CN103763928A - 癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性前体药物 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性分子偶联物和用于减少或基本上消除与向需要其的患者给予癌症化疗剂相关联的化疗的副作用的方法。

Description

癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性前体药物
相关申请的引用
本申请要求于2011年6月6日提交的美国临时申请号US61/493,827和于2011年6月13日提交的美国临时申请号US61/496,367的权益，它们的全部内容都通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体涉及用于治疗患者的化合物和方法。更具体地，本发明涉及的是用于在癌症治疗中使用的分子偶联物（molecular conjugate）。具体地，本发明涉及酸不稳定的、亲脂性偶联物、在其形成中有用的方法和中间产物，以及使用其治疗患者的方法。
背景技术
目前市场上存在许多用于治疗各种癌症的抗癌药物。例如，紫杉醇和多西他赛是用于治疗乳腺癌和卵巢癌的两种有前景的抗癌药物，并且它们有希望用于治疗各种其他癌症如皮肤癌、肺癌、头颈部癌。正在开发或测试用于治疗这些和其他癌症的其他有前景的化疗药剂。化合物如紫杉醇、多西他赛（多西紫杉醇）及其他紫杉烷类、喜树碱类、埃博霉素类和苦木素类、以及表现出癌症治疗方面疗效的其他化合物引起了相当大的兴趣。令人特别感兴趣的是在体外和体内表现出抗癌活性的天然产物药物以及它们的合成类似物。
然而，许多确定的抗癌化合物在它们于化疗方案中的应用方面存在许多困难。此类化疗剂在疾病治疗方面应用的一个主要问题是难以在对正常、健康组织没有不利影响的条件下靶向癌症组织。例如，紫杉醇通过阻断有丝分裂和细胞分裂过程来发挥其抗肿瘤活性，有丝分裂和细胞分裂在癌症细胞中比在正常细胞中更加频繁。尽管如此，接受化疗治疗的患者可能经历与正常、健康的细胞中有丝分裂的中断相关联的各种副作用。
能够在不伤害身体中其他细胞的情况下选择性地杀死癌症细胞的靶向癌症治疗将代表在临床治疗癌症方面的重大改进。在1958年以来的文献中，已经出现了使用抗体的靶向药物的报道。通过偶联至抗体以选择性递送至癌症细胞的靶向药物由于大尺寸的抗体（MW=125至150千道尔顿）以及由此它们相对不能穿透固体肿瘤的原因而具有有限的成功。
一种替代的策略包括使用较小的靶向配体和肽，其识别肿瘤细胞独特的或在肿瘤细胞上过表达的特异性受体作为靶向载体。此类构建体具有2-6千道尔顿的分子量，这使得它们容易渗透整个实体肿瘤。
因此，高度期望开发出用于在癌症治疗方案中以化疗剂直接靶向癌症细胞中使用的新的化合物和方法。这反过来可以引起降低或消除毒副作用、更有效地将药物递送至靶部位和减少给予的药物的剂量并由此降低对健康细胞的毒性和化疗方案的成本。
一个特别让人感兴趣的方法是使用已经被偶联到肿瘤分子的抗癌药物部分（moiety）。例如，Safavy的US6,191,290讨论了形成和应用偶联到能够结合至肿瘤细胞表面受体的受体配体肽的紫杉烷部分。Safavy特别指出此类受体配体肽可以是韩蛙皮素（铃蟾肽，bombesin）/胃泌素-释放肽（BBN/GRP）受体-识别肽（BBN[7-l3]）、促生长素抑制素受体-识别肽、表皮生长因子受体-识别肽、单克隆抗体或受体识别性碳水化合物。
合成这些药物分子偶联物的一个重要方面是使用一个或多个接头将这两种单元连接在一起以提供具有所需特性和生物活性的偶联物，特别是体循环中稳定但一旦内化于癌症细胞中或一旦富集于酸性肿瘤环境中即释放细胞毒性剂的偶联物。预计这种药剂将表现出对正常组织的低毒性。所得到的偶联物也应当足够稳定直到其达到靶标组织，并因此最大化其具有对正常、健康组织降低的毒性的靶向效应。
血脑屏障（BBB）是使脑与体循环隔离的专门的物理和酶学屏障。BBB的物理部分由以紧密结合（tight junction）布置的复杂系统的内皮细胞组成，其抑制任何明显的旁细胞运输（paracellular transport）。BBB基于脂溶性、分子大小和电荷选择性地排斥物质胞吞转运行使扩散抑制功能，从而产生药物递送至大脑的问题。由于存在高浓度的药物外排转运蛋白（例如，P-糖蛋白、多重耐药性蛋白、乳腺癌耐药蛋白）跨越BBB的药物递送存在进一步的问题。甚至在药物分子跨越进入大脑之前，这些转运蛋白活跃地从内皮细胞的细胞质中去除药物分子。
目前在脑恶性肿瘤的治疗中使用的药物递送方法一般为非特异性的且效率不高。治疗脑部疾病时要考虑的另外一个问题是药物在其赋形剂（vehicle）内跨越肿瘤或受影响的组织。在大多数情况下，目前用于将药物如此递送到大脑的赋形剂的尺寸以及其他生理性特征限制了药物的有效扩散通过病变组织。缺乏有效的药物扩散影响了治疗的疗效。
已经广泛的研究了将肽作为载体分子用于将药物递送到大脑中，希望它们能够被采用作为药物递送赋形剂。然而，由于肽的有限的生物利用度，它们是有问题的。尽管已经广泛地研究了增加此类分子的生物利用度的方法，但是它们充其量仅带来了适度的成功。
增加的细胞增殖和生长是癌症的标志。细胞增殖的增加与细胞中的胆固醇的高周转率相关。需要胆固醇用于膜合成和生长的细胞可通过受体介导的血浆低密度脂蛋白（LDL）的胞吞作用或通过从头合成（de novosynthesis）来获取胆固醇，LDL为血液中胆固醇的主要转运蛋白。
LDL被已知为LDL受体（LDLR）的受体摄取到细胞中；LDL和该受体一起被胞吞并被运输至细胞的核内体（endosome）中。核内体被酸化并从而由LDL释放出LDL受体；LDL受体再循环至表面，在该表面上其再参与LDL颗粒的额外摄取。有大量证据表明，各种组织中的肿瘤具有对LDL的高需要，其需求高到血浆LDL被耗尽的程度。认为LDL输入至癌细胞的增加是由于这些肿瘤中升高的LDL受体（LDLR）所引起的。已知一些肿瘤表达高量的LDLR，包括一些形式的白血病、肺肿瘤、结直肠肿瘤和卵巢癌。
正常的脑组织与恶性的脑组织的比较研究已经显示LDLR与恶性的和/或快速增长的脑细胞和组织相关的高度倾向。一些研究表明，快速增长的脑细胞（如在早期发育阶段和在侵蚀性地增长的脑肿瘤中看到的那些）由于它们对胆固醇的增加的需求而表现出LDLR的增加的表达。
其中，有问题的且低效治疗的脑癌是多形性成胶质细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）。此种毁灭性的脑肿瘤是100%致命的。另外，超过85%的与总原发性脑癌相关的死亡是由于GBM导致的。目前的治疗方法依赖于包括神经外科手术、放疗和化疗的多式联运方式（multimodal approach）。即使是使用这些方式的最佳成果也仅中等地增加患有这种肿瘤的患者的存活时间。
作为最高恶性肿瘤性的胶质瘤，GBM以不受控制的、活跃的细胞增殖和对常规疗法的普遍耐受性为特征。培养中的GBM细胞具有高数目的低密度脂蛋白受体（LDLR）。由于这种受体在神经细胞和正常的神经胶质细胞中几乎不存在，因此其代表了用于递送治疗剂如细胞毒素或放射性药物的理想靶标。改善现有的治疗方法或开发新的治疗方法的努力都没有取得成功，并且治疗恶性胶质瘤的成果仅为中等的、充其量是约10个月的中位存活时间。
与具有很少LDL受体的正常脑细胞不同，培养中的GBM细胞在它们的表面上具有高数目的LDL受体。由于癌性组织的高度增生性和对胆固醇周转的高需求，其他癌症细胞同样也可以具有高表达的LDLR。这提示LDL受体是GBM和其他恶性肿瘤中用于通过LDL颗粒递送抗肿瘤药物的潜在的独特分子靶标。
Figure BDA0000432398950000041
及其同事已经证明被称为LDE的富胆固醇微乳液或纳米颗粒制剂在被注入到血流中后富集在癌组织中（D.G.Rodrigues,D.A.Maria,D.C.Fernandes,C.J.Valduga,R.D.Couto,O.C.Ibanez和R.C.
