KR20130096744A - 나노와이어를 구비한 분자 전달 - Google Patents

나노와이어를 구비한 분자 전달 Download PDF

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KR20130096744A
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홍근 박
자콥 로빈슨
아미 서턴
마르셀라 조르골리
알렉산더 칸 쉘렉
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프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

전기 전도성 층으로 코팅된 다수의 나노와이어 (예를 들어, Si NW)를 포함하는 분자 전달 장치. 또한 개시된 것은 나노와이어-매개 전기천공법에 의한 분자를 전달하는 방법이다.

Description

나노와이어를 구비한 분자 전달{MOLECULAR DELIVERY WITH NANOWIRES}
본 출원은 2010년 9월 29일에 출원한 미국 가출원 61/387,604 및 2011년 3월 14일에 출원한 미국 가출원 61/452,283 모두의 우선권을 주장한다. 이러한 선행 출원들은 전체적으로 여기에서 참조로 포함되었다.
본 발명은 미국 국립 보건원이 재정한 계약번호 1DP1OD003893-01 하에서 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 일부 권리를 가진다.
세포 내로 외인성 유전 물질의 전달은 바이러스적으로 (예를 들어, 아데노-연관 또는 렌티-바이러스 벡터를 사용), 화학적으로 (예를 들어, 인산 칼슘, 리포솜, 또는 다양이온을 사용), 기계적으로 (예를 들어, 미세주입법), 및 또는 물리적으로 (예를 들어, 전기천공법) 이루어질 수 있다.
이러한 다른 전달 방법 중에서, 전기천공법은 두 개의 평행한 전극들 사이에서 형성된 균일한 전기장에 세포들을 위치시킴으로써 이루어진다. 막횡단 퍼텐셜이 대략 0.25 내지 1 V의 역치 레벨을 초과할 때, 세포막의 지질 이중층은 친수성 구멍 (보편적으로 20-120 ㎚ 사이의 직경)을 형성하기 위하여 재배열된다. 구멍 크기보다 작은 임의의 분자는 전기영동 또는 확산 중 하나를 통하여 세포로 유입될 수 있다. 보편적으로, 용액에 현탁된 세포를 전기천공하기 위하여, 수 마이크로초 내지 밀리초 지속되는 (세포 크기에 의해 변하는) 대략 1000 V의 펄스가 요구된다.
이 방법은 특정한 세포에 대하여 효과적으로 작동하지만, 작은 면역 세포 및 뉴런의 전기천공법은 덜 효과적이다. 균일한 전기장이 전기천공법을 위한 작은 세포 또는 뉴런들에 인가될 때, 세포막의 많은 부분에 걸친 퍼텐셜은 파괴 퍼텐셜을 상회하며, 낮은 세포 생육성을 초래한다. 이러한 세포들을 위하여 개선된 전기천공 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 진폭이 10 V 미만인 전압 파형이 한 세트의 전기 전도성 나노와이어를 집합적으로 세포내 전극으로서 이용하여 효율적으로 세포를 전기천공할 수 있다는 예상하지 못한 발견에 기초한다.
일면에서, 이 발명은 (i) 기질 및 (ii) 기질의 표면에 부착한 다수의 나노와이어를 포함하는 분자 전달 장치가 특징이다. 기질은 전기 전도성이며, 나노와이어는 전기 전도성 층으로 코팅된다.
위의 기술된 장치에서 사용된 전기 전도성 기질은 전기 전도성 물질로 코팅된 표면을 가지는 비 전도성 또는 반도성 물질로 구성된 기질일 수 있으며, 이 표면은 나노와이어와 전기적으로 소통한다. 다르게는, 전기 전도성 물질로 구성될 수 있다. 기질을 위한 물질의 예시는 반도체 (예를 들어, Si 및 Ge), 화합물 반도체 (예를 들어, InP 및 GaAs), 산화 금속 (예를 들어, ZnO, ITO, 및 산화 Ir), 및 금속 (예를 들어, Au, Pt, Ag, Ir, 및 Cr)을 포함한다.
