KR20130125736A - 코엔자임 ｑ１０을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

코엔자임 ｑ１０을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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조미라
전주연
변재경
임예빈
정영옥
이선영
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가톨릭대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 효과가 우수하여, 이식거부질환과 같은 면역 거부 질환 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

Description

코엔자임 Ｑ１０을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating inflammatory disease or immunological rejection comprising coenzyme Q10 as an effective component}
본 발명은 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
면역거부반응이란 이식된 조직을 숙주가 비자기(nonself)로 인식하고 이를 제거하고자 하는 반응으로 MHC(major histocompatibility complex) 혹은 minor histocompatibility complex가 관여하는 것으로 알려져 있다. 거부반응은 세포매개면역과 체액면역 모두가 관련하나 이들의 상대적인 기여도는 이식반응의 종류에 따라 다르다.
T세포매개 반응의 경우, 모든 세포에 광범위하게 표현되어 있는 MHC가 동종항원(alloantigen)으로서 역할을 하며, CD4 T세포(MHC typeⅡ인식)와 CD8 T세포(MHC typeⅠ인식)가 모두 관여한다. T세포매개반응은 수용자의 림프구가 공여자의 MHC를 만났을 때 개시되는데, 즉, 숙주 T세포가 이식장기내의 가지세포를 만나거나 공여자의 가지세포가 수용자의 림프절로 유입된 후 면역작용이 시작되며, 활성화된 CD4 T세포는 지연과민반응에서 나타나는 cytokine을 분비하여 혈관투과성을 증가시키고, 림프구, 대식구와 같은 단핵세포의 국소 침윤을 일으키며, 침윤된 대식구에 의해 미세혈관 손상, 조직허혈 및 이식조직 파괴가 일어나게 된다.
또한, 동종 항원에 대한 항체매개 반응으로도 면역 이식거부가 일어날 수 있는데, 초급성 거부는 이미 형성된 항공여자 항체가 존재하거나, 신장이식, 임신(태아에서 기원한 nonself MHC), MHC가 일치되지 않은 사람에게서 수혈을 받은 경우(혈소판, 백혈구)에 일어나게 되고, 이식 항원에 노출된 적이 없으나 나중에 항체가 형성되어 거부반응이 나타나는 경우에는, B세포가 T세포의 도움을 받아 공여자의 항원에 대한 항체를 분비하고, 항체의 최초 표적은 이식 조직의 혈관이다.
일반적인 장기이식에서는 수혜자가 이식 장기를 거부하지만, 골수이식이나 면역세포를 이식할 경우는 이식해준 면역세포들이 수혜자의 면역계를 거부하는데, 이를 이식편 대 숙주 거부반응(graft-versus-host rejection)이라고 한다.
이식편대숙주질환(graft-versus-host disease, GvHD)은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 면역 거부 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구감소증 등의 증상이 나타나는 질환으로 심한 경우 환자가 사망할 수 있다.
이식편대숙주질환은 크게 급성 이식편대숙주질환(acute Graft-versus-Host Disease, aGvHD)과 만성 이식편대숙주질환(chronic Graft-versus-Host Disease, cGvHD)으로 구분된다.
만성 이식편대숙주질환은 동종이식의 경우 이식 후 보통 4~6개월이 지나서 발생하며, 이식 80일 이전이나 1년 이후 발생하는 경우는 드물다. 따라서 동종반응이 만성 이식편대숙주질환을 일으키는 주요한 전제조건이며, 만성 이식편대숙주질환의 발명과정은 긴 잠복기를 거치거나, 표적 장기에 미치는 영향이 느리게 나타난다는 것을 알 수 있다.
또한 급성 이식편대숙주질환은 동종조혈세포이식의 중요한 합병증으로, 동종조혈모세포 이식 후 대게 30~40일 이내에 발생하게 되며, 피부, 간 그리고 위장관을 침범하게 된다. 이러한 급성 이식편대숙주질환은 3단계로 발생하게 되는데, 1단계에서는 골수를 이식하기 이전에 발생하는 것으로 환자의 조직이 손상되고 경우에 따라서는 박테리아 감염 등에 의해 항원제시세포(antigen presenting cell)가 활성화되는 단계이며, 2단계에서는 이식되는 골수세포 중의 T 세포가 활성화되는 단계이다. 이미 활성화된 환자의 항원제시세포가 T 세포를 Th1 세포로 분화시키며, 궁극적으로 IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인 분비를 증가시킨다. 3단계에서는 환자의 장기가 파괴된다. 활성화된 Th1 세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 사이토톡식 T 세포 (cytotoxic T cell) 및 자연살해세포 (naturall killer cell)등이 활성화되면 이들 세포는 환자의 장기를 공격하게 되어 이식편대숙주질환이 발생하게 된다.
이러한 이식편대숙주질환을 치료하기 위해서 여러 가지 방법이 제안되고 있다. 이식되는 골수세포 중에서 T 세포를 제거하는 방법, T 세포와 항원제시세포의 반응을 억제하기 위해 CD80, CD86 등에 대한 항체를 투여하는 방법, IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인에 대한 항체를 투여하는 방법 등이 제시되고 있다. 이와 더불어 사이클로스포린 에이, 라파마이신, FK-506 스테로이드제제 등의 화합물 면역거부 억제제를 투여하는 방법도 사용되고 있다. 이들 방법 중에서 T 세포의 활성화를 억제하는 화합물 면역거부 억제제 투여법이 가장 널리 사용되고 있다.