Figure BDA0000432398950000042
Improvement of paclitaxel therapeutic index by derivatization and associationto a cholesterol-rich microemulsion:in vitro and in vivo studies.CancerChemotherapy and Pharmacology55:565-576(2005)）。将与LDE相关联的紫杉醇亲脂性衍生物的细胞毒性、药代动力学、对动物的毒性以及治疗作用与商用紫杉醇进行了比较。结果显示LDE-紫杉醇油酸酯是稳定的。由于在商业制剂中使用的赋形剂Cremophor EL（聚氧乙烯蓖麻油）的细胞毒性，与商用紫杉醇相比，复合物中药物的细胞增殖抑制活性降低。
Figure BDA0000432398950000043
及其同事发现LDE-紫杉醇油酸酯是稳定的复合物，并且与紫杉醇相比，毒性大大降低而活性得到了增强，这可以在临床应用中带来改善的治疗指数。
捕捉通过癌症组织过表达的LDL受体及由此而来的从体循环中对LDL颗粒的高摄取而向该癌症组织选择性且特异性地递送化疗化合物的巨大潜力，要求癌症化疗剂具有高亲脂性以便保持被俘获于LDL颗粒的脂质核中且不扩散到血浆中以导致由将正常组织暴露于药剂而带来毒副作用。另外，一旦带有其化疗有效负载的LDL颗粒通过LDL受体介导的摄取进入癌症细胞至核内体的酸性环境中，该LDL受体即与LDL颗粒解离并被再循环至细胞表面，并且LDL颗粒将其脂质内容物及其亲脂性化疗剂释放至核内体的酶和酸性环境中。很少有癌症化疗剂固有地具有足够的亲脂性以被充分地保留在LDL颗粒的脂质核中。这就产生了对癌症化疗剂的适合的亲脂性衍生物的需求，这些亲脂性衍生物在正常体循环中具有高稳定性并且高度保留于LDL颗粒的脂质核中，但在核内体的酸性环境中很容易释放活性化疗剂。本发明的化合物解决了这种需求。
定义：
在本文中，单独或以组合使用的术语“烷基”，是指具有1至22个碳原子的可选取代的直链烷基或支链烷基（例如C1-C22烷基或C1-22烷基）。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、叔戊基、戊基、己基、庚基、辛基等。在某些实施方式中，烷基基团，如C1-C22烷基或C5-C22烷基，也可以包括在烷基基团中的一个或多个双键，并且也可以是指C1-C22烯基或C5-C22烯基基团。
单独或以组合使用的术语“烯基”，是指具有一个或多个碳-碳双键并且具有2至约22个碳原子的可选地取代的直链烃基或支链烃基。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、1,4-丁二烯基等。
术语“烷氧基”是指烷基醚基，其中术语烷基如上所限定。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。
术语“非对映异构体”是指在包含两个以上不对称碳原子的化合物中出现的四种以上异构体中的任何一组。彼此之间为立体异构体但不是对映体的化合物称为非对映异构体。
本文中使用的词组“保护基团”是指临时取代基，其保护潜在的反应性官能团免于不期望的化学转化。这类保护基团的实例包括羧酸的酯、醇的甲硅烷基醚、以及醛和酮各自的缩醛和缩酮。已经综述了保护基化学（Greene,T.W.;Wuts,P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis,4thed.;Wiley:New York,2007）。用于保护羟基的示例性的甲硅烷基团包括TBDMS（叔丁基二甲基甲硅烷基）、NDMS（2-降冰片基二甲基甲硅烷基）、TMS（三甲基甲硅烷基）和TES（三乙基甲硅烷基）。示例性的NH-保护基团包括苄氧基羰基、叔丁氧基羰基和三苯基甲基。
可以互换使用的术语“紫杉烷类”、“紫杉烷衍生物”和“紫杉烷类似物”等是指与由短叶红豆杉（Taxus brevifolia）（即短叶紫杉（Pacific yew））直接衍生的或半合成的一类抗肿瘤剂有关的化合物。这类紫杉烷类的实例包括紫杉醇和多西他赛和它们的天然的及它们的合成的或半合成的衍生物。
本文中使用的“药用赋形剂”或“药用盐”是指本文中所公开的化合物的赋形剂或盐，它们是药用的并提供了所需的药理活性。这些赋形剂和盐包括与无机酸，如盐酸、氢溴酸、磷酸等，形成的酸加成盐。盐也可以是与有机酸，如乙酸、丙酸、己酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、苯甲酸等，形成的。
“治疗有效量”是指引起本说明书中所列举的任何生物效应的药物量。
发明内容
在一个实施方式中，提供了新的且有用的带羟基的癌症化疗剂（HBCCA）的分子偶联物的组合物。在另一个实施方式中，提供了在治疗癌症中使用的癌症化疗剂的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物的组合物。在另一个实施方式中，提供了用于形成在治疗癌症中使用的分子偶联物，如酸不稳定的、亲脂性前体药物偶联物的中间化合物。在另一个实施方式中，提供了用于制备酸不稳定的、亲脂性药物偶联物的高效方法。在另一个实施方式中，提供了向患者给药化疗剂的方法，其减少或基本上消除了癌症患者传统上经受的副作用。在另一个实施方式中，提供了将化疗剂富集于患者的癌症细胞中的方法。
在一个实施方式中，提供了一种式1、式1.1或式2的酸不稳定的亲脂性分子偶联物（ALLMC）、和它们的分离的对映体、非对映异构体或它们的混合物、或它们的药用盐：
Figure BDA0000432398950000071
其中：R是带有羟基的癌症化疗剂；对于式1或式1.1，R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2是C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'是氢或C1-C6烷基；Z是O或S；Q是O或S；且T是O或S；对于式2：R2是C1-C22烷基；T是O或S；且X是氢或选自由甲磺酸酯、磺酸酯和卤素（Cl、Br和I）组成的组中的离去基团。化合物1.1包括纯顺式异构体、纯反式异构体以及顺式异构体和反式异构体的混合物和它们的非对映异构体。
在另一个实施方式中，提供了上述式1或1.1的酸不稳定的亲脂性分子偶联物，其中：R是带有羟基的癌症化疗剂；R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2是C5-C22烷基；Y是O或S；Z是O；Q是O；且T是O。在一方面，式2的酸不稳定的亲脂性分子偶联物其中：R2是C5-C22烷基；T是O；且X是氢或选自由Cl、Br和I组成的组中。在另一种变化方案中，R2是C9-C22。在另一方面，上述酸不稳定的亲脂性分子偶联物包含式1a、式1b或式2a：
Figure BDA0000432398950000072
其中：R是带有羟基的癌症化疗剂（HBCCA）；
对于式1a或式1b，R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；且R2是C5-C22烷基；和
对于式2a：R2是C1-C22烷基；且X是氢或选自由Cl、Br和I组成的组中。在式1a或1b的碳酸酯（即-OC(O)O-）的化合物的一个变化方案中，该化合物是式1a的相应磺酸酯（即-OS(O)O-），其中由磺酸酯基团取代碳酸酯基团。化合物1b包括纯顺式异构体、纯反式异构体和顺式和反式异构体的混合物、以及它们的非对映异构体。
在式1、式2、式1a和式2a的化合物的另一个变化方案中，R1是氢或C1-C4烷基或C5-C22烷基，而R2是不饱和脂肪酸的碳残基，如选自由二十碳烯酸（包括顺式异构体、反式异构体和异构体的混合物）的C19残基、油酸的C17残基和反油酸的C17残基所组成的组中的碳残基。如本文中所使用的脂肪酸的“碳残基”（例如C17残基、C19残基等）是指排除羧基碳的脂肪酸的碳链。
在上述酸不稳定的亲脂性分子偶联物的另一方面，带有羟基的癌症化疗剂选自由紫杉烷类、abeo-紫杉烷类、喜树碱类、埃博霉素类、葫芦素类、苦木素类（quassinoids）、蒽环类药物类和它们的类似物及衍生物所组成的组中。在上述酸不稳定的亲脂性分子偶联物的另一方面，带有羟基的癌症化疗剂选自由阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、吉西他滨、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、伊达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春花碱所组成的组中。在上述酸不稳定的亲脂性分子偶联物的另一方面，偶联物选自图18、图19和图20中的化合物。另一个变化方案中，基团-ALL1、-ALL2、-ALL3…至-ALLn中只有一个是-ALL基团并且其他是氢。在另一个变化方案中，基团-ALL1、-ALL2、-ALL3…至-ALLn中的两个是-ALL基团。
