KR20130099764A - 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다. 상기 도금양 추출물은 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 염증과 관련된 각 수준의 단백질의 발현의 발현여부, 염증과 관련된 여러 사이토카인(cytokine)의 mRNA의 전사여부 및 염증 관련 단백질의 전사인자의 수준 및 활성 정도를 통해 확인한 결과, 효과적으로 염증을 저해할 수 있다는 것이 확인되었으므로, 상기 도금양 추출물은 염증과 관련된 질병에서 염증을 억제하는 항염증제 및 항염효과가 있는 화장료 조성물 등으로 응용될 수 있다.

Description

도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING INFLAMMATORY DISEASES CONTAINING RHODOMYRTUS TOMENTOSA EXTRACT}
본 발명은 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 박테리아, 곰팡이, 바이러스 또는 다양한 종류의 알레르기 유발물질 등과 같은 외부감염원을 포함한 외부에서 들어온 해로운 물질이나 유기체 등에 노출되거나 상기 외부에서 들어온 해로운 물질이나 유기체 등에 노출되는 등 여러 요인에 의하여 세포나 조직이 손상을 입거나 파괴되었을 때 그 손상을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키기 위하여 국소적으로 일어나는 면역반응을 의미한다.
또한, 상기 염증을 유발하는 여러 요인으로 외상, 화상, 동상, 방사능 등에 의한 물리적 요인, 산(acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해 발생되기도 한다.
상기 염증반응은 생체를 보호하고 조직 손상으로 생성된 산물들을 제거하는데 유용한 방어 메카니즘으로, 국소 혈관과 체액에 존재하는 각종 염증 매기인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액침윤, 세포 이동, 조직 파괴, 홍반, 부종, 발열 또는 통증 등의 나타난다. 또한, 상기와 같은 증상에 의해 기능장애가 유발되기도 한다.
상기 염증은 정상적인 경우에는 생체 내에서 염증반응을 통하여 외부감연원을 제거하거나 발병 요인을 중화 또는 제거하고, 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키는 작용을 한다. 하지만, 항원이 계속 제거되지 않거나 특정한 내부 물질이 원인이 되어 염증의 정도가 일정 수준 이상이 되거나 만성화되면, 과민성 질환이나 만성염증과 같은 질병 상태로 진행되는 경우 문제가 된다. 임상질환 가운데 거의 모든 질환에서 염증 반응을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 암발생 과정(carcinogenesis)에서도 염증 반응과 관련된 효소들이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 수혈, 약물투여 또는 장기이식 등의 치료과정에서도 장애요인이 된다.
생체에 있어서 염증반응은 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히, 면역세포에 의해 생산되는 염증 반응과 관련된 다양한 효소에 의해 반응이 개시되거나 조절된다.
구체적으로, 상기 면역세포들은 히스타민(histamine), 일산화질소(nitric oxide, NO) 또는 프로스타글라딘 E2(prostaglandin E2, PGE2) 등의 도움으로 혈관을 통해 손상된 부위로 이동하여 염증반응을 개시한다. 상기 손상된 부위로 이동한 면역세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β) 또는 IL-6(interleukin-6)와 같은 사이토카인(cytokine)이나 MIP-1, IL-8 또는 MCP-1등과 같은 케모카인(chemokine)을 분비하여 직접적인 외부침입물질을 파괴하거나 다른 면역세포들을 모아 염증반응을 개시한다.
상기 염증반응을 일으키는 interferon-γ, lipoteichoic acid, lipopolysaccharide(LPS) 등의 염증유발 물질이나 다양한 염증 유도 사이토카인에 노출될 경우, iNOS(inducible Nitric Oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)가 발현되어, NO와 PGE2가 과량 생성된다. 이들 여러 염증 개시인자들(iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 등)은 활성화된 NF-κB에 의해 전사가 촉진되며, 이로 인해 NO가 필요이상으로 생성되면 쇼크에 의한 혈관확장, 염증반응에 의해 유발되는 조직손상, mutagenesis, 신경조직의 손상 등을 일으킨다.