현재까지 많은 화합물 면역억제제가 개발되어 있으나 사이클로스포린에이가 가장 우수한 임상효과를 나타내고 있으며 급성 이식편대숙주병을 포함하여 장기이식거부반응 등에 널리 쓰이고 있다. 그러나 사이클로스포린에이는 고용량으로 사용할 경우 T 세포의 활성화를 완벽하게 억제하여 질병을 치료할 수 있으나 신장독성을 포함하여 상당한 부작용을 나타내는 문제점이 있다.
따라서 부작용이 없고 치료 효과가 우수한 새로운 면역거부반응 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 면역거부반응을 완화시킨다는 것을 규명함으로써 각종 염증성 질환 또는 면역 이식 거부 관련 질환에서 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 Th17 세포에 처리하여 Treg 세포로 재분화 시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
더 나아가 본 발명의 다른 목적은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나 또는 TH17, RORr T, CCL20의 발현을 감소시키거나 또는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.001uM 내지 5uM의 농도로 포함되어 있을 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 거부 질환은 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역 거부 질환의 예방 또는 치료 효과는 체액성 면역반응(humoral response)을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 체액성 면역반응은 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증성 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절병증, 강직성 척추염, 건선관절염, 세균성 관절염, 소아기 류마티스관절염, 재발류마티스, 류마티스 다발근육통증, 라임 관절염, 유착 관절낭염 또는 염증성 장질환인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a 또는 VEGF 발현을 감소시키는 효과, 파골세포의 분화를 억제시키는 효과, 골(연골)보호 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골보호 효과는 TRAP(tartrate-resistant acid-phosphatase), RANK(Receptor activator of nuclear factor kappa-B) 또는 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)의 발현 감소를 통한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조절 T 세포를 활성화시키는 방법은 조절 T 세포에서 Foxp3의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 Th17 세포에 처리하여 Treg 세포로 재분화 시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공한다.
본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 효과가 우수하여, 이식거부질환과 같은 면역 거부 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.
도 1은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)에 세포독성이 있는 지 유무를 알아보기 위하여 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 농도별로 처리하고, MTT 어세이 분석을 한 결과이다.
도 2는 Th17/IL-17 세포와 Foxp3+ Treg 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 3은 Th0 조건으로 Th17을 유도한 뒤 코엔자임 Q10을 농도별로 처리하였을 때의 그래프이다.
도 4는 인간 말초 단핵세포에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 Treg의 발현 FACS로 관찰한 결과이다.
도 5a와 5b는 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 Treg의 발현 Realtime PCR로 관찰한 결과이다.
도 6은 코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성 확인 실험 결과이다.
도 7은 류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인 결과이다.
도 8은 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF의 발현 확인 결과이다.
도 9는 코엔자임 Q10에 의한 류마티스 관절염 동물 모델에서 체액성 면역반응 (humoral response)을 확인한 결과이다.
도 10은 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 골파괴 억제 기전 확인 결과이다.
도 11은 SKG 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절 확인 결과이다.
도 12는 코엔자임 Q10을 이용한 염증성 장질환 치료 효과 확인 결과이다.
도 13은 골관절염 동물모델에서 코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과 확인 결과이다.
도 14는 코엔자임 Q10이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향 확인 결과이다.
도 15는 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, IL-15의 발현 확인 결과이다.
도 16은 골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현 확인 결과이다.
본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.
코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 체내에서 합성되는 지용성 비타민류 물질로 영양소의 대사에 관여하며 항산화력이 비타민 E보다 우수한 것으로 알려져 있고, 비타민 Q(vitamin Q)라고도 한다. 화학식은 C59H90O4이고, 고등어, 꽁치, 정어리 등의 등푸른 생선과 현미, 계란, 두류, 시금치, 땅콩 등의 견과류에도 포함되어 있다 . 코엔자임 Q10은 육류 등의 음식을 통해 소량을 얻을 수 있으나 대부분은 체내에서 만들어지며, 코엔자임 Q10은 당질을 에너지로 바꾸어 혈당을 감소시키며 비타민 E와 같이 항산화 작용을 하여 세포막의 산화를 막고 산소 이용율을 높이는 작용도 한다. 또한 정자를 활성화 시키고 면역세포나 백혁구의 작용을 높이는 작용을 한다. 활성산소의 생성을 억제하는 항산화능이 우수하여 동맥경화나 고혈압과 같은 심혈관계질환, 암, 뇌출혈, 알츠하이머병, 당뇨병 등의 질병을 예방해 주는 효과도 있다고 알려져 있다.
