KR20130097056A - Ｚｎ(ⅱ)계 색측정 센서 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 pH 7.4의 수성 배지에서 생물학적으로 중요한 트라이포스페이트인 ATP(아데노신 트라이포스페이트)를 선택적이고 효율적으로 인식할 수 있는 아자-매크로사이클 Zn(II)-착물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A)을 가진 새로운 색측정 케모센서 분자를 기술한다. ATP는 살아있는 유기체들에서 에너지원이기 때문에, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)은 신진대사 과정 동안 제 위치에서 발생한 ATP에 결합하는 것을 통해 살아있는 세포들에서 염색제로서 사용될 수 있다. L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)은 살아있는 세포에 대해 비 독성인 것으로 발견되었고 미생물 세포 성장 연구들이 관찰될 수 있다. 따라서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)은 생존가능한 염색제로서 사용될 수 있다. 또한, 물에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 용해도는 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 증가하였다(반응식 2). 이것이 살아있는 세포들의 더 빠르고 더 강한 염색을 얻는 것을 도왔다. 따라서 염색 효율은 α-CD를 사용함으로써 추가로 향상될 수 있다.
Description
본 발명은 살아있는 세포들을 위한 생존가능한 염색제로서 유용한 화학식 1A의 화합물에 관한 것이다.
화학식 1A
본 발명은 또한 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 다이포스페이트(ADP), 피로포스페이트(PPi), 시토신 트라이포스페이트(CTP) 및 수성 및 생리적 pH의 포스페이트와 비교하여 아데노신 트라이포스페이트(ATP)에 대한 선택성을 가진 Zn(II)계 색측정 센서(Zn(II)의 테트라아자 거대고리 착물)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 순수한 물에서 이의 용해도에 의한 낭포성섬유증의 연구를 위해 사용된 세포 성장 동역학을 연구하기 위해 사용된, 진핵생물들뿐만 아니라 원핵생물들을 위한 염색제로서 유용한 아연 착물(L. Zn)(반응식 1, 화학식 1A)에 관한 것이다.
센서 분자들은 일반적으로 표적 분석물에 특이적이고 (색원체 신호 유닛들을 위한) 스펙트럼(전자 스펙트럼, 형광 스펙트럼 및 NMR 스펙트럼) 특성들 또는 (산화환원 활성 신호 유닛을 위한) 산화환원 데이터에서 결합 유도 변화들을 알릴 수 있는 신호 유닛(signaling unit)에 공유 결합된 수용체 단편으로 구성된다. 이들 중에서, 색측정 센서들은 결합 현상의 육안 탐지에 의해 다른 것들보다 명확한 강점을 가진다.[(a) Vaquez, M.; Fabbrizzi, L.; Taglietti A.; Pedrido, R. M.; Gonzalez-Noya, A. M.; Bermejo, M. R. Angew . Chem . Int . Ed . 2004, 43, 1962. (b) Lin, Z.; Ou, S.; Duan, C.; Zhang, B.; Bai, Z. Chem. Commun . 2006, 624. (c) Miyaji, H.; Sessler J. L. Angew . Chem . Int . Ed . 2001, 40, 154. (d) Libra, E. R.; Scott, M. J. Chem . Commun . 2006, 1485. (e) Zhang, D.; Zhang, M.; Liu Z.; Yu, M.; Li, F.; Yi, T.; Huang, C. Tetrahedron Lett . 2006, 47, 7093. (f) Han, M. S.; Kim, D.H. Angew . Chem. Int . Ed . 2002, 41, 3809. (g) Jose, D. A.; Kar, P.; Koley, D.; Ganguly, B.; Thiel, W.; Ghosh, H.N.; Das, A. Inorg . Chem., 2007, 46, 5576. (h) Jose, D. A.; Kumar, D. K.; Kar, P.; Verma, S.; Ghosh, A.; Ganguly, B.; Ghosh, H. N.; Das, A. Tetrahedron, 2007, 63, 12007. (i) Jose, D. A.; Kumar, D. K.; Ganguly, B.; Das, A. Org . Lett . 2004, 6, 3445. (j) Jose, D. A.; Kumar, D. K.; Ganguly, B.; Das, A. Tetrahedron Lett . 2005, 46, 5343. (k) Jose,D. A.; Singh, A.; Ganguly, B.; Das, A. Tetrahedron Lett . 2007, 48, 3695 (l) Hu, S.; Guo, Y.; Xu, J.; Shao, S. Org . Biomol . Chem . 2008, 6, 2071.]
형광계 센서들은 원하는 분석물의 매우 낮은 농도의 탐지를 가능하게 한다는 것은 일반적으로 인정되는 사실이다. 따라서, 소량으로 또는 극소량으로 존재하는 표적 분석물의 시각적 탐지를 가능하게 하는 색측정 센서를 개발하는 것은 화학자들과 재료 과학자들에게 도전이다. 또한, 수용액, 특히 생리적 상태에 있는 표적 분석물의 탐지는 응용 잠재력의 가능성 때문에 더욱더 중요하다.
음이온의 선택적 인식과 감지를 위한 케모센서(chemosensor)의 설계는 상당히 중요한 영역이다.[(a) Hu, S.; Guo, Y.; Xua , J.; Shao, S. Org . Biomol . Chem . 2008, 6, 2071, (b) Zeider, F. H. Inorg . Chem . 2008, 47, 1264.]
이런 내용에서, 수성 환경과 생리적 pH 이하에서 생물학적으로 중요한 음이온들을 탐지하고 감지할 수 있는 센서들은 생물학적 마커로서 이들의 응용 잠재력 때문에 특히 중요하다. [Khakh, B. S.; North, R.A. Nature, 2006, 442, 527.] 우리의 이전 논문들 [(a) Ghosh, A.; Shrivastav, A.; Jose, D. A.; Mishra, S. K.; Mishra, S.; Das, A. Anal . Chem . 2008, 80, 5312. (b) Jose, D. A.; Mishra. S.; Ghosh, A.; Shrivastav, A.; Mishra, S. K.; Das, A. Org . Lett . 2007, 9, 1979.]에서, 리포터 그룹으로서 곁가지 아조-기능성을 가진 Zn(II)계 배위 착물은 제 위치(in situ)에서 생산된 ATP에 대한 우선적 결합을 통해 효모 세포들(Saccharomyces cerevisiae)을 염색하는데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 사카로마이세스 세레비제, 진핵 미생물은 ATP 형태로 에너지를 얻으며 이런 진핵 생물들의 표면은 음으로 하전된 ATP 이온들에 노출된다. 이런 세포들은 대략 5분 동안 센서 분자 1. Zn에 노출될 때 염색되는 것으로 발견되었다. 이런 사전 결과들이 원핵 미생물들을 위한 것뿐만 아니라 성장 동역학을 연구하기 위한 색측정 염색제로서 더욱 효율적인 리포터 분자를 발견할 가능성을 연구하도록 자극하였다. 이런 내용에서, 생존가능한 염색제는 실질적인 용도와 더욱 관련이 있다.
ATP는 생물학적 시스템에서 보편적인 에너지 운반체이며 생화학적 반응, 능동 수송, 핵산 합성, 근육 작용 및 세포들의 이동에 영향을 준다. [(a) Ivanova, E. P.; Alexeeva, Y. V.; Pham, D. K.; Wright, J. P.; Nicolau, D. V. Int . Microbiol. 2006, 9, 37. (b) Leevy, W. M.; Johnson, J. R.; Lakshmi, C.; Morris, J.; Marquez, M.; Smith, B. D. Chem . Commun . 2006, 1595. (c) Gordon, J. L. Biochem . J. 1986, 233, 309.] 세포질 ATP 농도의 상승은 ATP-의존성 K+ 채널들의 막 탈분극의 기능에서 중요한 사건이다. 따라서, 시간에 따른 살아있는 세포들에서 세포성 ATP 수준들의 측정이 중요한데, 이것은 세포들의 신진대사 상태를 판단할 수 있게 하기 때문이다. 이와 관련하여, 염색 시약의 성질은 중요한데 이는 염색 시약은 리빙 시스템에 해롭지 않아야 하며 세포 증식을 유지할 수 있어야 하고 이의 등급을 평가할 수 있어야 하기 때문이다. 또한, 원핵생물들 및 진핵생물들은 다른 세포 구조를 가지는 것이 주지되어 있다. 원핵생물들은 진핵생물들에 존재하는 어떠한 막-결합 세포 기관을 갖지 않는다; 예를 들어, 진핵생물들은 미토콘트리아를 가진다. 원핵생물들 중에서, 그람 양성(Gram +ve) 및 그람 음성(Gram -ve) 박테리아는 다른 세포벽 구조와 화학적 조성을 가진다. [(a) Nelson, D.L.; Cox, M. M.; Lehninger: Principles of Biochemistry, 3rd ed.; Worth Publishers: New York, 2003. (b) Bergey, D. H.; John, G. H.; Noel, R. K.; Peter, H. A. S. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed.; Lippincott Williams & Wilkins, 1994.]. 따라서, 소형 박테리아의 막을 효과적으로 정확하게 서술할 수 있는 경우, 염색제를 위해 더욱더 중요할 것이다. 그러므로, 이의 더 넓은 이용가능성을 확인하기 위해서, 두 다른 살아있는 세포인 씨. 에이. 바실러스 메가테리윰(c.a. Bacillus megaterium) 및 수도모나스 플루오레센(Pseudomonas fluorescence)을 사용하여 이 시약(L. Zn)(반응식 1, 화학식 1A)을 테스트하였다. 신선한 물은 생명에 필수적이며 인간 소비, 식품 제조 및 의약 제조와 같은 산업들을 위한 신선한 물의 다양한 공급원들에서 박테리아를 관찰하는 방법들은 미생물학적 품질 보증을 위해 필요하다. 여러 가능성 중에서, 가장 인기있는 방법은 배양 방법이며, 결과들을 얻는데 주로 24시간 이상이 필요하며 박테리아 수는 때때로 일부 생존가능한 박테리아들은 배양하기 어렵기 때문에 과소평가된다. 또한, 정량화 및 효모 생존성이 발효,[[(a) Cahill, G.; Walsh, P.K.; Donnelly, D. J. Am . Soc . Brew. Chem . 1999, 57, 72. (b) Zhang, T.; Fang, H. H. P.; Biotechnol . Lett . 2004, 26, 989.], 의학적 검사, [Biswas, K.; Rieger, K.; Morschha user; J. Gene, 2003, 307, 151.], 폐수 처리, [Dan, N. P.; Visvanathan, C.; Basu, B. Bioresour. Technol. 2003, 87, 51.], 치과용 바이오필름 [Millsap, K.W.; M. van der, H. C.; Bos, R.; Busscher, H. J. FEMS, Microbiol . Rev . 1998, 21, 321.] 및 바이오공학 시스템 [Narvhus, J. A.; Gadaga, T. H. Int . J. Food Microbiol . 2003, 86, 51S.]에 중요하다. 이것이 세포들의 생존가능한 염색을 기초로 한 더욱 빠르고 신뢰성 있는 방법의 개발을 필요로 한다. 비록 형광 염색 시약들이 더욱 인기있지만, 색측정 염색제들의 사용은 탐지 기술이 간단하기 때문에 자신만의 중요함을 가진다. 단순 광 현미경을 사용하여 염색된 세포들을 관찰할 수 있다. 여러 경우에서, 특정 형광 마커들(예를 들어, 4,6-다이아미디노-2-페닐인돌다이하이드로클로라이드 DAPI)로 염색된 세포들은 생존하지 못한다. [Baskin, D.S.; Ngo, H.; Didenko, V.V. Toxicol . Sci . 2003, 74, 361.] 또한, 상대적으로 적은 관심을 받는 주요 양태들 중 하나는 효모에서 에너지 의존성 공정의 시간 프로파일 작용이며, 이는 우리가 성장하는 미생물들과 ATP 결합을 통해 빠르고, 쉽고 정확한 방식으로 생물공정, 즉 성장 동역학 반응에 대한 이들의 상관관계를 관찰할 수 있게 한다.
더욱 중요하게는, 아연 착물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A)은 제 위치에서 발생된 ATP에 대한 결합을 통해 다른 생물학적 세포들을 위한 색측정 염색제로서 사용될 수 있다. 이런 염료는 성질이 비 친유성이며 살아있는 미생물들(진핵생물 및 원핵생물)에 대해 비 독성인 것을 발견하였다. 또한, 염색된 세포들은 이들 개개의 매체에서 성장하는 것을 발견하였고 이것은 염색 이후에도 미생물들의 생존성의 유지를 확인시켰다.
저널 "Shawn C. McCleskey et al. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1114."을 참조할 수 있고, 여기서 칩-기초 어레이의 내용에서 센서들 및 표시자-대체 분석법의 조합 라이브러리의 사용은 수용액에서 구조적으로 유사한 분석물들의 분화를 허용한다는 것을 보고하였다. 초분자 화학 유효성분들과 패턴 인식의 결합은 감지를 위한 이런 프로토콜을 유도한다. 저자들은 개개의 라이브러리 구성요소들 사이의 교차 반응성을 연구하기 위한 수단으로서 분석물들 및 다른 포스페이트 유도체들의 혼합물들을 분석하였다. 이런 논문의 단점은 센서가 트라이포스페이트에 대해 선택적이었다는 것이나, 우리 시스템은 배타적으로 ATP에 대해 선택적이다.
저널 "Chun Li et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 6371"을 참조할 수 있고, 여기서 ATP를 위해 수용액에서 작동하는 새로운 색측정 및 형광 센서를 개발하였다. 이런 발견은 수용성 접합 폴리머들의 응용분야를 확장시킬 뿐만 아니라 ATP의 손쉬운 관찰에 대한 새로운 방법을 제공할 것이다. 따라서, 저자들은 자신들의 시스템이 프로브의 막 투과성을 개선하기 위해서 폴리티오펜들에서 치환된 그룹들의 합리적인 디자인 이후 일상적인 세포질 분석법에 응용될 것을 예상한다. 그러나 여기서 저자들은 살아있는 세포 염색에 대해 확인하지 않았다.
저널 "Shenliang Wang et al. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 10380"을 참조할 수 있고, 여기서 첫 번째 자극 GTP(구아노신 트라이포스페이트) 형광 센서가 발견되었고, 따라서 세미-디자인드 다양성 지향 센서 접근이 아니다. GTP에 대한 G49의 이런 전례 없는 높은 선택성과 이의 시각적 녹색 형광 증가를 기초로, 저자들은 이 화합물을 "GTP 그린"으로 부르도록 제안한다. 주요 단점은 저자들이 육안을 통해 탐지될 수 있는 임의의 시각적 색 변화를 발견하지 못했다는 것이었다. 저자들은 GTP의 플루오르 센서에 의한 변화들을 보여준다.
저널 "Okoh et al. Biochemistry, 2006, 45, 14764"을 참조할 수 있고, 여기서 대장균의 포스페이트 결합 단백질을 기초로 한 무기 포스페이트(Pi)에 대한 새로운 바이오센서를 개시하였다. 두 시스테인 돌연변이가 도입되었고 6-아이오도아세트아미도테트라메틸로다민으로 표지화하였다. 서로 물리적으로 밀접하고 정확하게 배향될 때, 두 로다민 염료는 상호작용하여 비 공유 다이머를 형성한다. 이런 상태에서, 이들은 모노머 로다민의 높은 형광 강도와 달리, 적은 형광을 갖거나 형광을 갖지 않는다. 표지화 위치들은 로다민들 사이의 거리와 배향이 Pi 결합과 결부된 형태적 변화의 결과로서 변하도록 위치되었다. 이런 행동이 염료들 사이의 상호작용의 정도를 변화시킨다. 이런 검사된 (A17C, A197C)의 최고 돌연변이는 Pi가 결합할 때 형광 강도의 평균 ~18배 증가를 나타낸다. 센서의 사용은 헬리카제가 DNA를 따라 이동할 때 실시간으로 ATP 가수분해를 측정하기 위해 설명된다. 새로운 센서의 장점들은 로다민 형광체의 사용과 이런 이중 표지화 전략의 효능의 면에서 논의된다. 여기서 저자들은 단지 무기 포스페이트로 연구하였고; 저자들은 생물학적 포스페이트에 의한 어떠한 변화를 보여주지 않는다. 이것이 본 시스템의 주요 단점이다.
