KR20130117659A

KR20130117659A - 2-이미노비오틴 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20130117659A
Application number: KR1020127033825A
Authority: KR
Inventors: 폴 빌럼 테레지아 요제프 뢰프켄
Original assignee: 뉴로픽시어 비.브이.
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2013-10-28
Also published as: JP5798621B2; RU2627460C2; ES2759605T3; EP2575892B1; CA2837129A1; IL223269A0; KR101805950B1; AU2011258964B2; CA2837129C; BR112012030014B1; MX338405B; CN103037904B; US9616135B2; WO2011149349A1; NZ604498A; MX2012013695A; CN103037904A; EP2575892A1; US20150202303A1; BR112012030014A2

Abstract

본 발명은 2-이미노비오틴의 수용성을 개선하는 것에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 2-이미노비오틴을 투여로부터 이익을 얻는 질환 또는 상태에 있는포유동물에 투여하는데 적합한 조성물에 관한 것이다.

Description

2-이미노비오틴 조성물 및 그의 용도 {2-Iminobiotin formulations and uses thereof}

2-이미노비오틴은 신생아에서 출산전후기 질식(저산소증 허혈)의 영향을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있는 것으로 보고되었다(미국 특허 제6,894,069호, 상기 특허를 전부 본 명세서에 참조로 편입시킨다). 특히, 새끼 돼지에 대한 생체내 연구는 2-이미노비오틴이 알로푸리놀(allopurinol) 또는 데페록사민(deferoxamine)보다 상기 영향을 예방 및/또는 치료하는데 보다 효과적임을 입증하였다.

그러나, 생리적 pH에서 2-이미노비오틴의 낮은 용해도는 치료제로서 그의 유용성을 제한한다. 당해 기술분야에서 개선된 2-이미노비오틴 조성물 및 그의 용해도를 증가시키는 방법에 대한 필요가 있다. 본 발명은 그러한 개선을 제공한다.

본 발명의 한 태양은 약 3 내지 약 7의 pH를 가지고, 약 1mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체 및 약 2.5 내지 약 40%의 치환된 베타-시클로텍스트린을 포함하는, 2-이미노비오틴(2-IB) 또는 그의 유도체의 수용성 조성물을 제공한다.

한 실시형태로, 상기 조성물은 약 4 내지 약 7의 pH를 가지고, 약 2mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체, 및 약 2.5 내지 약 20%의 치환된 베타-시클로텍스트린, 바람직하게는 설포부틸-에테르-베타-시클로덱스트린(SBE-CD) 또는 히드록시프로필--베타-시클로덱스트린(HP-CD)을 포함한다.

한 실시형태로, 상기 조성물은 약 4 내지 약 5의 pH를 가지고, 약 3.5mg/ml 이상의 2-이미노비오틴, 및 약 2.5 내지 약 40, 바람직하게는 약 5 내지 약 10%의 치환된 베타-시클로텍스트린, 바람직하게는 설포부틸-에테르-베타-시클로덱스트린(SBE-CD) 또는 히드록시프로필--베타-시클로덱스트린(HP-CD)을 포함한다.

한 실시형태로, 상기 조성물은 약 4 내지 약 5의 pH를 가지고, 약 3 내지 약 5mg/ml, 바람직하게는 약 4 내지 약 5mg/ml의 2-이미노비오틴, 및 약 2.5 내지 약 5%의 치환된 베타-시클로텍스트린, 바람직하게는 설포부틸-에테르-베타-시클로덱스트린(SBE-CD) 또는 히드록시프로필--베타-시클로덱스트린(HP-CD)을 포함한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 용해도 증강제로서 시트르산 또는 그의 탈양성자화된 형태(시트레이트)를 추가로 포함한다.

한 실시형태로, 약 5의 pH를 가지고, 약 3mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 약 3 내지 약 40%, 바람직하게는 약 5%의 SBE-CD를 포함하는, 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체의 수용성 조성물이 제공된다.

한 실시형태로, 약 4의 pH를 가지고, 약 3mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 약 5 내지 약 40%의 HP-CD를 포함하는, 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체의 수용성 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약 5 내지 약 20%의 HP-CD를 포함한다.

한 실시형태로, 상기 조성물은 등장제로서 NaCl, 바람직하게는 0.1 내지 2%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 0.8%를 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 태양은 약 3 내지 약 7의 pH를 가지고, 약 0.75mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 포함하는, 2-이미노비오틴(2-IB) 또는 그의 유도체의 수용성 조성물을 제공한다. 놀랍게도, 2-IB는 시트르산 완충액에서 더 높은 용해도를 가지는 것으로 발견되었다. 본 명세서에서 시트르산 완충액은 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 의미하고, 예를 들어 시트르산나트륨 무수물(sodium citrate dehydrate)의 수용액을 포함한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 약 3 내지 약 7, 바람직하게는 약 3 내지 약 6, 보다 바람직하게는 약 3.5 내지 약 4.5, 보다 더 바람직하게는 약 4의 pH를 가지고, 약 0.5 내지 약 10mg/ml, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5mg/ml, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2mg/ml, 보다 더 바람직하게는 약 0.5 내지 약 1mg/ml의 2-이미노비오틴, 및 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약 1 내지 약 40, 약 5 내지 약 30, 바람직하게는 약 10 내지 약 20, 보다 바람직하게는 약 12.5 내지 약 17.5, 보다 더 바람직하게는 15mM의 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 포함한다. 완충액의 양이 목적하는 pH 수준을 달성하기 위해 조절될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 바람직하게는, 상기 조성물은 등장제로서 0.1 내지 2%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.5%의 NaCl을 포함한다. 조성물의 한 대표적인 예는 약 0.9% 농도의 NaCl을 포함한다.

바람직하게는, 상기 조성물은 인간 신생아에 투여하는데 적합하다. 바람직하게는, 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체는 5℃에서 최소한 3일 동안 용해성을 유지한다. 한 실시형태로, 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체는 5℃에서 최소한 0.5, 1, 1.5, 2 또는 3년 동안 용해성을 유지한다.

본 발명의 다른 태양은 신생아에서 출산 중 합병증의 영향을 치료, 바람직하게는 출산전후기 질식 또는 그의 위험을 치료하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체의 조성물을 제공한다. 한 실시형태로, 상기 조성물은 신생아에 투여된다. 한 실시형태로, 상기 조성물은 분만 전 및/또는 분만 중에 산모에 투여된다.

본 발명의 다른 태양은 출산 중 합병증의 영향을 치료, 바람직하게는 출산전후기 질식 또는 그의 위험을 치료하는데 사용하기 위한 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체의 용도를 제공하며, 상기 치료는 신생아를 저체온화하는 것과 병용된다.

본 발명의 또 다른 태양은 치료적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 조성물을 그를 필요로 하는 신생아에게 투여하는 단계를 포함하는, 신생아에서 출산 중 합병증의 영향을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시형태로, 상기 조성물은 분만 전 및/또는 분만 중에 그를 필요로 하는 산모에게도 투여되거나 산모에게만 투여된다. 바람직하게는, 합병증은 출산전후기 질식 또는 그의 위험이다.

본 발명의 또 다른 태양은 치료적으로 유효한 양의 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체를 그를 필요로 하는 신생아에게 투여하는 단계 및 신생아를 저체온화하는 단계를 포함하는, 신생아에서 출산 중 합병증의 영향을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시형태로, 상기 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체는 분만 전 및/또는 분만 중에 그를 필요로 하는 산모에게도 투여되거나 산모에게만 투여된다. 바람직하게는, 합병증은 출산전후기 질식 또는 그의 위험이다. 바람직하게는, 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체는 본 발명에 따른 조성물에 존재한다.

본 발명의 또 다른 태양은 출산 중 합병증의 영향을 치료하기 위한 본 발명에 따른 조성물로 의약을 제조하기 위한 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체의 용도를 제공한다. 한 실시형태로, 상기 치료는 신생아를 저체온화하는 것과 병용된다. 바람직하게는, 합병증은 출산전후기 질식이다. 상기 조성물은 또한 2-이미노비오틴 치료에 반응성인 질환 또는 질병을 치료하는데 사용하기 위해 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양은 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체를 베타-시클로덱스트린을 포함하는 수용액에 용해시키는 단계 및 용액의 pH를 조절하여 2-이미노비오틴 또는 그의 유도체 용액을 수득하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 2-이미노비오틴 용액의 pH는 시트르산을 사용하여 조절된다. 바람직하게는, pH는 약 3 내지 약 7로 조절된다. 바람직하게는, 수용액은 pH 4 내지 6.6이다. 바람직하게는, 베타-시클로덱스트린은 SBE-CD이다. 바람직하게는, 수용액은 NaCl을 포함한다. 바람직하게는, 수용액은 시트르산 또는 그의 탈양성자화된 형태를 포함한다.

바람직하게는, 2-IB 유도체는 2-이미노비오틴 카르복시 유도체이다. 바람직하게는, 2-이미노비오틴 카르복시 유도체는 2-이미노비오틴 히드라지드 및/또는 2-이미노비오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 2-IB를 포함한다.

2-이미노비오틴(2-IB)는 수용성이 저조하여 투여용 수용액으로 제형화하기 어렵다(비교예 참조). 본 발명에 따르면, 2-IB를 시트르산/시트레이트 완충액 및/또는 치환된 베타-시클로덱스트린에 가하여 수용액으로 제형화될 수 있도록 2-IB의 수용성이 충분히 증가될 수 있음이 발견되었다. 본 명세서에서 "불용성" 및 "저조한 용해성"이란 용어는 약물의 특징을 수용성과 관련하여 표현하기 위해 사용된다. 본 명세서에서 불용성은 0.1mg/ml 미만의 용해도를 의미하고, 저조한 용해성은 0.1 내지 1mg/ml 범위의 용해도를 의미한다.

2-IB의 용해도는 pH 의존적이다. 물에서 2-IB의 용해도는 pH 7.4에서 약 0.34mg/ml이고, pH 5에서 약 0.59mg/ml이며, pH 3.5에서 약 4.5mg/ml이다. 낮은 pH 용액의 근육내 투여는 대상에서 통증을 유발하고(Rukwied R., J Pain. 2007 May;8(5):443-51), 지속적인 정맥내 주입으로 투여되는 경우에는 대사성 산증을 초래할 수 있기 때문에(Federman MD, Clinical Neuropharmacology 2009 Nov-Dec;32(6):340-1), 본 발명의 한 목적은 치료적 환경에서 투여에 적합한 pH 및 2-IB 농도의 2-IB 조성물을 제공하는 것이다.