용어 "나노와이어" (또는 이후로 "NW")는 1 ㎚ 내지 1 ㎛ 범위의 직경을 가지는 선, 막대, 또는 원뿔 모양의 물질을 지칭한다. 여기에서, 원뿔은 0-90 도 범위에서 반각 (예를 들어, 0-15 도)을 가진다. NW는 바람직하게는 표면에 대하여 실질적으로 수직 방향 (즉, 60-90 도)을 따라 표면에 부착되었다. 이들은 20-10,000 ㎚의 높이 (예를 들어, 100-5,000 ㎚ 및 800-1,200 ㎚), 10-500 ㎚의 직경 (예를 들어, 50-250 ㎚ 및 70-180 ㎚), 및 0.05-10 와이어 ㎛-2 (예를 들어, 0.1-5 와이어 ㎛-2 및 0.2-2 와이어 ㎛-2)의 밀도를 가질 수 있다. 이들은 반도체 (예를 들어, Si 및 Ge), 화합물 반도체 (예를 들어, GaAs 및 InP), 산화 금속 (예를 들어, ZnO), 금속 (예를 들어, Au, Ag, Ir, Pt), 탄소, 질화 붕소 또는 그의 조합물로 형성될 수 있다.
NW 및 기질상에 코팅된 전도성 층은 금속 (예를 들어, Au, Ag, Pt, Pd, Cr, Ni, Ir, Al, W, Ti, 및 Fe), 산화 금속 (예를 들어, 산화 Ir, ITO, 및 ZnO), 반도체 (예를 들어, Si 및 Ge), 화합물 반도체 (예를 들어, GaAs, GaP, InP, InAs, InGaAs, 및 GaN), 질화 금속 (예를 들어, TiN, ZrN, 및 TaN), 또는 그의 조합물로 형성될 수 있다.
화합물 반도체는 Ⅳ-Ⅳ 반도체 (예를 들어, SiC 및 SiGe), Ⅲ-Ⅴ 반도체 (예를 들어, AlN, AlP, AlGaAs, GaN, GaAs, InP, 및 InGaAs), Ⅱ-Ⅴ 반도체 (예를 들어, Zn3Sb2 및 Cd3As2), Ⅱ-Ⅵ 반도체 (예를 들어, CdS, CdSe, 및 CdTe), Ⅳ-Ⅵ 반도체 (예를 들어, SnS 및 PbSnTe), Ⅰ-Ⅵ 반도체 (예를 들어, Cu2S), Ⅰ-Ⅶ 반도체 (예를 들어, CuCl), 및 산화 반도체 (예를 들어, SnO2, CuO, 및 Cu2O)와 같은 두 개 이상의 원소로 형성될 수 있다. 특별히 다르게 정해지지 않았으면, 본 발명의 전기 장치에 사용하는 반도체는 그 고유의 형태 (즉, 순수한 형태) 및 도핑된 형태 (즉, 하나 이상의 도판트를 포함)를 모두 포함한다. 용어 "조합물"은 혼합물, 합금, 또는 두 개 이상의 성분의 적합한 반응 생성물을 지칭한다. 예를 들어, "규소 및 금속의 조합물"은 규소와 금속의 혼합물 또는 금속의 규소화물이 될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포 내로 외인성 분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 (ⅰ) 표면을 가지는 기질 및 표면에 부착된 다수의 NW의 제공, (기질 및 NW 각각은 전기 전도성임); (ⅱ) NW가 세포 내로 침투되도록 NW와 세포의 접촉; 및 (ⅲ) 배쓰 용액 내 전극과 기질 사이에서 전류 또는 전압 파형의 인가를 포함한다. 결과적으로, 분자는 세포막에 일시적으로 형성된 구멍을 통하여 세포 내로 들어간다. 전기 전도성 NW는 (1) 전기 전도성 물질로 코팅된 표면을 가지는 비 전도성 또는 반도성 물질로 만들어질 수 있고 이 표면은 NW가 부착된 기질의 표면과 전기적으로 소통하는 것이며; 또는 (2) 전기 전도성 물질로 만들어질 수 있다.