저널 "Akio Ojida et al. Chem. Asian J. 2006, 1, 555"를 참조할 수 있고, 뉴클레오시드 피로포스페이트(뉴크레오시드 PP) 유도체들은 살아있는 세포들에 넓게 퍼져있고 다양한 생물학적 사건들에서 중추적인 역할을 한다는 것을 기술하였다. 저자들은 배위 화학을 사용을 가능하게 하는 뉴클레오시드 PPs에 대한 신규한 형광 케모센서를 보고한다. 두 개의 Zn(II)-다이피콜일아민 단위를 포함하는 케모센서들은 수용액에서 뉴클레오시드 PP(PP 결합을 위해 Ka > 106M-1)에 강하게 결합되고 이중 방출 변화에 의해 이들을 감지한다. 상세한 형광 및 UV/Vis 스펙트럼 연구들은 뉴클레오시드 PPs와 결합 직후 케모센서들의 방출 변화들을 나타내었다. 이것은 배위의 음이온-유도 재배열을 기초로 한 독특한 감지 시스템이다. 저자들은 또한 뉴클레오시드 PP 전환을 포함하는 두 개의 중요한 생물학적 공정: 뉴클레오시드 PPs의 아피라제-촉매화 가수분해 및 b-1,4-갈락토실트랜스페라제에 의해 촉매화된 글리코실 이동의 실시간 관찰에서 이런 케모카인들의 용도를 설명하였다. 주요 문제는 저자들은 육안을 통해 탐지될 수 있는 어떠한 시각적 색 변화도 발견하지 못했다는 것이었다. 저자들이 보여준 모든 것은 발광을 통한다.
저널 "Akio Ojida et al Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5518"을 참조할 수 있고, 여기서 최근에 상당한 관심을 받고 있는 생물학적으로 중요한 음이온들을 위한 분자-인식 및 감지 시스템의 개발이 설명되었다. 다양한 음이온들 중에서, 아데노신 트라이포스페이트(ATP)와 같은 뉴클레오시드 피로포스페이트, 무기 피로포스페이트 및 인 단백질을 포함하는 포스페이트 유도체들은 생물학적 시스템들에서 이들의 중추적인 역할들 때문에 중요한 감지 표적들이다. ATP는 보편적인 에너지 원뿐만 아니라 여러 생물학적 공정에서 세포외 신호 매개체로서 알려져 있고 단백질 인산화는 살아있는 세포들에서 신호 변환 케스케이트의 편재하는 제어 메커니즘으로 인식된다. 여기서 저자들은 어떠한 시각적 변화를 보여주지 않았다. 저자들은 단지 새로운 형광 케모센서를 개발하였다.
저널 "Zdenek Kejik et al Chem. Commun., 2006, 1533"을 참조할 수 있고, 여기서 ATP를 위한 센서로서 하나의 테트라부루신-포르피린을 보고하였다. 저자들은 ADP 및 AMP의 존재하에서 ATP에 대한 선택성을 디자인하고 테스트하였다. 그러나 이런 시스템이 가진 단점은 저자들이 피로포스페이트를 위한 하나의 형광 프로브를 발견하였지만 이것이 임의의 생물학적 응용분야에 사용될 수 있는지의 설명이 없다는 것이다.
저널 "Yasuyuki Tsuboi et al., Applied Surface Science, 2007, 253, 8422"을 참조할 수 있고, 여기서 마이크로칩 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 센서의 조립에 사용될 잠재적 기술로서 연구되었던 효소 루시페라제의 레이저-유도 순방향 전송(LIFT)을 증명하였다. 폴리(다이메틸실록세인)(PDMS)은 루시페라제의 증착을 위한 기질로 선택되었다. 유리 및 폴리스티렌과 같은 다른 단단한 기질과 비교하여, PDMS의 유연성은 PDMS를 루시페라제의 마이크로 스팟들의 고정화를 위한 뛰어나 기질로 만든다는 것이 발견되었다. 355nm 레이저를 사용하는 PDMS 기질 위로 루시페라제의 LIFT는 성공적으로 수행된 반면, 효소의 생체활성은 유지되었다. 루시페라제 때문인 황색 발광은 루시페린과 ATP 사이의 효소 반응으로부터 PDMS 칩 상에 전송된 스팟으로부터 관찰되었다. 마이크로칩 ATP 센서는 PDMS 칩에 소형 포토다이오드를 부착시킴으로써 조립하였다. 조립된 마이크로칩의 기초로, 스팟으로부터의 발광 강도 및 ATP 농도 사이의 미카엘리스-멘텐 관계를 확인하였다. LIFT 기술과 PDMS 기질의 조합을 사용하여 바이오센서들의 조립에 대한 가능성은 매우 좋은 것으로 나타났다. 비록 바이오센서들은 재료 과학의 면에서 일부 응용분야에서 효과가 있지만 생물학에서 이런 응용분야는 이들의 시스템에 의해 나타나지 않았다.
저널 "Das et al. Org. Lett., 2007, 9, 1979, and Anal. Chem., 2008, 80, 5312"을 참조할 수 있고, 여기서 피콜일 아민 유도체와의 새로운 색측정 Zn(II) 착물 및 다른 생물학적으로 중요한 포스페이트들과의 이들의 상호작용은 수용액(pH ~ 7.2)에서 조사하였다. 시각적 색 변화는 ATP와의 결합에 대해 탐지된 반면, 다른 생물학적으로 관련된 음이온들(AMP, ADP, PPi 또는 포스페이트)가 사용될 때 이런 변화는 관찰되지 않는다. Zn 착물은 (진핵생물에서) 미토콘트리아에 의해 제 위치에서 발생된 ATP에 대한 결합을 통해 다른 생물학적 세포들을 위한 염색제로서 사용될 수 있다. 원핵생물(박테리아)의 경우, 미토콘트리아가 없기 때문에 세포막이 세포 에너지 전환을 책임진다. ATP는 어떠한 진핵생물에서 발견되지 않은 세포막 상의 이들의 독특한 세포 구조로 생산된다. 이런 염색된 세포들은 일반적인 광 현미경으로 볼 수 있다. 이런 시약은 Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아(원핵생물)를 구별하기 위해 사용될 수 있다. 이 염료는 성질이 친유성이고 살아있는 미생물들(진핵생물 및 원핵생물)에 독성이 없는 것으로 발견되었다. 또한, 염색된 세포들은 이들의 개개의 배지에서 성장하는 것이 발견되었고 이것이 구입할 수 있는 여러 다른 염료들과 달리, 염색 이후에도 미생물들의 생존성의 유지를 확인하였다. 우리의 이전 연구에서 주요 문제는 용해성이었고, 화합물은 순수한 물에 용해되지 않았고, 5% 에탄올은 센서를 용매화하기 위해 필요한 동시에 염색 컬러 강도는 본 발명과 비교하여 적었다.
저널 "Peng Jiang et al. Biochemistry, 2007, 46, 12979"을 참조할 수 있고, PII 신호 변환 단백질은 가장 넓게 분포된 것들 중에서 성질이 신호 단백질들이며, 박테리아로부터 더 높은 식물들까지의 유기체들에서 질소 동화를 제어하는 것이 개시되었다. PII 단백질들은 세포성 신진대사 상태의 신호들을 통합하고 신호 변환 효소들 또는 주요 신진대사 효소들인 수용체들과 상호작용하거나 이들을 제어한다. 대장균 PII에 의한 종래 연구는 PII의 모든 신호 변환 기능들은 PII에 대한 ATP 결합을 필요로 하였다는 것을 보여주었고 ATP 결합은 PII에 대한 R-케토글루타레이트의 결합과 상승작용이었다. 게다가, 질소와 탄소 상태의 세포 신호인 R-케토글루타레이트는 PII 기능을 강하게 제어하는 것으로 관찰되었다. 저자들은 재구성된 신호 변환 시스템에서, ADP는 두 대장균 PII 수용체, ATase 및 NRII(NtrB)의 PII 제어에 대해 및 신호 변환 UTase/UR에 의한 PII 우리딜화에 대해 매우 극적인 효과를 가졌다는 것을 증명하였다. ADP는 R-케토글루타레이트에 대해 길항적으로 작용하였는데, 즉, 낮은 아데니릴레이트(adenylylate) 에너지 전하가 질소 제한의 신호를 감소하는데 작용하였다. 재구성된 신호 변환 시스템들에서 일어나는 상호작용들을 개별적으로 연구함으로써, 저자들은 필수적으로 모든 PII 및 PII-UMP 상호작용들은 ADP에 의해 영향을 받는다는 것을 관찰하였다. 저자들은 또한 특정 조건들하에서, PII 트라이머의 3개의 뉴클레오티드 결합 부위들이 ATP 및 ADP의 조합들에 의해 차지될 수 있다는 것을 제안한다. 전체적으로, 결과들은 PII 단백질들은, R-케토글루타레이트의 센서들로서 작용하는 것 이외에, 아데니릴레이트 에너지 전하의 직접 센서들로서 작용하는 능력을 가진다는 것을 보여준다. 저자들은 생물학적 세포들의 염색에 대해 연구하지 않았다.
저널 "Hao Wang et al. Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 162"을 참조할 수 있고, 여기서 ATP를 위한 새로운 다이토픽 콜리산-기초 형광 케모센서를 기술하였다. 포스페이트, AMP, ADP, ATP, CTP, GTP 및 TTP와의 상호작용들은 조사되었다. ATP가 pH 7.4에서 센서의 1:1 수성 CH3CN 용액에 첨가될 때, 형광의 현저한 감소가 관찰된 반면, 다른 게스트 분자들은 훨씬 적은 효과를 나타내었다. 센서와 ATP 사이의 착물은 결합된 UV, 1H, 13C 및 31P NMR 분광 방법들을 통해 확인되었다. 이 센서의 독특함은 개개의 결합 상수들로부터 증명되는 것과 같이, 다른 뉴클레오티드보다 33-124배 더욱 선택적으로 ATP와 결합하는 것이다. 이 센서는 매우 민감한 감지 프로브이며; 30nM의 적은 ATP가 센서의 15% 형광 소광을 일으킬 수 있다. 비록 저자들은 ATP와 선택적으로 결합하는 센서 시스템을 가졌으나, 저자들은 생물학적 세포들을 염색하기 위한 센서를 사용하지 않았고 센서는 생리학적 조건들에서 작동하지 않았다.
저널 "Tae-Hyuk Kwon et. al. Chem. Eur. J. 2008, 14, 9613"을 참조할 수 있고, 여기서 다른 뉴클레오티들에 비해 HEPES 버퍼에서 티미딘 5'-트라이포스페이트(TTP)에 결합 직후 선택적 발광 향상을 나타낸 총체적 센서 시스템을 보고하였다. 총체적 센서 시스템은 에너지 억셉터와 에너지 도너로 구성되었다. 뉴클레오티드들 중에서, TTP에 대한 선택적 인식과 발광 향상은 Zn2 +-사이클렌(사이클렌 = 1, 4, 7, 10-테트라아자사이클로도데케인)에 대한 티미딘 유닛의 강한 결합 및 mCP와 FIrpic 모이어티들 사이의 분자간 에너지 전송에 의해 성취되었다. 저자들은 이 센서에 의한 어떠한 생물학적 응용분야를 나타내지 않았다.
저널 "Akihiko Ishida et al. Anal Bioanal Chem, 2008, 392, 987"을 참조할 수 있고, 여기서 효소 사이클링 및 Fe(III)-자일레놀 오렌지(XO) 착물 형성을 사용하는 ATP의 분석법에 대한 색측정 방법의 개발을 기술하였다. 황색으로부터 심홍색으로의 뚜렷한 색 변화를 나타내는 Fe(III)-XO 착물들의 색 특성들은 스크리닝 작업에서 시각적 관찰을 지원한다. 이런 방법에서, 소량의 ATP가 피루베이트로 전환되었고, 이것은 결합된 효소 반응들에 의해 지수적으로 추가로 증폭되었다. 결국은, 피루베이트가 피루베이트 옥시다아제 반응과 Fe(II) 산화를 통해 Fe(III)-XO 착물들로 전환되었다. 분석 결과로서, 황색 또는 심홍색이 관찰되었다: 황색은 ATP 농도가 테스트의 기준보다 낮은 것을 나타내며 심홍색은 ATP 농도가 기준보다 높다는 것을 나타낸다. 이 방법은 소젖에 첨가된 대장균 세포들로부터 추출된 ATP의 분석에 적용되었다. 저자들은 생물학적 세포들의 염색에 대해 연구하지 않았고 어떠한 세포 성장 동역학도 연구하지 않았다.
저널 "Yimin Sun et al. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 3044"을 참조할 수 있고, 여기서 구아니디니오카본일 피롤 모이어티를 가진 새로운 4-아미노-1,8-나프탈이미드-기초 형광 케모센서를 개시하였다. 센서는 ATP, ADP, AMP 및 수용액에 있는 다른 무기 음이온들에 비해 피로포스페이트와 선택적 형광 향상을 나타낸다. 이 시스템이 가진 주요 단점은 저자들이 어떠한 생물학적 세포들로 이들의 시스템을 확인하지 않았다는 것이다.
저널 "Itaru Hamachi et al J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12095"를 참조할 수 있고, 여기서 소형 분자 케모센서들에 의한 형광 감지는 다양한 생물학적 물질들의 기능의 평가를 위한 다양한 기술이라는 것을 기술하였다. 이런 형광 케모센서를 금속-음이온 배위 화학을 사용하여 ATP와 같은 뉴클레오시드 폴리포스페이트에 대해 개발하였다. 케모센서는 결합 모티프(binding motifs)로서 2,2'-다이피콜일아민(Dpa)-Zn(II) 및 뉴클레오시드 폴리포스페이트에 대한 형광 감지 유닛으로서 잔텐의 두 위치로 구성되었다. 케모센서 1-2Zn(II)는 대형 형광 향상(F/Fo>15) 및 강한 결합 친화력을 가진 뉴클레오시드 폴리포스페이트를 선택적으로 감지하는 반면, 모노포스페이트 종들 및 다양한 다른 음이온들에 의한 탐지가능한 형광 변화는 유도되지 않았다. '흥분'(turn-on)인 1-2Zn(II)의 형광은 아연-결합수의 전례 없는 친핵성 공격에 의해 형성된 이의 비형광 탈접합 상태로부터 잔텐 고리의 접합 형태의 결합-유도 회복을 포함하는 새로운 메커니즘을 기초로 한다. 뉴클레오시드 폴리포스페이트들을 탐지하는 센서의 선택적이고 매우 민감한 능력은 살아있는 세포들에서 ATP 미립자 저장들의 형광 시각화에서 이의 생체분석 응용분야들을 가능하게 하여, 센서의 잠재적 용도를 나타낸다. 저자들은 일부 생물학적 세포 염색을 연구하였고, 이들은 공초점 현미경을 통해 세포 염색을 보여주었으나, 본 발명에 의해 단순 광 현미경을 통해 염색된 세포들을 볼 수 있다.
저널 "Hongmei Wu et al. Inorg. Chem. 2009, 48, 408"을 참조할 수 있고, 여기서 다른 리보뉴클레오시드에 비해 수성 배지에서 아데노신 트라이포스페이트의 선택적 탐지를 위해, 메타 위치에서 중앙 벤젠 고리 내에 아마이드기들을 포함하는 두 개의 트라이덴테이트 N2O 유닛을 변형시킴으로써 제조된 발색단 유닛과 수소결합 유발 위치로 이루어진 금속나선형 삼각형을 개발하였다. 비록 저자들은 ATP와 선택적으로 결합하는 센서 시스템을 가졌지만, 이들은 생물학적 세포들에 의해 염색제로서 센서를 연구하지 않았다.