한편, 일상생활에 사용되는 화장료는 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용되는 제품이지만 화장료 조성물을 살펴보면 피부 보호 목적과는 상이한 성분들이 제품 형성에 필수 불가결한 존재로서 사용된다. 예를 들어, 계면활성제, 방부제, 향료, 자외선 차단제, 색소 및 기타 효능이나 효과를 부여하기 위해 쓰이는 여러 가지 성분들을 들 수 있다. 상기 화장료 제조에 필수적으로 사용되는 성분은 일반적으로 피부에 염증이나, 뾰루지 또는 부종 등과 여러 가지 부작용을 발생하는 것으로 알려져 있다.
또한, 체내로부터 배출되는 피지 성분, 땀 성분 및 화장료 성분 중의 지방산, 고급 알코올, 단백질 등이 피부 상에 존재하는 피부 상재 균들에 의해 독성이 강한 물질로 분해되면, 이들에 의해 피부 염증이 유발될 수도 있으며, 태양으로부터 나오는 자외선에 의해서도 피부 염증이 유발된다는 것은 잘 알려진 사실이다.
이렇듯 화장료에 있어서 피부 부작용 유발요인은 항상 잠재되어 있으며 이를 해결 하고자 여러 가지 연구가 진행되어 왔다. 현재까지 홍반이나 부종 같은 자극완화 및 염증 완화 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계로 플루페나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin)등이 있고, 스테로이드계로는 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 있으며, 알란토인, 아즈렌, ε-아미노키프론산, 하이드로코티존, 감초산 및 그 유도체(β-글리칠레친산, 글리칠레친산 유도체) 등이 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 일반적으로 항염제로 쓰이는 상기 인도메타신은 화장료에는 사용할 수 없는 물질이고, 상기 하이드로코티존은 사용량이 제한되어 있으며, 감초산 및 그 유도체는 안정화시키기 어렵거나 용해도가 좋지 않아 실제 적용 시 농도의 제한으로 인하여 실질적인 효과를 거두기가 어려운 점이 있는 등 지금까지 알려진 항염제는 피부안전성 면이나 화장료 배합시의 안정성 면에서 대부분 문제점을 가지고 있어서 그 사용이 제한되고 있다.
또한 최근 위염과 관련한 치료제의 기전은 2번째 히스타민 수용체(H2 receptor)를 막아서 위벽세포에서 위산의 분비를 감소시키는 H2 저해제(H2-Blockers)가 주를 이룬다. 위산이 줄어듦으로 인해 이미 손상된 위벽세포(위궤양 등)의 추가적인 손상을 방지하게 된다. 이러한 H2 저해제는 간에서의 다른 약들의 대사를 방해하기 때문에(potent inhibitors of P-450) 다른 약과 같이 복용할 경우 주의가 필요하고, 항안드로겐(Anti-Androgen) 효과가 있어서 남성에게서 여성형 유방(gynecomastia), 발기부전(impotence), 성욕 감소 등의 부작용이 발생할 수 있다. 또한 태반과 뇌혈관장벽을 통과하므로 임산부나 노인에게 부작용이 더 위험할 수 있고, 두통 이나 혼동, 혼미, 어지럼증 등을 일으킬 수 있다.
그러므로, 이러한 부작용이나 세포독성에 대한 위험이 없거나 적으면서, 효과적으로 NF-κB, iNOS 및 TNF-α 발현을 억제할 수 있어 염증 치료 및 예방 효과가 우수하여, 부작용 없이 염증을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.
KR 0530843 B1 KR 0614465 B1 KR 0941133 B1 KR 0954984 B1
상기와 같은 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 천연물질인 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 염증과 관련된 PGE2, NF-κB, AP-1 및 iNOS의 발현을 억제할 수 있는 성분을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.
상기 도금양 추출물은 염증과 관련된 각 수준의 단백질의 발현의 발현을 억제할 수 있고, NO 발현량을 억제할 수 있으며, 염증 관련 단백질의 전사인자를 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 천연물로부터 유래된 것으로 부작용이 문제될 가능성도 낮고, MTT 분석 결과 세포 독성도 없는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 항염 조성물은 항염증제의 유효성분 또는 염증을 억제하기 위한 목적으로 화장료 조성물의 유효성분으로 제공될 수 있다.
본 발명자들은 도금양 추출물이 염증을 직접적으로 유도할 수 있는 NO의 분비를 억제할 수 있고, 상기 NO의 분비 및 염증을 유발하는 프로스타글란딘 생성과 관련된 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제할 수 있으며, 상기 iNOS의 mRNA 및 COX-2의 mRNA 전사를 제어할 수 있을 뿐만 아니라, 염증과 관련된 사이토카인의 mRNA 전사를 억제할 수 있다는 결과를 통하여, 도금양 추출물이 항염효과가 우수하다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다.