이 방법에서 사용되는 장치는 이 방법에서 사용되는 NW가 전기 전도성 층으로 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다는 것을 제외하고는 위에서 기술한 것과 동일하다.
전달되는 분자는 핵산 (예를 들어, siRNA 및 microRNA를 포함하는 RNA 및 DNA), 단백질, 다당류, 또는 작은 분자가 될 수 있다. 용어 "작은 분자"는 다양한 약물 분자, 형광 염료, 올리고당, 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드를 포함하는 1000 Da 미만 분자량을 가지는 임의의 분자를 지칭한다.
세포는 원핵 세포 (예를 들어, 대장균) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 효모 세포 및 사람 세포)가 될 수 있다. 사람 세포는 일차 세포, 형질전환 세포 (예를 들어, HEK 세포), 또는 암세포 (예를 들어, HeLa 세포)가 될 수 있다. 일차 세포는 난모세포, 뉴런, 신경모세포, 베타 세포, 근육세포, 조골세포, 섬유아세포, 각질세포, 단핵구, 면역 세포, 또는 줄기 세포가 될 수 있다. 면역 세포는 대식세포, 자연 살해 세포, T 세포, 및 B 세포, 및 수지상 세포가 될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 성체 줄기 세포 (예를 들어, 조혈모 세포 및 중간엽 줄기 세포)가 될 수 있다. 바람직하게는, 생물학적 세포 각각은 두 개 이상의 NW에 의하여 침투된다.
전기적 신호는 전기적 전류 또는 전압 신호 중 하나일 수 있다. 전압 파형의 진폭은 0.1-10 V (예를 들어, 3-7 V 및 4-6 V)이다. 용어 "파형"은 시간의 함수로서 전압 (또는 전류) 진폭의 플롯이다. 이는 사각, 삼각, 톱니 또는 사인곡선적 형태 펄스의 일반적인 용어이다.
본 발명의 또 다른 측면은 여전히 세포 내로 외인성 분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 (ⅰ) 전기 절연 층으로 코팅된 표면을 가지는 기질 및 다수의 전기 전도성 나노와이어 (제1 단부 및 제2 단부를 가지는 각각의 것은 제1 단부 및 제2 단부를 제외하고 전기 절연 층으로 코팅되며, 제1 단부는 표면에 부착되고 제2 단부는 전기 전도 층으로 코팅됨)의 제공; (ⅱ) 하나 이상의 나노와이어가 세포 내로 침투되도록 분자를 포함하는 배쓰 용액에 담그어진 세포와 나노와이어의 접촉; 및 (ⅲ) 하나는 각 나노와이어의 제1 단부에 연결되고 다른 것은 배쓰 용액에 위치하는, 두 전극 사이에서 전류 또는 전압 파형의 인가를 포함한다. 결과적으로, 분자는 세포막에 일시적으로 형성된 구멍을 통하여 세포 내로 들어간다.
이 방법에서 사용된 기질은 반도체 (예를 들어, Si), 화합물 반도체 (예를 들어, GaAs, InP, GaN, 및 GaP), 또는 다이아몬드로 형성될 수 있다. 이는 전기 절연 층으로 코팅된다. 이 방법에서 사용된 NW는 각 NW의 두 말단 사이의 구역이 전기 절연 층으로 코팅된 것을 제외하고는 위에서 기술한 것과 동일하다. 아울러, 각 NW는 전압 파형에 의하여 개별적으로 다룰 수 있는 것일 수 있다. 전기 절연 층은 산화물 (예를 들어, 실리카, 알루미나, 및 산화 하프늄), 질화물 (예를 들어, 질화 규소), 또는 그의 조합물로 형성된다. 다르게는, 전기 절연 층은 파릴렌 (예를 들어, 파릴렌 C, N, AF-4, SF, HT, A, AM, VT-4, 또는 CF), 폴리디메틸실록산, 메틸 메타크릴레이트, 포토레지스트 (예를 들어, SU-8), 및 전자빔 레지스트 (예를 들어, 폴리메틸메타크릴레이트, ZEP-520, 및 수소 실세스퀴옥산)와 같은 유기 금속으로 형성된다.