저널 "Aiko Nonaka et al. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 3621"을 참조할 수 있고, 여기서 수용액에서 여러-포스페이트들의 형광 탐지를 위한 새로운 전략. ZnII-DPA(DPA = 다이피콜일아민)-첨가된 페닐보론산은 알리자린 염료와 어셈블리를 형성하며, 여기서 염료는 ZnII-DPA 모이어티에서 배위결합된 아연(II)에 유리하게 결합한다는 것을 개시하였다. 추정의 분석물로서 피로포스페이트(PPi)의 첨가는 착물의 재구성을 일으켜서 다른 보로네이트 에스터 어셈블리를 생산하며, 이것이 육안으로 탐지될 수 있는 형광의 증가를 일으킨다. 시스템은 다른 포스페이트들에 비해 PPi-선택성을 나타내었다는 것을 유의하는 것이 흥미롭다. 이런 시스템의 결함은, 저자들이 포스페이트와 선택적으로 결합하지 않는 다른 포스페이트들과 결합하는 센서를 발견하였고 따라서 ATP에 대해 선택적인 센서가 아니라는 것이다.
Anal
.
Chem
. 2008, 80, 5312-5319
and
Org
.
Letts
. 2007, 9, 1979-1982에 기술된 본 발명의 Zn(
II
)계
색측정
센서 L.
Zn
(반응식 1, 화학식 1A)과
Zn
(
II
)계
색측정
센서 1.
Zn
(반응식 1b)의 비교:
본 발명자들의 이전 논문(Organic Letters, 2007, Vol. 9, No.10, 1979-1982 and Anal . Chem . 2008, 80, 5312-5319)에 기술된 Zn(II)계 착물[1.Zn(반응식 1b)]은 본 발명에 기술된 [L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)]과 다르다. 이 두 논문에 보고된 의견은 실질적인 응용분야를 발견할 수 있는 임의의 염색제들은 수용액에 완전히 용해되어야 하기 때문에 1.Zn이 순수한 수용액에서 이의 용도면에서 중대한 제한들을 가졌다는 것을 보여주었다. 1.Zn은 물에 불용성이었고 이를 가용화하기 위한 특정량의 알코올을 사용해야 하며 그런 후에 이 시약의 이 알코올 용액은 염색 목적을 위해 사용될 수 있다. 비록, 착물은 원핵세포들 및 진핵세포들에 독성이 없는 것으로 발견되었지만, 알코올의 용도는 바람직하지 않았거나 실질적인 세포 염색 실험들이 허용되지 않았는데, 이는 살아있는 유기체에 일부 악영향을 가질 수 있기 때문이다. 본 발명은 이런 문제들을 극복할 수 있었다.
본 특허출원에서 발명자들은 육안으로 탐지될 수 있는 색의 변화들과 관련된 ATP와 결합할 수 있는 화학식 1A의 다른 Zn(II)계 착물 L.Zn을 보고하였다.
이 새로운 시약은 물에 완전히 용해되며 따라서 세포 염색 실험들에 관한 어떠한 실질적인 응용분야에 적절하고 가장 적합하다. 또한, ATP에 대한 결합에 대해, 이런 착물에 대한 최대 흡수도는 (463nm으로부터 503nm로) 40nm만큼 이동되며 이것이 우리의 이전 공개공보에서 보고한 시약(1.Zn)과 비교된 대로 더욱 분명하고 뚜렷한 색 변화들을 일으켰다.
우리의 이전 시약(1.Zn)의 경우 이동은 에탄올-수성 버퍼 배지에서 단지 21nm이었다. 본 Zn(II)-착물 L.Zn(본 특허출원에 보고)을 위한 40nm의 더 큰 이동은 스펙트럼 측정들에 중요하며 따라서 세포 성장 동역학 연구들에 중요하다.
또한, 적합한 센서의 경우 최적의 결합 상수 값을 가지는 것이 바람직하다. 본 특허출원에 보고된 본 Zn(II)-착물을 위한 결합 상수는 (1.Zn)에 대해 이전에 보고한 (1130±6)M-1)보다 낮은 (978±4)M-1이다. 이것이 이 센서가 이전에 보고한 Zn(II)-착물(1.Zn)과 비교하여 더욱 가역적으로 ATP와 결합하게 할 것이다.
더욱 중요하게는, 이 Zn(II)-시약의 더 높은 용해도는 α-사이클로덱스트린(α-CD)(도 8의 a = L.Zn 단독, b = L.Zn + α-CD)의 사용을 통해 얻을 수 있다. α-CD의 존재하에서 수용액에서 L.Zn의 용해도는 도 8에서 볼 수 있듯이 증가하며, α-CD의 첨가에 의해 색 강도는 증가하여 L.Zn의 더 많은 양이 용액 속으로 들어간다는 것을 나타낸다. 이런 관찰은 이전 시약 1.Zn에 대해 보고되지 않았다. α-CD의 사용은 약물 운반체로서 일반적이며 살아있는 세포에 완전히 비 독성인 것으로 알려져 있다. 따라서, Zn(II)-착물(본 특허출원에 보고)과 조합한 α-CD의 사용은 더 높은 농도로 이 센서 분자를 사용할 기회를 제공하는데 더 좋은 색 변화(도 13, α-CD이 없는 D1 및 α-CD가 있는 D2) 및 살아있는 세포들의 더 빠른 염색을 얻는데 도움이 될 수 있다.
α-CD의 존재하에서 본 Zn(II)-시약(L.Zn)을 사용하여, 진핵 및 원핵(Gram +ve / Gram -ve) 세포들은 단지 2분 배양으로 염색될 수 있는 반면; 이전 시약(1.Zn)의 경우 세포들은 색 발달을 위해 10분 동안 배양될 것을 필요로 하였다. 또한, 염색된 세포(본 Zn(II)-착물 사용)의 색 강도는 이전에 보고된 색 강도와 비교하여 훨씬 더 강했다. 이것은 단지 구조적 변화(1.Zn에 보고된 대로 비스피콜일 아민 대신에 본 연구에서 아자매크로사이클릭 리간드의 사용)에 의해 성취될 수 있다(반응식 1b).
본 Zn(II)-착물은 CTP와 비교하여 ATP에 대해 더욱 선택적인 것으로 발견되며 CTP와 관련된 색 변화는 거의 무시할 수 있다(도 2a).
합성 변화: 합성 절차에 따라, 이전에 보고된 Zn(II)-착물(1.Zn)의 합성을 위해 사용된 리간드는 최적의 수율을 얻기 위해 0℃에서 다이피콜일 아민 및 4-(4-다이메틸아미노-페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드(1:1.05 몰 당량)를 반응시켜 합성하였다. 본 리간드(L)의 합성을 위해 1,4,8,11-테트라 아자사이클로테트라데케인이 10시간 동안 실온(30℃)에서 4-(4'-다이메틸아미노-페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드(1:1 몰 당량)와 반응하게 하였고 그런 후에 1시간 동안 환류하였다. 4-(4-다이메틸아미노-페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드의 농도를 증가시키려는 어떠한 시도가 여러 생성물과 불순물을 발생시킬 것이고 이런 불순물들을 제거하는 것은 매우 어려웠다. 또한, 반응 온도는 합리적인 수율을 얻기 위해 중요하다. 0℃에서 반응은 본 연구에서 원하는 생성물에 대한 매우 나쁜 수율을 발생시킬 것이다. 또한, 본 연구에서, Zn(II)-착물에 대한 정제는 CHCl3로 세척함으로써(반응하지 않은 유기 시약의 제거) 성취될 수 있으며, 이는 이런 유기 용매에서 Zn(II)-착물의 더 높은 용해도 때문에 이전 연구에서는 불가능하였다. 이런 정제 단계가 원하는 Zn(II)-착물(L.Zn)의 정제를 훨씬 쉽게 만들었고 이를 가장 순수한 형태로 분리하는 것을 도왔다. 또한, 이전 착물(1.Zn)에서 Zn(II)-중심은 비스피콜일 아민 기능성의 3개의 질소 원자와 배위결합하며 이것이 Zn(II)-중심에 대한 3개의 포스페이트 산소 원자의 결합 가능성을 제한한다. hs 시스템(L.Zn)에서, 테트라아자매크로사이클릭 모이어티의 4개 N 원자가 Zn(II)-중심과 결합하며 Zn(II)-이온은 배위하는 N-원자들의 평면 위에 잔존하며 이것이 3개의 포스페이트 O-원자의 Zn(II)-중심에 대한 배위결합을 도우며(반응식 1a), 결국에 ATP에 대한 결합에 대해 더 나은 스펙트럼 및 눈에 보이는 색 변화를 유도한다.
본 센서 분자(L.Zn)의 사용 가능성 및 이전에 보고된 분자(1.Zn)의 제한: 이런 형태의 색측정 센서 분자들은 제 위치에서 생산된 ATP의 정량적 탐지를 허용하여 세포들의 에너지 효율을 나타내기 때문에 낭포성섬유증에 대한 연구에 매우 유용할 수 있다. 이런 측정은 ATP가 낭포성섬유증에 중요한 중대한 단백질들의 대부분을 제어하기 때문에 매우 중요한 의미를 가진다. 또한, 이런 형태의 색측정 센서들은 ATP의 양을 정량하는 방식으로서 흐름세포분석기에 의한 실험들에 대한 현탁 세포들과 사용될 수 있다. 분명하게는 접합제는 ATP에 대해 선택적이어야 하며 수용액에서 활성적이어야 한다.
이런 응용분야들의 경우 임의의 알코올 또는 다른 유기 용매들의 사용을 피하는 것이 필수적이다. 이전에 보고된(D1 및 D2) 화합물 1.Zn의 주요한 제한은 특정량의 알코올을 사용해야 하는 것과 실질적인 목적을 위한 이런 시약을 사용하는 가능성을 제한하는 것이다. 세포 염색 연구들을 위한 순수한 수용액인 최근 착물(L.Zn)을 사용한다. 주요 구성요소들 중 하나는 이 (L.Zn) 착물(이전 착물 1.Zn와 비교할 때)을 합성하는데 일반적이지 않으며, 이것이 차이를 더하거나 또는 더욱 정확하게는 개선된 용해도와 염색 특성을 더한다. 합성 절차에서, 최적의 수율로 원하는 화합물 L.Zn을 얻는데 중요한 명백히 미세하나 중요한 차이가 있다. 알코올의 소수 중요한 부작용들: 식용 알코올의 한 효과는 "혈액 응집"이며 적혈구들은 함께 덩어리가 되어 작은 혈관들이 메우고, 산소의 조직들을 죽이고, 세포 사망을 일으킨다. 이런 세포 사망이 가장 심각하고, 주로 뇌에서 인식되지 않는다. 알코올은 다른 음식들과 달리 소화되지 않고, 대신 변환되어 세포들과 조직들로 운송된다; 이것은 정상적인 소화 과정을 피해서 혈류로 직접 들어간다. 약 20%의 알코올이 위벽들을 통해 혈액으로 직접 흡수되고 80%가 소장을 통해 혈류 속에 흡수된다.
본 발명의 주요 목적은 Zn(II)계 색측정 센서(반응식 1, 화학식 1A)를 준비하고 살아있는 세포들을 위한 생존가능한 염색제로서 이의 사용을 위한 방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이의 시각적 탐지를 가능하게 하는 색의 변화에 의해 아데노신 트라이포스페이트(ATP)에 선택적으로 결합하는 케모센서를 사용하여 감지하기 위한 방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수용액의 ATP 또는 생리학적 조건의 탐지를 위한 방법을 표준화하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 물에서 케모센서의 용해도를 향상시키기 위한 적절한 방법을 찾는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 광학적 광 현미경을 사용하여 효모(진핵생물) 세포 및 Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아(원핵생물) 세포들과 같은 살아있는 유기체(미생물들)에서 ATP의 탐지를 위한 적절한 방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아를 구별하기 위한 이런 케모센서를 사용하는 가능성을 연구하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 케모센서의 생존성을 테스트하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 성장 동역학을 연구하기 위한 방법을 확립하는 것이다.
따라서, 본 발명은 화학식 1A의 화합물을 제공한다.