상기 도금양(Rhodomyrtus tomentosa)는 도금양과의 상록관목으로 도금랑나무 또는 도금양나무라고도 하며, 높이 2 m 정도 자라고, 줄기는 곡게 서며 전체에 흰 털이 빽빽이 난다. 잎은 마주나고 긴 타원형이며 가장자리가 밋밋하고 길이가 3 cm 내지 6 cm이다. 꽃은 6월에 피고, 연한 홍자색을 띠며, 꽃잎은 5장으로 둥글고 꽃받침조각도 5장이다. 수술은 많고, 씨방은 아래쪽에 있으며, 암술대는 1개이다. 열매는 달걀 모양으로 지름이 1 cm 내지 5 cm이다. 일본, 타이완, 중국 남부, 필리핀 또는 말레이시아 등지의 열대 지역과 아열대 지역에 두루 분포하며, 관상용 식물로 정원에 심고, 열매는 식용으로 사용된다.
상기 도금양 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 일 예로 등골나물의 꽃, 잎, 가지, 뿌리, 열매 또는 껍질이나 이의 분쇄물에 추출용매를 가하여 추출함으로써 제조하거나 추출용매로 추출하여 제조한 조추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조된 것일 수 있다.
상기 추출용매는 물 및 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 상기 알코올 희석수 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 5의 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알코올 희석수는 알코올을 50 내지 99.9%(v/v)로 물에 희석한 것일 수 있다.
본 발명의 도금양 추출물의 추출용매는 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 알코올 희석수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 메탄올 또는 메탄올 수용액일 수 있다. 상기 추출과정은 일 예로, 4℃ 내지 120℃, 또는 50℃ 4내지 90℃, 또는 60℃ 내지 80℃에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 추출시간은 특별히 한정되지는 않으나, 10분 내지 12시간일 수 있다.
본 발명의 도금양 추출물은 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 구체적으로는 냉침추출법, 온침추출법, 열 추출법, 초음파 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.
또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매, 바람직하게는 헥산 및 메틸렌클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획 시 용매는 2종 이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하거나 혼합하여 사용하여, 각 용매 추출물을 제조할 수 있다. 또한, 상기 분획과정은 일 예로, 4℃ 내지 120℃, 또는 50℃ 내지 90℃, 또는 60℃ 내지 80℃에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 제조된 추출물 또는 상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.
따라서 상기 항염 조성물은 염증을 억제하거나 염증을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 염증은 일반적인 염증질환을 포함하는 개념이며, 일 예로 상기 염증질환은 각종 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염, 위염, 간염, 장염, 췌장염 및 신장염으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 알레르기는 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 곤충 알러지, 식품 알러지 및 약품 알러지를 포함한다.
따라서, 본 발명의 항염 조성물은 염증질환의 치료 또는 예방용 조성물로 응용되거나, 상기 염증질환의 예방 또는 개선용 식품조성물로 응용될 수 있다. 상기 식품조성물은 일 예로 상기 염증질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 상기 도금양 추출물을 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 15 중량% 포함될 수 있다.
상기 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 도금양 추출물은 상기 항염 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 도금양 추출물을 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 도금양 추출물은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.
이 경우 상기 조성물 내 도금양 추출물의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 추출물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 또한, 상기 약학 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 도금양 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 항염효과가 있는 것으로 인정된 물질, 일 예로 항염증제, NO 저해제 또는 COX-2 저해제 등으로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다.
상기 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 형태는 크림(CREAM), 로션제(LOTIONS), 연고제(ONITMENTS), 경고제(PLASTERS), 액제(LIQUIDS AND SOULTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 엘릭서(ELIXIR), 침제(INFUSIONS), 향낭(SACHET), 패취제(PATCH) 또는 주사제(INJECTIONS) 등의 형태일 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공한다.
상기 도금양 추출물은 바람직하게는 도금양 메탄올 추출물 또는 도금양 메탄올 수용액 추출물일 수 있다.
상기 항염증제는 상기 유효성분을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 상기 유효성분은 항염증제 전체에 대해 0.1 중량% 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으나, 통상 0.001 중량% 내지 50 중량%의 함량으로 포함되는 것이 일반적이다.