在另一个实施方式中，提供了药物组合物，其包含：a)治疗有效量的单一的非对映异构体形式的上述化合物；和b)药用赋形剂。在另一方面，药物组合物适于口服给予；或作为适于肠胃外给予的液体制剂。在另一方面，组合物适用于通过选自由口服、非肠道、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、肌内、直肠内、鼻内、脂质体、皮下和鞘内所组成的组中的途径给予。在另一个实施方式中，提供了用于治疗患者中癌症的方法，包括向需要此种治疗的患者给予治疗有效量的化合物或上述化合物或任何上述化合物的组合物或组合物。在该方法的一个方面，癌症选自由白血病、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌和黑素瘤所组成的组中。在该方法的另一方面，癌症选自由肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和头颈部癌所组成的组中。在该方法的另一方面，与非偶联的带有羟基的癌症化疗剂相比，该方法提供了至少10%、20%、30%、40%或至少50%降低程度的由癌症细胞表达的抗药性。
在另一个实施方式中，提供了用于减少或基本上消除与向患者给予癌症化疗剂相关联的化疗的副作用的方法，该方法包括向患者给予治疗有效量的式1、式1.1或式2的酸不稳定的亲脂性分子偶联物和它们分离的对映体、非对映异构体或它们的混合物：
其中：R是带有羟基的癌症化疗剂；对于式1或式1.1：R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2是C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'是氢或C1-C6烷基；Z是O或S；Q是O或S；并且T是O或S；对于式2：R2是C1-C22烷基；T是O或S；并且X是氢或选自由甲磺酸酯、磺酸酯和卤素（Cl、Br和I）的组成的组中的离去基团。化合物1.1包括纯的顺式异构体、纯的反式异构体以及顺式异构体和反式异构体的混合物、和它们的非对映异构体。在上述的一个变化方案中，R2是C9-C22烷基。在一个方面，该方法在患者的癌症细胞中提供更高浓度的癌症化疗剂。在另一方面，当向患者给予非偶联的癌症化疗剂相比时，该方法在癌症细胞中递送高出至少5%、10%、20%、30%、40%或至少50%浓度的癌症化疗剂。
在另一个实施方式中，提供了式3a或式3b的化合物：
Figure BDA0000432398950000092
其中：R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；R2是C5-C22烷基；Y选自O、NR'或S，其中R'是氢或C1-C6烷基；Z选自O或S；Q是O或S；并且T是O或S。在该化合物的另一方面，R1是氢或C1-C4烷基；R2是C5-C22烷基；Y是O或S；Z是O；Q是O；并且T是O。当使活化的式3a或式3b的化合物与带羟基的癌症化疗剂（HBCCA）缩合时，活化的化合物可以被用来制备酸不稳定的亲脂性偶联物。如本文所定义的，在式1、式1a、式1b、式1.1、式2和式2a中一般用残基或基团“R”表示HBCCA，例如，并且其中在HBCCA未偶联以形成酸不稳定的亲脂性分子偶联物时，那么HBCCA也可一般性地表达为具有式“R-OH”，原因在于HBCCA可以由一个或多个羟基（-OH）基团官能化。类似地，可以与HBCCA缩合以形成酸不稳定的亲脂性分子偶联物的该酸不稳定的、亲脂性基团（即，活化的化合物的“-ALL”基团）一般表示为“R-O-ALL”。因此，当多于一个-ALL基团与HBCCA基团缩合或偶联时，那么每个-ALL基团可以被独立地指定为-ALL1、-ALL2、-ALL3…至-ALLn，其中n是可以与-ALL基团偶联或偶合的癌症化疗剂上的可用羟基的数目。作为式1和式2的化合物的实例，例如HBCCA和-ALL基团被指定为如下所示。
Figure BDA0000432398950000101
酸不稳定的、亲脂性分子偶联物（ALLMC）的实例描绘如下，其中HBCCA基团是具有两个-ALL基团的紫杉醇：
Figure BDA0000432398950000102
在上述紫杉醇的酸不稳定的分子偶联物的代表性实例中，-ALL1和-ALL2各自独立地是氢或本文中所定义的-ALL基团。对于具有多于一个羟基的HBCCA基团来说，难以接近的羟基或不能形成酸不稳定的亲脂性基团的羟基，那么该处指定为-ALL基团的基团为氢。
在另一个实施方式中，提供了生产在治疗癌症患者中使用的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物的方法。在一方面，该方法包括使丙酮缩甘油（solketal）（2,2-二甲基-4-羟甲基-1,3-二氧杂环戊烷）与醛或酮反式缩酮化以形成式4的化合物。化合物4可以与酸卤化物（其中X是卤化物）缩合以形成式3的化合物。在式3的化合物的一个变化方案中，可以由离去基团如2-卤代-苯氧基、2,4-卤代-苯氧基、2,4,6-三卤代-苯氧基、2,6-二卤代-苯氧基替代对硝基苯氧基，其中卤代选自氟代、氯代、溴代或碘代。
3与HBCCA（R-OH）的缩合提供癌症化疗化合物1的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物，其中R、R1和R2如本文所限定。
Figure BDA0000432398950000111
在另一个实施方式中，提供了制备式2a的化合物的方法，包括HBCCA与烯醇醚或乙烯基醚的缩合反应以形成式2a的化合物：
Figure BDA0000432398950000112
其中R-OH是HBCCA，R3是C2-C23烷基，并且X是氢或选自Cl、Br或I的卤素。
在另一个实施方式中，提供了使用在类似于LDL颗粒或“伪-LDL颗粒”的纳米微粒化脂质乳液中的本发明的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物使癌症化疗剂集中在患者的选定的靶细胞中的方法。在另一个实施方式中，该方法包含向患者给予选定剂量的治疗有效量的、溶解于伪-LDL颗粒的脂质核中的癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性分子偶联物。
上述实施方式中还包括的方面和变化方案是氨基酸如精氨酸等的盐、葡糖酸盐和半乳糖醛酸盐。一些本发明的化合物可以形成内盐或两性离子（Zwitterion）。某些本发明的化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合物形式，并且也在本发明的范围之内。某些上述化合物也可以以一种或多种固体相或晶体相或多晶形物存在，此类多晶形物或此类多晶形物的混合物的可变的生物学活性也包括在本发明的范围内。还提供的是包含药用赋形剂和治疗有效量的至少一种本发明化合物的药物组合物。
本发明的化合物或它们的衍生物的药物组合物可以配制为用于胃肠外给予的溶液或冻干粉末。在使用之前，可以通过添加合适的稀释剂或其他药用载体以重构粉末。通常液体制剂是缓冲的等渗的水溶液。合适的稀释剂的实例是标准等渗盐水溶液、5%右旋糖水溶液或缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。此类制剂特别适合于肠胃外给予但也可以用于口服给予。也可以添加赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯树胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠或柠檬酸钠。可替代地，这些化合物可以被胶囊化、片剂化或制备为用于口服给予的乳剂或糖浆。可以添加药用固体或液体载体以增强或稳定该组合物、或促进组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇或水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酼钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。载体也可以包括缓释材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯（单独使用或与蜡组合使用）。固体载体的量可以变化但优选的是每剂量单位为约20mg至约1g。依照药物的常规技术来制得药物制剂，包括对于片剂形式根据需要的碾磨、混合、制粒和压片；或者，对于硬明胶胶囊形式的研磨、混合和填充。当使用液体载体时，制剂将是糖浆剂、酏剂、乳剂或水或非水悬浮剂的形式。此类液体制剂可以直接口服（p.o.）给予或填充于软明胶胶囊中。可以在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,A.Gennaro,ed.,20th edition,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.中找到适合于各种这些给予方法的制剂。
当结合附图和照片考虑本发明的以下示例性实施例的详细描述时，本发明的这些和其他目的将变得更加容易领会和理解。本申请自始至终所列举的所有文献的全部公开内容都通过引用并入本文。
附图说明