화학식 1A
본 발명의 한 실시태양에서, 상기 화합물은 성질이 비 친유성이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 화합물은 살아있는 세포들을 위한 생존가능한 염색제로서 유용한 색측정 센서이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 살아있는 세포들은 원핵세포 및 진핵세포로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 사용된 원핵세포들은 바실러스 종들 및 수도모나스 종들이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 사용된 진핵세포들은 효모(Saccharomyces cerevisiae)이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 화학식 1A의 화합물의 제조 방법은 다음 단계를 포함한다:
i. 25-30℃ 범위의 온도에서 300 내지 600rpm(분당 회전수)의 속도로 온화한 교반하에서 용매에 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데케인을 용해하는 단계;
ii. 2 내지 5℃ 범위의 온도에서 단계(i)에서 얻은 용액을 얼음에 유지하는 단계;
iii. 300 내지 600rpm의 속도로 온화한 교반하에서 0.5 내지 1 mL/minute의 속도로 단계(ii)에서 얻은 용액에 트라이에틸 아민 염기를 첨가하는 단계;
iv. 0 내지 5℃ 범위의 온도에서 15 내지 60 mL/hr 범위의 속도로 단계(iii)에서 얻은 용액에 테트라하이드로퓨란 속 4-(4-다이메틸아미노-페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드의 개별적으로 제조된 용액을 첨가하는 단계;
v. 5 내지 10시간 범위의 기간 동안 25 내지 30℃의 온도 범위에서 단계(iv)에서 얻은 생성된 혼합물을 교반하는 단계;
vi. 65 내지 70℃ 범위의 온도에서 20 내지 60분 범위의 기간 동안 단계(v)에서 얻은 혼합물을 재환류하는 단계;
vii. 리간드의 침전물을 분리하기 위해 단계(vi)에서 얻은 혼합물을 여과하는 단계;
viii. 단계(vii)에서 얻은 리간드의 침전물을 세척하고 건조하는 단계;
ix. 20 내지 25℃ 범위의 온도로 알코올에 단계(viii)에서 얻은 리간드를 용해하는 단계;
x. 20 내지 25℃ 범위의 온도에서 단계(ix)에서 얻은 리간드의 용액에 질산염 아연 용액(리간드의 0.3 내지 0.8 몰 당량)을 첨가하는 단계;
xi. 12 내지 24시간 범위의 기간 동안 20 내지 25℃ 범위의 온도에서 단계(x)에서 얻은 용액을 교반하는 단계;
xii. 2 내지 5시간 범위의 기간 동안 10 내지 20℃ 범위의 온도에서 단계(xi)에서 얻은 용액을 휘젓는 단계;
xiii. 화학식 1A의 화합물을 얻기 위해 클로로폼으로 단계(xii)에서 얻은 침전물을 여과하고 세척하는 단계.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 용매는 클로로폼, 메탄올, 다이클로로메테인 및 테트라하이드로퓨란(THF)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 사용된 알코올은 메탄올과 에탄올로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 화학식 1A의 화합물 및 상기 단계를 사용하는 살아있는 세포들을 염색하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 6 내지 36시간 범위의 기간 동안 30 내지 40℃ 범위의 온도에서 (i) 글루코오스 효모 추출물 한천(GYE) 배지에서 사카로마이세스 종들(MTCC 5548), (ii) 영양소 발효액에 바실러스 종들(MTCC 5549) 및 (iii) 킹스 B 배지(King's B medium)에서 수도모나스 종들(MTCC 5550)을 배양하는 단계;
b. 5 내지 20분 범위의 기간 동안 28 내지 38℃의 온도 범위에서 화학식 1A의 0.6x10-4 내지 1.2x10-4M 화합물로 단계(a)의 세포들을 배양하는 단계;
c. 28 내지 38℃의 온도 범위에서 10 내지 12시간 범위의 기간 동안 7.4 내지 7.6 범위의 pH에서 버퍼 속 글루터알데하이드로 단계(b)에서 얻은 배양된 샘플을 고정하는 단계;
d. 0.5 내지 1.0시간 범위의 기간 동안 상기 버퍼로 단계(c)에서 얻은 샘플을 세척하는 단계;
e. 오스뮴 테트라옥사이드와 버퍼로 단계(d)에서 얻은 샘플을 차후 고정하고 상기 버퍼로 세척하는 단계;
f. 등급별 물 에탄올 시리즈에 의해 단계(e)에서 얻은 샘플로부터 물을 제거하는 단계;
g. 상기 버퍼에 단계(f)에서 얻은 샘플들을 세정하고 단순 현미경 아래서 보기 위해 염색된 표본을 얻도록 스퍼터 코터에서 금으로 코팅하는 단계;
h. 염색된 세포들의 다른 색 강도와 모양으로 살아있는 세포들을 구별하는 단계.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 사용된 버퍼는 포스페이트 버퍼이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 센서와 살아있는 세포의 결합은 주사전자현미경(SEM) 분석에 의해 확인된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 염료에 의한 염색 이후 세포들의 생존성은 세포 분할의 발생을 나타내는 오목 슬라이드에서 현적법(hanging drop method)에 의해 테스트된 미생물들에서 2분열(binary fission)을 관찰함으로써 증명된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 화학식 1A의 화합물의 가역적 결합은 광 현미경 및 UV-Vis 분광학을 통해 시트르산 나트륨 20%(w/v) 용액으로 세포들을 탈색함으로써 확인된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 화학식 1A의 화합물에 의한 살아있는 세포의 염색은 3개의 포스페이트 그룹들은 Zn와 배위결합하며 모든 3개의 인 원자들에 대해 31PNMR 이동을 얻은 살아있는 세포들의 세포 벽에 존재하는 ATP에 의한 센서의 헵타 배위결합 종들의 형성에 의해 수행된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 화학식 1A의 화합물의 흡수 스펙트럼 적정 곡선은 ATP의 첨가 이후 40nm 스펙트럼 이동을 나타내며 ATP와 화합물의 결합 상수는 (978±4)M-1이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 물에서 화학식 1A의 화합물의 용해도는 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 약 7 내지 7.5배 증가한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 화학식 1A의 화합물의 염색의 강도는 Zn(II)계 색측정 센서 L.Zn에 대한 최대 흡수도가 α-CD(사이클로덱스트린)의 수용액의 첨가에 의해 5nm만큼 이동하는 것을 보여줌으로써 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 증가한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 화학식 1A의 화합물에 의한 염색은 10-20분 후에 발생하며 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 1초 내지 2분 후에 발생하여 화학식 1A의 화합물의 염색 속도는 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 증가하는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 염료 없는 사카로마이세스 종들의 세포 표면들의 SEM 이미지들은 염료가 있는 사카로마이세스 종들의 세포 표면들의 SEM 이미지들이 거친 것과 비교하여 부드러운 것으로 발견되었다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 염료가 없는 Gram +ve 박테리아의 SEM 이미지들은 염료가 있는 Gram +ve 박테리아의 SEM 이미지들이 거친 것과 비교하여 부드러운 것으로 발견되었다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 염료가 없는 Gram -ve 박테리아의 SEM 이미지들은 염료가 있는 Gram -ve 박테리아의 SEM 이미지들이 거친 것과 비교하여 부드러운 것으로 발견되었다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, Gram +ve 박테리아에 대한 염색된 세포들은 염색된 Gram -ve 박테리아의 염색된 세포들과 비교하여 더 길게 보였다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데케인은 6 내지 15 밀리 몰 범위의 농도이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 트라이에틸아민의 첨가 속도는 0.5 내지 1.0mL/min의 범위로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 4-(4'-다이메틸 아미노 페닐 아조)-벤젠 설폰일 클로라이드는 15 내지 20mM 범위의 농도이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 4-(4-다이메틸 아미노 페닐 아조)-벤젠 설폰일 클로라이드의 첨가 속도는 15 내지 60mL/hour 범위로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 반응 혼합물은 5 내지 10시간 범위의 기간 동안 25 내지 30℃ 범위의 온도를 유지하면서 교반된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 반응 혼합물은 20 내지 60분 범위의 기간 동안 재환류된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 이렇게 제조된 리간드는 14 내지 20mM 범위의 농도와 20 내지 30℃ 범위의 온도를 유지하면서 용매에 용해된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 질산 아연 용액은 리간드의 0.3 내지 0.8 몰 당량 범위로 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 리간드와 질산 아연 용액의 반응 혼합물은 20 내지 30℃ 범위의 온도에서 12 내지 24시간 범위의 기간 동안 교반된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 최종 반응 혼합물은 2 내지 5시간 범위의 기간 동안 10 내지 20℃ 범위의 온도에서 정적 상태로 유지된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 배양된 종들은 28 내지 38℃ 범위의 온도에서 0.1-0.15mM의 농도 범위로 5 내지 20분 범위의 기간 동안 센서와 배양되었다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 생물학적 샘플들은 센서로 염색되었다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 효모 세포(진핵생물) Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아(원핵생물)는 동일한 센서로 염색될 때 염색된 세포들의 색의 강도를 기준으로 구별될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 노출 이후 테스트 미생물들의 군집들은 이들의 생존성을 확인하기 위해 영양소 한천 판 상에 도말평판법(streaking)에 의해 성장되었다.
본 발명의 장점
1. Zn(II)계 색측정 센서는 다른 뉴클레오티드보다 아데노신 트라이포스페이트(ATP)와 우선적으로 결합한다.
2. 센서는 살아있는 세포에 대해 비 독성이다.
3. 센서는 생존가능한 염색제로서 사용될 수 있고 세포 성장 동역학 연구를 위해 사용될 수 있다.
4. α-사이클로덱스트린의 사용은 물에서 센서의 용해도를 증가시킨다.
5. 염색된 미생물 세포는 광 현미경을 통해서뿐만 아니라 센서와 함께 육안으로 배양 발효액에서 뚜렷하게 볼 수 있다.
6. 센서는 성질이 비 친유성이다.
7. 염색 공정은 쉽고(단일 염색제), 빠르고 환경친화적이다.
8. 본 발명은 단지 한 단계에서 Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아 사이를 구별할 수 있는 독특한 염색제이다.
반응식 1은 Zn(II)-아자매크로사이클릭 착물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A)의 합성을 나타내며 또한 L.Zn와 ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 결합 방식을 나타낸다.
반응식 2는 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)과 α-CD(α-사이클로덱스트린)의 포함 메커니즘을 나타낸다.
도 1은 다양한 음이온(~17.0mM); 1:ATP; 2:CTP; 3:ADP; 4:F-, Cl-, Br-, I-, CH3COO-, H2PO4 -, PPi, SO4 2 -, NO3 -, CN-, AMP, SCN-의 존재하에서 25℃에서 HEPES(N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-에테인설폰산) 버퍼 용액(pH ~7.2)에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(8.87μM)의 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 다양한 포스페이트 이온들 없이 및 다양한 포스페이트 이온들의 존재하에서 수용액에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(8.87μM)의 색 변화를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽으로: 블랭크, H2PO4 -, PPi, AMP, ADP, ATP, CTP(음이온 농도 ~500μM) 첨가.
도 3은 ([ATP] = 0 - 17.28mM)이 L.Zn(II)-화합물(반응식 1, 화학식 1A)(9.46μM)의 수용액에 pH 7.2(10mM HEPES 버퍼 용액)와 25℃에서 첨가될 때 흡수 스펙트럼 적정 곡선을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 4는 ([CTP] = 0 - 10.17mM)이 L.Zn(II)-화합물(반응식 1, 화학식 1A)(1.79μM)에 pH 7.2(10mM HEPES 버퍼 용액)와 25℃에서 첨가될 때 흡수 스펙트럼 적정 곡선을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 5는 ADP([ADP] = 0 - 6.55mM)가 L.Zn(II)-화합물(반응식 1, 화학식 1A)(8.86μM)에 pH 7.2(10mM HEPES 버퍼 용액)와 25℃에서 첨가될 때 흡수 스펙트럼 적정 곡선을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 6a는 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 결합 방식; 25℃에서 ATP 단독(A) 및 Zn(II)-착물, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)과 ATP(B)를 나타내는 500MHz 브루커(Model noAdvance-DPX-500) 장치를 사용하여 D2O에 기록된 31P NMR 스펙트럼을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 6b는 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 결합 방식; 25℃에서 CTP 단독(C) 및 Zn(II)-착물, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)과 CTP 결합(D)을 나타내는 500MHz 브루커(Model noAdvance-DPX-500) 장치를 사용하여 D2O에 기록된 31P NMR 스펙트럼을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 7은 화합물(7.2μM)과 과량의 ATP(900μM)가 존재할 때 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 형성을 확인하는 ESI(전자분사 이온화) 질량 분석의 결과들을 보여주는 그래프를 나타낸다. L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)(모노소듐 염)에 대한 분자량은 1081이다.(사용된 장치: Thermo Finnigan LCQTM Advantage MAX quadrupole ion trap instrument, San Jose, Calif., USA)
도 8은 25℃ 수용액에서 변하는 [α-CD](0-2.3mM)에 의한 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(8.3μM)의 전체 스펙트럼 변화를 나타낸다. 삽입물은 이중 증류되고 탈이온화된 물에서 α-CD의 (a) 부존재 및 (b) 존재하에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 포화 용액의 색의 사진이다.
도 9a는 25℃에서 (A) 염색되지 않은 효모 세포들 및 (B) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(1.16x10-4M)로 염색된 효모 세포들 및 (C) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(5x10-4M) 및 α-CD(2.92x10-3M)의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 9b는 25℃에서 (A) 염색되지 않은, (B) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.66x10-4M)로 염색된 및 (C) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.5x10-3M) 및 α-CD(2.92x10-3M)의 Gram+ve 박테리아의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 9c는 25℃에서 (A) 염색되지 않은, (B) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.66x10-4M)로 염색된 및 (C) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.5x10-3M) 및 α-CD(2.92x10-3M)의 Gram-ve 박테리아의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 10a는 (a) ATP(13.6mM)/ATP(13.6mM) 및 시트르산 나트륨 용액(20%(w/v))의 존재하에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(2.97μM)/L.Zn(반응식 1, 화학식 1A), (b) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(7.1μM)/효모/L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(7.1μM)의 존재 + 효모 세포들의 존재 및 이에 첨가된 시트르산 나트륨 용액(35%(w/v))의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼은 25℃에서 기록하였다.
도 10b는 (A) L.Zn-α.CD(0.5mM)[α.CD]=(2.92mM)로 염색된 효모, (B) L.Zn(66μM)로 염색된 효모 및 (C) 시트르산 나트륨(20% W/V)에 의한 처리 이후 L.Zn-α.CD 염색된 효모 세포, (D) 시트르산 나트륨(20% W/V)에 의한 처리 이후 L.Zn 염색된 효모 세포의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 11은 (A) 블랭크 효모 세포들, (B) L.Zn 착물(반응식 1, 화학식 1A)로 처리된 효모 세포들, (C) 블랭크 Gram -ve 박테리아 세포들, (D) L.Zn 착물(반응식 1, 화학식 1A)로 처리된 Gram -ve 박테리아 세포들, (E) Gram +ve 박테리아 세포들 및 (F) L.Zn 착물(반응식 1, 화학식 1A)로 처리된 Gram +ve 박테리아 세포들의 SEM 이미지들을 나타낸다. [L.Zn]=0.116mM.
도 12는 시간에 따른 세포 개체수의 변화로부터 얻은 (a) 사카로마이세스 세레비제, (c) 수도모나스 플루오레센 및 (e) 바실러스 메가테리윰의 성장 곡선을 나타낸다. L.Zn (반응식 1, 화학식 1A)(D-1)(0.106mM) 및 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.164mM)과 α-CD(0.938mM)(D-2)의 존재하에서 (b) 사카로마이세스 세레비제, (d) 수도모나스 플루오레센 및 (f) 바실러스 메가테리윰의 수성 배지에 대한 600nm에서 흡수도의 상대 변화. 연구는 25℃에서 수행하였다.
도 13은 L.Zn (반응식 1, 화학식 1A)(D-1)(0.106mM) 및 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.164mM)과 α-CD(0.938mM)(D-2)로 염색하고 다른 시간 간격에서 관찰된 효모 세포의 광 현미경 이미지들을 나타낸다.
반응식 2는 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)과 α-CD(α-사이클로덱스트린)의 포함 메커니즘을 나타낸다.
도 1은 다양한 음이온(~17.0mM); 1:ATP; 2:CTP; 3:ADP; 4:F-, Cl-, Br-, I-, CH3COO-, H2PO4 -, PPi, SO4 2 -, NO3 -, CN-, AMP, SCN-의 존재하에서 25℃에서 HEPES(N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-에테인설폰산) 버퍼 용액(pH ~7.2)에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(8.87μM)의 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 다양한 포스페이트 이온들 없이 및 다양한 포스페이트 이온들의 존재하에서 수용액에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(8.87μM)의 색 변화를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽으로: 블랭크, H2PO4 -, PPi, AMP, ADP, ATP, CTP(음이온 농도 ~500μM) 첨가.
도 3은 ([ATP] = 0 - 17.28mM)이 L.Zn(II)-화합물(반응식 1, 화학식 1A)(9.46μM)의 수용액에 pH 7.2(10mM HEPES 버퍼 용액)와 25℃에서 첨가될 때 흡수 스펙트럼 적정 곡선을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 4는 ([CTP] = 0 - 10.17mM)이 L.Zn(II)-화합물(반응식 1, 화학식 1A)(1.79μM)에 pH 7.2(10mM HEPES 버퍼 용액)와 25℃에서 첨가될 때 흡수 스펙트럼 적정 곡선을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 5는 ADP([ADP] = 0 - 6.55mM)가 L.Zn(II)-화합물(반응식 1, 화학식 1A)(8.86μM)에 pH 7.2(10mM HEPES 버퍼 용액)와 25℃에서 첨가될 때 흡수 스펙트럼 적정 곡선을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 6a는 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 결합 방식; 25℃에서 ATP 단독(A) 및 Zn(II)-착물, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)과 ATP(B)를 나타내는 500MHz 브루커(Model noAdvance-DPX-500) 장치를 사용하여 D2O에 기록된 31P NMR 스펙트럼을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 6b는 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 결합 방식; 25℃에서 CTP 단독(C) 및 Zn(II)-착물, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)과 CTP 결합(D)을 나타내는 500MHz 브루커(Model noAdvance-DPX-500) 장치를 사용하여 D2O에 기록된 31P NMR 스펙트럼을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 7은 화합물(7.2μM)과 과량의 ATP(900μM)가 존재할 때 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 형성을 확인하는 ESI(전자분사 이온화) 질량 분석의 결과들을 보여주는 그래프를 나타낸다. L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)(모노소듐 염)에 대한 분자량은 1081이다.(사용된 장치: Thermo Finnigan LCQTM Advantage MAX quadrupole ion trap instrument, San Jose, Calif., USA)
도 8은 25℃ 수용액에서 변하는 [α-CD](0-2.3mM)에 의한 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(8.3μM)의 전체 스펙트럼 변화를 나타낸다. 삽입물은 이중 증류되고 탈이온화된 물에서 α-CD의 (a) 부존재 및 (b) 존재하에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 포화 용액의 색의 사진이다.