예를 들어, 질식 또는 저산소증과 연관된 상태의 치료에서, 효과적이기 위해서는 치료적으로 유효한 양의 약물이 특정 기간 내에 투여될 필요가 있다. 종래기술의 조성물로는, 2-IB의 낮은 용해도로 인해 상당한 부피의 2-IB 용액이 투여될 필요가 있다. 투여될 필요가 있는 용액의 부피가 클수록, 체내에 치료적으로 유효한 농도가 도달되기 전 시간이 더 길다. 신생아의 치료와 같은 몇몇 용도에서, 적정 약물 농도 내에서 투여될 필요가 있는 용액의 부피는 제한 요인이다. 통상적으로 질식기(asphyxiated term) 신생아에게 정맥내 투여하는데 안전한 것으로 고려되는 유체의 최대량은 50ml/kg/일이다. 2-IB의 용해도를 증가시킴으로써, 약물은 더 빨리 더 작은 부피로 투여될 수 있다.

2-IB 조성물은 장기간, 바람직하게는 수년 동안 안정한 것이 최적이다. 아울러, 상기 조성물은 5℃와 같이 냉장 보관되는 경우에도 침전되지 않아야 한다.

다양한 약물 조성물이 다양한 용매, 공용매, 계면활성제, 시클로덱스트린 및 기타 부형제를 사용하여 제조되었다. 2-IB의 용해도는 낮거나 조성물은 독성이 있었다(비교예 참조). 놀랍게도, 2-IB를 1% 초과, 특히 2.5% 이상의 치환된 베타-시클로덱스트린, 및/또는 시트르산 완충액과 제형화는 것은 적절한 pH 수준에서 증가된 용해도의 용액을 제공하였다.

본 발명에 따른 조성물은 2-IB(C₁₀H₁₇N₃O₂S)뿐만 아니라 2-IB 유도체의 약학적 용액을 제조하는데 적합하다. 2-IB 유도체는 2-이미노비오틴 카르복시 유도체를 포함한다. 2-이미노비오틴 카르복시 유도체는 iNOS의 저해제인 것으로 알려져 있으며, 이는 2-IB의 유리 카르복시기가 iNOS 저해에 필수적이지 않다는 것을 의미한다(Sup SJ, et al. Biochem and Biophy Res Comm 1994 204:962-968). 바람직하게는, 2-이미노비오틴 카르복시 유도체는 2-이미노비오틴 히드라지드 및/또는 2-이미노비오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물은 2-IB를 포함한다.

시클로덱스트린은 구조 및 성질이 다양한다. 예를 들어, 소수성 공동(cavity)의 크기(예를 들어, 직경 및 깊이) 및 기능성(예를 들어, 소수성, 전하, 반응성 및 수소결합능)은 치환 및 비치환 알파-, 베타- 및 감마-시클로덱스트린에 따라 다르다. "시클로덱스트린"이란 용어는 시클릭 알파 결합된 D-글루코피라노스 단위를 포함하는 화합물을 의미한다. 알파-시클로덱스트린은 6개의 시클릭 결합된 D-글루코피라노스 단위를 의미하고, 베타-시클로덱스트린은 7개의 시클릭 결합된 D-글루코피라노스 단위를 가지며, 감마-시클로덱스트린은 8개의 시클릭 결합된 D-글루코피라노스 단위를 가진다. 상기 시클릭 결합된 D-글루코피라노스 단위는 소수성 공동을 규정하고, 시클로덱스트린은 고체 상태 또는 수용액에서 다른 유기 분자, 염 및 할로겐과 내포 화합물을 형성하는 것으로 알려져 있다. 통상적으로, 조성물을 위해 선택되는 시클로덱스트린은 조성물의 목표 성분 및 기타 성분에 적합한 크기 및 기능성을 가진다. 불행하게도, 시클로덱스트린 착물화가 불가능하거나 어떠한 분명한 이점도 제공하지 않는 약물이 많다(J. Szejtli, Cyclodextrins in Drug Formulations: Part II, Pharmaceutical Technology, 24-38, August, 1991).

치환된 시클로덱스트린은 측쇄로서 어떠한 유기 부분 또는 헤테로유기 부분도 포함할 수 있다. 바람직한 시클로덱스트린은 알킬화 또는 히드록시알킬화되거나, 반응하여 설포알킬 에테르를 형성한 치환된 베타-시클로덱스트린을 포함한다. 바람직한 베타-시클로덱스트린은 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린, 예를 들어 (S)-2-히드록시프로필-베타-시클로덱스트린, 2-O-[(S)-2'-히드록시프로필]-베타-시클로덱스트린. 2-O-[(R)-2'-히드록시프로필]-베타-시클로덱스트린, 6-O-[(S)-2'-히드록시프로필]-베타-시클로덱스트린. 2-O-[(R)-2',3'-히드록시프로필]-베타-시클로덱스트린; 히드록시에틸-베타-시클로덱스트린; 카르복시메틸-베타-시클로덱스트린; 카르복시메틸-에틸-베타-시클로덱스트린; 디에틸-베타-시클로덱스트린; 디메틸-베타-시클로덱스트린; 글루코실-베타-시클로덱스트린; 히드록시부테닐-베타-시클로덱스트린; 말토실-베타-시클로덱스트린; 및 설포부틸에테르-베타-시클로덱스트린을 포함한다. 본 조성물 및 방법에 있어서, 치환된 베타-시클로덱스트린, 예를 들어 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린 및 설포부틸에테르-베타-시클로덱스트린은 조성물의 다른 성분을 보완하는 크기 및 기능성을 가지는 것으로 생각된다. 보다 바람직하게는, 시클로덱스트린은 설포부틸에테르-베타-시클로덱스트린("SBE-CD")이다.

두 종류의 치환된 베타-시클로덱스트린이 2-IB 조성물에서 시험되었다. 둘다 2-IB의 용해도를 현저히 증가시켰다(실시예 참조). 설포부틸에테르-베타-시클로덱스트린(SBE-CD)는 나트륨 설포네이트 염이 부틸 에테르 스페이서기에 의해 소수성 공동으로부터 분리된 상업적으로 입수가능한 다음이온성 베타-시클로덱스트린 유도체 또는 설포부틸에테르이다(캡티솔(Captisol^TM)은 CyDex Inc.로부터 입수가능한 7치환된 설포부틸에테르-베타-시클로덱스트린의 상품명이다).

히드록시프로필-베타-시클로덱스트린(HP-CD)는 Roquette Pharma S.A.로부터 클렙토스(Kleptose^TM)로서 상업적으로 입수가능한 베타-시클로덱스트린 유도체이다. 시클로덱스트린은 미국 특허 제5,134,127호 및 제5,376,645호에 추가로 기재되어 있으며, 이들 특허의 전체 내용을 본 명세서에 참조로 편입시킨다.

본 발명에 따른 2-IB 조성물은 2-IB와 치환된 베타-시클로덱스트린의 건조 물리적 혼합물 또는 건조 내포 복합체로 형성되고, 물의 부가 시 재구성되어 수성 조성물을 형성할 수 있다. 대안적으로, 수성 조성물은 동결건조되고, 나중에 물로 재구성될 수 있다.

한 실시형태로, 본 발명에 따른 2-IB 조성물은 수용액의 형태이고, pH를 약 4 내지 약 7의 범위 내로 조절하기 위해 산 완충액을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 산 완충액의 예는 염산, 황산, 인산, 브롬화수소산 등과 같은 산, 및 옥살산, 말레산, 푸마르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 아세트산, 메탄술폰산, 톨루엔술폰산, 벤젠술폰산, 에탄술폰산 등과 같은 유기산을 포함한다. 상기 산의 산염도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 목적하는 pH를 달성하기 위해 충분한 시트르산 및/또는 시트르산나트륨 또는 기타 시트레이트염을 포함한다. 한 실시형태로, 상기 조성물은 1 내지 25mM의 시트르산을 포함한다. 한 실시형태로, 상기 조성물은 0.1 내지 5mM의 시트르산나트륨을 포함한다. 한 실시형태로, 상기 조성물은 20mM 이상의 시트르산/시트레이트를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약 1 내지 약 40, 약 5 내지 약 30, 바람직하게는 약 10 내지 약 20, 보다 바람직하게는 약 12.5 내지 약 17.5mM의 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약 15mM의 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 포함한다.

본 발명에 따른 2-IB 조성물은 다음과 같이 제조될 수 있다: 시트르산 또는 다른 산 완충액을 주입용 물에 용해시킨다. 치환된 베타-시클로덱스트린(바람직하게는 SBE-CD)를, 사용되는 경우, 산 완충액-물 용액에 용해시킨다. 그런 다음, 2-IB를 상기 용액에 용해시킨다. 대안적으로, 치환된 베타-시클로덱스트린(바람직하게는 SBE-CD)를, 사용되는 경우, 물 용액에 용해시킨 다음, 2-IB를 상기 용액에 용해시킨다. pH를 약 3 내지 약 6의 범위 내로 조절한다.

상기 조성물은 바람직하게는 멸균 및 무발열물질로 사용을 위해 제조 및 포장된다. 예를 들어, 생성된 용액은 무균 여과, 예를 들어 0.22 마이크론 멤브레인 필터를 통해 무균 여과되고 멸균 바이알에 충진될 수 있다. 바이알은 봉쇄 및 밀봉되고 최종 멸균될 수 있다. 또한 상기 용액은 앰플, 주사기, IV 백 또는 기타 용기에 제공될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 단일 투여량 단위로 제공된다. 상기 조성물은 2-IB 안정성에 영향을 주지 않고 가압멸균될 수 있다(표 24).

또한 등장제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 약학적 제형의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 가능하게 될 수 있다.