한편, 면역 거부 반응이란 공여체에서 수용체에 접종 또는 이식된 이질적인 세포 또는 조직의 특이적인 면역반응에 의한 붕괴현상으로써, 이식항원을 달리하는 공여자로부터 이식한 이식편은 수용자의 면역학적 기작으로는 생착(生着)할 수 없으며, 이러한 거부반응은 세포성 면역 및 체액성 면역에 의해 야기된다. 피부나 고형종양의 이식에서는 거부반응의 주체가 세포성 면역인데, 즉, 이식 피부 편을 거부한 동물의 혈청의 이입은 수용하는 동물과 같은 이식편의 거부는 촉진하지 않지만 림프계 세포의 이입은 이식편의 생착일수를 단축한다. 또한, 신생아기에 흉선을 절제한 동물은 피부거부반응을 나타내지 않는데, 반면, 신장거부반응에는 거부반응의 주체로 액성항체도 작용하며, 특히 수용자가 이미 공여자 림프구에 대한 항체를 갖고 있는 경우에는 사구체에 미소혈전을 만들어 초급성 거부반응을 일으키게 된다. 이식 후 7~21일 사이에는 급성거부반응이 일어나게 되며 이때는 세포성 면역과 체액성 항체의 양자가 모두 관여한다. 또한, 이식 후 수 개월~수 년 후에는 만성거부반응이 일어나는데 이는 사구체 기저막에서의 면역글로불린과 C3의 침착에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다.
한편, 본 발명자들은 이러한 면역거부반응을 치료할 수 있는 새로운 치료제를 찾기 위해 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 면역거부반응에 의한 질환을 치료할 수 있는 효과가 있는지를 MTT 어세이 분석을 통해 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따라, 사람의 단핵구 세포에 코엔자임 Q10을 0.01uM 내지 30uM의 농도별로 처리하여 세포에 독성효과가 있는지를 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군과 코엔자임 Q10을 30uM 까지 처리한 군에서 차이가 없어 본 발명의 코엔자임 Q10에 세포독성이 일어나지 않았음을 알 수 있었다(도 1 참조).
나아가 본 발명은 코엔자임 Q10에 의한 Th17 세포 억제 및 Treg 세포 증가 효과를 알아보기 위하여, Th17/IL-17 세포와 Foxp3+ Treg 세포를 유세포 분석기로 분석한 결과, 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 Th17 세포를 억제하고 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 증가시키는 것으로 나타났고(도 2 참조), Th0 조건으로 Th17을 유도한 뒤 코엔자임 Q10을 농도별로 처리하였을 때, Th17 세포를 억제하는 농도가 0.5uM 미만으로는 차이가 없어, 본 발명의 코엔자임 Q10을 0.5uM 미만으로 처리하였을 때 가장 효과적임을 알 수 있었다(도 3 참조).
또한, 본 발명은 코엔자임 Q10에 의한 면역염증 반응 조절 효과를 알아보기 위하여, 본 발명의 일실시예에 따라 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰한 결과 Th17세포의 발현은 감소된 동시에 Treg의 발현은 증가된 것을 확인할 수 있었고(도 4 참조), 코엔자임 Q10에 의한 Th17과 Treg의 molecule을 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석한 결과, Th17 조건에 코엔자임 Q10을 처리한 세포에서 얻은 mRNA level의 IL-17, RORr T, CCL20은 발현은 감소되었고, Treg세포의 대표적인 마커인 Foxp3의 발현은 증가된 것을 관찰(도 5참조)할 수 있었다.
또한, 코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성(plasticity)를 확인하는 실험을 하여 FACS로 확인하였는데 그 결과 Th17 세포의 발현은 감소시키고 Treg의 발현양을 증가 시켰음을 관찰할 수 있었다. 이는 코엔자임 Q10이 Th17 세포를 Treg 세포로의 재분화 시킬 수 있음을 보여주는 결과(도 6참조)이다.
나아가 본 발명은 코엔자임 Q10이 류마티스 관절염에 관한 치료 효과를 확인하는 실험을 하였다. 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과를 확인한 결과 코엔자임 Q10을 투여한 쥐의 관절과 연골의 파괴 정도는 정상적인 쥐와 유사하게 유지됨을 알 수 있었다(도 7 참조). 또한 류마티스 관절염 동물의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF 발현을 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에 따라 관절염 유발 후 36일이 지난 쥐의 관절에서 면역 조직화학 염색을 진행 한 후 발현의 정도를 확인한 결과 코엔자임 Q10을 투여한 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF 발현이 감소되어 있음을 알 수 있었다(도 8 참조). 또한, 류마티스 관절염 동물 모델에서의 체액성 면역반응 (humoral response)을 확인하기 위해 쥐의 비장에서 공초점형 (confocal) 염색으로 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 관찰한 결과 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 감소됨을 알 수 있었다(도 9참조).
나아가 본 발명은 도 10과 같이 코엔자임 Q10을 투여한 본 발명의 일실시예에 따른 SKG 쥐의 관절에서 골파괴 기전과 관련 있는 TRAP, RANK, RANKL의 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 관찰 하였고, 코엔자임 Q10의 파골세포 분화 조절능을 관찰하기 위한 Osteoclasto-genesis 분화 실험에서는 TRAP 양성인 세포가 코엔자임 Q10의 농도에 의존적으로 감소되고 있음을 관찰할 수 있었다. 또한, 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절을 확인하기 위하여 본 발명의 일실시에에 따라 코엔자임 Q10을 처리하여 3일간 배양 후 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석한 결과, 코엔자임 Q10을 투여한 마우스의 비장세포에서 Th17 조건과 비교하여 IL-17은 감소시키고 Treg의 발현은 증가시키는 것을 확인하였다(도 11참조).