图18、图19和图20描述了代表性的酸不稳定的亲脂性分子偶联物。
具体实施方式
可以采用下列步骤用于制备本发明的化合物。在制备这些化合物中使用的起始原料和试剂亦或可获自商业供应商如Aldrich Chemical Company(Milwaukee,Wis.)、Bachem(Torrance,Calif.)、Sigma(St.Louis,Mo.)，亦或通过本领域普通技术人员所熟知的方法，依照参考文献如Fieser andFieser's Reagents for Organic Synthesis,vols.1-17,John Wiley and Sons,New York,N.Y.,1991；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds,vols.1-5andsupps.,Elsevier Science Publishers,1989；Organic Reactions,vols.1-40,JohnWiley and Sons,New York,N.Y.,1991；March J.:Advanced OrganicChemistry,4th ed.,John Wiley and Sons,New York,N.Y.；和Larock:Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers,New York,1989中所描述的步骤制得。
在一些情况下，可以引入保护基团并最后移除。在Greene et al.,Protective Groups in Organic Synthesis,Second Edition,John Wiley and Sons,New York,1991中描述了适合于氨基、羟基和羧基的保护基团。可以通过使用许多不同的试剂例如，如在Larock:Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers,New York,1989中所描述的试剂来完成标准的有机化学反应。
用于合成癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性分子偶联物的一般步骤。
形成活化的中间产物化合物：
可以根据本文中公开的一般方法来制备适合用于形成癌症化疗剂的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物的化合物。在一方面，使丙酮缩甘油在酸催化和有机溶剂的存在下与烷基醛或二烷基酮反应以分别形成醛丙酮缩甘油（缩醛）（aldehyde solketal(acetal)）衍生物或酮丙酮缩甘油（缩酮）衍生物。根据本方法，可以制备5元和6元环状缩醛，并且可以通过色谱法分离为其基本纯的形式。在一个方面，溶剂是甲苯并且反应在升高的温度如约60℃至80℃下进行。随后通过在碱催化存在下与酸卤化物如氯甲酸4-硝基苯基酯的反应，使缩醛或缩酮丙酮缩甘油衍生物活化以形成相应的活化衍生物，如式3的碳酸4-硝基苯基酯中间产物化合物。在一方面，碳酸4-硝基苯基酯中间产物可以与HBCCA缩合以形成酸不稳定的、亲脂性分子偶联物。
Figure BDA0000432398950000141
在另一方面，使丙酮缩甘油首先在碱催化存在下与酸卤化物如氯甲酸4-硝基苯基酯反应以形成丙酮缩甘油硝基碳酸酯（solketal nitrocarbonate），其随后在酸催化和有机溶剂存在下与烷基醛或二烷基酮反应以分别形成式3的醛丙酮缩甘油（缩醛）衍生物或酮丙酮缩甘油(缩酮)衍生物。在一方面，溶剂是甲苯并且反应在RT（室温）下进行。在一方面，该碳酸4-硝基苯基酯中间产物可以与HBCCA缩合以形成相应的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物。
在另一方面，醇，如硬脂醇，在过渡金属催化剂（如[Ir(cod)Cl]2）和碱性添加剂（如Na2CO3）存在下与乙酸乙烯酯反应以形成相应的乙烯基醚。在一方面，溶剂为甲苯且反应在100℃下进行。在一方面，乙烯基醚衍生物可以与HBCCA缩合以形成相应的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物。
用于合成癌症化疗剂的另一种酸不稳定的亲脂性分子偶联物的一般步骤：
在一个实施方式中，HBCCA可以在室温（RT）下，在碱（如催化量的N,N-二甲基-4-氨基吡啶（DMAP）和吡啶）存在下，在有机溶剂（如二氯甲烷（DCM））中与碳酸4-硝基苯基酯化合物反应，以形成所需的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物。
如下列线路中所示的，通过使用衍生自相应的天然脂肪酸的醛处理丙酮缩甘油、随后通过与氯甲酸4-硝基苯基酯反应，已经获得了初始合成的活化的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物中间产物。
Figure BDA0000432398950000152
线路：合成亲脂性碳酸酯分子偶联物中间产物：早期方法
然而，该方法导致形成5-元和6元偶联物以及它们的相应顺式/反式异构体。尽管5-元和6元缩醛都可以作为亲脂性偶联物的前体，但是在缩醛形成步骤中分离出3组区域异构体和立体异构体。在一个实施方式中，通过色谱法可以分离得到基本纯形式的所需缩醛。如下示出用于制备5-元缩醛的可替代的反应顺序。该路径提供了5-元缩醛并且提供了获取各种候选化疗剂的亲脂性偶联物的方法。使用带羟基的癌症化疗剂进一步处理活化的碳酸酯中间产物以产生相应的目标酸不稳定的、亲脂性分子偶联物前体药物。
Figure BDA0000432398950000161
线路：合成亲脂性碳酸酯分子偶联物和前体药物：修改的方法
可以通过在DCM中在卤化剂（如NXS，如N-溴代琥珀酰亚胺（NBS））的存在下使HBCCA与烷基乙烯基醚反应来形成癌症化疗剂的可替代的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物。在一方面，在低温如约-78℃下将反应物混合于溶液中，搅拌反应并使其缓慢地温热到RT。
Figure BDA0000432398950000162
可以在酸催化剂（如对-甲苯磺酸盐吡啶鎓（PPTS））存在下使HBCCA与高级烷基乙烯基醚（衍生自天然脂肪酸）反应形成癌症化疗剂的其他可替代的酸不稳定的亲脂性分子偶联物。在一方面，在RT下将反应物混合于溶液中以合成相应的酸不稳定的亲脂性缩醛前体药物。
形成酸不稳定的亲脂性偶联物：
方法A：将式3的碳酸4-硝基苯基酯-丙酮缩甘油偶联物（0.21mmol）的无水二氯甲烷（1ml）溶液加入到HBCCA（0.2mmol）和DMAP（0.3mmol）的无水二氯甲烷（2ml）溶液中，并且在氮气气氛（N2）下在RT下搅拌该反应混合物。通过TLC/HPLC监测反应进度，完成后，用二氯甲烷（DCM）稀释该反应混合物，用NH4Cl（s）、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。通过硅胶快速色谱法（SGFC）纯化粗品残余物以获得偶联的前体药物。
方法B：在N2下在-15°下，向烷基乙烯基醚（1.2mmol,6eq.）和HBCCA（0.2mmol,1eq.）的无水DCM（8mL,0.025M）溶液中加入NBS（1mmol,5eq.）。在-15℃至0℃下搅拌反应混合物，并且通过TLC/HPLC监测反应进度。完成后，用DCM稀释反应混合物，并且用NaHCO3（饱和的）、水和盐溶液洗涤。用硫酸钠干燥有机层并蒸发。通过SGFC纯化粗品残余物以获得偶联的前体药物。
方法C：向烷基乙烯基醚（1.2mmol,6eq.）和HBCCA（0.2mmol,1eq.）的无水DCM（8mL,0.025M）溶液中加入PPTS（0.02mmol,10mol%），并且在N2下在RT下搅拌反应混合物。通过TLC/HPLC监测反应进度。完成后，用DCM稀释反应混合物，并且用NaHCO3（饱和的）、水和盐溶液洗涤。用硫酸钠干燥有机层并蒸发。通过SGFC纯化粗品残余物以获得偶联的前体药物。
表征酸不稳定的亲脂性偶联物：
通过HPLC和高分辨质谱的组合表征酸不稳定的亲脂性偶联物。给出了每种化合物的具体情况。
制备ART449
在N2下在RT下，将二十二碳六烯酸醇的碳酸4-硝基苯基酯（0.5g）的无水DCM溶液加入到ART273（0.522g）和DMAP（0.140g）的无水DCM(18mL)溶液中，并且搅拌。完成后，用DCM稀释反应物，用饱和氯化铵溶液（NH4Cl（s））、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。通过硅胶纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART449。-TOF MS:m/z1003.4859(M+CF3CO2)-
Figure BDA0000432398950000171
制备ART448