위에서 언급했듯이 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포일 수 있다. 전달되는 분자는 또한 핵산, 단백질, 다당류, 또는 작은 분자일 수 있다. 전기적 신호는 전기적 전류 또는 전압 신호 중 하나일 수 있다. 전압 파형의 진폭은 0.1-10 V이다.
위에서 기술한 두 가지 NW계 전기천공 방법의 한 장점은 분자 전달을 이루기 위하여 요구되는 낮은 전압 파형, 즉, 10 V 미만인 진폭이다. 이는 상용되는 전기천공 시스템에 의해 사용되는 것보다 약 100 배 낮은 것이다. 요구되는 전압을 낮추는 것은 기계 사용을 더 알맞게 만들 뿐만 아니라, 또한 세포사를 유발할 수 있는 아크(arcing)의 가능성을 줄인다. 추가로, 이러한 방법들은 분자들을 서로 다른 그들의 형상 (예를 들어, 크기) 또는 전압 펄스 (예를 들어, 진폭 및 펄스 지속시간)를 변화시킴으로써 거의 모든 진핵 및 원핵 세포들로 운반하는데 사용될 수 있다.
원핵 세포로의 이행은 큰 규모의 병행 항생제 스크리닝을 포함한 풍부한 새로운 적용을 가능하게 한다. 규소 웨이퍼 상의 NW는 대량 생산될 수 있다. 이러한 높은 처리량, 낮은 비용 생산은 본 발명의 전달 방법의 넓은 범위의 적용을 허용한다.
하나 이상의 실시태양의 상세 내용이 아래의 수반되는 서술에서 설명된다. 다른 측면, 특징, 및 장점이 다음의 도면, 실시태양의 상세한 기술로부터 및 또한 첨부한 청구항들로부터 분명해질 것이다.
도 1a는 배양되고 수직 Si NW의 어레이 맨 위에 고정된 사람 섬유아세포의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지이다; 도 1b는 백금 코팅된 Si NW의 SEM 이미지이다; 그리고 도 1c는 전기 전도성 NW의 끝에서 전기장 증가의 한정된 요소 시뮬레이션을 보여주는 사진이다. 스케일 바(scale bar): (a) 10 ㎛, (b) 200 ㎚, 및 (c) 200 ㎚.
도 2a 및 b는 각기 임의의 펄스의 인가 없이 (대조군) 및 5.75 V의 진폭을 가지는 일련의 전압 펄스를 인가한 HEK293 세포의 호에슈트 핵 표지(Hoescht nuclear labeling)를 보여주는 두 개의 형광 이미지들이다; 도 2c 및 d는 각기 HEK293 세포에서 펄스의 인가 없이 (대조군) 및 5.75 V의 진폭을 가지는 일련의 전압 펄스 인가 후에 비-세포막-투과성 녹색 형광 염료(셀세인(celcein))의 부재 및 존재를 보여주는 두 개의 형광 이미지들이다; 도 2e 및 f는 각기 펄스의 인가 없이 (대조군) 및 5.75 V의 진폭을 가지는 일련의 전압 펄스 인가 후에 죽은 세포들의 염색을 보여주는 두 개의 형광 이미지들이다; 도 2g는 세포 형광 세기를 보여주는 히스토그램이다; 그리고 도 2h는 형질감염 효율 및 세포 생육성을 보여주는 막대 도표이다.