나아가 본 발명은 코엔자임 Q10을 이용한 염증성 장질환 치료 효과를 알아보기 위하여 본 발명의 일실시예에 따라 정상 쥐에 염증성 장 질환을 유도하고 코엔자임 Q10을 투여하여 몸무게 변화를 측정한 결과 코엔자임 Q10에 의해서 염증성 장 질환이 현저하게 억제되었고 따라서 코엔자임 Q10은 염증성 장 질환 동물 모델의 생체 내에서 질환 억제 효력이 뛰어남을 확인할 수 있었다(도 12참조).
한편, 본 발명은 코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과를 알아보기 위하여 본 발명의 일실시예에 따른 Wistar rat의 관절 내에 골관절염을 유도한 후 아무것도 처리하지 않은 군과 코엔자임 Q10을 처리한 군의 Paw withdrawal latency와 역치(threshold)를 측정한 결과 코엔자임 Q10을 경구 투여한 군은 투여하지 않은 군에 비해 paw withdrawal latency 및 threshold가 높게 나왔는데(도 13참조) 이는 코엔자임 Q10을 경구투여한 군은 투여하지 않은 군에 비해 강한 자극에 대해서도 오래 견디는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 코엔자임 Q10이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에 따른 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, Toluidine blue, Sagranin O, H&E염색을 통한 조직학적 분석을 한 결과 코엔자임 Q10을 투여하지 않은 군에서는 연골의 파괴가 더 심하게 일어나 그 부위가 확인 되지 않을 뿐 아니라 뼈가 과형성되어 비정상적인 모습을 띠고 있음에 반해, 코엔자임 Q10을 경구투여한 군에서는 여전히 연골이 잘 유지되어 있음을 확인하였고 따라서 코엔자임 Q10이 연골의 파괴를 억제함으로써 골관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 알 수 있었다(도 14참조).
나아가 본 발명은 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, IL-15의 발현을 확인하기 위해 Matrix degrading enzyme matrix metalloproteinase-13과 염증성 cytokine의 발현을 확인한 결과 관절파괴 관련 분자인 MMP13의 발현과 pro-inflammatory cytokine인 IL-1b, IL-6, IL-15의 발현이 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 알 수 있었다(도 15참조). 또한, 골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에 따른 Wistar rat에 MIA주입 후 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과, 코엔자임 Q10이 catabolic factor인 INOS, Nitrotyrosine의 생성을 억제하고, glvcation end product인 RAGE의 발현을 억제함을 알 수 있었다(도 16참조).
이와 같은 결과를 통해, 본 발명자들은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 작용이 있음을 입증하였다.
그러므로 본 발명은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure pat00001
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명에 따른 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 병인세포인 Th17 세포를 효과적으로 억제(차단)하는 역할을 하고, 조절 T 세포(Treg)를 촉진 또는 증가시키는 역할을 할 수 있으므로, 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하고 있는 조성물은 면역조절 이상으로 유발될 수 있는 면역 거부 질환의 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.001uM 내지 5uM일 수 있으며, 바람직하게는 0.01uM 내지 0.5uM일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 면역 거부 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역 거부 질환"은 인체에 자신의 조직이 아닌 외부 이물질이 들어올 때 면역시스템이 이를 식별하여 제거하거나 공격하는 반응으로 다른 사람 또는 다른 동물의 장기를 이식할 때 나타나는 질환을 의미한다.
이러한 면역 거부 질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 초급성 거부반응(hyperacute rejection), 급성 거부반응(acute rejection), 만성 거부반응(chronic rejection), 이식편대숙주질환 등을 모두 포함할 수 있다.
또한, 이식을 받는 측에 미리 혈청항체가 존재하고 있으면, 이식된 장기 또는 조직은 항원항체반응의 결과, 수 시간 내에 혈전이 형성되어 괴사에 빠지고 만다. 이것을 초급성 거부반응이라고 하며, 수혈이 행하여진 경우나 2회째의 이식 수술 시에 생긴다.
본 발명에서 급성거부반응이란 면역체계의 구성요소 중 T세포에 의해 일어나는 반응으로 T세포는 외부 물질 중 단백질을 인지하고 그에 대한 항체를 만들어 내는 기능을 한다. 이식된 기관을 구성하는 단백질 중 일부를 T세포가 항원으로 인지하고 항체를 만들며 만들어진 항체가 이식된 기관을 공격하는 과정에 의해 일어나는 질환을 말한다.
본 발명에서 만성 거부반응이란 이식장기로부터의 숙주와는 다른 조직적 합성 항원에 대한 액성면역반응이 원인으로, 이식장기세포에 대한 항체(면역 글로불린)가 보체 등과 협동해서 상해를 준다. 신장이식의 경우에는 단백뇨, 혈압상승, BUN이나 혈청 크레아티닌의 상승이 서서히 일어나며, 수개월에서 수년에 걸쳐 신기능이 저하되는 질환을 말한다. 또한, 급성거절반응과 달리 부신피질호르몬 등의 면역억제제의 대량투여는 거의 무효하며 일반적으로 비가역성이라는 점이 특징이다.