在N2下在RT下，将5-己烯-1-醇的碳酸4-硝基苯基酯（0.1g）的无水DCM溶液加入到ART273（0.207g）和DMAP（0.051g）的无水DCM(5mL)溶液中。完成后，用DCM稀释反应物，用NH4Cl（s）、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。在硅胶上纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART448。-TOF MS:m/z789.2928(M+CF3CO2)-
Figure BDA0000432398950000181
制备ART473
在N2下在-78℃下，将环己基乙烯基醚（0.24mL）加入到ART273（0.230g）和NBS（0.282g）的无水DCM（5mL）溶液中。完成后，将溶液蒸发并且在硅胶上纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART473。
Figure BDA0000432398950000182
制备ART471
在N2下在-78℃下，将叔丁基乙烯基醚（0.24mL）加入到ART273（0.250g）和NBS（0.307g）的无水DCM（5mL）溶液中。完成后，将溶液蒸发并且在硅胶上纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART471。
Figure BDA0000432398950000183
制备ART472
在N2下在-78℃下，将十八烷基乙烯基醚（0.448g）加入到ART273（0.208g）和NBS（0.255g）的无水DCM（5mL）溶液中。完成后，将溶液蒸发并且在硅胶上纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART472。
制备ART470
在N2下在-78℃下，将乙烯基乙醚（0.11mL）加入到ART273（0.150g）和N-溴代琥珀酰亚胺（NBS,0.170g）的无水DCM（5mL）溶液中。完成后，将溶液蒸发并且在硅胶上纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART470。
Figure BDA0000432398950000192
制备ART489
在N2下在RT下，将十八烷基丙酮缩甘油-4-硝基苯基碳酸酯（0.750g）的无水DCM溶液加入到ART198（0.754g）和DMAP（0.238g）的无水DCM（30mL）溶液中。完成后，用DCM稀释反应物，用NH4Cl（s）、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。在硅胶上纯化粗品残余物，得到固体ART489。-TOF MS:m/z1031.4645（M+CF3CO2）-
Figure BDA0000432398950000193
制备ART488
在N2下在RT下，将十八烷基丙酮缩甘油-4-硝基苯基碳酸酯（0.53g）的无水DCM溶液加入到ART273（0.507g）和DMAP（0.168g）的无水DCM（30mL）溶液中。完成后，用DCM稀释反应物，用NH4Cl（s）、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。在硅胶上纯化粗品残余物，得到固体ART488。-TOF MS:m/z10034994（M+CF3CO2）-
Figure BDA0000432398950000201
制备ART332
在N2下在RT下，将丙酮缩甘油-4-硝基苯基碳酸酯（1.1g）的无水DCM溶液加入到ART273（1.30g）和DMAP（0.36g）的无水DCM（30mL）溶液中。完成后，用DCM稀释反应物，用NH4Cl（s）、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。在硅胶上纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART332。-TOF MS:m/z947.4601（M+CF3CO2）-
Figure BDA0000432398950000202
制备ART441
在N2下在RT下，顺序地将DHA（0.2g）、DCC（0.157g）和DMAP（0.006g）加入到ART273（0.279g）的无水DCM（10mL）溶液中。完成后，用DCM稀释反应物，用NH4Cl（s）、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。在硅胶上纯化粗品残余物，得到为白色固体的ART441（0.2g）。
Figure BDA0000432398950000211
制备ART467
在N2下在RT下，将十八烷基丙酮缩甘油-4-硝基苯基碳酸酯（1.75g）的无水DCM溶液加入到紫杉醇（2.59g）和DMAP（0.557g）的无水DCM（30mL）溶液中。完成后，用DCM稀释反应物，用NH4Cl（s）、水和盐水洗涤。分离有机层，用硫酸钠干燥并蒸发。在硅胶上纯化粗品残余物，以得到为白色固体ART467。-TOF MS:m/z1306.5445（M+CF3CO2）-
制备ART151
按照方法A中描述的步骤制备ART151。HPLC保留时间为6.06，方法：紫杉烷偶联物_MKG4（C18柱，MeOH/H2O/THF95/3/2至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，14min）。+TOFMS:m/z1239.6523[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000213
制备ART152
按照方法B中描述的步骤制备ART152。HPLC保留时间为8.21，方法：紫杉烷偶联物MKG4（C18柱，MeOH/H2O/THF95/3/2至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，14min）。+TOFMS:m/z1228.5654[M+1]（M+H+）
制备ART153
按照方法C中描述的步骤制备ART153。HPLC保留时间为7.05，方法：紫杉烷偶联物_MKG4（C18柱，MeOH/H2O/THF95/3/2至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，14min）。+TOFMS:m/z1150.6485[M+1]（M+H+）
Figure BDA0000432398950000222
按照方法A中描述的步骤制备ART161。HPLC保留时间为4.88，方法：紫杉烷偶联物_MKG6（C18柱，MeOH/H2O95/5至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，16min）。+TOF MS:m/z1235.6276[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000223
按照方法A中描述的步骤制备ART207。HPLC保留时间为6.06，方法：紫杉烷偶联物_MKG17（协同柱，ACN/H2O60/40至100%ACN10min，2min100%ACN，230nm，1.5ml/min，30℃，15min）。+TOF MS:m/z1220.6156[M+1]和m/z1237.6382[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000231
按照方法A中描述的步骤制备ART156。HPLC保留时间为6.2，方法：紫杉烷偶联物_MKG4（C18柱，MeOH/H2O/THF95/3/2至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，14min）。+TOFMS:m/z1176.6466[M+1]和m/z1193.6730[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000232
按照方法A中描述的步骤制备ART162。HPLC保留时间为8.96，方法：紫杉烷偶联物_MKG16（协同柱，MeOH/H2O75/25至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，15min）。+TOF MS:m/z1189.6491[M+18]和m/z1172.6224[M+1]（M+H+）
Figure BDA0000432398950000233
按照方法A中描述的步骤制备ART208。HPLC保留时间为7.4，方法：紫杉烷偶联物_MKG19（协同柱，ACN/H2O50/503min，80-100%ACN/H2O10min，2min100%ACN，230nm，1.5ml/min，30℃，15min）。+TOF MS:m/z1174.6306[M+1]（M+H+）
Figure BDA0000432398950000241
依照方法C中描述的步骤制备ART185。HPLC保留时间为6.42，方法：紫杉烷偶联物MKG15（协同柱，70-100%ACN/H2O10min，100%ACN2min，230nm，1.5ml/min，30℃，15min）。+TOF MS:m/z1104.6648[M+1]（M+H+）和m/z1126.6447[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000242