상기 항염제는 류마티스 관절염, 루푸스, 다발성 경화증과 같은 각종 만성 염증 질환, 패혈증, 쇼크, 장기이식의 거부반응과 같은 각종 급성 염증 질환, 안과질환, 기관지염, 또는 염증성 장질환의 예방 및 치료의 목적으로 사용가능하다.
상기 담체 또는 부형제의 일예로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 담체 또는 부형제는 2종 이상 사용될 수 있다.
또한 항염증제를 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 항염증제는, 도금양 추출물 이외에 공지의 항염활성을 갖는 화합물 또는 식물 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 도금양 추출물 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 20 중량부로 포함될 수 있다.
항염증제의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
본 발명에 따른 항염증제는 경구 또는 비경구로 사용될 수 있으며, 예컨대 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내, 코안, 경막외 및 구강경로를 통하여 사용될 수 있으며, 이의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 항염증제는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 ㎎/㎏(체중) 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되지는 않는다.
본 발명은 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것일 수 있다.
상기 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 염증질환을 억제하거나 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
상기 염증질환은 일 예로 각종 피부염, 알레르기, 전신성 홍반성 낭창, 망막염, 위궤양, 십이지장궤양, 간염, 식도염, 위염, 장염, 췌장염, 대장염, 관절염, 신장염, 위암, 전신부종, 국소부종 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 상기 전신부종은 구체적으로 울혈성 심부전, 교착성 심낭염, 제한성 심장 근육 병증, 간경변, 신부전, 신증후군 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 상기 국소부종은 피부와 연부 조직의 일부가 부은 상태를 의미하며, 구체적으로 피부와 연부 조직에 염증이 발생하는 봉소염, 정맥이나 리프관의 환류 장애, 피부와 연부조직의 일부가 손실되는 화상, 벌레물림, 세균감염 등을 포함할 수 있으며, 상기 알레르기는 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 알러지성 결막염, 알러지성 피부염, 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염, 두드러기(urticaria), 곤충 알러지, 식품 알러지 및 약품 알저리를 포함 할 수 있다. 바람직하게는 피부염, 알레르기, 위궤양, 십이지장궤양, 간염, 식도염, 위염, 장염, 췌장염, 대장염, 신장염, 위암, 전신부종, 국소부종 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 위궤양, 십이지장궤양, 위염, 장염, 췌장염, 국소부종 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.
상기 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하고, 소화기관, 배설기관 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하며, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 도금양 추출물은 상기 염증질환 예방 또는 약학 조성물 내에 단독으로 사용될 수 있으며, 그 외 약리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 도금양 추출물을 포함하는 조성물이 약제로 사용되거나, 의약 또는 약학적 용도로 사용되는 경우, 상기 도금양 추출물은 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용될 수 있다.
이 경우 상기 조성물 내 도금양 추출물의 함량은 0.001 중량 % 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량% 또는 1 중량% 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 조성물의 사용태양 및 사용방법에 따라 상기 추출물의 함량은 바람직한 함량으로 적절히 조절하여 사용될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀 및 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 또한, 상기 약학 조성물은 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, pH 조절제, 영양제, 비타민, 전해질, 알긴산 및 그의 염, 펙트산 및 그의 염, 보호성 콜로라이드, 글리세린, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 도금양 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 공지의 염증질환에 효과가 있는 것으로 인정된 물질, 일 예로, 항염증제, NO 저해제 또는 COX-2 저해제 등으로 사용되는 물질을 더욱 포함할 수 있다.
상기 조성물이 약제로 사용하는 경우 투여방법은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 일 예로는 경구, 경피, 피하, 정맥, 구강, 경막외 및 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 상기 조성물의 제형은 사용방법에 따라 달라질 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 일반적으로는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제(TABLETS), 알약, 연질 또는 경질 캅셀제(CAPSULES), 환제(PILLS), 산제(POWDERS) 및 과립제(GRANULES) 등이 포함되고, 이러한 제제는 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제(SUSTESIONS), 내용액제, 유제(EMULSIONS) 및 시럽제(SYRUPS) 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 형태는 크림(CREAM), 로션제(LOTIONS), 연고제(ONITMENTS), 경고제(PLASTERS), 액제(LIQUIDS AND SOULTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 유동엑스제(FRUIDEXTRACTS), 엘릭서(ELIXIR), 침제(INFUSIONS), 향낭(SACHET), 패취제(PATCH) 또는 주사제(INJECTIONS) 등의 형태일 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 제형화될 수 있다.