본 발명에서 "이식편대숙주질환(graft-versus-host disease, GVHD)"은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구감소증 등의 증상이 나타나는 질환을 말한다.
본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 면역 거부 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 면역 거부 질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,
(3) 면역 거부 질환을 경감시킴.
(4) 면역 거부 질환의 재발을 예방함, 및
(5) 면역 거부 질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 이외에, 당업계의 공지된 담체 및 희석제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형을 가질 수 있다.
상기 제형들은 약제학적 조성물에 통상적으로 사용되는 적당한 부형제, 충전물, 결합제, 습윤제, 분해제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 완충액, 방부제, 용해보조제, 소독제, 감미료, 향신료, 진통제, 안정화제, 등장액제 등을 이용한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 기술된 각각의 제형은 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제의 구체적인 예로는 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘, 카복시비닐 중합체, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 나트륨 녹말, 펙틴, 잔탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 겔라틴, 한천, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소비톨 및 젖산 등이 있다. 한 개 또는 그 이상의 첨가제가 조제 형태에 따라 선택되거나 또는 적절히 조합될 수 있다. 더 나아가, 세포치료제 투여방법으로는, 정맥내, 동맥내 투여와 같은 통상적인 전신투여 이외에 표적세포로의 국소적 투여가 행해질 수 있으며, 카테터 기술 및 외과적 수술과 조합된 투여 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적으로 유효한 양으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"이란, 치료하고자 하는 면역 거부 질환에 대해 완화, 억제, 호전 및/또는 완치효과를 나타내는 유효성분의 양을 말한다. 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 치료적으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 당 분야에서 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정 할 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역 거부 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 상기 약제학적으로 유효한 양과 동일한 개념이다.
나아가 본 발명은 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법 및 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
코엔자임 Q10의 세포독성 확인
본 발명자들은 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)에 세포독성이 있는 지 유무를 알아보기 위하여 MTT 어세이 시험방법을 수행하였다. 이를 위해 먼저, 사람의 단핵구 세포를 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecos Modified Eagles Medium) 배지에 넣고, 5% CO2 조건에서 37℃로 배양하였다. MTT 어세이를 위해, 상기 사람단핵구 세포는 96웰 플레이트(96 well plate)에 각 웰당 2×105개로 맞추어 분주하고 코엔자임 Q10을 농도별 처리(0.01uM, 0.1uM, 0.5uM, 1uM, 5uM, 10uM, 30uM)하여 72시간 동안 배양한 다음, 이 후, MTT 용액(0.5% 3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- 2H-tetrazolium bromide)을 첨가하여 4시간 배양한 후 ELISA(enzyme-linked immunospecific assay) 측정기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 아무 것도 처리하지 않은 대조군과 코엔자임 Q10을 농도별로 처리한 군에서 큰 차이가 없는 것으로 보아 본 발명의 코엔자임 Q10에 세포 독성이 없음을 알 수 있었다(도 1 참조).
<실시예 2>
코엔자임 Q10에 의한 Th17 세포 억제 및 Treg 세포 증가 효과
사람의 단핵구 세포에서 분리한 CD4+ T cells 1×10 을 Th17 세포 분화 조건으로 자극하기 위해 48 웰 플레이트에 5X105씩 분주하고, anti-IL-4 2ug/ml, anti-IFNr 2ug/ml와 상기 세포에 동시에 코엔자임 Q10을 농도별(0.01uM, 0.1uM, 0.5uM, 1uM, 5uM, 10uM) 두 시간 동안 전처리 배양하였다. anti-CD3 항체가 0.5μg/Ml 로 코팅(coating) 처리된 플레이트에 두 시간 전처리 배양한 세포를 옮기고 Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/mL, IL-1β 20ng/ml, IL-6 20ng/ml를 자극하고 72시간동안 배양 한다. 수집한 세포는 PerCP-anti-mouse CD4항체와 APC-anti-mouse-CD25 항체를 넣고 4℃에서 30분간 암시야에서 반응시킨 뒤 FACs buffer (0.002% sodium azide, 0.2% BSA/PBS)로 세척하고, 이 세포들을 Permwash buffer로 4℃에서 30분 암시야에 반응시킨 뒤 세척한 후 PE-anti-mouse-IL-17 항체와 FITC-anti-mouse-Foxp3로 4℃에서 30분 암시야에 반응후 세척한다. FACs buffer에 재부유하여 Th17/IL-17 세포와 Foxp3+ Treg 세포를 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)이 Th17 세포를 억제하고 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)를 증가시킴을 알 수 있었고(도 2 참조), anti-CD3 0.5ug/ml항체를 두시간 전처리 하고 anti-CD28 1ug/ml로 자극한 Th0 조건에서 코엔자임 Q10을 농도별로 처리하였을 때, Th17 세포를 억제하는 농도가 0.5uM 미만으로는 차이가 없어, 본 발명의 코엔자임 Q10을 0.5uM 미만으로 처리하였을 때 가장 효과적임을 알 수 있었다(도 3 참조).
