에멀전 중 혼입에 의한 약물 안정화
Figure pct00068
마우스 중 산 불안정, 친유성 분자 결합체의 최대 허용 용량 (MTD) 의 추정:
ART 198 및 273 및 그들 각각의 산 불안정, 친유성 분자 결합체 (각각, ART 489 및 ART 488) 의 스톡 용액을 에탄올 중에 제조한 후, 지질 에멀전 (인트라리피드) 으로 희석하고, 킬로그램 당 밀리그램 단위의 다양한 투여량으로 마우스에게 정맥내 주사했다. 동물을 30 일의 기간 동안 매일 독성 및/또는 사망의 징후에 대해 관찰했다. MTD 는 전체 30 일 관찰 기간 동안 투약된 마우스의 생존률로서 정의되었다.
ART 198 의 MTD 는 4.0+/- 1.0 ㎎/㎏ 으로 측정되었고; ART 273 의 MTD 는 1.0+/- 0.5 ㎎/㎏ 으로 측정되었고; ART 489 의 MTD 는 3.1+/- 1.0 ㎎/㎏ 으로 측정되었고; ART 488 의 MTD 는 4.0+/-0.5 ㎎/㎏ 으로 측정되었다.
ART 198 및 그것의 산 불안정, 친유성 분자 결합체 ART 489 에 대해 관찰된 MTD 의 유사성, 또는 ART 273 의 경우, ART 273 에 대해 약 1 ㎎/㎏ 으로부터 그것의 산 불안정, 친유성 분자 결합체 ART 488 에 대해 약 4 ㎎/㎏ 으로의 MTD 의 증가는 그들의 관찰된 시험관내 세포독성에 비추어 놀랍다. 시험관내 세포독성 평가에서, ART 273 의 산 불안정, 친유성 분자 결합체는 ART 273 보다 거의 10 배 (10X) 강력한 것으로 일상적으로 관찰된다. MTD 측정 결과는 암 화학요법제의 산 불안정, 친유성 분자 결합체가 감소된 독성으로 인해 환자 치료에 더욱 유익할 수 있음을 시사한다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1 , 1.1 또는 화학식 2 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체 (ALLMC) 및 이의 단리된 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 이의 혼합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00069

    [식 중:
    R 은 히드록실 포함 암 화학요법제이고;
    화학식 1 또는 1. 1 의 경우:
    R1 은 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고;
    R2 는 C5-C22 알킬이고;
    Y 는 O, NR' 또는 S 로부터 선택되고, 여기서 R' 은 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    Z 는 O 또는 S 이고;
    Q 는 O 또는 S 이고; T 는 O 또는 S 이고;
    화학식 2 의 경우:
    R2 는 C1-C22 알킬이고;
    T 는 O 또는 S 이고;
    X 는 수소 또는 메실레이트, 술포네이트 및 할로겐 (Cl, Br 및 I) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이탈기임].
  2. 제 1 항에 있어서, 식 중 하기와 같은 화학식 1 또는 1. 1 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체:
    식중,
    R 은 히드록실 포함 암 화학요법제이고;
    R1 은 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고;
    R2 는 C5-C22 알킬이고;
    Y 는 O 또는 S 이고;
    Z 는 O 이고;
    Q 는 O 이고; T 는 O 임.
  3. 제 1 항에 있어서, 식 중 하기와 같은 화학식 2 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체:
    식중,
    R2 는 C5-C22 알킬이고;
    T 는 O 이고;
    X 는 수소 또는 Cl, Br 및 I 로 이루어지는 군으로부터 선택됨.
  4. 제 1 항에 있어서, 하기 화학식 1a , 1b 또는 화학식 2a 를 포함하는 산에 불안정한 친유성 분자 결합체:
    Figure pct00070