소아 투여용 2-IB 조성물은 바람직하게는 사용금지 부형제(예를 들어, 락트산, 도큐세이트 나트륨(docusate sodium), 프로필렌 글리콜 등)을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 소아 투여용 조성물은 벤질 알코올, 프로필 갈레이트(proply gallate), 폴리소르베이트 20, 40 또는 60, 벤조산나트륨, 티메로살(thimerosal), 낙화생유 또는 붕산도 포함하지 않는다. 당업자의 판단으로 적절한 첨가제를 선택할 수 있다.

바람직하게는, 2-IB 조성물은 등장성이다. 한 실시형태로, 2-IB 조성물은 NaCl, 바람직하게는 0.1 내지 0.9%, 보다 바람직하게는 0.2 내지 0.9%를 추가로 포함한다. 한 실시형태로, 2-IB 조성물은 글루코스, 락토스 또는 만니톨과 같은 당, 바람직하게는 1 내지 5%, 보다 바람직하게는 2 내지 5%를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 특히 소아용 조성물의 경우에, 당은 글루코스이다. 상기 조성물은 NaCl과 당의 조합을 조성물이 등장성이 되도록 하는 양으로 포함할 수 있다.

본 발명은 2-IB의 용액 및 제형, 바람직하게는 비경구 투여용 용액 및 제형을 제공한다. 본 명세서에서 비경구 투여는 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피내(intradermal), 복강내, 경기관(transtracheal), 피하(subcutaneous), 표피하(subcuticular), 관절내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수강내(intraspinal) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함하나 이에 한정되지 않는 투여 방식을 의미한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 정맥내 투여된다.

상기 조성물은 바이알, 앰플, 주사기, IV 백 또는 기타 용기에 제공될 수 있다. 그들은 대상에 직접 투여되거나 추가로 희석될 수 있다. 조성물의 투여량 농축액은 희석 즉시 또는 필요시 희석 후 24시간 이내와 같이 표준 치료 기간 동안 사용될 조성물의 양을 함유한 밀봉된 용기에 제공될 수 있다. 정맥내 투여용 용액은, 예를 들어 투여량 농축액 조성물을 용기(예를 들어, 유리 또는 플라스틱 병, 바이알, 앰플)에 희석제와 함께 가하여 투여를 위한 목적하는 농도를 달성함으로써 제조될 수 있다.

액체 투여량 농축액에 수성 용매의 부가는 투여량 농축액의 일정 부분 또는 전체를 희석을 위해 제거함으로써 단위 투여량의 액체 약학적 조성물을 형성하기 위해 편리하게 사용될 수 있다. 투여량 농축액은 적절한 수성 용매를 함유한 정맥내(IV) 용기에 부가될 수 있다. 유용한 용매는 주사용 표준 용액(예를 들어, 5% 덱스트로스, 식염수, 락테이티드 링거 또는 주사용 멸균수 등)이다. 통상적인 단위 투여량 IV 백은 입구와 출구를 가지고 표준 용량(예를 들어, 25 mL, 50 mL, 100 mL 및 150 mL)를 가지는 종래의 유리 또는 플라스틱 용기이다.

다른 실시형태로, 제공된 제형을 사용 시까지 조성물을 광으로부터 보호하는 용기에 포장하는 것이 바람직할 수 있다. 한 실시형태로, 그러한 광보호 용기의 사용은 하나 이상의 분해 경로를 억제할 수 있다. 예를 들어, 바이알은 내용물을 광에 노출되는 것으로부터 보호하는 광 용기일 수 있다. 추가로 및/또는 대안적으로, 바이알은 조성물을 광에 노출되는 것으로부터 보호하는 어떠한 종류의 용기에도 포장될 수 있다(예를 들어, 바이알의 2차 포장). 유사하게, 어떠한 다른 종류의 용기도 광보호 용기이거나, 광보호 용기 내에 포장될 수 있다.

상기 조성물은 어떠한 척추동물도 포함하는 대상, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에 투여될 수 있다. 대상의 예는 인간, 비인간 영장류, 설치류, 기니아 피그, 토끼, 양, 돼지, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 새 및 물고기를 포함한다.

한 실시형태로, 2-IB 조성물은 갓난아이, 특히 출산 중 합병증, 특히 저산소증 허혈을 유발할 수 있는 출산전후기 질식을 겪거나, 겪을 것으로 예상되거나, 또는 위험이 있는 것으로 판단되는 신생아에 투여하는데 적합한다. 출산전후기 질식은 출산 전 또는 후에도 발생할 수 있고, 또한 본 발명에 따른 2-IB 조성물로 치료하는데 적합하다. "갓난아이" 및 "신생아"라는 용어는 자연분만에 의해 태어난 아이뿐만 아니라, 예를 들어 제왕절개에 의해 태어난 아이를 포함하고, 조산아 및/또는 인공분만아도 포함한다.

한 실시형태로, 2-IB 조성물은 질식된 갓난아이가 예상되는 경우에, 태아의 어미에 투여하는데 적합한다. 어미(산모)라는 용어는 태아 또는 갓난아이의 어미를 의미하며, 자연, 수정, 유도 및 대리 어미를 포함한다.

통상적으로, 2-IB 조성물에 의한 신생아의 치료는 출산 직후, 예를 들어 치료적 개입을 위한 "윈도우(window)" 동안에 수행될 것이다. 통상적으로, 상기 윈도우는 출산 후 첫째 날, 특히 출산 후 첫 0-24시간의 기간이다. 그러나 질식된 갓난아이가 예상되는 경우에, 치료는 예상되는 분만 전, 특히 분만 전 약 0-24시간에 산모에 수행될 수 있다.

상기 치료의 일부로서, 2-IB 조성물은 일반적으로 신생아에 하나 이상의 약학적으로 유효한 양, 특히 상기 영향을 예방 및/또는 치료하는데 효과적인 하나 이상의 양으로 투여될 것이다. 그러한 치료는 단일 투여를 포함할 수 있으나, 통상적으로 그리고 바람직하게는 수시간 또는 수일에 걸쳐, 예를 들어 투여 요법 또는 치료 요법의 일부로서 또는 투여 요법 또는 치료 요법에 따라 다수 투여를 포함한다. 그러한 치료 요법은 예를 들어 다음과 같을 수 있다: 첫 24시간 동안 4시간 마다 물질의 정맥주사.

통상적으로, 신생아에 투여되는 2-IB의 양은 하루에 체중 1kg당 0.01 내지 30mg, 바람직하게는 하루에 0.1 내지 25mg/kg, 보다 바람직하게는 1.8 내지 12mg/kg/day에 해당할 것이다. 상기 양은 활성 성분을 의미하고 탄수화물, 지방 또는 단백질 등과 같은 보조제(adjuvant) 또는 담체를 포함하지 않는다. 상기 양은 하루에 단일 투여량 또는 다수 투여량으로 투여되거나, 일정 시간 동안 본질적으로 지속적으로, 예를 들어 지속 주입에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 2-IB는 3-6 투여량/일로 투여된다. 바람직하게는, 2-IB는 사람 신생아에 0.01 내지 1mg/kg, 바람직하게는 0.05 내지 0.75mg/kg, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.5mg/kg의 투여량으로 투여된다. 투여량의 대표적인 예는 0.075, 0.45, 바람직하게는 0.15mg/kg이다.

치료는 질식 후 24, 48 또는 72시간까지, 또는 신생아에게 더 이상 상기 영향의 위험이 없는 것으로 판단될 때까지 계속될 수 있다. 그러나 치료, 특히 예방적 치료는 분만 전 또는 분만 동안 산모에 2-IB 조성물의 투여를 포함할 수도 있다. 상기 조성물은 산모에, 예를 들어 경구적으로, 피하 또는 정맥 주사에 의해 투여될 수 있다. 이때 투여되는 양은 화합물의 태반이동 및 대사, 간초회통과효과 및 분포용적에 따라, 동일하거나 더 많을 수 있다. 따라서 산모에 투여되는 양은 예를 들어, 하루에 산모의 체중 1kg당 0.01-25mg의 활성 성분일 수 있다.

본 발명의 한 태양은 저체온화와 병용하여 2-IB를 투여하는 것을 포함하는 출산 중 합병증의 치료를 제공한다. 저체온화는 몇몇 뇌 손상 모델에서 치료 효과를 나타내는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 신생아 질식의 시험관내 모델(Onitsuka, M., et al. 1998. Mild hypothermia protects rat hippocampal CA1 neurons from irreversible membrane dysfunction induced by experimental ischemia. Neuroscience Research 30:1-6) 및 생체내 모델(Debillon, T., et al. 2003. Whole-body cooling after perinatal asphyxia: a pilot study in term neonates. Developmental Medicine and Child Neurology 45:17-23) 둘 다에서 저체온화의 유리한 효과를 보여주는 다수의 문헌이 존재한다.

본 명세서에서 "저체온화"라는 용어는 특정 대상(이 경우에는, 신생아)을, 예를 들어 수동적 또는 능동적 기법에 의해 신체 온도를 낮춤으로써, 저체온 상태로 하는 것을 의미한다. 통상적으로, 저체온 상태로 하는 것은 대상의 신체 조직의 대사 감소를 유도하여, 산소에 대한 필요를 감소시킨다.

한 실시형태로, 포유동물의 심부 체온은 포유동물에 대한 정상 심부 체온보다 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10° 낮아진다. 한 실시형태로, 포유동물의 심부 체온은 포유동물에 대한 정상 심부 체온보다 1-10, 2-6, 바람직하게는 2-4° 낮아진다.

한 실시형태로, 포유동물의 온도는 약 31 내지 약 37℃의 온도로 유지된다. 보다 바람직하게는, 포유동물의 온도는 약 32 내지 약 36℃, 보다 바람직하게는 약 32 내지 약 35℃, 보다 더 바람직하게는 약 33 내지 약 35℃의 온도로 유지된다.