도 9a는 25℃에서 (A) 염색되지 않은 효모 세포들 및 (B) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(1.16x10-4M)로 염색된 효모 세포들 및 (C) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(5x10-4M) 및 α-CD(2.92x10-3M)의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 9b는 25℃에서 (A) 염색되지 않은, (B) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.66x10-4M)로 염색된 및 (C) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.5x10-3M) 및 α-CD(2.92x10-3M)의 Gram+ve 박테리아의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 9c는 25℃에서 (A) 염색되지 않은, (B) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.66x10-4M)로 염색된 및 (C) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.5x10-3M) 및 α-CD(2.92x10-3M)의 Gram-ve 박테리아의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 10a는 (a) ATP(13.6mM)/ATP(13.6mM) 및 시트르산 나트륨 용액(20%(w/v))의 존재하에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(2.97μM)/L.Zn(반응식 1, 화학식 1A), (b) L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(7.1μM)/효모/L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(7.1μM)의 존재 + 효모 세포들의 존재 및 이에 첨가된 시트르산 나트륨 용액(35%(w/v))의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼은 25℃에서 기록하였다.
도 10b는 (A) L.Zn-α.CD(0.5mM)[α.CD]=(2.92mM)로 염색된 효모, (B) L.Zn(66μM)로 염색된 효모 및 (C) 시트르산 나트륨(20% W/V)에 의한 처리 이후 L.Zn-α.CD 염색된 효모 세포, (D) 시트르산 나트륨(20% W/V)에 의한 처리 이후 L.Zn 염색된 효모 세포의 광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 11은 (A) 블랭크 효모 세포들, (B) L.Zn 착물(반응식 1, 화학식 1A)로 처리된 효모 세포들, (C) 블랭크 Gram -ve 박테리아 세포들, (D) L.Zn 착물(반응식 1, 화학식 1A)로 처리된 Gram -ve 박테리아 세포들, (E) Gram +ve 박테리아 세포들 및 (F) L.Zn 착물(반응식 1, 화학식 1A)로 처리된 Gram +ve 박테리아 세포들의 SEM 이미지들을 나타낸다. [L.Zn]=0.116mM.
도 12는 시간에 따른 세포 개체수의 변화로부터 얻은 (a) 사카로마이세스 세레비제, (c) 수도모나스 플루오레센 및 (e) 바실러스 메가테리윰의 성장 곡선을 나타낸다. L.Zn (반응식 1, 화학식 1A)(D-1)(0.106mM) 및 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.164mM)과 α-CD(0.938mM)(D-2)의 존재하에서 (b) 사카로마이세스 세레비제, (d) 수도모나스 플루오레센 및 (f) 바실러스 메가테리윰의 수성 배지에 대한 600nm에서 흡수도의 상대 변화. 연구는 25℃에서 수행하였다.
도 13은 L.Zn (반응식 1, 화학식 1A)(D-1)(0.106mM) 및 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.164mM)과 α-CD(0.938mM)(D-2)로 염색하고 다른 시간 간격에서 관찰된 효모 세포의 광 현미경 이미지들을 나타낸다.
본 발명은 중간체 리간드 (E)-4-((4-(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라테케인-1-일-설폰일)페닐)다이아젠일)-N,N-다이메틸아닐린(L)(반응식 1, 화학식 2)이 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라테케인과 (E)-4-((4-(다이메틸아미노)페닐)다이아젠일)벤젠-1-설폰일 클로라이드의 반응에 의해 합성되었다는 것을 제공한다. 이것은 상응하는 Zn(II)-착물(L.Zn(II))(반응식 1, 화학식 1A)의 합성을 위한 비 수성 용매에서 Zn(NO3)2와의 반응을 위해 사용하기 전에 추가로 정제되었다. 이 착물은 육안으로 탐지될 수 있는 관련 색 변화와 함께 중성 수용액 또는 생리학적 pH를 가진 용액에서 ATP와 CTP와 같은 트라이포스페이트에 결합하는 것으로 발견되었다. 이것이 살아있는 진핵세포 및 원핵세포를 위한 가능한 염색제로서 이런 Zn(II)-착물을 사용하는 가능성을 열어 놓았다. 이런 Zn(II)-시약은 CTP의 탐지에 사용될 수 있으나, CTP에 대한 이런 착물의 친화력은 ATP와 비교하여 훨씬 낮다. 이런 발견들을 기초로, 본 발명은 다른(화학적 및 생물학적) 분석 방법을 포함하는 다양한 분석 기술들을 통해 점진적으로 개발되었다.
본 발명은 ATP에 대해 선택성을 가진 Zn(II)-아자매크로사이클-계 착물, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)를 제공한다.
본 발명은 다음 단계들을 포함하는 Zn(II)계 색측정 센서들의 제조 방법을 제공한다:
i. 클로로폼, 메탄올, 다이클로로메테인, 테트라하이드로퓨란 등의 50 내지 100mL의 부피 범위의 용매들로 6 내지 15mM의 농도 범위의 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데케인을 용해하는 단계;
ii. 2 내지 5℃ 범위의 온도에서 단계(i)에서 얻은 용액을 얼음에 유지하고, 온화한 교반하에서 0.5 내지 1 mL/minute의 속도로 트라이에틸 아민 염기를 첨가하고 15 내지 60 mL/hr 범위의 속도로 15 내지 25mM의 4-(4-다이메틸아미노-페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 첨가하는 단계;
iii. 5 내지 10시간 범위의 기간 동안 25 내지 30℃의 온도 범위에서 단계(ii)의 생성된 혼합물을 교반하는 단계;
iv. 20 내지 60분 범위의 기간 동안 혼합물을 재환류하는 단계;
v. 침전물을 여과하고 THF로 세척하고 리간드를 얻기 위해 고체를 건조하는 단계;
vi. 20 내지 25℃ 범위의 온도로 14 내지 20mM 범위의 농도를 갖기 위해 알코올에 리간드를 용해하는 단계;
vii. 20 내지 25℃ 범위의 온도에서 단계(vi)에서 제조된 용액에 리간드의 0.3 내지 0.8 몰 당량의 범위로 질산염 아연 수용액을 첨가하는 단계;
viii. 12 내지 24시간 범위의 기간 동안 동일한 온도 범위에서 단계(vii)의 용액을 교반하는 단계;
ix. 2 내지 5시간의 기간 동안 10 내지 20℃ 범위의 온도에서 단계(viii)의 생성된 용액을 휘젓는 단계;
x. 센서를 얻기 위해 클로로폼으로 침전물을 여과하고 세척하는 단계;
xi. 6 내지 36시간 범위의 기간 동안 30 내지 40℃의 온도 범위에서 분리된 (i) GYE 배지 속 사카로마이세스 종들, (ii) 영양소 발효액 속 바실러스 종들 및 (iii) 킹스 B 배지 속 수도모나스 종들을 배양하는 단계;
xii. 0.1 - 0.15mM 범위의 농도를 가진 단계(x)에서 얻은 100μl의 센서로 5 내지 20분 범위의 기간 동안 28 내지 38℃의 온도 범위에서 단계(xi)에서 얻은 100μl의 각각의 배양된 종들을 배양하는 단게;
xiii. 단순 현미경 아래에서 보기 위해 샘플을 센서로 염색하는 단계;
xiv. 다른 색 강도로 Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아를 구별하는 단계;
xv. 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 단계(xi) 내지 (xiv)의 테스트 미생물들의 군집들을 성장시키는 단계.
화합물 L의 합성(반응식 1, 화학식 2)
1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데케인(사이클램)(247mg, 1.23mmole)을 250mL 둥근 바닥 RB 플라스크에 마른 테트라하이드로퓨란(40mL)에 용해하였다. 테트라하이드로퓨란(10-15mL) 속 4-(4-다이메틸아미노-페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드(400mg, 1.23mmole) 및 트라이에틸 아민(Et3N)(1mL)의 용액을 얼음의 차가운 조건에서 상기 용액에 첨가하였다. 그런 후에, 생성된 혼합물을 25℃ 내지 30℃로 10시간 동안 교반하였고 그런 후에 1시간 동안 추가로 재환류하였다. 이렇게 얻은 오렌지색 침전물을 여과하고 테트라하이드로퓨란으로 세척하였다. 마지막으로 고체 잔류물(L)을 건조하였다; 수율:75%.
화합물 L.Zn의 합성(반응식 1, 화학식 1A)
L(200mg; 0.41mmolle)의 용액을 100mL의 1구 플라스크에서 25mL 메탄올에 용해하였다. 여기에 1.0mL의 질산 아연 수용액(148.69mg의 ZnNO3.6H2O, 1.2몰 당량)을 첨가하였다. 생성된 용액을 25℃ 내지 30℃로 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 5시간 동안 냉장고에 보관하였고 보랏빛 색의 침전물이 나타났다. 구치(no.3) 도가니를 사용하여 여과하여 침전물을 수집하였고 CHCl3로 수회 세척하였다; 수율:65%.
생물학적 샘플 제조
염색 연구들에 사용된 미생물들은 CSMCRI 정원 토양으로부터 분리된 수도모나스 종(MTCC 5550), 아라비아 해(베라월 해변, 20.95973N 70.27932E)로부터 분리된 (21.7587325N 72.1443897E), 바실러스 종(MTCC 5549), 응유로부터 분리된 사카로마이세스 종(MTCC 5548)이다.
사카로마이세스 종의 분리물을 37℃에서 24시간 동안 GYE(글루코오스 효모 추출 한천) 배지, 영양소 발효액 속 바실러스 종 및 킹스 B 배지 속 수도모나스 종에서 배양하였다. 이의 100μl를 취해서 100μl의 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(1.16x10-4M) 용액과 함께 30 내지 40℃에서 배양시켰다. 샘플들을 pH 7.5의 0.1M 포스페이트 버퍼 속 2%(v/v) 글루타르알데하이드로 실온 25-30℃에서 밤새 고정하였다. 그런 후에 샘플들을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.5)로 실온 25-30℃에서 1시간 동안 세척하였다. 동일한 버퍼에서 2%(w/v) 오스뮴 테트록사이드(OsO4)에서 이후 고정을 수행하였고 0.1M 포스페이트 버퍼로 20분 동안 1회 세척하였다. 그런 후에, 등급별 물-에탄올 시리즈; 15분 동안 25% 에탄올, 15분 동안 50% 에탄올, 30분 동안 75% 에탄올, 60분 동안 90% 에탄올, 30분 동안 무수 알코올로 물을 제거하였다. 표본들을 버퍼에서 세정하고 현미경 검사 이전에 스퍼터 코터(Polaron SC7620)에서 금으로 코팅하였다. 이 재료를 15kV의 가속 전압에서 주사전자현미경(SEM) LEO 1430 VP에서 검사하였다.
블랭크 및 염색된 진핵생물(효모), Gram +ve 및 Gram -ve 세포들의 SEM 이미지들을 기록하여(도 11) 염색에 대한 세포들의 외부 표면의 형태에서 변화(들)를 나타내었다. ATP의 최대 농도는 세포내 간극에서 미토콘트리아를 통해 배출되며 그런 후에 세포 표면으로 분비된다. 여러 ATP 결합 카세트 단백질(예를 들어, 세포내 단백질(PEP), 포유류 AMP-활성 단백질 키나아제(AMPK))는 혈장 막에 축적되는 것으로 보고된다.[(a) Nelson, D.L.; Cox, M. M.; Lehninger: Principles of Biochemistry, 3rd Edition. Worth Publishers. NY; Bergy (b) John, D. H.; Noel, G. H.; Peter, R. K.; Bergey's, H. A. S. Manual of Determinative Bacteriology, 1994, 9th ed.; Lippincott Williams & Wilkins]. 염료가 없는 효모 세포들의 SEM 이미지들은 염색된 세포 표면들은 거친 것으로 발견된 염료가 있는 효모 세포들의 이미지들과 반대로 부드러운 것으로 발견되었다. 이것이 세포에 부착하는 이질적 재료, 즉 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 존재를 나타내었다. 염료 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 결합에 대한 세포 표면들에 대한 변화들은 염색제 부존재 및 염색제 존재하에서 Gram -ve 및 Gram +ve 박테리아에 대해 기록된 SEM 이미지들로부터 명백하였다(도 11c 내지 11f). 샘플 표면들의 SEM 이미지들에서 명도의 차이가 샘플 표면의 균일하지 않은 화학적 성질을 나타낸다. Gram +ve 박테리아와 비교하여 Gram -ve 박테리아의 상대적으로 더 밝은 세포 외부는 세포외 표면에 대한 더 높은 음 전하의 축적을 나타낸다. 이런 관찰은 세포외 ATP 방출이 Gram -ve 박테리아 및 포린으로 불리는 단백질을 가진 이의 더욱 다공성 표면에 대해 더 높다는 것을 기술하는 이전 보고서들과 잘 연관된다. [(a) Wexler, H. M. Clinical Infectious Diseases. 1997, 25, S284. (b) Ivanova, E. P.; Alexeeva, Y. V.; Pham, D. K.; Nicolau, W. D.; Internationalmicrobiology, 2006, 9, 37. (c) Werner, T. P.; Amrhein, N.; Freimoser, F. M. BMC Plant Biology, 2007, 7:51 doi:10.1186/1471-2229-7-51.]
염색제로서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)를 사용하여 효모와 박테리아를 염색하고 광 현미경으로 염색된 세포 배지를 관찰한다.
사카로마이세스 종의 분리물을 37℃에서 24시간 동안 GYE(글루코오스 효모 추출 한천) 배지, 영양소 발효액 속 바실러스 종 및 킹스 B 배지 속 수도모나스 종에서 배양하였다. 이의 100μl를 취해서 100μl의 [L.Zn] = 1.16x10-4M 용액(pH 7.2, 10mM HEPES 버퍼 용액)과 함께 실온에서 배양시켰다. 샘플들을 pH 7.5의 0.1M 포스페이트 버퍼 속 2%(v/v) 글루타르알데하이드로 25 내지 35℃에서 밤새 고정하였다. 그런 후에 샘플들을 0.1M 포스페이트 버퍼(pH 7.5)로 실온 25 내지 35℃에서 1시간 동안 세척하였다. 동일한 버퍼에서 2%(w/v) 오스뮴 테트록사이드(OsO4)에서 이후 고정을 수행하였고 0.1M 포스페이트 버퍼로 20분 동안 1회 세척하였다. 그런 후에, 등급별 물-에탄올 시리즈; 15분 동안 25% 에탄올, 15분 동안 50% 에탄올, 30분 동안 75% 에탄올, 60분 동안 90% 에탄올, 30분 동안 무수 알코올로 물을 제거하였다. 표본들을 버퍼에서 세정하고 현미경 검사 이전에 스퍼터 코터(Polaron SC7620)에서 금으로 코팅하였다. 이 재료를 15kV의 가속 전압에서 주사전자현미경(SEM) LEO 1430 VP에서 검사하였다.
L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 용해도를 향상시키는 것은 수용액이다(반응식 2)
물에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 용해도는 제한된다(0.0448gL-1). 그러나, 용해도는 α-사이클로덱스트린(α-CD)의 존재하에서 증가할 수 있다. 2.3mg의 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)를 5mL의 이중 증류수에 용해시키고 25 내지 35℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 후에 용액을 여과하고 여과액에 용해된 고체의 농도는 식 O.D여과액/εLZn(O.D여과액은 여과액이 광학 밀도이며 εLZn은 L.Zn의 분자 흡광 계수이다)를 기초로 계산하였고(값은 독립적 실험을 통해 미리 구하였다) 0.0448gL-1인 것으로 발견되었다. 유사한 실험을 α-CD의 존재하에서 반복하였다. 이 경우 14.2mg의 α-CD를 2.913mg의 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)을 포함하는 5mL의 이중 증류수에 용해하였고 이 용액을 1시간 동안 25℃에서 교반하면서 약간의 현탁된 고체를 가진 용액을 얻었다. 이것을 G-4 구치 도가니를 사용하여 여과하였다. 여과액을 수집하고 여과액의 광학 밀도(O.D.)를 458nm에서 관찰하였다. 내포 착물(수도로탁세인 형태)의 완전한 형성을 고려하면, 농도는 공지된 εLZn .α- CD 값 및 458nm에서 O.D.를 기초로 평가하였다. 계산은 0.34gl-1 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)이 생성된 용액에 존재한다는 것을 나타내었다. 한편 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 면에서 용해도의 ~7.5 증가를 얻었고 이것은 수용액에 α-CD의 부존재 및 존재하에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 포화 용액의 눈에 보이는 색의 차이에서 명백하다(도 8). 수도로탁세인 형태의 수용액에 존재하는 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)은 반응식 2에서 L.Zn.CD로 나타내어진다.