<실시예 3>
인간말초혈액 세포에서 코엔자임 Q10을 이용한 Th17/Treg동시 조절 및 면역염증 반응 조절 효과 확인
인간 말초혈액 세포에서 코엔자임 Q10을 이용한 Th17/Treg 조절 및 면역 염증 반응 조절 효과를 확인하기 위해 FACS, Real time PCR로 분석하였다.
<3-1> 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q10 에 의한 Th17 세포와 Treg 의 발현 FACS로 관찰
인간 말초혈액 세포에서 코엔자임 Q10을 이용한 Th17/Treg 조절 및 면역염증 반응 조절 효과를 확인하기 위한 실험을 하였다. 인간 말초단핵구 세포로 Th17세포로 분화를 유도하고 동시에 코엔자임 Q10으로 자극하여 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)를 사용하여 관찰하였다.
그 결과 도 4와 같이 Th17 조건에 코엔자임 Q10을 처리 한 결과 코엔자임 Q10이 용량 의존적으로 Th17 세포의 발현은 감소된 동시에 Treg의 발현은 증가된 것을 확인할 수 있었다.
<3-2> 인간 말초단핵세포에서 코엔자임 Q10 에 의한 Th17 세포와 Treg 의 발현 Realtime PCR 로 관찰
인간 말초혈액 세포에서 코엔자임 Q10을 이용한 Th17과 Treg 조절 및 면역염증 반응 조절 효과를 확인하기 위해, 인간 말초단핵구 세포로 Th17 세포로 분화를 유도하고 동시에 코엔자임 Q10으로 자극하여 코엔자임 Q10에 의한 Th17세포와 Treg관련 분자(molecule)을 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석을 하였다.
그 결과 도 5와 같이 Th17 조건에 코엔자임 Q10을 처리한 세포에서 얻은 mRNA level의 IL-17, RORr T, CCL20은 발현이 감소된 것으로 관찰 되었고, Treg 세포의 대표적인 마커인 Foxp3의 발현은 코엔자임 Q10 10μM에서 통계적으로 유의하게 증가 된 것을 관찰 할 수 있었다.
<3-3> 코엔자임 Q10 에 의한 Treg 의 가소성 확인 실험
코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성을 확인하기 위하여 인간 말초단핵구 세포에서 Treg 분화 유도후 3일 후에 다시 Th17 세포로 분화를 유도하고 동시에 코엔자임 Q10으로 자극하여 코엔자임 Q10에 의한 Treg의 가소성(Plasticity)를 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)를 사용하여 관찰하였다.
그 결과 도 6과 같이 인간 말초단핵구 세포에서 Treg 분화를 유도한 후 상기 Treg 분화를 유도한 세포에 다시 Th17 세포로의 유도 조건과 이 조건에 코엔자임 Q10을 처리하였을 때 Th17세포의 발현은 감소시키고 Treg의 발현양을 증가 시켰음을 확인 할 수 있었다. 이는 코엔자임 Q10이 Th17세포를 Treg 세포로의 재분화 시킬 수 있는 능력을 보여주는 결과이다.
<실시예 4>
코엔자임 Q10을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과 및 Th17/Treg 동시 조절 및 면역염증 반응 조절 효과 확인
코엔자임 Q10을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과 및 Th17/Treg 동시 조절 및 면역염증 반응 조절 효과 확인을 위한 실험을 진행하기 위해 8주령의 SKG 쥐에 Zymosan 2mg/kg으로 I.P.에 주입하여 관절염을 유발시켰다. 상기 관절염을 유발시킨 8주령의 SKG 쥐에 코엔자임을 주 3회 경구 섭취하여 관절염을 유발시켜 실험을 진행하였다.
<4-1> 류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q10 에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인
류마티스 관절염 동물 모델에서의 코엔자임 Q10에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인하기 위해 상기 실시예 4의 SKG 쥐에 관절염을 유발 후 36일 지난 후 마우스를 치사시켜 관절에서 연골의 파괴정도와 염증 세포의 침윤 정도를 관찰하기 위해서 H&E, Safranin o, Toluidine blue 염색을 진행하였다.
그 결과 도 7과 같이 관절염 평가는 마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 쥐 1 마리당 최고의 관절염 지수는 16점이 된다. 코엔자임 Q10이 10mg/kg을 경구투여한 마우스는 관절염 지수가 억제됨으로써 류마티스 관절염의 치료활성을 나타내었으며 관절염 7일차부터는 관절염 지수가 유의성 있게 증가함을 관찰 할 수 있었다. 조직학적 검사 결과 관절염 관절에서 많은 염증 세포들의 침윤이 확인되었으며, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰 되는 반면, 코엔자임 Q10을 투여한 마우스는 관절과 연골의 파괴정도가 정상 마우스와 유사하게 유지됨을 확인 할 수 있었다. 또한 세포의 증식 정도를 각군의 비장세포에서 아무것도 자극하지 않은 Nil 조건과 anti-CD3 0.5㎍/㎖ 모두에서 코엔자임 Q10을 투여한 마우스에서 감소 되어있음을 확인할 수 있었다.
<4-2> 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10 에 의한 IL -21, IL-1b, IL -17, TNF -a, VEGF 의 발현 확인
류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF의 발현을 확인하기 위해 상기 실시예 4의 쥐에 관절염 유발 후 36일이 지난 SKG 쥐를 치사하여 쥐의 관절에서 면역 조직화학 염색을 진행 하였다.