신체의 심부 온도를 낮춤으로써 저체온화를 유도하는 것은 당해 기술분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 통상적인 저체온화 유도 방법은 신체 전체 또는 머리 냉각을 사용한다. 저체온화는 빙수/냉수 또는 표면 냉각(Olympic CoolCap^TM system ) 및 큰 용기에 담긴 카테테르를 사용한 냉각과 같은 기계적 냉각 장치를 사용하여 유도될 수 있다. 대안적으로, 저체온화는 예를 들어, 바닐로이드 수용체 작용제(vanilloid receptor agonist), 캡사이시노이드(capsaicinoid) 또는 캡사이시노이드 유사 작용제(미국 특허공개 제20090197966호, 상기 특허를 본 명세서에 참조로 편입시킨다) 및 NT69L 및 NT77과 같은 혈액뇌장벽을 통과할 수 있는 뉴로텐신 유사체(미국 특허 제7,319,090호, 상기 특허를 본 명세서에 참조로 편입시킨다)와 같은 약제를 사용하여 유도될 수 있다.

저체온화와 2-IB는 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 "동시에"는 2-IB가 저체온화와 동시에 투여되는 것을 의미하기 위해 사용되는 반면, "병용하여"라는 용어는 2-IB가, 동시가 아니라면, 2-IB 및 저체온화 모두 치료적 효과를 나타내는 기간 내에 "순차적으로" 투여되는 것, 즉 둘 다 동일한 기간 내에 치료적으로 작용하도록 이용가능한 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서 "순차적" 투여는 2-IB가 저체온화 전 또는 후 5분, 10분 또는 수시간 내에 투여되도록 할 수 있다. 다만, 2-IB의 순환 반감기는 신생아가 저체온 상태에 노출될 때 2-IB가 치료적으로 유효한 양으로 존재하도록 하는 것이어야 한다.

"병용하여" 또는 "순차적으로"와 달리, 본 명세서에서 "별개로"는 2-IB의 투여와 신생아의 저체온화 사이의 갭이 현저한 것, 즉 신생아가 저체온 상태에 노출되었을 때, 2-IB가 더 이상 혈류에 치료적으로 유효한 양으로 존재하지 않음을 의미하기 위해 사용된다.

한 바람직한 실시형태로, 2-IB는 치료적으로 유효한 양으로 투여된다.

다른 바람직한 실시형태로, 2-IB는 치료적으로 유효한 양 미만으로 투여된다. 다시 말해, 2-IB는 저체온 상태 없이 투여되는 경우 목적하는 치료 효과를 나타내는데 불충분한 양으로 투여된다. 보다 더 바람직하게는, 2-IB와 저체온화의 병용은 시너지 효과를 가진다. 즉, 병용은 상승적이다.

한 실시형태로, 저체온화는 저산소 허혈(hypoxic-ischemic: HI) 손상 또는 출산 후 최소한 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 또는 96시간 동안 유지된다. 한 바람직한 실시형태로, 저체온화는 저산소 허혈 손상 또는 출산 후 약 6 내지 약 24시간, 바람직하게는 최소한 72시간 동안 유지된다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 따른 치료는 저산소 허혈 손상 약 6시간 내에, 보다 바람직하게는 약 2시간 내에, 보다 더 바람직하게는 1시간 내에 시작된다.

본 발명의 다른 태양으로, 2-IB는 저산소 손상 전에 투여된다. 따라서 한 바람직한 실시형태로, 2-IB는 출산 전에 산모를 경우하여, 예를 들어 분만 전 또는 분만 동안 산모에 투여함으로써 신생아에 투여된다. (a) 치료적으로 유효한 양의 2-IB를 분만 전 및/또는 분만 동안 포유동물의 어미에게 투여하는 단계; 및 (b) 포유동물을 출산 후에 저체온화하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 포유동물에서 신생아 질식을 치료하는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 2-IB가 출산 전 약 48 또는 24시간까지 산모에게 투여된다. 출산 후에, 신생아는 저체온 상태로 된다. 한 실시형태로, 2-IB는 산모가 위험한 것으로 발견되거나, 태아가 질식성인 것으로 발견되거나, 성장을 지연하자마자 산모에게 투여된다.

"약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정확도를 고려할 때 측정된 양의 허용가능한 정도의 오차를 의미한다. 통상적으로, 오차의 정도의 대표적인 예는 일정 값 또는 값 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내이다.

본 명세서에서 질환 또는 상태를 "예방"하는 치료제는 통계적 샘플에서, 치료되지 않은 대조 샘플에 비해 치료된 샘플에서 질환 또는 상태의 발생을 감소시키거나, 치료되지 않은 대조 샘플에 비해 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 발생을 지연시키거나 증증도를 감소시키는 화합물을 의미한다.

"치료"라는 용어는 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함한다. "예방적 또는 치료적" 처치라는 용어는 당해 기술분야에서 이해되며, 하나 이상의 대상 조성물의 호스트에의 투여를 포함한다. 원치 않는 상태(예를 들어, 호스트 동물의 질환 또는 기타 원치 않는 상태) 의 임상적 표시 전에 투여되는 경우 처치는 예방적(즉, 호스트를 원치 않는 상태가 발생하지 않도록 보호)인 반면, 원치 않는 상태의 임상적 표시 후에 투여되는 경우 처치는 치료적(즉, 존재하는 원치 않는 상태 또는 그의 부작용을 감소시키거나, 완화하거나, 안정화)이다.

도 1은 다른 pH에서 10% SBE-CD의 존재 및 부재 하에 2-IB의 용해도이다.

2-IB는 산성 카르복실산기뿐만 아니라 염기성 아미노기도 가진다. PrologP 계산 소프트웨어를 사용한 이들 기의 계산된 pKa는 카르복실산기가 4.78이고 아미노기가 11.48이다. 2-IB에 존재하는 산성기 및 염기성기로 인해, 2-IB는 중성 pH 범위에서 양쪽성이온 특성을 나타낸다. 그 결과, 2-IB의 수용해도는 매우 pH 의존적이고 중성 pH 조건에서 35g/l의 계산값보다 훨씬 더 낮다(표 1 참조). 2-IB의 양쪽성이온 성질로 인해, 적합한 조성물을 개발하는 것이 어렵다. 하기 비교 실시예는 IV 투여에 적합한 2-IB의 조성물을 개발하기 위한 다수의 시도를 보여준다.

비교예 1: 용매 선택

2-IB의 용해도를 하기 용매에서 측정하였다.

- 물 중 0.9% 염화나트륨

- 물 중 5% 덱스트로스

- N,N-디메틸아세트아미드

- N,N-디메틸포름아미드

- 디메틸 술폭시드

- 에탄올

- 프로필렌 글리콜

- 폴리에틸렌글리콜 400

- 옥수수유

약 10mg의 2-IB를 측량하여 10ml 튜브에 넣었다. 그런 다음, 각 용매의 작은 분취량(100㎕ - 100㎕ - 200㎕ - 400㎕ - 800㎕ - 1600㎕ - 3200㎕)을 단계적으로 부가하였다. 각각의 부가 후에, 용액을 강하게 혼합하고 시각적으로 용해도로를 판단하였다. 모든 용매에 대해 최종 부피는 6400㎕(1.6mg/ml)이었다.

모든 실험에서, 6400㎕의 용매의 부가 후에 다량의 비용해 2-IB가 남아 있었으며, 이는 2-IB가 상기 용매 중 어느 것에도 충분히 용해성이 아님을 의미한다. 100㎕의 1N 염산의 부가 후에, 2-IB는 모든 용매에 완전히 용해되었다. 이는 2-IB의 양쪽이온성 특성 및 용해도에 대한 pH의 강한 영향을 추가로 보여준다. 시각적으로, 2-IB의 가장 많은 부분이 프로필렌 글리콜에 용해되었다. 따라서 200㎕ 프로필렌 글리콜 다음에 100㎕ 1N 염산을 부가하면서(즉, 10mg 2-IB + 200㎕ 프로필렌 글리콜 + 100㎕ 1N 염산), 프로필렌 글리콜에 대해 실험을 반복하였다. 이에 의해 완전히 용해되고 안정한 33mg/ml 2-IB 용액이 생성되었다. 상기 조성물에 물을 가하면 즉시 2-IB가 침전되었으며, 이는 상기 방법이 IV 조성물로의 실행가능한 루트가 아님을 보여준다.

시험된 모든 용매가 2-IB의 완전한 가용화를 위해 산의 부가를 필요로 하였기 때문에, 물 중 5% 덱스트로스로 계속하기로 결정하였다. 이는 다른 용매가 분명히 IV 도입 동안 훨씬 덜 생체적합성이거나 염석 효과의 더 큰 위험을 가지고 있기 때문이다(물 중 0.9% 염화나트륨). 5% 덱스트로스 중 산성화된 2-IB 조성물이 제조되는 경우, 산성화 후의 pH는 1-5mg/ml 범위의 명목 2-IB 농도에 대해 약 2이다. 0.1% 수산화나트륨으로 부분적인 중성화가 (명목 농도에 따라) 3-3.5의 pH까지 가능하지만, 결국 2-IB의 침전이 처음에는 매우 미세한 "모발" 같은 침상으로 발생하여 더 큰 응집체로 성장한다. 시각적으로 관찰할 때 7의 pH에서 거의 모든 2-IB가 용액으로부터 침전하였다.

비교예 2: 계면활성제

용해도 증강 특성을 위해 하기 계면활성제를 시험하였다.

- 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드(양이온성 계면활성제, 1%)

- 폴리옥시에틸렌(40)스테아레이트(비이온성 계면활성제, 1%, 0.1% 및 0.01%)

- 폴리소르베이트 80(비이온성 계면활성제, 1%)

- 나트륨 도데실설페이트(음이온성 계면활성제, 1%, 0.1%, 0.01%)

계면활성제의 모액을 5% 덱스트로스에서 제조하였다. 사용된 시험 방법은 비교예 1에 기재된 바와 같이, 소량의 2-IB(10mg)에 각각의 계면활성제 용액을 단계적으로 부가하는 것이었다. 2-IB는 산의 부가 없이 1.6mg/ml의 명목 농도에서 어느 계면활성제 용액에도 용해되지 않았다. 산의 부가 후에, 그것은 완전히 용해되었으나, 0.1N 수산화나트륨으로 그 후의 (부분적인) 중화 후에는 계면활성제가 없는 실험에서 관찰된 바와 정확히 동일하게 2-IB가 다시 침전되었다. 따라서 계면활성제는 2-IB의 용해도를 증가시키지 않으므로(낮은 pH에서도 아님) 조성물에 유용한 부가가 아니다.