리간드 L(반응식 1, 화학식 2)의 특징묘사
화합물 L의 분리 수율(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다); 75 %. 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2
L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 특징묘사
화합물 L.Zn의 분리 수율(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다); 65%. 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22. 분석 데이터는 이 분자에 대한 제안된 구조와 매우 잘 일치한다.
L.Zn(반응식 1, 화학식 1A) 및 α-CD 사이의 내포 착물 형성을 위한 안정성 상수의 평가
예비 스펙트럼 연구들은 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(463nm)에 대한 최대 흡수도가 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 8.3μM 용액에 α-CD(0 - 2.3mM)의 수용액을 과량으로 첨가함에 의해 더 짧은 파장(458nm)으로 이동한다는 것을 나타낸다. α-CD에 트랜스-1,2-비스-(4-피리딜)에틸렌, 4,4'-아조피리딘(AZP) 및 일부 관련 바이피리딘/바이페닐 분자들의 첨가에 의한 호스트-게스트 형태 내포 착물의 형성은 여러 연구자들에 의해 보고된다(Shukla, A. D.; Bajaj, H. C.; Das, A. Angew . Chem . Int . Ed . 2001, 40, 446.; Shukla, A. D.; Bajaj, H. C., Das, A. Nat . Acad . Science, 2002, 114, 431.; Beer, A.J.; Macartney, D. H. Inorg . Chem . 2000, 39, 1410.; Macartney, D.H.; Waddling, C. A.; Inorg . Chem. 1994, 33, 5912.; Philip, D.; Stoddart, J.F. Angew . Chem . Int . Ed. 1996, 35, 1154.). CD 공동에 이런 화합물들이 내포되면 비록 에너지 수준의 혼돈은 쉽게 판단할 수 있는 것으로 보고되지 않지만 HOMO-LUMO 에너지 차이에 영향을 미쳐서 흡수 스펙트럼 밴드에 영향을 미친다는 것이 보고된다. 따라서, 본 연구에서, 5nm의 관찰된 이동은 내포 현상 및 수도-로탁세인 착물의 형성에 영향을 줄 수 있다. 체계적인 분광 광도 적정에 대해 최대 흡수는 5nm만큼 이동한 것으로 발견되었고 두 개의 동시 등흡광점이 관찰되었다. 이런 분광 광도 적정을 기초로 한 결합 상수의 평가는 255(±15)M-1의 결합 상수 값을 나타내었다. UV-vis 적정으로부터 결합 상수를 계산하기 위해 사용된 일반식은 아래에 제공된다:
L.Zn + CD = L.Zn.CD
L에 대한 최대 흡수도는 λL인 반면 이 파장에서 흡광 계수 및 OD는 각각 εL과 AL이다.
L.Zn.CD에 대한 최대 흡수도는 λL. Zn . CD인 반면 이 파장에서 흡광 계수 및 OD는 각각 εL. Zn . CD과 AL . Zn . CD이다.
따라서, 수용체 분자([L]) 및 α-사이클로덱스트린([CD])의 소정의 농도의 경우
[L.Zn.CD] = [{AL . Zn . CD-A0}/εL. Zn . CD] (1)
여기서, A0는 외부적으로 첨가된 CD의 첨가 이전 λL. Zn . CD에서 OD 값이다.
AL . Zn . CD는 100 몰 당량의 CD의 첨가 이후 λL. Zn . CD에서 기록하였다.
따라서, λL. Zn . CD = AL . Zn . CD/[L.Zn]free (2)
(모든 수용체 분자가 CD에 결합한다고 가정하면 CD는 이 파장에서 어떠한 흡수도 갖지 않는다)
따라서, 일단 [L.Zn.CD]을 평가할 수 있으면, 식 1과 3
[L.Zn]free = [L.Zn]initial - [L.Zn.CD] (3)
및, [CD]free = [CD]initial - [L.Zn.CD] (4)를 사용하여 착화되지 않은 수용체 분자, [L.Zn]의 농도를 계산할 수 있다.
만일 K가 CD의 소정의 농도에 대한 내포 착물, L.Zn.CD에 대한 형성 상수인 경우
결합 상수, K = [L.Zn.CD]/{[L.Zn]free[CD]free} (5)
따라서, 과량의 α-CD(125배)의 존재하에서, 수도록탁세인 형태, 즉, L.Zn.α-CD(반응식 2)은 수용액에서 지배적인 형태로 존재할 것으로 예상된다(도 8).
ATP 및 다른 음이온에 의한 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)로 나타낸 화합물의 결합에 영향을 미칠 수 있는 전자 스펙트럼 변화들을 측정하기 위한 실험을 수행하였다.
다양한 중요한 음이온들(ATP, CTP, ADP, AMP, PPi, H2PO4 -, SO4 2 -, CH3CO2 -, I-, Br-, Cl- 및 F- 등)에 대한 Zn-착물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A)의 결합 행동을 조사하기 위해서, 다음 실험을 수행하였다.
ATP, CTP, ADP, AMP, PPi, H2PO4 -, SO4 2 -, CH3CO2 -, I-, Br-, Cl- 및 F-의 나트륨염들을 위한 용액(~21 mM)을 10mM HEPES 버퍼 용액(pH 7.2)에서 개개의 염을 사용하여 제조하였고 사용을 위해 저장하였다. 또한, 화학물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 용액(44.35μM)을 이중으로 증류하고 탈이온화된 물을 사용하여 제조하고 저장하였다. 이런 저장 용액들을 실험을 위한 용액의 제조 당일에 사용하였다.
테스트 용액을 1mL의 프로브 저장 용액(화합물(L.Zn)(본 발명의 반응식 1, 화학식 1A)을 위한 44.35μM의 이전에 제조되고 저장된 용액)을 10mL 테스트 튜브에 넣은 후 사용하였고, 프로브 저장 용액의 최종 농도는 8.87μM이었다. 여기에 ATP 및 다른 음이온(CTP, ADP, AMP, PPi, H2PO4 -, SO4 2 -, CH3CO2 -, I-, Br-, Cl- 및 F- )의 미리 제조되고 저장된 용액의 각각의 4mL를 테스트 튜브에 첨가하고 용액들의 각각의 분취량이 (17mM)이었다. 그런 후에 생성된 용액을 이중 빔 분광측광기(Shimadzu UV-3101 PC)를 사용하여 적절한 기준선 보정 이후 UV-vis 스펙트럼 측정에 사용하였고 이의 결과들은 도 1에 도시된다.
도 1에 도시된 대로, 본 발명에 따른 화합물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A)의 흡수 스펙트럼에서, ATP가 pH 7.2에서 첨가되었을 때, 503nm에서 뚜렷하게 새로운 흡수 스펙트럼 밴드가 나타났다. 따라서 40nm의 적색 이동은 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 용액에 ATP(~1920 당량)의 용액의 첨가에 의해 관찰되었다. CTP에 대한 이런 이동은 훨씬 덜 현저하였고 단지 9nm의 적색 이동이 관찰되었다. 반대로, 2000 당량의 다른 음이온들이 첨가되었을 때, 변화가 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A)은 ATP에 우선적으로 결합한다는 것을 알 수 있다.
수성 배지 속 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(8.87μM)의 용액을 H2PO4 -, PPi, AMP, ADP, ATP 및 CTP와 같은 다른 포스페이트 음이온들의 ~500μM의 과량으로 처리하였다. 개개의 음이온의 첨가시에, 현저한 색 변화가 ATP의 존재하에서만 관찰되었다. 약간의 색 변화가 ADP와 CTP의 경우에 관찰되었다. 따라서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)은 다양한 포스페이트 음이온들 중에서 선택적으로 ATP와 결합할 수 있고 ATP의 결합과 관련된 색 변화는 육안을 통해 탐지될 수 있다(도 2).
ATP의 농도에 의존하는 화합물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A)에 대한 UV-vis 스펙트럼 적정 실험.
Zn(II)-화합물(L.Zn)(반응식 1, 화학식 1A) 및 ATP 사이의 결합 특성을 조사하기 위해서, 다음 실험을 수행하였다.
ATP(21.6mM)의 용액을 10mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에테인설폰산(HEPES) 버퍼 용액(pH 7.2)을 사용하여 제조하였다. 또한, 화합물(L.Zn)(실시예 1에서 얻은 반응식 1, 화학식 1A)의 용액(47.3μM)을 이중으로 증류하고 탈이온화된 물을 사용하여 제조하였다. 이런 저장 용액들을 실험을 위한 용액의 제조 당일에 사용하였다.
1.0mL의 저장된 용액의 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)([L.Zn] = 47.3μM)를 테스트 튜브에 놓았고, L.Zn 용액의 최종 농도는 9.46μM이었다. 여기에 변하는 양의 ATP(0.1 - 4mL의 저장된 ATP 용액(21.6mM))을 첨가하였다. 그런 후에 생성된 용액을 5mL의 생성된 분취량의 전체 부피를 유지하는 10mM HEPES 버퍼 용액(pH 7.2)의 첨가에 의해 희석되었고, 이중 빔 분광 광도계 및 석영 분광 측광 셀(3.5mL 용량)을 사용하는 분광 측광 측정을 위해 사용되었다. 전체 스펙트럼 변화는 적절한 기준선 보정 이후 이중 빔 분광측광기(Shimadzu UV-3101 PC)를 사용하여 측정하였다. 이 적정 동안 모든 실험들에 대한 슬릿 폭은 0.2nm에서 변하지 않게 유지되었고 이의 결과들은 도 3에 도시된다.
도 3에 도시된 대로, 변하는 ATP에 의해 화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 흡수 적정 스펙트럼에서, 본 발명에 따라, 화합물의 최종 농도가 pH 7.2에서 9.46μM일 때, 첨가된 ATP의 양은 0 당량으로부터 1826 몰 당량으로 증가하였고 따라서 착물 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)의 형성에 의해 새로운 스펙트럼 밴드가 503nm의 파장에서 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 착물(L.Zn-ATP)(반응식 1, 화학식 1B)의 형성을 위한 결합 상수는 화합물과 ATP의 분광 측광 적정을 통해 978±15M-1(25℃)이었다는 것을 알 수 있다.
UV-vis 적정으로부터 결합 상수를 계산하는데 사용된 일반식.
L.Zn + A- = L.Zn-A-
L.Zn에 대한 최대 흡수도는 λL인 반면 이 파장에서 흡광 계수 및 OD는 각각 εL과 AL이다.
L.Zn-A-에 대한 최대 흡수도는 λL. Zn -A-인 반면 이 파장에서 흡광 계수 및 OD는 각각 εL. Zn -A-과 AL . Zn -A-이다.
따라서, 수용체 분자([L.Zn]) 및 음이온([A-])의 소정의 농도의 경우
[L.Zn-A-] = [{AL . Zn -A--A0}/εL. Zn -A-] (6)
여기서, A0는 외부적으로 첨가된 A-의 첨가 이전 λL. Zn -A-에서 OD 값이다.
AL . Zn -A-는 100 몰 당량의 A-의 첨가 이후 λL. Zn -A-에서 기록하였다.
따라서, εL. Zn -A- = AL . Zn -A-/[L.Zn]free (7)
(모든 수용체 분자가 A-에 결합한다고 가정하면 A-는 이 파장에서 어떠한 흡수도 갖지 않는다)
따라서, 일단 [L.Zn.A-]을 평가할 수 있으면, 식 6과 7
[L.Zn]free = [L.Zn]initial - [L.Zn-A-] (8)
및, [A-]free = [L.Zn]initial - [L.Zn-A-] (9)를 사용하여 착화되지 않은 수용체 분자, [L.Zn]의 농도를 계산할 수 있다.
만일 K가 A-의 소정의 농도에 대한 내포 착물, L.Zn-A-에 대한 형성 상수인 경우
결합 상수, K = [L.Zn-A-]/{[L.Zn]free[A-]free} (10)
1.0mL의 저장된 용액 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)([L.Zn] = 8.95μM)을 테스트 튜브에 놓았고 L.Zn 용액의 최종 농도는 1.79μM이었다. 여기에 변하는 양의 CTP(저장된 CTP 용액(12.71mM)의 0.1-4mL)를 첨가하였다. 그런 후에 생성된 용액을 5mL의 생성된 분취량의 전체 부피를 유지하는 10mM HEPES 버퍼 용액(N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-2-에테인설폰산)(pH 7.2)의 첨가에 의해 희석되었고, 석영 분광 측광 셀(3.5mL 용량)을 사용하는 분광 측광 측정을 위해 사용되었다. 전체 스펙트럼 변화는 적절한 기준선 보정 이후 분광측광기(Shimadzu UV-3101 PC)를 사용하여 측정하였다. 이 적정 동안 모든 실험들에 대한 슬릿 폭은 0.2nm에서 변하지 않게 유지되었고 이의 결과들은 도 4에 도시된다.
도 4에 도시된 대로, 변하는 CTP에 의해 화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 흡수 적정 스펙트럼에서, 본 발명에 따라, 화합물의 최종 농도가 pH 7.2에서 1.79μM일 때, 첨가된 CTP의 양은 0 당량으로부터 5681 당량으로 증가하였고 따라서 착물 L.Zn-CTP의 형성에 의해 새로운 스펙트럼 밴드가 477nm의 파장에서 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 착물(L.Zn-CTP)의 형성을 위한 결합 상수는 화합물과 CTP의 분광 측광 적정을 통해 220(±15)M-1(25℃)이었다는 것을 알 수 있다.
1mL의 저장된 용액 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)([L.Zn] = 44.3μM)을 테스트 튜브에 놓았고 L.Zn 용액의 최종 농도는 8.86μM이었다. 여기에 변하는 양의 ADP(저장된 ADP 용액(8.19mM)의 0.1-4mL)를 첨가하였다. 그런 후에 생성된 용액을 5mL의 생성된 분취량의 전체 부피를 유지하는 10mM HEPES 버퍼 용액(pH 7.2)의 첨가에 의해 희석되었고, 일치하는 한 쌍의 석영 분광 측광 셀(3.5mL 용량)을 사용하는 분광 측광 측정을 위해 사용되었다. 전체 스펙트럼 변화는 적절한 기준선 보정 이후 이중 빔 분광측광기(Shimadzu UV-3101 PC)를 사용하여 측정하였다. 이 적정 동안 모든 실험들에 대한 슬릿 폭은 0.2nm에서 변하지 않게 유지되었고 이의 결과들은 도 5에 도시된다.
도 5에 도시된 대로, 변하는 ADP에 의해 화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 흡수 적정 스펙트럼에서, 본 발명에 따라, 화합물의 최종 농도가 pH 7.2에서 8.86μM일 때, 첨가된 ADP의 양은 0 당량으로부터 924 몰 당량으로 증가하였고 따라서 착물 L.Zn-ADP의 형성에 의해 새로운 스펙트럼 밴드가 471nm의 파장에서 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 착물(L.Zn-ADP)의 형성을 위한 결합 상수는 화합물과 ADP의 분광 측광 적정을 통해 142(±15)M-1(25℃)이었다는 것을 알 수 있다.