그 결과, 도 8과 같이 염증성 Cytokine의 발현을 관찰하기 위해서 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF의 발현을 각 군의 관절에서 조사한 결과 proinflammatory cytokine인 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a, VEGF의 발현이 코엔자임Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다.
<4-3> 코엔자임 Q10 에 의한 류마티스 관절염 동물 모델에서 체액성 면역반응 (humoral response ) 관찰
코엔자임 Q10에 의한 류마티스 관절염 동물 모델에서 체액성 면역반응 (humoral response) 관찰하기 위해 상기 실시예 4의 SKG 쥐에 관절염 유발 후 36일이 지난 SKG 쥐를 치사하여 쥐의 비장에서 공초점형 (confocal) 염색으로 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 관찰하였다.
관절염의 완화 기전에 코엔자임 Q10의 체액성 면역반응에 의한 영향을 관찰하기 위해서 마우스의 비장에서 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 조사한 결과 코엔참조).자임 Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 관찰 할 수 있었다(도 9
<4-4> 류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10 에 의한 골파괴 억제 기전 확인
류마티스 관절염 동물 모델의 관절에서 코엔자임 Q10에 의한 골파괴 억제 기전 조사하기 위해 상기 실시예 4의 SKG 쥐에 관절염 유발 후 36일이 지난 SKG 쥐를 치사하여 골파괴 분화 조절과 관련 있는 TRAP, RANK, RANKL의 발현을 조사하였다. 또한, 코엔자임 Q10의 파골세포 분화 조절능을 보기 위해서 B6 마우스 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 자극하고 코엔자임 Q10을 처리하여 TRAP 양성 세포를 조사하였다.
그 결과, 도 10과 같이 코엔자임 Q10을 투여한 SKG 쥐의 관절에서 골파괴 기전과 관련 있는 TRAP, RANK, RANKL의 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 관찰 하였다. 또한, 코엔자임 Q10의 파골세포 분화 조절능을 관찰하기 위한 Osteoclasto-genesis 분화 실험에서는 TRAP 양성인 세포가 코엔자임 Q10의 농도에 의존적으로 감소되고 있음을 관찰할 수 있었다.
<4-5> B6 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10 에 의한 Th17 / Treg 조절 확인
B6 쥐의 지라세포(splenocyte)에서 코엔자임 Q10에 의한 Th17/Treg 조절 확인하기 위해 B6상기 실시예 4의 B6 쥐의 비장세포를 Th17 분화조건에 코엔자임 Q10을 처리하여 3일간 배양 후 Th17과 Treg의 발현을 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter)로 관찰하고, Th17 관련 분자를 정량 중합효소연쇄반응장치(Realtime PCR)로 분석하였다.
그 결과 도 11과 같이 코엔자임 Q10을 투여한 마우스의 비장세포에서 Th17 조건과 비교하여 IL-17은 감소시키고 Treg의 발현은 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 이 세포의 RNA를 얻어 mRNA 수준에서 Th17 관련 분자를 분석 한 결과 Th17 관련 분자가 코엔자임 Q10을 처리한 조건에서 모두 감소되어있음을 관찰하였다.
<실시예 5>
코엔자임 Q10을 이용한 염증성 장질환 치료 효과 확인
코엔자임 Q10을 이용한 염증성 장질환 치료 효과 확인을 확인하여 위하여 7주령의 C57/BL6 정상마우스에 2.5% DSS(dextran sulfate sodium)을 5일간 먹여 염증성 잘 질환을 유도하고, 약물은 유도 0일부터 20mg/kg로 경구 투여하여 각 군의 몸무게 변화를 측정하였다.
그 결과 도 12와 같이 코엔자임 Q10에 의해서 염증성 장 질환이 현저하게 억제되었으며, 함께 병용 투여한 군에서는 10% 이상의 질환 경감효력을 보였다. 따라서 코엔자임 Q10은 염증성 장 질환 동물 모델의 생체 내에서 질환 억제 효력이 뛰어남을 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
코엔자임 Q10을 이용한 골관절염 치료 효과 조사 및 염증 면역조절 효과 조사
코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과를 확인하기 위한 실험과 코엔자임 Q10이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향을 평가하는 실험 및 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, Il-6, Il-15, INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 관찰 비교 분석하는 실험을 진행하였다.
<6-1> 골관절염 동물모델에서 코엔자임 Q10 에 의한 골관절염 치료 효과 확인
골관절염 동물모델에서 코엔자임 Q10에 의한 골관절염 치료 효과 확인하기 위해서 6주령의 Wistar rat의 오른쪽 무릎의 관절 내에 (intra-articular) 3mg/50㎕의 용량으로 MIA(Monosodium Iodoacetate)를 투여하여 골관절염을 유도하였다. 상기 MIA는 생리식염수에 용해시켜 투여하였다. 골관절염이 유도된 rat을 각각 6마리씩 2군으로 나누고, 아무것도 처리하지 않은 군(MIA만 처리)으로 하고, 두 번 째 군(MIA-코엔자임 Q10군)은 코엔자임 Q10 100 mg/kg의 용량으로 면실유(cotton seed oil)에 용해시켜 매일 경구투여하였다. 행동력 측정은 Dynamic plantar aesthesiometer를 이용하여 rat의 뒷발에 자극을 주고 그에 대한 반응을 관찰하였다. Dynamic plantar aesthesiometer에 장착되어 있는 0.5mm의 직경의 침으로 20초 동안 50g의 힘으로 rat의 발바닥에 직각방향으로 자극을 주어 rat이 해당되는 무게의 힘을 느끼고 발을 뗄때의 초와 무게값을 얻어 Paw withdrawal latency와 역치(threshold)를 측정하였다.