依照方法C中描述的步骤制备ART137。HPLC保留时间为10.63，方法：紫杉烷（C18柱，ACN/H2O50/50至100%ACN10min，2min100%ACNH，230nm，1.5ml/min，30℃，16min）
Figure BDA0000432398950000243
按照方法A中描述的步骤制备ART164。HPLC保留时间为7.73，方法：紫杉烷偶联物_MKG6（C18柱，MeOH/H2O95/5至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，16min）。+TOF MS:m/z1255.7506[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000251
按照方法A中描述的步骤制备ART163。HPLC保留时间为7.56，方法：紫杉烷偶联物_MKG6（C18柱，MeOH/H2O95/5至100%MeOH10min，2min100%MeOH，230nm，1.5ml/min，30℃，16min）。+TOF MS:m/z1251.7233[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000252
按照方法A中描述的步骤制备ART209。HPLC保留时间为9.6，方法：紫杉烷偶联物_MKG18（协同柱，ACN/H2O80/2010min，100%ACN2min，230nm，1.5ml/min，30℃，15min）。+TOF MS:m/z1253.7505[M+18]（M+NH4 +）
Figure BDA0000432398950000253
特定化合物的细胞毒性：
使用SK-N-AS细胞的MTS增殖分析
第1天：在96孔组织培养板（Falcon）中以100μL将SK-N-AS细胞以5×103每孔接种于适合的生长培养基中，每种待测试的药物各一个板。第1列为空白；其含有培养基但不含细胞。在37℃在5%CO2中过夜孵育该板以使得能够附着。
第2天：将稀释于培养基中的药物以0.005nM至10μM的浓度加入到细胞中，一式四份。在药物暴露48至72小时后，基于细胞类型，按照
Figure BDA0000432398950000261
含水非放射性细胞增殖分析（MTS），Promega，向所有孔中加入MTS药剂并且孵育1至6小时（37℃，5%CO2）。使用Bio-Tek协同HT多路检测微滴定板读取器在490纳米波长下对板进行处理，并且使用KC4V.3软件处理数据。绘制了药物浓度相对于吸光度的数据图，并且对于每种测试化合物外推产生50%抑制的浓度（IC50）。
如表1中所汇总的，确定了每种测试化合物在SK-N-AS细胞系中的IC50值。在实验中包括了临床比较药物紫杉醇，以使得能够将候选化合物的结果与紫杉烷类中的临床相关标准进行比较。
表1：SK-N-AS中的IC50（nM）值
Figure BDA0000432398950000262
使用配对的MDR+和MDR-细胞系的MTT增殖分析
进行了酸不稳定的亲脂性分子偶联物的细胞毒性的第二个评价。这些实验的目的是在多药耐药细胞以及它们的亲代敏感系中比较偶联物的毒性以测试如下假设，即这些化合物的子集在耐药系中能够表现出在亲代敏感细胞系中观察到的类似水平的毒性。
使用人癌症细胞系和表现出多药耐药的配对亚系进行基于MTT的细胞毒性检测。这些细胞系包括子宫肉瘤系MES-SA和其多柔比星耐受亚系MES-SA/Dx5。参见W.G.Harker,F.R.MacKintosh,和B.I.Sikic.Development and characterization of a human sarcoma cell line,MES-SA,sensitive to multiple drugs.Cancer Research43:4943-4950(1983)；W.G.Harker和B.I.Sikic.Multidrug(pleiotropic)resistance in doxorubicin-selectedvariants of the human sarcoma cell line MES-SA.Cancer Research45:40914096(1985)。
MES-SA/Dx5表现出对于许多化疗剂（包括长春花碱、紫杉醇、秋水仙碱、长春新碱、依托泊苷、放线菌素D、米托蒽醌和道诺霉素）的显著交叉耐药性，并且对丝裂霉素C和美法仑具有中等的交叉耐药性。然而，未观察到对于博来霉素、顺铂、卡莫司汀、5-氟尿嘧啶或甲氨蝶呤的耐药性。MES-SA/Dx5细胞表达高水平的ABCB1（MDR1）mRNA和其基因产物P-糖蛋白。MES-SA和MES-SA/Dx5购自美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC,Manassas,VA）。
所测试的第二组细胞，CCRF-CEM或简称为CEM，来自患有急性淋巴母细胞性白血病的患者的血液（G.E.Foley,H.Lazarus,S.Farber,B.G.Uzman,B.A.Boone,和R.E.McCarthy.Continuous culture of humanlymphoblasts from peripheral blood of a child with acute leukemia.Cancer18:522-529(1965)）。开发亚系CEM/VLB100能耐受高达至100ng/ml的长春花碱（W.T.Beck,T.J.Mueller,and L.R.Tanzer.Altered surface membraneglycoproteins in Vinca alkaloid-resistant human leukemic lymphoblasts.Cancer Research39:2070-2076(1979)）。通过过表达MDR1基因实现耐药性。然而，CEM亚系指定的CEM/VM-1-5中的耐药性为“非典型的”（M.K.Danks,J.C.Yalowich,and W.T.Beck.Atypical multiple drug resistance ina human leukemic cell line selected for resistance to teniposide(VM-26).Cancer Research47:1297-1301(1987)）。包括在“典型的”多药抗性表型中的所述药物的种类为长春花生物碱类、蒽环类、表鬼臼毒素类（epipodophyllotoxins）和抗生素类。然而，CEM/VM-1-5细胞尽管对依托泊苷、蒽环类抗生素和米托蒽醌具有耐药性和交叉耐药性，其保持对长春花生物碱类敏感（Danks,M.K.;Schmidt,C.A.;Cirtain,M.C.;Suttle,D.P.;Beck,W.T.,Altered catalytic activity of and DNA cleavage by DNAtopoisomerase II from human leukemic cells selected for resistance to VM-26.Biochemistry1988,27,8861-8869）。CEM/VM-1-5细胞中的耐药性是通过ABCC1（MRP1）基因的过表达来起作用的。CEM、CEM/VLB100和CEM/VM-1-5细胞获自伊利诺伊大学芝加哥分校（University of Illinois atChicago）的WT Beck博士。
表2：在配对的细胞系中测试浓度的汇总
Figure BDA0000432398950000281
Figure BDA0000432398950000282
数据表示为IC50值(nM)。
1通过将耐药性系的IC50除以敏感的MES-SA细胞的IC50计算得到。
2通过将耐药性系的IC50除以敏感的CEM细胞的IC50计算得到。
HTL是指人类T-淋巴母细胞；Hs是指人类肉瘤。
所观察到的酸不稳定的亲脂性分子偶联物的细胞毒性表明它们仍然具有它们所需用于保持作为潜在化疗剂的效用的抗癌活性。特别值得注意的是，对于酸不稳定的亲脂性分子偶联物，由耐药细胞系表达的耐药性的明显程度降低了20至50%。这是意料不到的结果。
酸不稳定的、亲脂性分子偶联物在血浆中的稳定性：
评价了酸不稳定的亲脂性分子偶联物在血浆中对水解的稳定性，以测定它们将活性癌症化疗剂释放至体循环中并由此导致一般的脱靶毒性（“副作用”）的潜力。用来自小鼠、大鼠和人类的血浆孵育偶联物。
HPLC级甲醇来自Fisher（Fair lawn,NJ,USA），目录号：A452-4（074833）。HPLC级水来自Fisher（Fair lawn,NJ,USA），目录号：W5-4（073352）。无药物的小鼠、大鼠和人类血浆购自Innovative Research Inc.（Southfield,MI,USA）。
Figure BDA0000432398950000291
I.V.脂肪乳剂来自Hospira,Inc.（LakeForest,Illinois）。