ATP와 CTP의 31P NMR 스펙트럼(도 6a 및 도 6b)을 부루커 500 MHz(부르커 어드밴스 II-DPX 500 MHz) FT NMR에 기록하였다. ATP와 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 결합은 31P NMR 분광학에 의해 확인하였다(도 6a). L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)에 결합된 ATP의 α,β 및 γ-P-원자들에 대한 31P 신호들에 대한 업 필드 이동(각각 0.07ppm, 0.09ppm 및 0.05ppm)을 관찰하였다. 거의 유사한 이동이 다른 사람들에 의해 이전에 보고되었다(Ojida, A.; Park, S. K.; Mito-oka, Y.; Hamachi, I. Tetrahedron Lett . 2002, 43, 6193). α,β 및 γ-P-원자들에 대한 31P NMR 신호들은 개개의 포스페이트 유닛을 통해 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 Zn-원자에 대한 결합을 나타낸다. 이런 관찰은 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)이 ATP의 존재하에서 헵타 배위결합 착물을 형성할 수 있다는 결론을 내리도록 유도한다. 이런 형태의 헵타 배위결합 Zn 착물의 예는 문헌에 있다[(a) Lindloy, L. F.; Busch, D. H. Inorg . Chem. 1974, 13, 2494. (b) Wester, D.; Palenik, G. J. J. Am . Chem . Soc . 1974, 95, 6505.].
31P 신호들에서 매우 미미한 이동은 유사한 실험들이 CTP에 대해 반복될 때 관찰되었다(도 6b). L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)에 결합된 CTP의α,β 및 γ-P-원자들에 대한 31P 신호들에 대한 업 필드 이동(각각 0.0ppm, 0.03ppm 및 0.01ppm)을 관찰하였다. 동일한 실험들이 ADP 및 AMP로 수행될 때 이런 이동은 관찰되지 않았다. 따라서, 31P NMR 스펙트럼 데이터는 결합 친화력에서 관찰된 경향을 확인시킨다(ATP>>CTP>ADP>>AMP). 생각건대, ATP와 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A) 사이의 향상된 정전기 상호작용은 L.Zn-ATP에서 효율적인 L.Zn-O(포스페이트) 결합에 중요하다. 한편, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 관찰된 결합 우위, ATP>>CTP>ADP>>AMP는 포스페이트 종들의 음이온 전하들의 수의 차이에 영향을 줄 수 있다.
ATP의 부존재 및 존재하에서 착물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 질량 분석은 전자분사 이온화(ESI) 기술을 사용하여 수행하였다.
본 발명에 따른 화합물(L.Zn, 반응식 1, 화학식 1A)의 착물이 형성되는지 아는지를 평가하기 위해서, 전자분사 이온화 질량 분석을 문헌을 참조하여 수행하였다(Kwon, J. Y.; Jang. Y. J.; Lee, Y. J.; Kim, K. M.; Seo M. S.; Nam, W.; Yoon, J. J. Am . Chem . Soc . 2005, 127, 10107).
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A; 7.2μM) 및 900μM의 ATP(125 몰 당량)을 부피 플라스크 속에 넣고 5mL의 HPLC 등급수에 용해하여 혼합 용액을 형성하였다. 그런 후에 이 혼합 용액을 양극 모드에서 전자분사 이온화(ESI) 기술을 사용하여 질량분석하였다. 그 결과, 피크를 대략 m/z = 1082 얻었고 도 7에 도시된다(사용된 장비: Thermo Finnigan LCQTM Advantage MAX quadrupole ion trap instrument, San Jose, Calif., USA)(도 7).
L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 수용액에 대한 ATP의 이나트륨 염의 첨가에 의해, 새로운 착물 L.Zn-ATP(반응식 1, 화학식 1B)가 형성되었다. 이 용액을 ESI-질량 스펙트럼을 기록하기 위해 사용하였고 스펙트럼은 도 7에 도시된다. 도 7에 도시된 피크는 [C34H49N12P3SO15NaZn + H+] = [L.Zn(NO3)2의 [C24H37N7P3SO2Zn] - 2(NO3 -)] + [C10H12N5O13P3Na2 - Na+] + H+에 상응하는 질량을 나타낸다. L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)와 ATP 사이의 1:1 착물 형성의 형성을 입증하는 것이 명백하다. 따라서, 질량 스펙트럼 분석은 제안된 착물, L.Zn-ATP의 형성을 확증한다.
전자 스펙트럼 연구들에 대한 논의에서 상기한 대로, 본 발명의 Zn(II) 착물, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)은 수용액에서 다른 음이온들을 인식하지 않으며 ATP에 대해 선택성을 보였다. ATP와 결합에 의해, 육안으로 탐지될 수 있는 구별된 색 변화에 의한 더욱 바람직한 전하 전송 전환에 의해 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)에 대한 새로운 흡수 밴드가 503nm에서 관찰되었다. 따라서, 이것이 광 현미경을 통해 간단히 볼 수 있도록 살아있는 세포들을 위한 색측정 염색제로서 본 발명의 이 Zn(II)-착물(L.Zn, 반응식 1, 화학식 1A)을 사용하는 가능성을 연구할 기회를 제공하였다.
사카로마이세스 세레비제(S.cerevisiae), 진핵 미생물은 ATP 형태로 에너지를 얻으며 이런 진핵 생물들의 표면은 음으로 하전된 ATP 이온들을 가진다. 따라서, 본 발명자들은 진핵생물 세포들을 염색하기 위해 수용체 분자, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)을 사용할 수 있었다. 효모 세포들은 20분 동안 수용체 분자 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A) 또는 2분 동안 L.Zn-CD(반응식 2)(([L.Zn] = 0.5 x10-3M[α-CD] = 2.92x10-3M)에 노출되었고 그런 후에 광 현미경(AXIO IMAGER-Carl Zeiss) 아래서 관찰하였다.
예비 스펙트럼 연구들은 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(463nm)에 대한 최대 흡수도가 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 8.3μM 용액에 α-CD(0 - 2.3mM)의 수용액을 첨가함에 의해 더 짧은 파장(458nm)으로 이동한다는 것을 나타낸다. CD 공동에 이런 화합물들이 내포되면 비록 에너지 수준의 혼돈은 쉽게 판단할 수 있는 것으로 보고되지 않지만 HOMO-LUMO 에너지 차이에 영향을 미쳐서 흡수 스펙트럼 밴드에 영향을 미친다는 것이 보고된다. 따라서, 본 연구에서, 5nm의 관찰된 이동은 내포 현상 및 수도-로탁세인 착물의 형성에 영향을 줄 수 있다. 체계적인 분광 광도 적정에 대해 최대 흡수는 5nm만큼 이동한 것으로 발견되었고 두 개의 동시 등흡광점이 관찰되었다. 이런 분광 광도 적정을 기초로 한 결합 상수의 평가는 255(±15)M-1의 결합 상수 값을 나타내었다. 따라서, 과량의 α-CD(125배)의 존재하에서, 수도록타세인 형태, 즉, L.Zn.α-CD(반응식 2)은 수용액에서 지배적인 형태로 존재할 것으로 예상된다(도 8).
일반적인 광 현미경(AXIO IMAGER-Carl Zeiss) 아래서 본 무색 효모 세포들의 이미지들은 도 9a에 도시된다. 이렇게 관찰된 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(0.116mM) 및 L.Zn.α-CD(반응식 2)(([L.Zn] = 0.5 mM, [α-CD] = 2.92mM)로 처리된 세포들의 이미지들은 (유사한 배율로) 각각 도 9b 및 9c에 도시된다. 도 9a는 처리된 세포가 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)로 염색되었고 세포들의 색은 연분홍빛-보랏빛으로 변한 것을 나타내었다(도 9a(B)). 효모 세포들의 색 변화는 세포들의 표면상에 음으로 하전된 포스페이트 그룹들이 수용체 분자 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)와 효과적으로 결합하였다는 것을 나타내었다. 염색은 물/에탄올(70/30, v/v) 혼합물에 의한 이후 후속 세척에도 안정한 것으로 발견되었다. 에탄올은 생물학적 샘플들의 탈수제와 우수한 정착제로 작용하는 것으로 알려져 있다. L.Zn(반응식 1, 화학식 1A) 또는 L.Zn.α-CD(반응식 2) 또는 유리 Zn(II) 이온들의 용액으로 이런 세포들을 처리함으로써 대조 실험들을 수행하였는데; 색의 이런 변화는 관찰되지 않았다. 이것이 관찰된 염색에 대한 믿을 만한 이유로서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)에 대한 세포 표면의 ATP 이온들의 결합을 확인시킨다. L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)에 대한 세포 표면상에 제 위치에서 생산된 ATP 이온들의 결합은 관찰된 염색에 대한 믿을 만한 이유로서 생각되었다. 추가 흡수 스펙트럼(도 10a) 및 광 현미경 이미지들(도 10b)은 ATP뿐만 아니라 염색된 효모 세포에 대한 과량(50 몰 당량)의 시트레이트 이온의 첨가에 의해 무색이 되었다는 것을 나타내었다. 동일한 관찰이 효모 세포들 및 L.Zn/L.Zn.α-CD(반응식 2)에서 관찰되었다(도 10b). 이런 관찰은 효모 세포들에서 제 위치에서 생산된 ATP의 가역적 결합을 기초로 설명될 수 있다.
우리는 원핵생물(Gram +ve 및 Gram - ve 박테리아 세포들)을 위한 염색제로서 L.Zn/L.Zn.α-CD을 사용하는 가능성을 연구하였다. 도 9b(A) 및 9c(A)는 광 현미경 아래서 볼 때, 각각 두 박테리아, 바실러스 메가테리윰(Gram +ve) 및 수도모나스 플루오레센(Gram -ve)의 이미지들을 나타내었다. 도 9b(B) 및 9c(B)는 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(66μM)의 존재하에서 볼 때 동일한 박테리아의 이미지들을 나타내었다. 이런 도면들은 L.Zn의 존재하에서 박테리아 염색들의 뚜렷한 색 변화를 분명하게 보여주었다. 도 9b(C) 및 9c(C)는 L.Zn.α-CD([L.Zn] = 0.5mM, [α-Cd] = 2.92mM)의 존재하에서 볼 때 동일한 박테리아의 이미지들을 나타내었다 동일한 배율을 가진 도 9b 및 9c는 본 염료 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)가 염색된 세포들의 분명히 다른 색 강도 및 모양을 통해 Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아를 구별할 수 있다는 것을 나타내었다. Gram +ve 박테리아에 대한 예상된 염색된 세포들은 염색된 Gram -ve 박테리아의 예상된 염색된 세포들과 비교하여 더 긴 것으로 보였다. 염색하는 동안 L.Zn.α-CD(반응식 2)에 의한 두 다른 박테리아의 염색 강도 차이; 게다가, 개개의 박테리아의 세포 구조 및 세포 벽 조성의 차이는 각각의 박테리아 세포들의 세포 생물학 및 관련된 상세한 생화학을 깊이 연구한 후 훨씬 잘 이해될 수 있다.
블랭크 및 염색된 진핵생물(효모), Gram +ve 및 Gram -ve 세포들의 SEM 이미지들(도 11)은 염색에 대한 세포들의 외부 표면의 형태에 변화(들)를 나타내었다. 염료가 없는 효모 세포들의 SEM 이미지들은 염색된 세포 표면들은 거친 것으로 발견된 염료가 있는 효모 세포들의 이미지들과 반대로 부드러운 것으로 발견되었다. 이것이 세포에 부착하는 이질적 재료, 즉 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 존재를 나타내었다. 염료, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 결합에 대한 세포 표면들에 대한 변화들은 염색제 부존재 및 염색제 존재하에서 Gram -ve 및 Gram +ve 박테리아에 대해 기록된 SEM 이미지들로부터 명백하였다(도 11c 내지 11f). 샘플 표면들의 SEM 이미지들에서 명도의 차이가 샘플 표면의 균일하지 않은 화학적 성질을 나타낸다. Gram +ve 박테리아와 비교된 Gram -ve 박테리아에 대해 외부인 상대적으로 더 밝은 세포는 세포외 표면에 대한 더 높은 음 전하의 축적을 나타낸다.
영향을 받지 않은 세포 확산과 성장은 염색제(L.Zn 또는 L.Zn.α-CD)가 비 독성이며 염색 이후 세포들이 생존할 수 있게 하였다는 것을 확인하였다. 따라서, L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)은 ATP와 같은 생활성 분자들을 위한 효율적인 제 위치 케모센서로서 또한 생존가능한 염색제로서 사용될 수 있다. L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 부존재 및 존재하에서 수성 배지에서 진핵 효모 세포들(Saccharomyces cerevisiae) 및 원핵 박테리아 세포들(Gram +ve(Pseudomonas fluorescence) 및 Gram -ve(Bacillus megaterium))의 성장 프로파일은 도 12에 도시된다. 흡수도 변화(λmax = 600nm) vs 시간(t)은 30h까지 좌표로 나타내었고; 이후에 성장에 쉽게 판단할 수 있는 변화가 관찰되지 않았다. 도 12a-f는 신진대사 과정 동안 개개의 세포들의 연속적 성장과 세포 성장 및 ATP 생성 사이의 좋은 상관관계를 나타내었다. 이런 동역학 연구들은 다른 성장 단계들을 관찰하기 위해 수행되었고; 배치 배지가 lag 단계로부터 log 단계로 그런 후에 정지 단계로 성장함에 따라 ATP의 농도 증가 및 궁극적으로 성장 곡선의 감소가 관찰되었다. 도 12a, 12c 및 12e는 각각 시간에 따른 사카로마이세스 세레비제, 수도모나스 플루오레센 및 바실러스 메가테리윰의 실제 성장 곡선을 보여준다. 한편, 도 12b, 도 12d 및 12f는 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)(D1) 및 L.Zn.α-CD(반응식 2)(D2)의 존재하에서 각각 사카로마이세스 세레비제, 수도모나스 플루오레센 및 바실러스 메가테리윰에 대한 시간에 따른 세포질에서 ATP의 상대적 축적을 보여준다. 도 12는 동일한 실험 조건들 하에서 배지에서 실제 세포 성장과 ATP의 농도의 축적이 정밀하게 일치하는 것을 나타내었다. 실제 세포 성장과 ATP 농도(도 12)에서 관찰된 상대적 감소는 ATP를 소비하고, 특정 시간 이후 더욱 중요해지는 이화 과정을 검토하면 설명될 수 있다.
ATP 또는 ADP/AMP/PPi는 살아있는 시스템의 세포들 내에서 높은 농도로 저장될 수 없다. 세포질에서 이들의 상대적 농도는 일반적으로 다양한 생물학적 과정에 의해 좁은 농도 한계에 대해서 제어된다. 실제로, 박테리아는 신진대사 과정에 제어 메커니즘을 이용하여 세포들의 필요를 충족시키나 초과하지 않게 한다. 따라서, 비록 Gram +ve 및 Gram -ve 박테리아의 메커니즘은 완전히 다르나, 이런 제어의 생리학적 결과들은 동일하다. 그러나; 동역학 연구들은 신진대사 과정 동안 세포 성장과 ATP의 방출은 염색제로서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)를 사용하여 연관될 수 있다는 것을 나타내었다. Gram -ve 박테리아의 경우에 관찰된 흡수도 변화의 정도 및 더 높은 기울기는 Gram +ve와 비교하여 세포 성장 동안 방출된 ATP에 대한 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 더 높은 결합을 나타내었다.
세포들의 생존성은 광 현미경 아래에서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)로 염색하기 이전 및 이후에 관찰되었다. 세포 성장, 세포 분할뿐만 아니라 이들의 사망은 염색된 세포 현탁이 3시간까지 오목 슬라이드에 제조된 현적(hanging drop)으로 생각될 때 관찰될 수 있다(도 13).
우리는 금속 중심이 음이온성 분석물과 결합하기 위한 수용체 유닛으로 작용하는 쉬운 2 단계 합성 절차를 따라 새로운 Zn(II)계 색측정 센서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)을 합성하였다. 센서는 순수한 수성 배지에서 ATP에 대해 선택적이며 ATP와 결합한 이후 현저한 색 변화를 나타낸다. 다른 생물학적 세포들(진핵세포 및 원핵세포)에서 생산된 ATP에 대한 결합을 통해 살아있는 세포 염색에 대한 이런 화합물의 능력을 검사하였다. 이런 시약은 육안으로 광 현미경을 통해 관찰될 수 있는 세포들을 염색하는 것으로 발견되었고 비 독성인 것으로 발견되었다. 이런 생존가능한 염색제는 세포 성장 동역학에 대한 연구를 가능하게 하였다.