    [식 중:
    R 은 히드록실 포함 암 화학요법제 (HBCCA) 이고;
    화학식 1a 또는 1b 의 경우:
    R1 는 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고;
    R2 는 C5-C22 알킬이고;
    화학식 2a 의 경우:
    R2 는 C1-C22 알킬이고;
    X 는 수소이거나 또는 Cl, Br 및 I 로 이루어진 군에서 선택됨].
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록실 포함 암 화학요법제가 탁산, 아베오-탁산, 캠프토테신, 에포틸론, 쿠쿠르비타신, 쿠아시노이드, 안트라시클린 및 이의 유사체 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 산에 불안정한 친유성 분자 결합체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록실 포함 암 화학요법제가 아클라루비신, 캠프토테신, 마소프로콜, 파클리탁셀, 펜토스타틴, 암루비신, 클라드리빈, 시타라빈, 도세탁셀, 엘리프티늄 아세테이트, 에피루비신, 에토포시드, 포름에스탄, 풀베스트란트, 겜시타빈, 이다루비신, 피라루비신, 토포테칸, 발루비신 및 빈블라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 산에 불안정한 친유성 분자 결합체.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 도 18, 도 19 및 도 20 에서의 화합물로부터 선택되는 산에 불안정한 친유성 분자 결합체.
  8. a) 단일 부분입체 이성질체의 형태의, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 치료적 유효량; 및 b) 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  9. 암 치료가 필요한 환자에게 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 암 치료 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 암이 백혈병, 신경아 세포종, 교아 세포종, 자궁경부암, 직장암, 췌장암, 신장암 및 흑색종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 암이 폐암, 유방암, 전립선암, 난소암 및 두경부암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-공액 히드록실 포함 암 화학요법제와 비교했을 때, 적어도 10% 내지 50% 감소된, 암 세포에 의해 발현된 저항도를 제공하는 방법.
  13. 환자에게 암 화학요법제의 투여와 연관된 화학요법의 부작용을 감소시키거나 실질적으로 제거하기 위한 방법으로서, 하기 화학식 1 , 1.1 또는 화학식 2 의 산에 불안정한 친유성 분자 결합체; 및 이의 단리된 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 또는 이의 혼합물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법:
    Figure pct00071

    [식 중:
    R 은 히드록실 포함 암 화학요법제이고;
    화학식 1 또는 1. 1 의 경우:
    R1 은 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고;
    R2 는 C5-C22 알킬이고;
    Y 는 O, NR' 또는 S 로부터 선택되고, 여기서 R' 은 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    Z 는 O 또는 S 이고;
    Q 는 O 또는 S 이고; T 는 O 또는 S 이고;
    화학식 2 의 경우:
    R2 는 C1-C22 알킬이고;
    T 는 O 또는 S 이고;
    X 는 수소 또는 메실레이트, 술포네이트 및 할로겐 (Cl, Br 및 I) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이탈기임].
  14. 제 13 항에 있어서, 더 높은 농도의 암 화학요법제를 환자의 암 세포에 제공하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 환자에 대한 비-공액 암 화학요법제의 투여와 비교했을 때, 높은 농도의 암 화학요법제를 적어도 5%, 10%, 20%, 또는 적어도 50% 로 암 세포에 전달하는 방법.
  16. 하기 화학식 3a 또는 3b 의 화합물:
    Figure pct00072

    [식 중:
    R1 은 수소, C1-C4 알킬 또는 C5-C22 알킬이고;
    R2 는 C5-C22 알킬이고;
    Y 는 O, NR' 또는 S 로부터 선택되고, 여기서 R' 은 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    Z 는 O 또는 S 로부터 선택되고;
    Q 는 O 또는 S 이고; T 는 O 또는 S 임].
  17. 제 16 항에 있어서, 식중 하기와 같은 화합물:
    R1 은 수소 또는 C1-C4 알킬이고;
    R2 는 C5-C22 알킬이고;
    Y 는 O 또는 S 이고;
    Z 는 O 이고;
    Q 는 O 이고; T 는 O 임.
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