그 결과 도 13과 같이 코엔자임 Q10 100mg/kg를 경구 투여한 군은 투여하지 않은 군에 비하여 paw withdrawal latency 및 threshold가 유의성 있게 높았다. 이러한 결과는 코엔자임 Q10을 경구투여한 군은 투여하지 않은 군에 비하여 강한 자극에 대해서도 오래 견디는 것을 나타낸다.
<6-2> 코엔자임 Q10 이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향 확인
코엔자임 Q10이 골관절염 유발 동물의 연골에 미치는 영향 확인하기 위하여 6주령의 Wistar rat에 MIA 주입 7일 후에 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, Toluidine blue, Sagranin O, H&E염색을 통한 조직학적 분석을 통해 확인하였다.
그 결과 도 14와 같이 코엔자임 Q10을 투여하지 않은 군에서는 연골의 파괴가 더 심하게 일어나 그 부위가 확인되지 않을 뿐 아니라 뼈가 과형성되어 비정상적인 모습을 띠고 있음에 반해, 코엔자임 Q10을 경구투여한 군에서는 여전히 연골이 잘 유지되어 있음을 확인하였다. 따라서 상기 실험을 통해 코엔자임 Q10이 연골의 파괴를 억제함으로써 골관절염에 대한 우수한 예방 및 치료 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.
<6-3> 골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP -13, IL -1b, IL -6, IL -15의 발현 확인
골관절염 동물 모델의 관절에서 MMP-13, IL-1b, IL-6, IL-15의 발현을 확인하기 위해 6주령의 Wistar rat에 MIA 주입 7일 후에 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, 면역조직화학 염색법으로 MMP-13, IL-1b, IL-6, IL-15의 발현을 관찰 비교 분석하였다.
그 결과 도 15에 나타난 바와 같이 코엔자임 Q10의 관절보호 및 치료 효과 메커니즘을 조사하기 위해서 Matrix degrading enzyme matrix metalloproteinase-13과 염증성 cytokine의 발현을 각 군의 관절에서 확인한 결과 관절파괴 관련 분자인 MMP13의 발현과 pro-inflammatory cytokine인 IL-1b, IL-6, IL-15의 발현이 코엔자임 Q10을 투여한 군에서 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다.
<6-4> 골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS , Nitrotyrosine , RAGE 의 발현 확인
골관절염 동물 모델의 관절에서 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 확인하기 위한 실험을 하였다. 6주령의 Wistar rat에 MIA 주입 7일 후에 rat의 관절을 채취하여 분리한 뒤, 면역조직화학 염색법으로 INOS, Nitrotyrosine, RAGE의 발현을 비교 분석 하였다.
그 결과 도 16과 같이 코엔자임 Q10이 catabolic factor인 INOS, Nitrotyrosine의 생성을 억제하고, glvcation end product인 RAGE의 발현을 억제함을 나타내었다.
따라서, 코엔자임 Q10이 골관절염 치료 효과가 우수하므로 노인성 골관절염 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나 또는 TH17, RORr T, CCL20의 발현을 감소시키거나 또는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 0.001uM 내지 5uM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역거부질환은 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease)인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 면역거부질환의 예방 또는 치료 효과는 체액성 면역반응(humoral response)을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 체액성 면역반응은 배중심(Germinal center) 및 형질세포(plasma cell)의 발현 및 TFH 세포의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절병증, 강직성 척추염, 건선관절염, 세균성 관절염, 소아기 류마티스관절염, 재발류마티스, 류마티스 다발근육통증, 라임 관절염, 유착 관절낭염 또는 염증성 장질환인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 코엔자임 Q10(coenzyme Q10)은 IL-21, IL-1b, IL-17, TNF-a 또는 VEGF 발현 감소 효과, 파골세포의 분화 억제 효과 또는 골(연골)보호 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 골보호 효과는 TRAP(tartrate-resistant acid-phosphatase), RANK(Receptor activator of nuclear factor kappa-B) 또는 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)의 발현 감소를 통한 것임을 특징으로 하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조절 T 세포를 활성화시키는 방법은 조절 T 세포에서 Foxp3의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법.
  12. 시험관(in vitro)내에서 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 Th17 세포에 처리하여 Treg 세포로 재분화 시키는 방법.
  13. 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
  14. 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포에 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
  15. 코엔자임 Q10(coenzyme Q10) 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제제.
KR1020130052669A 2012-05-09 2013-05-09 코엔자임 ｑ１０을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역거부질환의 예방 또는 치료용 조성물 KR20130125736A (ko)

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