상기 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 상기 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 도금양 추출물은 식물 유래 추출물로 부작용이 문제될 가능성이 적고, 세포독성이 없는 범위 내에서 사용하더라도, 염증 억제 효과가 뛰어나기 때문에 염증의 예방 및 개선 효과가 우수하므로 화장품에 포함된 성분들에 의해 유도되는 염증 및 외부 환경에 의해 유도되는 염증을 효과적으로 제어할 수 있어 상기 도금양 추출물은 염증질환을 예방 및 개선하는 효과를 갖는 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 기초 화장료, 메이크업 화장료, 바디 화장료, 두발용 화장료, 두피용 화장료, 면도용 화장료 또는 구강용 화장료의 용도로 제공될 수 있다.
상기 기초 화장료의 예로는 크림, 화장수, 팩, 마사지 크림, 유액 등이 있고, 상기 메이크업 화장료의 예로는 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱, 아이섀도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬 등이 있으며, 상기 바디 화장료의 예로는 비누, 액체 세정제, 입욕제, 선스크린 크림, 선 오일 등이 있고, 상기 두발용 화장료의 예로는 샴푸, 린스, 헤어 트리트먼트, 헤어 무쓰, 헤어 리퀴드, 포마드, 헤어 칼라제, 헤어 블리치제 또는 칼라 린스 등이 있으며, 상기 두피용 화장료의 예로는 헤어 토닉 또는 스칼프 트리트먼트 등이 있고, 상기 면도용 화장료의 예로는 애프터셰이브로션 또는 셰이빙 크림 등이 있으며, 상기 구강용 화장료의 예로는 치약 또는 마우스 워셔 등이 있다.
상기 화장료 조성물에는 유효성분 외에 사용용도 및 화장료 조성물의 성질에 따라 통상 화장료 조성물에 배합되고 있는 성분, 일 예로 보습제, 자외선 흡수제, 비타민류, 동식물 추출성분, 소화제, 미백제, 혈관확장제, 수렴제, 청량제, 호르몬제 등이 추가로 배합될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 약물 또는 유효성분을 피부조직으로 침투 또는 이행시키기 위해서 필요한 기제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 사용용도 및 화장료 조성물의 성질에 따라 적절한 형태를 취할 수 있으며, 일 예로 수용액계, 가용화계, 유화계, 유액계, 겔계, 페이스트계, 연고계, 에어졸계, 물-기름 2층계 또는 물-기름-분말 3층계일 수 있으며, 상기 제형의 예는 단순한 예시일 뿐, 상기 예시에 의해 본 발명의 화장료 조성물의 제형 및 형태가 제한되는 것은 아니다.
상기 유효성분은 상기 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하기로는 0.01 중량% 내지 20 중량%일 수 있으나, 상기 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 유효성분외의 성분의 함량에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 상기 함량에 의해 본 발명에 포함되는 유효성분의 함량이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증을 억제하여 염증질환을 예방 및 치료하기 위한 약학 조성물, 식품 조성물 및 특정 제형 등과 관련하여 화장품 제조에 필수적으로 사용되는 성분 또는 외부환경으로 인한 피부의 염증을 효과적으로 억제할 수 있는 특징을 갖는 화장료 조성물 등에 응용될 수 있으므로, 본 발명은 염증질환과 관련된 질병에 대한 치료와 관련된 의료산업 및 피부염증의 제어와 관련된 화장품 산업의 분야에서 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 도금양 추출물(GI-ME)의 세포독성을 확인한 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 도금양 추출물의 함량을 의미하고, 상기 그래프의 세로축은 세포 생존율(Cell viability(%) of control)을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 도금양 추출물이 NO 생산에 미치는 영향을 정량적으로 확인한 그래프로, 상기 그래프의 세로축은 RAW 264.7 세포의 NO 함량의 대조군(control)에 대한 상대적인 값을 의미하고, 가로축은 도금양 추출물의 함량을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 도금양 추출물이 PGE2의 생산에 미치는 영향을 정량적으로 확인한 그래프로, 상기 그래프의 세로축은 RAW 264.7 세포의 PGE2 함량의 대조군(control)에 대한 상대적인 값을 의미하고, 가로축은 도금양 추출물의 함량을 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 도금양 추출물이 유도된 iNOS 및 COX-2의 발현에 미치는 영향을 나타낸 사안으로, 상기 도금양 추출물을 