표 1은 다양한 조성물에서 2-IB 용해도의 몇가지 예를 보여준다. 과량의 2-IB를 용매/계면활성제 용액에 가하고, 상온에서 혼합한 다음, 여과하여 비용해 2-IB를 제거하였다. 그런 다음, 이들 용액을 RP-HPLC에 의해 분석하여 2-IB의 용해된 함량을 측정하였다.

[표 1] 2-IB의 개관

비교예 3: 시클로덱스트린

하기 시클로덱스트린을 모두 5% 덱스트로스 용액 중 1% 농도에서 시험하였다.

- α-시클로덱스트린

- β-시클로덱스트린

- 히드록시프로필-α-시클로덱스트린

- (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린

- (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린

계면활성제와 유사하게, 용해도의 증가가 어떠한 실험 동안에도 관찰되지 안았으며, 낮은 pH에서도 아니었다.

비교예 4: 신규한 부형제

마지막으로 두 신규한 부형제, 크레모포(Cremophor) EL 및 솔루톨(Solutol) HS 15를 시험하였다. 이들 부형제의 모액을 5% 덱스트로스 중 10%의 농도로 제조한 다음, 단계적 용해도 방법을 수행하였다. 솔루톨 HS 15를 사용하여 최선의 결과가 (염산의 부가 후에) 얻어졌으므로 다음 단계는 솔루톨 HS 15 농도를 최적화하는 것이었다.

다섯 가지 농도, 5-10-15-20-25%의 솔루톨 HS 15를 약 5mg/ml의 조성물 농도에서 시험하였다(표 2). 2-IB의 최적 용해도는 20% 솔루톨 HS 15에서 관찰되었으나 여전히 매우 산성(pH < 2)의 초기 용액이 2-IB를 완전히 용해시키기 위해 필요하였다. 그러나, 이후에 수산화나트륨으로 부분적 중화 시, 2-IB의 침전이 더 높은 pH에서 덱스트로스 중 2-IB의 조성물에서 관찰된 것보다 훨씬 더 적은 양으로 발생하였다. 다양한 2-IB 조성물을 제조하고 48시간 동안 저장하여 2-IB 함량을 측정하였다.

[표 2]

¹ 1N 염산 및 0.1N 수산화나트륨을 사용하여 pH 조절

² 여과 후 농도 분석

본 프로젝트 동안 수행된 연구에 근거하여, 물 중 5% 덱스트로스 및 20% 솔루톨 HS 15로 구성된 비히클이 2-IB 조성물의 제조를 위한 최적의 비히클로서 선택되었다. 2-IB의 양쪽이온성 성질로 인해, 조성물은 비교적 낮은 pH(즉, < 3.5 - 3.6)에서만 제조될 수 있었다.

비교예 5: 솔루톨 HS 15 독성 시험

위스터(Wistar) 쥐에서 지속적 정맥내 주입을 통한 1차 독성 시험

그룹 I: 비히클 20% 솔루톨(지속적 정맥내 주입)

동물들에게 24시간 동안 4mL/kg/h의 투여량으로 비히클(5% 덱스트로스 중 20% 솔루톨)만 지속적으로 주입하였다.

사망은 발생하지 않았고 체중은 정상이었다. 구부린 자세 및 털세움이 주입 시작 후 약 12시간부터 계속 모든 동물에서 나타났다. 솔루톨 처리의 육안으로 보이는 영향을 조사하기 위해 부검을 하였다. 부검에서 육안으로 보이는 발견은 전신 및 체강의 황변(2/4), 대정맥에서 아주 적은 피브린 유사 코팅(4/4), 간의 강조된 소엽 패턴(1/4), 작은 간(1/4) 및 신장의 골반 팽창(1/4)으로 구성되었다.

그룹 II: 비히클 5% 솔루톨(지속적 정맥내 주입)

동물들에게 약 96시간 동안 4mL/kg/h의 투여량으로 비히클(5% 덱스트로스 중 5% 솔루톨)만 지속적으로 주입하였다.

사망은 발생하지 않았고, 어떠한 일관된 임상적 징후도 관찰되지 않았으며, 체중은 정상이었다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(2/3), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(2/3) 및 빌리루빈(2/3)의 중등도 내지 현저한 증가, 알칼리성 포스파타제(3/3) 및 글루코스(3/3)의 경미한 증가가 처치 종료 시점에서 발견되었다. 두 동물에서 혈장의 황변이 관찰되었다.

그룹 III: 5% 솔루톨 중 960mg/kg/24h의 2-IB(지속적 정맥내 주입)

동물들에게 5% 솔루톨/5% 덱스트로스를 사용하여 (4mL/kg/h의 투여량으로 10mg/mL의 투여 농도로) 지속적으로 주입하였다(덱스트로스 및 식염수의 최종 농도는 저장성(hypotonic), 각각 약 2.5% 및 0.45%이었다). 임상적 부작용 및 주입 시스템에서 조성물의 어려움(아마도 회전 고리에서, 주입 시스템의 막힘을 표시하는 펌프 알람)으로 인해, 46시간 후에 주입을 종료하였다.

동물 한 마리가 주입 46시간 후에 사망하였다. 두 마리의 체중이 증가하였다. 처치 2-3일에 모든 동물에서 구부린 자세, 털세움 및 창백함이 관찰되었다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(1/2), 알칼리성 포스파타제(1/2) 및 글루코스(2/2)의 경미 내지 중등도 증가뿐만 아니라, 크레아틴 및 소변(1/2)의 높은 값이 처치 종료 시점에서 발견되었다. 빌리루빈 수준은 정상 범위 이내이었다.

부검에서 육안으로 보이는 발견은 부종(2/3), 신장의 골반 팽창(2/3), 확장된 간(1/3), 확장된 장골 림프절(1/3), 폐의 암점(1/3) 및 대퇴 정맥 내 또는 주위의 피브린 유사 코팅으로 구성되었다.

따라서 5-20% 솔루톨에서 2-IB의 더 우수한 용해 특성이 발견되었지만, 상기 비히클은 적용된 투여량 및 비율에서 쥐에 지속적 정맥내 주입에 적합하지 않은 것으로 확인되었다.

비교예 6: pH

2-IB(5mg/ml)의 용해도를 다른 산을 사용하여 시험하였다. HCl을 사용한 pH 3.0과 비교하여 약산(아세트산 및 시트르산)을 사용한 비교적 더 높은 pH(pH 3.3)에서 용해성이 달성되었다. 이러한 차이는 pH 조절과 2-IB와 약산의 카르복실기 사이의 수소결합 형성의 시너지 효과 때문인 것 같다.

비교예 7: 시트레이트 완충액

과량의 2-IB를 시트레이트 완충액에 가하고, 상온에서 혼합한 다음, 여과하여 비용해 2-IB를 제거하였다. 그런 다음, 상기 용액을 RP-HPLC에 의해 분석하여 2-IB의 용해된 양을 측정하였다(표 3). 다양한 pH에서 50mM 시트레이트 완충액 중 2-IB의 용해도는 (상온) pH 3.0에서 11mg/ml로 측정되었다. pH 3.5에서는 거의 절반의 양의 2-IB가 용해되었다.

[표 3]

실시예 1

이전의 실험이 시클로덱스트린은 2-IB 용해도를 유의적으로 증가시키지 못함을 보여주었지만, 더 높은 농도의 시클로덱스트린을 사용하여 실험을 반복하였다. 놀랍게도, 1% 시클로덱스트린을 사용한 결과와 비교하여, 더 높은 농도의 시클로덱스트린은 2-IB 농도를 증가시킨다는 것을 발견하였다. 과량의 2-IB를 시클로덱스트린 용액에 가하고, 상온에서 3일 동안 혼합한 다음, 여과하여 비캡슐화/비용해 2-IB를 제거하였다. 그런 다음, 상기 용액을 RP-HPLC에 의해 분석하여 2-IB의 용해된 양을 측정하였다(표 13). 약 14mg/ml의 2-IB가 최종 조성물 pH가 5.1인 50mM 시트레이트 pH 4.0 중 40% SBE-CD에서 용해/캡슐화되었다. 최종 pH가 5.5인 시트레이트 완충액 pH 5를 사용한 40% SBE-CD에서는, 약 10mg/ml가 캡슐화되었다. 최종 pH가 6.8인 물을 사용한 40% SBE-CD에서는, 약 4.2mg/ml가 용해/캡슐화되었다. 상기 실험 결과는 적절한 수준의 2-IB가 비교적 낮은 pH, 낮은 초기 pH와 5-20% 시클로덱스트린 농도를 조합하여 캡슐화될 수 있음을 보여준다.

상기 결과는 사용된 두 종류의 시클로덱스트린에 대한 2-IB의 캡슐화 효율의 분명한 차이를 보여준다. 물과 SBE-CD(설포부틸에테르-β-시클로덱스트린)에서 2-IB의 용해도는 40% SBE-CD에서 4.2mg/ml의 2-IB가 캡슐화됨을 보여주며, 이는 40% HP-CD(히드록시프로필-β-시클로덱스트린)을 사용하여 캡슐화된 1.2mg/ml보다 훨씬 더 높다. HP-CD보다 SBE-CD에서 2-IB의 더 높은 용해도는 SBE-CD의 Mw(2163)가 HP-CD(1400)보다 크기 때문에 캡슐화에 의한 내포 착물화 때문만일 수는 없다.

수소결합 또는 전하 상호작용과 같은, 2-IB와 SBE-CD 사이의 다른 물리적 상호작용이 더 높은 용해도에 기여할 수 있다.

5℃에서 12시간 저장 후에 시클로덱스트린 조성물의 시각적 검사는 조성물 pH 및 시클로덱스트린의 농도 모두가 침전/캡슐화로부터의 방출 면에서 조성물의 안정성에 영향을 줌을 나타내었다(표 13). SBE-CD 조성물의 경우에는, 가장 낮은 시클로덱스트린 농도 또는 pH 4.4에서 2.5%의 조성물을 제외한 모든 조성물이 캡슐화된 상태(투명한 용액)를 유지하였다. 비슷한 pH(4.5), 더 높은 농도의 시클로덱스트린(5%)에서는 2-IB가 용해된 상태를 유지하였다. 유사하게, 비슷한 시클로덱스트린 농도(2.5%), 더 높은 pH(5.0)에서 2-IB는 용해된 상태를 유지하였으며, 이는 pH와 시클로덱스트린 농도 모두가 pH 5에서 저장 동안 SBE-CD 조성물의 안정성에 기여함을 나타낸다. 표 4A 및 표 4B에 2-IB에 대한 pH 및 시클로덱스트린 종류와 농도의 영향을 요약한다.