制备血浆培养物：
各自在小鼠、大鼠和人类血浆中以10μg/ml的浓度一式三份制备各药物（ART198、ART273、ART488和ART489），并且涡旋1分钟，并且以每分钟75次的振摇速率置于37℃的水浴中。在0、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、210、240、300、360和480分钟的时间点抽取样品。
用于血浆中ART198、ART273、ART488和ART489分析的分析方法：
使用BEH C18柱（1.7μm,2.1×50mm）在Waters Acquity UPLCTM上进行化合物的色谱分离。流动相由甲醇:0.1%甲酸（80:20）组成。流速为0.3ml/min；样品注射体积为5μL，产生3分钟的运行时间。
MS仪器由Waters Micromass Quattro MicroTM三重四极系统（Manchester,UK）组成。由4.0版本的MassLynx软件控制该MS系统。在正电喷雾电离模式下进行离子化。MS/MS条件如下：毛细管电压3.02kV；锥电压50v；提取器电压5v；和RF透镜电压0.5v。源温度和去溶剂化温度分别为100℃和400℃，并且脱溶剂气体流量和锥气体流量分别为400L/hr和30L/hr。
在选择的离子监测（SIM）中使用的ART198的选定的质量-电荷（m/z）比转换为：对于ART198，617（M+K）+，对于ART273，589（M+K）+，对于ART488，913（M+Na）+，和对于ART489，957（M+Na）+。停留时间设定为200毫秒。使用直接注入在甲醇中配制的标准溶液并以20μL/min的流速由注射泵递送来优化MS条件。
血浆样品制备：
分别在0、15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、210、240、300、360和480分钟的时间点采集100μL的样品，并且用甲醇终止反应。在单独组的实验中，将酸不稳定的、亲脂性分子偶联物溶解于少量的乙醇中并且稀释至脂质乳剂
Figure BDA0000432398950000301
中，并且在孵育前加入到小鼠和人类血浆中，类似地测量了偶联物的水解。将采集的含有药物的100μL血浆样品置于单独的Eppendorf微离心管中用于处理。加入甲醇（200μL）使用蛋白质沉淀技术提取药物。然后将微管旋涡混合10分钟并且以10,000rpm的速率离心15分钟（Eppendorf5415C离心机）。收集上清液并且在分析之前使用0.45μm过滤器（Waters13mm GHP0.45μm）过滤。
空白小鼠、大鼠和人类血浆样品的UPLC/MS/MS分析显示无内源性峰干扰ART198、ART273、ART488或ART489的定量。
使用加权线性最小二乘（1/x）回归作为数学模型。化合物的系数（r）范围为0.9925至0.9999。校准范围是根据待测量的样品的预计浓度来选择的。最终的校准范围为10至12,500ng/mL，具有10ng/mL的定量下限。
重复性和再现性偏差（%）在低浓度±20%和其他浓度水平±15%的可接受限度（acceptance limit）内，具有在评价的所有浓度下低于5%的RSD。
该方法的三个不同浓度测试药物从血浆中的平均回收率在86.22%至99.83%的范围内。这些结果提示以不同浓度水平的提取回收率方面没有相关差异。
孵育ART467和紫杉醇：
将来自210.6μg/ml的ART467的储液的0.2ml等份试样掺入至3.8ml的预孵育15min（37℃）的人类血浆中，并且在37℃的往复式水浴中孵育。在0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12和24小时提取样品。
用于ART467和紫杉醇的分析方法（液相色谱-串联质谱法）：
使用由二元泵（binary pump）、自动取样器、脱气机和柱温箱组成的ACQUITY UPLC液相色谱（Waters Corporation,Milford,MA,USA）进行色谱分离。以0.4ml/min的流速将甲醇-乙腈（50:50,v/v）的流动相泵入通过保持在25℃的ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm,2.1×50mm i.d.,Waters Corporation）。注入10μl样品，并且运行时间为3分钟。将LC流出物直接连接至装备有电喷射离子化（ESI）离子源的ESCi三重四极质谱仪中。在正离子模式下操作四极。使用MassLynx版本4.1软件使用多反应监测（MRM）模式进行定量。分别对于紫杉醇Na+加合物、l3C6-紫杉醇加合物和ART467加合物优化m/z876.2、307.9；882.2、313.9；以及1216.5、647.8的质量转换，停留时间为0.5s。使用氮气作为雾化气体（30l/h）和脱溶剂化气体（3001/h），使用250℃的脱溶剂温度，并且氩气为碰撞气体。将毛细管电压设定为3.5kV，并且锥电压为90V。将源温度设定为100℃。
血浆样品制备：
在不同的时间段（0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12和24h），提取200μl的等分试样并且立即加入到1.3ml的冷TBME中，并且随后加入20μl的内标储备液（80.7μg/ml在甲醇中）。将每个管涡旋混合约2min，然后在13000rpm下离心10min。将1.0ml所得的上清液转移至另一个管中，并且在35℃下在氮气流下干燥。用200μl的甲醇将各干燥的残留物重构并且涡旋混合0.5min。在13000rpm离心10min之后，将上清液转移至HPLC自动进样品小瓶中，并且将各样品的10μl等份试样注射到LC-MS-MS中。
在不同时间采集样品，并且癌症化疗剂的酸不稳定的亲脂性分子偶联物的百分比残留随着从偶联物的水解中释放出的化疗剂的百分比而确定。结果以表格的形式并且以图形表示。
未偶联的ART273在血浆中的稳定性：
测量了未偶联的ART273在小鼠、大鼠和人类血浆中的固有稳定性。没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠、大鼠和人类血浆中分别残留了约30%、54%和67%的起始的ART273。
表4：在37℃下ART273在血浆中的稳定性
Figure BDA0000432398950000321
Figure BDA0000432398950000322
ART273偶联物、ART488在血浆中的稳定性
测量了ART273偶联物、ART488在小鼠、大鼠和人类血浆中的固有稳定性。没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠、大鼠和人类血浆中分别残留了约36%、33%和44%的起始的ART488。同时也没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠、大鼠和人类血浆中形成的ART273大约分别相当于起始ART488的36%、32%和37%。
表5：在37℃下ART488在血浆中的稳定性
Figure BDA0000432398950000332
Figure BDA0000432398950000341
当以脂质乳剂添加时，ART273偶联物、ART488在血浆中的稳定性：
测量了ART273偶联物、ART488在小鼠和人类血浆中的固有稳定性。没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠和人类血浆中分别残留约89%和88%的起始的ART488。
表6：当以脂质乳剂添加时，在37℃下ART488在血浆中的稳定性
Figure BDA0000432398950000342
Figure BDA0000432398950000351
aND=未检测到
Figure BDA0000432398950000352
未偶联的ART198在血浆中的稳定性：
测量了未偶联的ART198在小鼠、大鼠和人类血浆中的固有稳定性。没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠、大鼠和人类血浆中分别残留约26%、30%和34%的起始ART198。
表7：在37℃下ART198在血浆中的稳定性
Figure BDA0000432398950000353
Figure BDA0000432398950000361
Figure BDA0000432398950000362
ART198偶联物、ART489在血浆中的稳定性：
测量了ART198偶联物、ART489在小鼠、大鼠和人类血浆中的固有稳定性。没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠、大鼠和人类血浆中分别残留约34%、34%和66%的起始的ART489。也没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠、大鼠和人类血浆中ART198分别相当于约35%、32%和20%的起始的ART489。