처리하지 않은 경우, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml 및 400 μg/ml로 각각 처리한 경우 발현 정도를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 도금양 추출물의 p65의 발현에 미치는 영향을 나타낸 사진으로, 상기 핵 절편에 LPS 및 도금양 추출물을 처리한 시간 및 각각의 처리여부를 의미하는 것으로 +는 양성으로 처리한 경우를 의미하고, -는 처리하지 않은 경우를 의미한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 도금양 추출물이 위염에 미치는 영향을 나타낸 사진으로, 좌측부터 아무처리도 하지 않은 대조군(Normal), 염증을 유발시킨 경우(HCl/EtOH), 도금양 추출물을 200 mg/kg씩 처리한 경우의 변화를 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것일 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 ; 항염효과 확인
항염 효과를 갖는 물질에 대해 연구하던 중, 본 발명의 발명자들은 도금양(Rhodomyrtus tomentosa)의 잎, 열매 및 줄기를 각각 건조하고 분쇄한 후, 각각의 분쇄물에 메탄올을 가하고 추출하여 도금양 에탄올 추출물을 제조하였다.
실시예 1. 시료 및 세포의 준비
상기 염증질환에 대한 예방 및 치료효과를 측정하기 위하여 하기 시료와 세포를 이용하여 시험을 수행하였다.
상기 시료의 입수처는 하기와 같다.
Src, Syk, ERK, p38, JNK, TAK1, MKK3/6, TLR4, iNOS, Akt, PDK1(phosphoinsitide-dependent kinase 1), IKK, c-Jun, c-fos, b-actin, histone H4, p65(NF-κB), MyD88에 대한 모든 항체는 Cell signaling(USA)으로부터 구입하였다. 또한, TNF-α및 IL-6에 대한 ELISA Kits는 Pierce Endogen(USA)에서 구입하였다. 또한, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), sulfanilamide, lipopolysaccharide(LPS) 및 다른 모든 시약들은 Sigma(USA)에서 구입하였다.
실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW264.7 세포와 HEK293 세포는 한국세포주연구재단(대한민국)으로부터 구입하여 사용하였다. 상기 RAW264.7 세포와 HEK293 세포는 RPMI1640 배지에 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco, Grand Island, NY), 클루타민 및 항생제(penicillin 및 streptomycin)를 첨가하고, 37℃의 온도 조건 및 5% CO2 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 각 실시예에서 실험은 세포밀도 2×106 cells/ml로 실험하였고, 상기 밀도에서 99% 이상의 세포가 생존함을 트리판 블루 염색으로 확인하였다.
실험에 사용한 쥐는 17 g 내지 21 g의 6주 내지 8주 된 수컷 ICR 쥐(대한 바이오링크)를 준비하고, 물과 사료(삼양사)를 자유식으로 공급하였다.
실시예 2. 세포독성의 확인
상기 도금양 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여, RAW 264.7 세포를 이용하여 MTT assay를 통한 세포 생존율을 확인하였다.
보다 구체적으로, 96 well plate에 2×106 cells/ml로 상기 RAW 264.7 세포를 분주하고 16 시간 동안 세포를 안정시킨 후, 상기 도금양 에탄올 추출물을 DMSO에 녹인 후, 농도별(12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖)로 처리하고, 1 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 1 ㎍/㎖의 농도로 LPS를 처리하고, 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 상기 배양 후, 세포 배양액을 제거하고, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)를 0.5 mg/ml의 농도로 처리한 후 4 시간 배양하였다. 상기 배양 후, 원심분리를 통해 상등액을 제거하고, DMSO 150 μl를 첨가하여 생성된 formazan crystals을 용해시킨 후 ELISA microplate reader(TECAN, USA)를 이용하여 570 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 구하였다.
상기 측정결과는 도 1에 나타내었으며, 상기 도 1에 나타낸 세포의 생존율은 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조구(control)에 대한 백분율로 표시하였다.