[표 4A] 2-IB의 농도(mg/ml)에 대한 SBE-CD 및 pH의 영향

[표 4B] 2-IB(mg/ml)의 농도에 대한 HP-CD 및 pH의 영향

실시예 2

2-IB의 용해도를 10% SBE-CD 용액에서 0.1M 시트르산 용액으로 조절된 다른 pH에서 스크리닝하였다. 실험 단계는 하기와 같다.

1. 0.5g의 SBE-CD를 측량하여 10ml 유리 바이알에 넣는다.

2. 각 바이알에 3ml WFI를 가하여 SBE-CD를 용해시킨다.

3. 과량의 2-IB(25mg - 100mg)를 측량하여 다른 바이알에 넣는다.

4. 1시간 동안 자기 교반한다.

5. 0.1M 시트르산으로 pH를 목표 pH로 조절한다.

6. 부가되는 0.1M 시트르산의 무게를 측정한다.

7. WFI를 5g의 전체 무게로 가한다.

8. 1시간 교반 후에 pH를 측정한다.

9. 조성물을 PVDF 0.22um 필터를 통해 여과한다.

10. HPLC 방법에 의해 2-IB의 용해도를 측정한다.

pH가 7.0에서 4.0으로 감소하면 2-IB의 용해도는 1.71mg/g에서 13.08mg/g로 증가하였다(표 5). 포화 용액은 상온에서 물리적으로 안정하고 어떠한 침전도 관찰되지 않았다. 그러나, 5℃에서 5일 저장 후에 2-IB 침전이 관찰되었다(표 5). pH 조절만 한 경우와 비교하여 10% SBE-CD가 존재하는 경우 2-IB의 용해도가 현저히 증가하였다(pH 5.0: 5.2 대 0.59mg/g; pH 4.0: 13.08 대 1.72mg/g). 용해도는 10% SBE-CD가 존재하는 경우 7.6 - 8.8배 증가하였다(도 1).

[표 5] 다른 pH에서 10% SBE-CD에서 2-IB의 용해도

-: 2-IB의 침전; + 비침전

실시예 3

8-10%의 SBE-CD를 함유하는 여섯 개의 조성물을 제조하였다(표 6). 각 조성물에서 2-IB의 농도는 낮은 온도에서 2-IB의 침전을 막기 위해 2-IB 용해도의 약 75%이었다(표 6 대 표 5). 최종 pH는 0.1M 시트르산 용액(또는 0.1M 시트르산나트륨)으로 pH 4.0 - 6.0으로 조절하였다. 상세한 조성물 제조방법을 F429-02-001P004를 예로 사용하여 다음과 같이 기재한다(표 14).

F429-02-001P004: 3.9mg/g 2-IB, 10% SBE-CD, pH 5.0

1. 82.93g 주사용 증류수를 200ml 유리병에 가한다.

2. 10g의 SBE-CD 분말을 측량하여 유리병에 가하고 자기 교반하여 용해시킨다.

3. 400mg의 2-IB를 측량한다.

4. 6.67g의 0.1mM 시트르산 용액을 가한다.

5. 5분 동안 자기 교반하여 2-IB를 완전히 용해시킨다.

6. 0.1M 시트르산나트륨으로 pH를 5.0으로 조절한다.

7. 0.22㎛ 필터(Millex-GP(PES))를 통해 용액을 여과한다.

8. 1.5ml를 6ml 유리 바이알에 충진하고 5, 25 및 40℃에서 저장한다.

[표 6] 다른 pH에서 SBE-CD에 기초한 2-IB 조성물

pH 7.0에서 2-IB의 용해도가 1.71mg/g이지만, 물 중 1.5mg/g의 2-IB인 pH 7.0의 조성물을 시험하였으며, 2-IB가 하룻밤 동안 교반한 후에 완전히 용해되지 않았기 때문에 상기 조성물은 실행가능하지 않았다. 이는 용해도 시험 및 조성물 제조를 위한 다른 방법 때문일 수 있다. 용해도 시험을 위해서는 과량의 2-IB 분말을 10% SBE-CD 용액에 가하고 2-IB의 작은 입자가 신속하게 용해되어 평형에 도달할 수 있다. 그러나, 조성물 제조를 위해서는 정확한 양의 2-IB 분말을 가하였고, 이는 다른 크기의 2-IB 입자를 함유한다. 큰 크기의 2-IB 입자는 pH 7.0에서 물에 매우 느린 용해 속도를 가질 수 있다. 표 6의 여섯 개의 조성물의 경우에는, 2-IB가 30분 이내에 신속하게 용해되었으며, 이는 빠른 용해 속도를 나타낸다. 여섯 개의 조성물은 모두 무색 투명 용액이었다.

조성물을 먼저 낮은 pH에서 제조하여 용해도를 증가시킨 다음 높은 pH로 적정하는 것은 실행가능하지 않다. 0.1M 시트르산삼나트륨으로 조성물 F429-02-001P004를 pH 5.0에서 pH 5.9로, 조성물 F429-02-001P006을 pH 4.0에서 pH 5.1로 적정할 때 침전이 관찰되었다.

표 6의 여섯 개의 조성물을 5, 25 및 40℃에서 6주 동안 저장하였다. T=0, 2주, 4주 및 6주의 시점에서, 조성물의 외관, pH, 오스모 몰농도, 및 2-IB의 순도 및 함량(HPLC)을 시험하였다(표 15). 6주 저장 후에, 세 저장 조건의 조성물에서 어떠한 침전도 관찰되지 않았다(표 16). 여섯 개의 조성물의 외관은 시각적으로 관찰할 때 5 및 25℃에서 변하지 않았다. 그러나, 약간 갈색이 40℃에서 관찰되었다. 색 강도는 2-IB 농도가 증가하고 pH가 감소함에 따라 증가하였다. 이에 대한 이유는 알려져 있지 않다. 2-이미노비오틴은 안정하고 순도 및 함량은 변하지 않았다. SBE-CD는 극도로 낮은 pH 및 높은 온도에서만 분해되었다. 여섯 개의 조성물의 pH 및 오스모 몰농도는 T=0 값과 비교할 때 5, 25 및 40℃에서 2, 4 및 6주 저장 후에 안정하였다.

여섯 개의 조성물에서 2-IB는 순도, 함량 및 회수율에 근거할 때 5, 25 및 40℃에서 6주 저장 후에 안정하였다(표 17). 여섯 개의 조성물에서 2-IB의 순도는 HPLC 방법에 의해 측정된 2-IB의 % 피크 면적에 근거하여 계산되었다. 그것은 약 99%이고 5, 25 및 40℃에서 6주 저장 후에 감소하지 않았다. T=0과 비교하여 약간 더 높은 함량 및 회수율에 대한 이유는 HPLC 방법의 분석 오차로 인한 것 같다.

실시예 4

조성물 조건을 표 18 및 19에 나타낸 바와 같이 추가로 시험하였다. 각 조성물을 10ml의 최종 부피로 제조하였다. 이 배치의 CoA에 특정된 수분 함량(4.2% w/w)을 고려하여 조성물 제조를 위해 2-IB를 측량하였다. 조성물의 1차 안정성을 5, 25 및 40℃에서 3일 저장 동안 시각적 관찰에 의해 평가하였다. T=0에서 샘플의 pH 및 오스모 몰농도를 추가로 평가하였다.

실시예 5

실시예 4의 조성물 중 둘을 보다 상세히 시험하였다. 조성물 F30 및 F34를 다음과 같이 제조하였다. 수분 함량(4.2% w/w)을 고려하면서 2-IB를 측량하여 미리 측량된 유리병에 넣었다. 시트르산 100mM(총량의 90%), NaCl/SBE-CD 모액 및 WFI(주사용 증류수) (총량의 80%)를 가하였다. 혼합물을 자기 교반 플레이트를 사용하여 교반하였다. pH는 4.0 초과이었고 시트르산 100mM 용액을 사용하여 4.0±0.2로 조절하였다. 용액의 최종 무게를 WFI의 부가에 의해 보정하여 750g을 수득하였다. 수득된 조성물을 Millipak 20 Durapore(PVDF 멤브레인)을 사용하여 여과하였다. 두 조성물을 약 70ml의 용액을 함유한 9개의 비닐 아세테이트 주입 백으로 나누었다. 조성물의 조성을 표 6에 나타낸다.

[표 6]

두 조성물 샘플의 외관, pH, 오스모 몰농도, 2-IB 함량 및 순도를 제조 즉시 시험하였다. 안정성을 위해 샘플을 세 온도: 5, 25 및 40℃에서 저장하였다. 안정성을 위한 시점은 1일, 2일 및 3일이었다. 각 안정성 시점에서 모든 저장 조건의 2-IB 샘플의 외관, pH, 2-IB 함량 및 순도를 시험하였다. 시험된 두 조성물은 5, 25 및 40℃에서 3일 동안 안정한 것으로 확인되었다(표 19A 및 19B).

실시예 6

실시예 4 중 두 조성물을 J. Pharma Sci, 1998 Feb; 87(2):196-9에 게재된 논문 Li P.; Vshnuvajjala R.; Tabibi S. E.; Yalkovsky S.H. "Evaluation of in-vitro precipitation methods"에 기재된 시험관내 고정 연속 희석 모델(In-Vitro Static Serial Dilution Model)에 근거하여 주사 시 침전 가능성을 예상하기 위해 시험하였다.

방법은 다음과 같았다:

3ml의 조성물을 3ml의 ISPB 또는 비히클로 희석하고 교반하였다(Isotonic Sorensen Phosphate buffer(ISPB) pH 7.4는 인산나트륨 이염기 7수화물- 2.146%, 인산이수소나트륨 무수물- 0.296% 및 염화나트륨- 0.178%를 사용하여 제조하였다). 그런 다음, 3ml의 생성된 용액/현탁액을 다른 3ml의 ISPB/비히클과 혼합하였다. 상기 단계를 7개의 연속 희석물을 얻을 때까지 반복하였다. 아울러, ISPB 대신에 희석제로서 비히클을 사용하여 각 희석에 대한 대조 튜브를 제조하였다.