본 발명은 Zn(II)계 색측정 센서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 제조 및 살아있는 세포들을 위한 생존가능한 염색제로서 이의 사용을 위한 방법 개발을 다룬다. 본 발명에서 센서의 제조는 리간드의 합성 및 아연 염 용액과 리간드의 반응을 포함한다. 금속 중심은 음이온성 분석물과 결합하기 위한 수용체 유닛으로 작용한다. 센서는 수성 배지에서 ATP에 대해 선택적이며 ATP와 결합한 이후 현저한 색 변화를 나타낸다. 센서는 염색제로서 작용하며 세포 성장 동역학에 대한 연구는 착수될 수 있다. 종래 기술은 어떻게 Zn(II)계 색측정 센서들이 살아있는 세포를 위한 생존가능한 염색제로서 사용될 수 있는지를 밝히거나 교시하지 않는다. 효모 세포(진핵생물) 및 Gram +ve/Gram -ve 박테리아 세포들(원핵생물)은 염색된 세포의 색 강도를 기초로 구별될 수 있다는 것은 본 발명에서 처음으로 보고된다. 또한, 센서는 비 독성이며 세포들의 염색 이후에도 수성 배지에서 생물학적 세포의 세포 성장 동역학의 평가 및 관찰을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 채택된 발명의 단계는 (i) 다양한 생물학적 포스페이트들 중에서 ATP와 우선적으로 결합하는 Zn(II)계 색측정 센서 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 제조이며 (ii) 센서는 수성 배지에서 pH 7.2의 생리학적 조건하에서 살아있는 세포들을 염색하는데 효과가 있고, (iii) 센서는 살아있는 세포들에 대해 비 독성이며 (iv) α-사이클로덱스트린 속에 센서의 내포가 살아있는 세포의 염색 강도 및 색 강도를 기초로 한 후속 분리를 증가시킨다.
본 발명을 통해 해결한 기술적 문제는 호흡 과정 동안 생산된 ATP의 다양한 농도의 인식을 통해 인 비보 세포 성장 동역학의 평가를 위해 사용될 수 있는 살아있는 세포에 대한 생존가능한 염색제를 개발하는 것이다. 생리학적 조건에서 살아있는 세포들을 염색하는데 유용한 센서들에 대해 공지된 방법들에서 발생하는 주요 문제의 하나는 센서들의 독성이다. 사용된 이런 센서들의 독성은 이런 독성이 살아있는 세포들의 사망을 일으키기 때문에 인 비보 세포 성장 동역학을 연구하는 것을 허용하지 않는다. 반대로, 본 발명의 Zn-계 색측정 센서는 비 독성이며 생물학적 세포들의 인 비보 세포 성장 동역학의 평가에 유용한 것으로 발견되었다. 게다가, 이런 센서의 도움으로, 세포 성장과 신진대사 과정 동안 개개의 세포의 점진적 성장에 의한 제 위치 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 발생 사이의 상관관계를 확립할 수 있다.
실시예들
다음 실시예들은 예로서 제공되며 따라서 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 50mL 테트라하이드로퓨란(24.76mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 50mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.5 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(센서)의 침전물을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. GYE 배지 속 100μL의 사카로마이세스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 75 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 2
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 154mL 마른 테트라하이드로퓨란(8.0mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 50mL 테트라하이드로퓨란(24.76mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 50mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.5 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. GYE 배지 속 100μL의 사카로마이세스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 70 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다); 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 3
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 50mL 마른 다이클로로메테인(24.76mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 50mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.5 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. GYE 배지 속 100μL의 사카로마이세스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 30 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 4
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 62mL 테트라하이드로퓨란(20mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 50mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.5 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. GYE 배지 속 100μL의 사카로마이세스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 68 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 5
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도의 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 62mL 테트라하이드로퓨란(20mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 25mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.35 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. GYE 배지 속 100μL의 사카로마이세스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 75 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 50 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 6
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 62mL 테트라하이드로퓨란(20mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 25mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.75 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. GYE 배지 속 100μL의 사카로마이세스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 75 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 63 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 7
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 62mL 테트라하이드로퓨란(20mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 25mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.75 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. 영양소 발효액 배지 속 100μL의 바실러스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 75 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 8
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 62mL 테트라하이드로퓨란(20mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 25mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.75 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. 킹스 B 배지 속 100μL의 수도모나스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 75 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
화합물 L.Zn(반응식 1, 화학식 1A)의 분리 수율: 수율; 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 9
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 62mL 테트라하이드로퓨란(20mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 25mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.75 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. 킹스 B 배지 속 100μL의 수도모나스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 75 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
수율 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
실시예 10
250mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에, 247mg(1.23mM 농도)의 1,4,8,11 테트라아자사이클로테트라데케인(사이클람)을 25℃에서 온화한 교반하에서 100mL 마른 테트라하이드로퓨란(12.3mM 농도)에 용해하였다. 용액이 있는 플라스크를 5℃ 온도에서 얼음에 보관하였다. 여기에 5mL의 트라이에틸아민을 1.0mL/min로 첨가하였다. 62mL 테트라하이드로퓨란(20mM 농도) 속 400mg의 4-(4'-다이메틸아미노페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드를 함유하는 개별적으로 제조된 용액을 교반하면서 5℃의 온도에서 25mL/hour로 첨가하였다. 25℃의 온도를 얻은 이후 혼합물을 6시간 동안 교반하고 그런 후에 30분 동안 재환류하였다. 여과되고 세척된 침전물(리간드)을 25℃에서 메탄올에 용해시켜 15mM의 농도를 갖게 하였다. 여기에 리간드의 0.75 몰 당량의 질산 아연 용액을 25℃의 온도에서 첨가하였고 15시간의 기간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물의 온도를 동결 냉각하여 15℃로 낮추었고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 원하는 화합물(L.Zn(반응식 1, 화학식 1A))의 침전물(센서)을 클로로폼으로 세척하고 보관하였다. 킹스 B 배지 속 100μL의 수도모나스 종들을 10분의 기간 동안 25℃에서 1.0x10-4M의 농도로 100μL의 센서로 배양하였다. 다른 색 강도를 기초로 Gram +ve 및 Gram -ve를 구별하였고 테스트 미생물들의 군집들은 영양소 한천 판 상에 도말평판될 때 성장되었다.
화합물 L(반응식 1, 화학식 2)의 분리 수율: 수율; 75 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1H NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, J (Hz), δ(ppm)): 7.98 - 7.96 (2H, d, J = 8.0, Ar-He) 7.9 - 7.87 (4H, m, Ar-Hc,Hd), 7.06 (3H, b, -NH매크로사이클), 6.77-6.75 (2H, d, J = 8.0, Ar-Hb), 3.15 (16H, br, Hf ,h,i,j,k,m,n,o), 3.11 (6H, s, -N(CH3)2), 2.03 (4H, br, Hg ,l). Es-Ms (+ ve 방식): m/z; 488.30 (M++H+). 원소 분석 데이터: Calc. C: 59.11, H: 7.65, N: 20.11, Expt. C: 59.1, H: 7.5, N: 20.2.
수율 65 %(수율은 출발 화합물들을 기초로 계산하였다). 1HNMR (500 MHz, DMF-d7, TMS, δ(ppm)): 7.92 - 7.91 (2H, d, J = 8.5, Ar-He), 7.88 - 7.86 (2H, d, J = 9, Ar-Hc), 7.81 -7.79 (2H, d, J = 8.5, Ar-Hd), 6.92 - 6.9 (2H, d, J = 9.5, Ar-Hb), 3.13 (6H, s, -N(CH3)2), 2.92-2.91 (8H, br, Hf ,g,n,o), 2.75 -2.74 (12H, br, Hh ,i,j,k,l,m),. ES-ms (+ve 방식, m/z): 676.00 (M+). 원소 분석: Calc. C: 42.57, H: 5.51, N: 18.62; Expt. C: 42.88, H: 5.56, N: 18.22.
반응식 1
반응식 2
Claims (23)
- 화학식 1A의 화합물:
화학식 1A. - 제 1 항에 있어서,
성질이 비 친유성인 화합물. - 제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 색측정 센서이며 살아있는 세포들에 대한 생존가능한 염색제로서 유용한 화합물. - 제 3 항에 있어서,
상기 살아있는 세포들은 원핵세포 및 진핵세포로부터 선택되는 화합물. - 제 3 항에 있어서,
사용된 원핵세포들은 바실러스 종들 및 수도모나스 종들인 화합물. - 제 3 항에 있어서,
사용된 진핵세포들은 효모(사카로마이세스 세레비제)인 화합물. - i. 25-30℃ 범위의 온도에서 300 내지 600rpm(분당 회전수)의 속도로 온화한 교반하에서 용매에 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데케인을 용해하는 단계;
ii. 2 내지 5℃ 범위의 온도에서 단계(i)에서 얻은 용액을 얼음에 유지하는 단계;
iii. 300 내지 600rpm의 속도로 온화한 교반하에서 0.5 내지 1 mL/minute의 속도로 단계(ii)에서 얻은 용액에 트라이에틸 아민 염기를 첨가하는 단계;
iv. 0 내지 5℃ 범위의 온도에서 15 내지 60 mL/hr 범위의 속도로 단계(iii)에서 얻은 용액에 테트라하이드로퓨란 속 4-(4'-다이메틸아미노-페닐 아조)벤젠 설폰일 클로라이드의 개별적으로 제조된 용액을 첨가하는 단계;
v. 5 내지 10시간 범위의 기간 동안 25 내지 30℃의 온도 범위에서 단계(iv)에서 얻은 생성된 혼합물을 교반하는 단계;
vi. 65 내지 70℃ 범위의 온도에서 20 내지 60분 범위의 기간 동안 단계(v)에서 얻은 혼합물을 재환류하는 단계;
vii. 리간드의 침전물을 분리하기 위해 단계(vi)에서 얻은 혼합물을 여과하는 단계;
viii. 단계(vii)에서 얻은 리간드의 침전물을 세척하고 건조하는 단계;
ix. 20 내지 25℃ 범위의 온도로 알코올에 단계(viii)에서 얻은 리간드를 용해하는 단계;
x. 20 내지 25℃ 범위의 온도에서 단계(ix)에서 얻은 리간드의 용액에 질산염 아연 용액(리간드의 0.3 내지 0.8 몰 당량)을 첨가하는 단계;
xi. 12 내지 24시간 범위의 기간 동안 20 내지 25℃ 범위의 온도에서 단계(x)에서 얻은 용액을 교반하는 단계;
xii. 2 내지 5시간 범위의 기간 동안 10 내지 20℃ 범위의 온도에서 단계(xi)에서 얻은 용액을 휘젓는 단계;
xiii. 화학식 1A의 화합물을 얻기 위해 클로로폼으로 단계(xii)에서 얻은 침전물을 여과하고 세척하는 단계
를 포함하는 화학식 1A의 화합물의 제조 방법. - 제 7 항에 있어서,
사용된 용매는 클로로폼, 메탄올, 다이클로로메테인 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제조 방법. - 제 7 항에 있어서,
사용된 알코올은 메탄올 및 에탄올로부터 선택되는 제조 방법. - a. 6 내지 36시간 범위의 기간 동안 30 내지 40℃ 범위의 온도에서 (i) 글루코오스 효모 추출물 한천(GYE) 배지에서 사카로마이세스 종들(MTCC 5548), (ii) 영양소 발효액에 바실러스 종들(MTCC 5549) 및 (iii) 킹스 B 배지(King's B medium)에서 수도모나스 종들(MTCC 5550)을 배양하는 단계;
b. 5 내지 20분 범위의 기간 동안 28 내지 38℃의 온도 범위에서 화학식 1A의 0.6x10-4 내지 1.2x10-4M 화합물로 단계(a)의 세포들을 배양하는 단계;
c. 28 내지 38℃의 온도 범위에서 10 내지 12시간 범위의 기간 동안 7.4 내지 7.6 범위의 pH에서 버퍼 속 글루터알데하이드로 단계(b)에서 얻은 배양된 샘플을 고정하는 단계;
d. 0.5 내지 1.0시간 범위의 기간 동안 상기 버퍼로 단계(c)에서 얻은 샘플을 세척하는 단계;
e. 오스뮴 테트라옥사이드와 버퍼로 단계(d)에서 얻은 샘플을 차후 고정하고 상기 버퍼로 세척하는 단계;
f. 등급별 물 에탄올 시리즈에 의해 단계(e)에서 얻은 샘플로부터 물을 제거하는 단계;
g. 상기 버퍼에 단계(f)에서 얻은 샘플들을 세정하고 단순 현미경 아래서 보기 위해 염색된 표본을 얻도록 스퍼터 코터에서 금으로 코팅하는 단계;
h. 염색된 세포들의 다른 색 강도와 모양으로 살아있는 세포들을 구별하는 단계
를 포함하여 제 1 항의 화합물을 사용하여 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
사용된 버퍼는 포스페이트 버퍼인 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
센서와 살아있는 세포의 결합은 주사전자현미경(SEM) 분석에 의해 확인되는 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
염료로 염색 이후 세포들의 생존성은 세포 분할의 발생을 나타내는 오목 슬라이드에서 현적법에 의해 테스트된 미생물들에서 2분열을 관찰함으로써 증명되는 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
화학식 1A의 화합물의 가역적 결합은 광 현미경 및 UV-vis 분광학을 통해 시트르산 나트륨 20%(w/v) 용액으로 세포들을 탈색함으로써 확인되는 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
화학식 1A의 화합물에 의한 살아있는 세포의 염색은 세 개의 포스페이트 그룹이 Zn과 배위결합하는 살아있는 세포들의 세포벽에 존재하는 ATP에 의한 센서의 헵타 배위결합 종들의 형성에 의해 수행되며 모든 세 개의 포스페이트 원자들에 대해 31PNMR 이동이 얻어지는 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
화학식 1A의 화합물의 흡수 스펙트럼 적정 곡선이 ATP의 첨가 이후 40nm 스펙트럼 이동을 나타내며 ATP와 화합물의 결합 상수는 (978±4)M-1인 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
물에서 화학식 1A의 화합물의 용해도는 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 약 7 내지 7.5배 증가하는 화합물. - 제 1 항에 있어서,
화학식 1A의 화합물의 염색의 강도는 Zn(II)계 색측정 센서 L.Zn에 대한 최대 흡수도가 α-CD(사이클로덱스트린)의 수용액의 첨가에 의해 5nm만큼 이동하는 것을 보여줌으로써 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 증가하는 화합물. - 제 10 항에 있어서,
화학식 1A의 화합물에 의한 염색은 10-20분 후에 발생하며 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 1초 내지 2분 후에 발생하여 화학식 1A의 화합물의 염색 속도는 α-CD(사이클로덱스트린)의 존재하에서 증가하는 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
염료 없는 사카로마이세스 종들의 세포 표면들의 SEM 이미지들은 염료가 있는 사카로마이세스 종들의 세포 표면들의 SEM 이미지들이 거친 것과 비교하여 부드러운 것으로 발견된 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
염료가 없는 Gram +ve 박테리아의 SEM 이미지들은 염료가 있는 Gram +ve 박테리아의 SEM 이미지들이 거친 것과 비교하여 부드러운 것으로 발견된 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
염료가 없는 Gram -ve 박테리아의 SEM 이미지들은 염료가 있는 Gram -ve 박테리아의 SEM 이미지들이 거친 것과 비교하여 부드러운 것으로 발견된 살아있는 세포들을 염색하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
Gram +ve 박테리아에 대한 염색된 세포들은 염색된 Gram -ve 박테리아의 염색된 세포들과 비교하여 더 길게 보이는 살아있는 세포들을 염색하는 방법.
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