상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 도금양 에탄올 추출물은 25 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖의 모든 농도에서 안전한 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 25 ㎍/㎖를 처리한 경우 실험결과에서 RAW 264.7 세포의 생존율이 100 % 안팎으로 나타났고, 가장 높은 농도인 400 ㎍/㎖를 처리한 경우에도 약 100 %에 준하는 세포 생존율이 확인되어, 상기 도금양 추출물은 25 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖의 농도에서 세포독성을 유발하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 항염효과 확인 1; Nitric oxide ( NO )의 생성 억제능 확인
상기 도금양 에탄올 추출물의 예방 및 치료효과를 확인하기 위하여, NO 생성 억제 여부를 분석하여 확인하였다.
우선, RAW 264.7세포를 96 well plate에 2×106 cells/ml로 상기 RAW 264.7 세포를 분주하고 18 시간 동안 세포를 배양한 후, 상기 도금양 에탄올 추출물을 농도별(12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖)로 30분간 처리하고, 24 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 1 ㎍/㎖의 농도로 LPS를 처리하고, 20시간 동안 37℃ 온도 조건 및 5% CO2의 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 상기 배양한 배양액에 Griess reagent를 첨가하여, NO(Nitric Oxide)의 함량을 정량하였다.
상세하게, 상기 배양한 세포배양액 100 μl와 Griess reagent(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid 및 1% α-naphthylamide in H20) 100 μl를 혼합하여 실온에서 5 분간 반응시킨 후, 540 ㎚에서 ELISA microplate reader(Tecan, USA)로 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite (NaNO2)로 흡광도를 측정하여 표준곡선을 얻은 후, 상기 측정한 흡광도로부터 N0의 농도를 산출하였다. 상기 산출된 NO 값을 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 도금양 에탄올 추출물은 NO 생성 억제능이 있는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로, 도금양 에탄올 추출물은 LPS 처리에 의해 증가된 NO 생성량을 억제하였고, 55 ㎍/㎖ 처리한 경우 아무 처리도 하지 않은 대조구와 비교하여 약 80% 정도로 NO 함량이 감소되었으며, 농도 의존적으로 계속하여 NO 함량이 감소하여, 300 ㎍/㎖를 처리한 경우 약 30% 정도 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 도금양 에탄올 추출물은 염증질환의 예방 및 치료 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
실시예4 . 항염효과 확인 2; PGE 2 의 생성 억제능 확인
RAW 264.7세포(1×106 cells/ml)를 18시간 배양한 후, 상기 도금양 에탄올 추출물로 24시간 동안 전처리를 한 후에, LPS를 이용하여 염증을 유발하고, 상기 전처리된 배양액을 24시간 동안 다시 배양하였다. 상기 배양한 배양액에 Griess reagent를 첨가하여, PGE2의 함량을 정량하였다. 상세하게, 상기 배양한 세포배양액 100 μl와 Griess reagent(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid 및 1% α-naphthylamide in H20) 100 μl를 혼합하여 실온에서 5 분간 반응시킨 후, 540 ㎚에서 ELISA microplate reader(Tecan, USA)로 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7세포에 상기 도금양 에탄올 추출물을 300 μg/ml 로 각각 처리한 경우 PGE2의 함량이 거의 50% 가까이 감소하는 것이 확인되었다. 따라서 상기 도금양 에탄올 추출물이 염증질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 항염효과 확인 3; 염증 관련 단백질 mRNA 정량 분석
상기 도금양 에탄올 추출물의 항염활성을 확인하기 위하여, iNOS, COX-2 및 GAPDH의 발현량을 mRNA를 분석하여 확인하였다.