혼합 시 침전의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 시각적 관찰을 사용하였다. 이러한 초기 관찰 후에, 조성물-완충액 혼합물을 1시간 동안 37℃ 및 50rpm에서 물 중탕에 놓은 후 원심분리하였다. 상층액을 HPLC 방법에 의해 분석하였다.

데이터 분석을 위해, 조성물-희석제 비를 총 부피(조성물의 부피 + ISPB의 부피)에 대한 조성물의 부피 비로서 정의한다. 각 희석에서 대조 농도와 측정 농도 사이의 차이는 원 조성물 1ml당 부재하는 약물의 양이다.

조성물 F30에 대한 시험관내 고정 연속 희석 모델

시험관내 고정 연속 희석 모델을 사용하여 조성물 F30을 주사 시 침전 가능성을 예상하기 위해 시험하였다. 상기 모델에서는, 조성물을 ISPB로 일대일 비로 연속적으로 희석시켰다. 다른 희석 단계에서 조성물의 외관을 표 7에 제시한다. 각 희석 단계에서 얻은 2-IB의 평형 농도 및 1ml당 부재하는 약물의 양은 표 8에 제시한다(각 희석에 대해 n=3). 각 희석 용액에서 평형 농도는 HPLC 방법에 의해 측정하였다. 각 희석에서 대조 농도와 측정 농도 사이의 차이는 원 조성물 1ml로부터 침전된 약물의 양과 같다. 조성물-희석제 비는 총 부피에 대한 조성물의 부피 비로서 정의한다. 0.5의 조성물-희석제 비에서, 인큐베이션 시 조성물은 반투명하게 변하고 약간의 침전이 관찰되었다. 이들 희석 비에서 손실된 약물의 양은 경미하였고, 아마도 약물 침전의 결과이다. 0.25-0.0625의 조성물-희석제 비에서는 투명 용액이 되었으나, 분석 결과는 약물이 손실되었음을 나타내었다. 손실된 약물 양은 시각적으로 관찰되지 않는 아주 적은 침전 또는 튜브 벽에 약물의 흡착의 결과일 수 있다.

[표 7] 연속 희석 단계의 시각적 관찰

[표 8] 다른 조성물-희석제 비에서 평균 평형 2-IB 농도 및 1ml당 부재 2-IB의 양(평균 n=3)

조성물 F34에 대한 시험관내 고정 연속 희석 모델

시험관내 고정 연속 희석 모델을 사용하여 조성물 F34를 주사 시 침전 가능성을 예상하기 위해 시험하였다. 다른 희석 단계에서 조성물의 외관을 표 9에 제시한다. 각 희석 단계에서 얻은 2-IB의 평형 농도 및 1ml당 부재하는 약물의 양의 평균은 표 10에 제시한다. 0.5-0.125의 조성물-희석제 비에서, 조성물은 탁함 내지 반투명하게 변하고 침전이 관찰되었다. 이들 희석 비에서 손실된 약물의 양은 상당하였고, 아마도 약물 침전의 결과이다. 희석을 계속하여 비가 0.0625에 도달하였을 때, 침전물이 관찰되었지만 분석 시험에 의해서는 검출되지 않았으며, 이는 아마도 침전물의 작은 양 때문이다. 0.0625 미만의 비에서, 평형 농도 점은 대조 곡선과 겹치고, 침전물이 재용해되는 것으로 관찰되었다.

[표 9] 연속 희석 단계의 시각적 관찰

[표 10] 다른 조성물-희석제 비에서 평균 평형 2-IB 농도 및 1ml당 부재 2-IB의 양(각 희석에 대해 n=3)

4mg/ml F30 조성물에서, 결과는 일련의 희석 후에 흐려짐 또는 침전이 없음을 나타내었고, 예상된 2-IB 농도가 발견되었다. 이는 2-이미노비오틴(4mg/ml) SBE-CD계 조성물이 정맥 투여 시 혈류에 의한 생리적 희석으로 인해 생체내에서 침전하지 않을 것 같음을 나타낸다.

실시예 7

본 시험의 성질 및 목적은 교배 후 20일에 암컷 위스터 쥐에 두 피하 주사에 의해 투여되는 경우, 2-이미노비오틴(2-IB)의 태반이동 및 혈액뇌장벽 통과 가능성을 평가하는 것이었다.

네 마리의 암컷 위스터 쥐에 교배 후 20일에 55mg/kg(각각의 주사는 27.5mg/kg)의 2-IB를 피하 주사하였다. 2-IB를 생리 식염수 용액, pH 3.6-3.8에서 2.75mg/ml의 농도로 제조하였다. 시험 기간 동안 모성 동물 중 사망은 발생하지 않았고 모든 태아는 생존가능하였다. 2차 주사 후 약 1시간에 부검을 수행하였다. 산모 및 태아 모두의 혈액 및 뇌 샘플을 수집하였다.

모든 모성 동물 및 태아의 혈장 샘플에서 2-IB는 정량화할 수 있었다. 혈장 2-IB 농도는 태아(평균 농도는 수컷이 1,765ng/mL, 암컷이 1,903ng/mL임)보다 모성 동물(평균 농도는 10,039ng/mL임)에서 3-7배 더 높았다.

[표 10] 2-IB 혈장 농도

정량화의 하한(Lower Limit of Quantification: LLOQ)은 5.0ng/mL이고 정량화의 상한(Upper Limit of Quantification: ULOQ)은 5000ng/mL이었다.

* 지시 값(초기 분석 배치는 거부되었지만, 낮은 부피로 인해 이 샘플은 재분석될 수 없었다).

2-IB는 모든 모성 동물 및 태아의 뇌 샘플에서 정량화할 수 있었다. 뇌 2-IB 농도는 모성 동물(평균 농도는 268ng/g임) 및 태아(평균 농도는 수컷이 329ng/g, 암컷이 369ng/g임)에서 비슷하였다.

[표 11] 뇌 샘플에서 2-IB 농도

LLOQ는 20.0ng/g이고 ULOQ는 5000ng/g이었다.

일반적으로, 뇌로 2-IB 통과는 태아(평균 뇌 대 혈장 비는 수컷이 0.19, 0.15 내지 0.21 범위, 암컷이 0.20, 0.15 내지 0.22 범위임)에서보다 모성 동물(평균 뇌 대 혈장 비는 0.03, 0.02 내지 0.04 범위임)에서 상대적으로 낮은 것으로 나타났다.

생분석 결과는 모든 모성 동물 및 그들의 태아가 피하 주사 후에 2-IB에 노출됨을 보여주었으며, 모성 동물은 태아보다 3-7배 더 높은 혈장 농도를 나타내었다(평균 혈장 2-IB 농도는 모성 동물이 10,039ng/mL이고, 수컷 태아가 1,765ng/mL이며, 암컷 태아가 1,903ng/mL임). 아울러, 2-IB 농도는 모든 모성 동물(평균 농도는 268ng/g임) 및 태아(평균 농도는 수컷이 329ng/g, 암컷이 369ng/g임)의 뇌에서 측정될 수 있었다. 뇌로 2-IB 통과는 태아(평균 뇌 대 혈장 비는 0.20임)에서보다 모성 동물(평균 뇌 대 혈장 비는 0.03임)에서 상대적으로 낮은 것으로 나타났다. 상기 결과를 근거로, 55mg/kg의 총 투여량 수준에서 위스터 쥐에 두 피하 주사 후에 2-IB의 태반 및 혈액뇌장벽 이동이 확인되었다.

실시예 8

3.8, 4.0 및 4.2의 pH에서 시트레이트 완충액 중 0.6mg/g, 0.75mg/g 및 1mg/g 농도의 2-IB 용액을 20g의 최종 무게로 다음과 같이 제조하였다(pH 4에서 완충 용량 목표는 15mM이었다).

시트르산 0.1M 용액 및 시트르산나트륨 이수화물 0.1M 용액을 각각 WFI에서 제조하였다. 2-IB를 측량하여 미리 측량된 유리 바이알에 넣은 후(이 배치의 CoA에 특정된 수분 함량(4.2% w/w)을 고려), 시트르산 용액을 가하였다. 희석을 위해 WFI를 가한 다음, 시트르산나트륨 이수화물 0.1M 용액을 가하여 필요한 pH 값까지 pH를 조절하였다. WFI를 20g의 총 무게까지 가한 다음, pH를 측정하였다.

그런 다음, 수득한 12개의 벌크 용액을 나누어 안정성 챔버에서 3일 동안 5℃±3℃ 및 25℃±2℃에서 저장하였다. 모든 저장된 용액의 pH 및 외관을 각 시점(0, 1, 2, 3일)에서 평가하였다.

표 20은 시트르산 완충액 조성물의 조성, 및 20g의 총 조성물 무게로 WFI의 부가 전 및 후에 목표 및 측정 pH를 보여준다.

실시예 9

다음 시험에서는, 15℃±3℃ 및 25℃±2℃의 온도에서 pH 4±0.2에서 2-IB 시트레이트 완충액 조성물의 안정성을 조사하였다. 시트레이트 완충액 pH 3.8, 4.0 및 4.2 중 0mg/ml(위약), 0.75mg/ml 및 1mg/ml의 2-IB 농도의 2-IB-시트레이트 완충액 조성물을 실시예 8에 기재된 바와 같이 제조하였다. 각 조성물을 20g의 최종 무게로 제조하고(pH 4에서 완충 용량 목표는 15mM이었다), 각각의 외관을 시각적으로 조사하고 pH를 측정하였다. 용액을 나누어 안정성 챔버에서 3일 동안 15℃±3℃ 및 25℃±2℃에서 저장하였다. 모든 저장된 용액의 pH 및 외관을 T= 0, 1, 2 및 3일의 시점에서 평가하였다.

표 21은 시트르산 완충액 조성물 각각의 조성, 및 20g의 총 조성물 무게로 WFI의 부가 전 및 후에 목표 및 측정 pH를 나타낸다. 또한 각 시점에서 외관 및 pH 데이터를 제시한다.