表8：在37℃下ART489在血浆中的稳定性
Figure BDA0000432398950000371
Figure BDA0000432398950000372
Figure BDA0000432398950000381
当以脂质乳剂加入时，ART198偶联物、ART489在血浆中的稳定性：
测量了ART198偶联物、ART489在小鼠和人类血浆中的固有稳定性。没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在480分钟后，在小鼠和人类血浆中分别残留了约73%和77%的起始的ART489。
表9：当以脂质乳剂添加时，在37℃下ART489在血浆中的稳定性
Figure BDA0000432398950000382
紫杉醇偶联物、ART467在血浆中的稳定性：
测量了在人类血浆中紫杉醇偶联物、ART467的固有稳定性。没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在1440分钟后，在人类血浆中残留了约41%的起始的ART467。也没有参照任何特定的动力学模型，可以看出在1440分钟后，在人类血浆中紫杉醇相当于约16%的起始的ART467。
表10：在37℃下ART467在人类血浆中的稳定性
Figure BDA0000432398950000392
Figure BDA0000432398950000401
在加入到血浆中之前，将酸不稳定的、亲脂性分子偶联物ART488和ART489溶解于脂质乳剂中显著地增强了偶联物对血浆介质的水解的稳定性（总结于表11中）。从缺乏由偶联物释放出的游离药物可以明显地看出，酸不稳定的、亲脂性分子偶联物保留于脂质乳剂中并且没有“泄漏”到培养物的血浆相中。在孵育中未观察到可检测浓度的游离药物，其中在加入到孵育培养基中之前，偶联物被首先溶解于脂质乳剂中（参见表6和表9）。
表11：通过加入到脂质乳剂中的药物稳定性
Figure BDA0000432398950000402
aNP=未进行实验
评价酸不稳定的、亲脂性分子偶联物在小鼠中的最大耐受剂量（MTD）。
在乙醇中制备ART198和273以及它们各自的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物（分别为ART489和ART488）的储备液，然后稀释至脂质乳剂（Intralipid）并且以毫克每千克为单位以不同的剂量静脉注射至小鼠中。为期30天，每天观察动物的毒性和/或死亡迹象。将MTD定义为剂量小鼠生存满30天观察周期的生存率。
ART198的MTD被确定为4.0+/-1.0mg/kg；ART273的MTD被确定为1.0+/-0.5mg/kg；ART489的MTD被确定为3.1+/-1.0mg/kg；ART488的MTD被确定为4.0+/-0.5mg/kg。
所观察到的ART198及其酸不稳定的亲脂性分子偶联物ART489、或在ART273的情况下的类似性，从ART273的约1mg/kg的MTD增加至其酸不稳定的亲脂性分子偶联物ART488的约4mg/kg，在考虑到观察到在体外的细胞毒性时，这是令人惊讶的。在体外细胞毒性评价中，定期观察的ART273的酸不稳定的亲脂性分子偶联物比ART273的效力大接近一个数量级（10X）。MTD测量结果提示癌症化疗剂的酸不稳定的、亲脂性分子偶联物由于其减少的毒性而对于治疗患者可能更有用。

Claims (17)

1.一种式1、式1.1或式2的酸不稳定的亲脂性分子偶联物（ALLMC）；和它们的分离的对映体、非对映体或它们的混合物；或它们的药用盐：
Figure FDA0000432398940000011
其中：
R是带有羟基的癌症化疗剂；
对于式1或式1.1：
R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；
R2是C5-C22烷基；
Y选自O、NR'或S，其中R'是氢或C1-C6烷基；
Z是O或S；
Q是O或S；并且T是O或S；
对于式2：
R2是C1-C22烷基；
T是O或S；并且
X是氢或是选自由甲磺酸酯、磺酸酯和卤素（Cl、Br和I）组成的组中的离去基团。
2.根据权利要求1所述的酸不稳定的亲脂性分子偶联物，其为式1或式1.1，其中：
R是带有羟基的癌症化疗剂；
R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；
R2是C5-C22烷基；
Y是O或S；
Z是O；并且
Q是O；并且T是O。
3.根据权利要求1所述的酸不稳定的亲脂性分子偶联物，其为式2，其中：
R2是C5-C22烷基；
T是O；且
X是氢或选自由Cl、Br和I所组成的组中。
4.根据权利要求1所述的酸不稳定的亲脂性分子偶联物，其包含式1a、式1b或式2a：
Figure FDA0000432398940000021
其中：
R是带有羟基的癌症化疗剂（HBCCA）；
对于式1a或式1b：
R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；并且
R2是C5-C22烷基；
对于式2a：
R2是C1-C22烷基；并且
X是氢或选自由Cl、Br和I所组成的组中。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的酸不稳定的亲脂性分子偶联物，其中，所述带有羟基的癌症化疗剂选自由紫杉烷类、abeo-紫杉烷类、喜树碱类、埃博霉素类、葫芦素类、苦木素类、蒽环类药物以及它们的类似物和衍生物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的酸不稳定的亲脂性分子偶联物，其中，所述带有羟基的癌症化疗剂选自由阿柔比星、喜树碱、马索罗酚、紫杉醇、喷司他丁、氨柔比星、克拉屈滨、阿糖胞苷、多西他赛、依利醋铵、表柔比星、依托泊苷、福美司坦、氟维司群、吉西他滨、依达比星、吡柔比星、拓扑替康、戊柔比星和长春花碱所组成的组中。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的酸不稳定的亲脂性分子偶联物，其中，所述偶联物选自图18、图19和图20中的化合物。
8.一种药物组合物，其包含：a）治疗有效量的、以单一对映异构体形式的权利要求1至7中任一项所述的化合物；和b）药用赋形剂。
9.一种治疗患者中癌症的方法，包括向需要此种治疗的患者给予治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的化合物或它们的组合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述癌症选自由白血病、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌和黑色素瘤所组成的组中。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和头颈部癌所组成的组中。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中，当与未偶联的带有羟基的癌症化疗剂相比，所述方法提供至少10%至50%降低的由癌症细胞表达的耐受程度。
13.一种用于减少或基本上消除与向患者给予癌症化疗剂相关联的化疗的副作用的方法，所述方法包括向患者给予治疗有效量的式1、式1.1或式2的酸不稳定的亲脂性分子偶联物、以及它们的分离的对映异构体、非对映异构体或它们的混合物：
Figure FDA0000432398940000041
其中：
R是带有羟基的癌症化疗剂；
对于式1或式1.1：
R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；
R2是C5-C22烷基；
Y选自O、NR'或S，其中R'是氢或C1-C6烷基；
Z是O或S；并且
Q是O或S；并且T是O或S；
对于式2：
R2是C1-C22烷基；
T是O或S；并且
X是氢或是选自由甲磺酸酯、磺酸酯和卤素（Cl、Br和I）所组成的组中的离去基团。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法在患者的癌症细胞中提供更高浓度的所述癌症化疗剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，当与向患者给予非偶联的癌症化疗剂相比时，所述方法在癌症细胞中递送高出至少5%、10%、20%或至少50%浓度的所述癌症化疗剂。
16.一种式3a或式3b的化合物：
Figure FDA0000432398940000051
其中：
R1是氢、C1-C4烷基或C5-C22烷基；
R2是C5-C22烷基；
Y选自O、NR'或S，其中R'是氢或C1-C6烷基；
Z选自O或S；并且
Q是O或S；并且T是O或S。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中：
R1是氢或C1-C4烷基；
R2是C5-C22烷基；
Y是O或S；
Z是O；并且
Q是O；并且T是O。
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