LPS 처리한 RAW 264.7 세포로부터 RNA를 준비하였다. 상기 방법은 Lee et al(2008)에 기재된 바에 따라 TRIzol Reagent(Gibco BRL)을 이용하여 준비하였다. 모든 RNA는 -70℃에서 보관한 후 사용한다. Semi-quantitative RT 반응은 MuLV reverse transcriptase를 이용하여 수행하였다. 모든 RNA(1㎍)는 oligo-dT15로 70℃에서 5분 동안 배양되고, 5×first strand buffer, 10 mM dNTPs 및 0.1 M DTT와 섞어주었다. 반응혼합물은 37℃에서 5 분 동안 더 배양하고, MuLV reverse transcriptase(2 U)를 첨가한 후에 60 분간 배양하였다. 70℃에서 10분간 배양하여 반응을 종결시켰다. RNase H를 첨가하여 모든 RNA를 제거하고, PCR반응을 수행하였다(conditions: 2 ㎕ cDNA, 4 μM의 5' 프라이머 및 3' 프라이머, 10×buffer(10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl and 0.1% Triton X-100), 250 μM dNTPs, MgCl2 25 mM 및 Taq DNA 중합효소 1unit(Promega, USA). PCR 반응은 94℃에서 30 초간 변성시키고, 55 내지 60℃에서 30 초간 어닐링 한 후에, 72℃에서 42초간 익스텐션시키고, 72℃에서 5분간 최종적으로 익스텐션한다. 1㎍의 RNA는 Molony murine leukemia virus 역전사 효소로 역전사 된다(Invitrogen). 각 샘플로부터 2㎕의 cDNA가 SYBR Green Master Mix Method(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 사용된다. 반응은 ABI사의 sequence detection system으로 진행하였다. 결과는 18S transcript에 따라 일반화하였다. iNOS, COX-2 및 GAPDH의 프라이머는 하기 표1에 정리하였다. 상기 확인된 결과는 도 4에 나타내었다.
Name Sequence (5'-> 3')
iNOS F GGA GCC TTT AGA CCT CAA CAG A
R TGA ACG AGG AGG GTG GTG
COX-2 F CACTACATCCTGACCCACTT
R ATGCTCCTGCTTGAGTATGT
GAPDH F CAA TGA ATA CGG CTA CAG CAA C
R AGG GAG ATG CTC AGT GTT GG
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, RAW264.7 세포의 mRNA를 분석한 결과 LPS의 첨가에 의해, iNOS, COX-2 및 GAPDH의 발현이 증가되었고, 상기 LPS에 의해 유도된 iNOS, COX-2 및 GAPDH의 발현은 상기 도금양 에탄올 추출물을 처리한 경우 그 발현 정도가 감소되었으며, 발현 감소 정도는 처리된 도금양 에탄올 추출물의 양에 따라 농도의존적으로 감소된 것을 확인할 수 있다.
실시예 6. 항염효과 확인 5; 염증 관련 단백질의 전사인자 생성 억제 여부
LPS에 의해 유도되는 염증과 관련하여, 핵 내의 염증 단백질 전사와 관련된 전사인자인 p65의 생성 정도와 활성화 즉, 인산화 정도를 확인하였다.
상기 확인을 위하여, LPS 처리 또는 LPS 및 도금양 에탄올 추출물을 처리한 RAW264.7 세포의 세포 분획 및 핵 추출물(nuclear extracts)은 Byeon, et al(Archives of Pharmacal Research 32, 1565-1572(2009))에 기재된 바에 따라 수행하였고, 이로부터 핵내 함량과 활성화 정도를 확인하기 위한 면역블러팅 분석(immunoblot analysis)은 Lee et al(British Journal of Pharmacology 154, 852-863(2008))에 기재된 바에 따라 분석하였다. 상기 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 도금양 에탄올 추출물을 처리하는 경우, 특히 60분 동안 처리하는 경우 유의적인 함량의 감소가 확인되었다.
실시예 7. 항염효과 확인 5; 실험동물을 이용한 위염 억제효과 확인
상기 도금양 에탄올 추출물이 위염의 치료 및 예방에 효과가 있다는 것을 확인하기 위해 라니티딘(ranitidine) 및 상기 도금양 에탄올 추출물을 이용하여 위염 치료효과를 확인하였다.
상기 ICR쥐에 위염을 유발시키고, 상기 도금양 에탄올 추출물을 200 mg/kg씩 처리하고 위염이 유발된 면적의 변화를 확인하여 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 염증이 유발된 쥐(vehicle)와 유발되지 않은 경우의 차이를 확인 할 수 있고, 도금양 에탄올 추출물을 처리한 경우 염증 정도가 완화되는 것을 확인할 수 있다.

Claims (5)

  1. 도금양(Rhodomyrtus tomentosa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 도금양 추출물은 등골나물 꽃을 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올 및 이의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 추출용매로 추출한 것인 항염 조성물.
  3. 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 염증질환은 피부염, 알레르기, 위궤양, 십이지장궤양, 간염, 식도염, 위염, 장염, 췌장염, 대장염, 신장염, 위암, 전신부종, 국소부종 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 염증질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  5. 도금양 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.
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