실시예 10

2-이미노비오틴의 용해도를 4.0-6.2의 pH 값에서 완충 5% 캡티솔 용액에서 측정하였다. 조성물은 오스모 몰농도의 조절을 위해 NaCl도 포함하였고, pH 4.0에서 목표 시트레이트 완충액 농도는 15mM이었다. 이들 용액의 2-IB 농도는 4.0, 2.0, 1.0, 0.75 및 0mg/g(위약) 2-IB이었다.

시트르산 0.1M 용액 및 시트레이트 이수화물 0.1M 용액의 제조는 실시예 8에 기재되어 있다. 25% 캡티솔-2.45% NaCl 용액의 벌크 용액을 제조하고 조성물의 추가 제조를 위해 사용하였다.

최종 벌크 조성물 각각의 외관을 시각적으로 관찰하고 pH를 측정하였다. 용액을 나누어 안정성 챔버에서 3일 동안 5℃±3℃ 및 25℃±2℃에서 저장하였다. 모든 저장된 용액의 pH 및 외관을 T= 0, 1, 2 및 3일의 시점에서 평가하였다.

표 22 및 23은 2-IB 시트레이트 완충액의 조성 및 외관과 pH 데이터를 나타낸다.

실시예 11

시트레이트 완충액에서 2-IB의 단기간 안정성(short-term stability: STS)을 하기 조성물에 대해 수행하였다(시점: T= 0, 2주, 4주 및 6주).

조성물 03-15는 시트레이트 완충액 pH 6.0 중 0.75mg/g 2-IB, 5% 캡티솔 및 2.45% NaCl (등장성용) 용액을 포함하고,

조성물 02-5B는 시트레이트 완충액 pH 4.0 중 0.75mg/g 2-IB 및 등장성용 NaCl을 포함한다.

다음 파라미터가 시험되었다: 시각적 외관, pH, 오스모 몰농도, 분석, IDD, 투명성, 가시적 입자 및 현미경을 쓰지 않으면 안 보이는 입자. pH 변이(pH 6.0에서 6주 동안 0.1 유니트)는 미미했다. 시험된 어떠한 온도에서도 안정성이 문제가 된다는 증거는 없었다.

실시예 12

수화된 2-IB와 비교하여 건조된 2-IB의 용해도 시험을 수행하였다. 조성물 #02-5에 근거하여, 세 조성물을 제조하였다. 07-1 조성물은 "그대로의" 2-IB 물질(즉, 바이알로부터 바로 취한 2-IB)로부터 건조 후에 수득하였다. 07-2 조성물은 "그대로의" 2-IB 물질을 20^oC / RH (70±5%)에서 방치하여 완전히 수화된 2-IB 물질로부터 수득하였다. 07-3 조성물은 "그대로의" 2-IB 물질로부터 수득하였다. 용액의 외관 및 pH를 조사하였다. 건조 물질, "그대로의" 물질 및 완전히 수화된 물질의 수분 함량은 각각 1%, 12% 및 18%로 측정되었다.

하기 표 12는 조성물(07-1, 07-2 및 07-3)의 제조를 위해 사용된 성분의 양, 시트르산 0.1M 용액에 (각 조성물에 사용된) 2-IB 물질을 용해시키기 위해 걸리는 시간 및 세 조성물의 최종 pH 및 외관을 나타낸다.

[표 12]

실시예 13

캡티솔의 존재 또는 부재하에 시트레이트 완충액 중 2-IB의 두 조성물의 최종 멸균 시험을 수행하여 어떤 멸균 방법이 2-IB를 분해하지 않고 사용될 수 있는지를 확인하였다.

2-IB가 없는 위약 조성물을 포함하여 네 개의 완충 2-IB 조성물을 제조하였다. 상기 용액 각각을 0.22㎛ PES 필터를 통해 여과하였다. pH, 오스모 몰농도, 시각적 외관 및 2-IB 함량을 측정하였다. 또한 2-IB 시트르산 용액을 시트르산나트륨 용액으로 적정한 후의 pH도 측정하였다.

각 조성물을 4 x 10g 부분들로 나누었다. 각 부분을 20ml 유리 바이알에 분배하였다. 네 샘플 각각을 Tuttnauer 증기 멸균기에 놓고 가압멸균하였다(프로그램 6(액체용, 121℃ 15분 동안)). 가압멸균 후에 샘플을 상온으로 냉각되도록 하였다. 네 바이알 각각으로부터 5g 샘플을 취하여 외관, pH 및 오스모 몰농도를 측정하였다. 나머지 5g의 조성물을 분석에 사용하였다.

표 24는 네 개의 조성물 각각의 제조를 위해 사용된 물질 및 양, 시트레이트 완충 용량, 최종 멸균 전 및 후의 시각적 외관, pH 및 분석을 나타낸다. 표 24에 언급된 분석은 HPLC 분석에 의해 추적 관찰된 용액의 안정성을 의미한다. 표 24에서 확인되는 바와 같이, 조성물은 2-IB 안정성의 유의적인 감소 없이 고압멸균될 수 있다.

실시예 14

두 선택된 조성물의 생체내 침전 가능성을 평가하기 위한 시험을 수행하였다. 상기 목적을 위해 실시예 6에 기재된 시험관내 고정 연속 모델을 사용하였다.

표 25는 09-1, 09-1V, 09-2 및 09-2V 제조를 위해 사용된 물질의 양, 완충 용량, 및 2-IB 시트르산 용액을 시트르산나트륨으로 적정 후의 pH 및 외관을 나타낸다. 표 26 및 27은 ISPB에서 09-1 및 09-1V의 희석물 및 비히클에서 09-1의 희석물에 대한 외관 및 pH 값을 나타낸다. 표 26 및 27에 제시된 외관 및 pH 결과는 수행된 모든 희석에 대해, 조성물 09-1 및 09-2가 모두 생리적 pH와 유사한 소렌슨 완충액으로 희석되었을 때 침전을 나타내지 않음을 보여준다. 따라서 상기 조성물의 생체내 침전의 위험은 낮다. 아울러, 보다 생리적 값으로 pH 변화는 신속하여 생체내 적합성/안전성을 증가시킨다.

[표 13] SBE-CD 또는 HP-CD 조성물에서 조성물의 개관, pH, 2-IB 용해도/캡슐화 및 안정성

[표 14] 다른 pH에서 SBE-CD에 근거한 2-IB의 조성물

[표 21] 시트레이트 완충액(pH = 4.0±0.2) 중 2-IB 조성물(0(위약), 0.75 및 1.0mg/g)을 제조하기 위해 사용된 성분의 양, 및 15℃±3℃ 및 25℃±2℃에서 온도 챔버에 저장된 각 조성물의 시점 T=0, 1, 2 및 3일에서 외관 및 pH 값

[표 23] 캡티솔을 함유한 시트레이트 완충액(pH = 4.0-6.2) 중 2-IB 위약 등장성 조성물의 조성, 및 5℃±3℃ 및 25℃±2℃에서 저장된 각 조성물의 시점 T=0, 1, 2 및 3일에서 외관 및 pH 값

[표 24] 네 개의 조성물 08-1, 08-2, 08-1P 및 08-2P 각각의 제조를 위해 사용된 물질 및 양, 시트레이트 완충 용량, 최종 멸균 전 및 후의 시각적 외관, pH 및 분석. 관주수(water for irrigation)는 전부 주사용 멸균수(Sterile Water for Injection USP)로 구성된 멸균, 저장성(hypotonic), 비발열성 관주 유체이다.

[표 25] 09-1 조성물 및 09-1V(09-1의 비히클(위약)), 09-2 및 09-2V(09-2의 비히클(위약)) 용액을 제조하기 위해 사용된 성분 양, 완충 용량, 및 2-IB 시트르산 용액을 시트르산나트륨으로 적정한 후의 pH 및 외관

[표 26] ISPB 및 비히클로 희석된 09-1 및 09-1V 희석물의 외관 및 pH

Claims

약 3 내지 약 7의 pH를 가지고, 약 1mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 약 2.5 내지 약 40%의 치환된 베타-시클로텍스트린을 포함하는, 2-이미노비오틴의 수용성 조성물.
제1항에 있어서, 약 4 내지 약 7의 pH를 가지고, 약 2mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 약 2.5 내지 약 20%의 치환된 베타-시클로텍스트린을 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약 4 내지 약 6.5의 pH를 가지고, 약 0.5 내지 3.5mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 약 5 내지 약 40%, 바람직하게는 약 5 내지 약 10%의 치환된 베타-시클로텍스트린을 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약 4의 pH를 가지고, 약 3.5mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 약 2.5 내지 약 40%, 바람직하게는 약 2.5 내지 약 10%의 SBE-CD를 포함하는 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약 4 내지 약 5의 pH를 가지고, 약 0.5 내지 5mg/ml, 바람직하게는 약 4 내지 약 5mg/ml의 2-이미노비오틴, 및 약 2.5 내지 약 5%의 SBE-CD를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 추가로 포함하는 조성물.
약 3 내지 약 7의 pH를 가지고, 약 1mg/ml 이상의 2-이미노비오틴 및 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물, 바람직하게는 20mM 이상을 포함하는, 2-이미노비오틴의 수용성 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 신생아에서 출산전후기 질식을 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
제7항에 있어서, 조성물이 신생아에 투여되는 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 조성물이 분만 전 및/또는 분만 중에 산모에게 투여되는 조성물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 신생아를 저체온화하는 것과 병용되는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 출산 중 합병증의 영향을 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
출산 중 합병증의 영향, 바람직하게는 출산전후기 질식을 치료하는데 사용하기 위한 2-이미노비오틴으로서, 치료가 신생아를 저체온화하는 것과 병용되는 2-이미노비오틴.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 2-이미노비오틴 치료에 반응성인 질환 또는 질병을 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
약 3 내지 약 6의 pH를 가지고, 약 0.5mg/ml 내지 5mg/ml의 2-이미노비오틴 및 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물을 포함하고, 바람직하게는 상기 시트르산, 그의 탈양성자화된 형태 또는 그들의 혼합물이 약 10mM 내지 약 20mM의 농도로 존재하는, 2-이미노비오틴의 수용성 조성물.