도 3a는 절연기상의 규소로 제조된 한 세트의 끝부분이 Pt인 NW 전극의 주사 전자 이미지이다 (인세트는 절연 산화물의 종말이 NW의 기저에서 보일 수 있는 NW 전극의 확대 단면도이다); 도 3b는 NW 전극 맨 위에서 배양된 HEK293 세포의 시차 간섭 콘트라스트 이미지이다. 왼쪽 아래에서 접근하는 것으로 보이는 패치 피펫이 전기천공법을 통해 세포 내로 유입되는 전류를 모니터하는데 사용된다; 도 3c는 Si NW 전극에 인가되는 전압 파형을 보여주는 개략도이다; 그리고 도 3d 및 e는 각기 4.5 V 및 5.5 V의 진폭을 가지는 전압 파형에 반응하여 세포 내로 유입되는 전류의 진폭을 보여주는 개략도이다.
도 4a는 그 맨 위에서 배양한 HEK293 세포를 가지는 Si NW 전극을 보여주는 명시야 이미지이다; 도 4b는 전기천공법을 통하여 단세포로 붉은 형광 염료를 전달한 이후에 동일한 위치의 형광 이미지이다; 도 4c는 핵의 상응하는 형광 이미지이다; 그리고 도 4d는 위의 세 이미지의 오버레이이다. 화살표는 Si NW의 위치를 의미한다.
본 발명은 NW계 전기천공법 장치 및 세포 내로 외인성 분자를 전기천공시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 NW는 전기 전도성이고, 바람직하게는 수직 방향으로 기질에 붙어있다. 시험관 내 전기천공법을 위해서, 세포들은 그러한 NW 기질에 직접적으로 배양되거나 다른 기질에서 배양되고 NW와 인접하게될 수 있다. 다르게는, 그러한 NW 기질은 시험관 내 또는 현장 생체분자 전달을 위하여 이식될 수 있다.
하나 이상의 NW의 일 말단은 세포의 기저막을 침투하고 그 안에 위치한다. 세포 내에 있는 말단을 가지는 이러한 NW의 한 세트는 집합적으로 세포가 담겨진 배쓰 용액에서 세포 밖의 전극과 쌍을 이루는 세포 내 또는 세포 옆의 전극처럼 움직인다. 전기 퍼텐셜 또는 전류가 전극의 쌍을 통과하며 인가될 때, 각 NW의 세포내 말단은 NW 끝에서 곡률의 반지름 (보편적으로 < 100 ㎚인 직경)에 상응하는 영역에 전기장을 집중할 수 있다. 전기장의 나노규모 집중은 전기천공법 프로토콜의 개발에 별도의 자유도를 더한다. 전기장 분포는 밀도, 종횡비, 및 수직 NW의 곡률의 반지름을 리소그래프 방식으로(lithographically) 맞추어(tailoring) 제어될 수 있다. 하나는 역치 퍼텐셜을 초과하고 따라서 세포, 특히 형질감염이 어려운 세포 (예를 들어, 줄기 세포 및 면역 세포)의 효율적이고 낮은 독성의 전기천공법이 실시 가능한 세포막의 부분 면적을 결정할 수 있다. 아울러, 전압 및 전류 레벨, 펄스 지속시간, 및 펄스의 수는 원하는 레벨의 효율 및 생육성을 이루기 위하여 최적화될 수 있다.
일 실시태양에서, NW 및 그 기질들 모두 전기 전도성이다. NW는 기질에 고르게 퍼져있다. NW는 문헌 [Shalek, et al., 2010, Proceedings of the National Academy of Sciences, 107, 1870-1875]에 기술된 대로 높은 처리량 방식으로 전도성 Si 웨이퍼 상에 제조될 수 있다. 이들 NW는 그 다음에 그들의 전기 전도성을 높여주는 금속으로 코팅될 수 있다. 분자 전달을 NW 기질 맨 위에서 세포 배양 및 배쓰 용액내 전극 및 기질 사이에 전류 또는 전압 파형 인가에 의해 이룰 수 있다. 생체분자 전달에 요구되는 진폭은 오직 수 볼트이다. 기질 맨 위에 있는 모든 세포의 대부분은 전기천공되고 생육가능한 상태로 남는다.
NW 및 기질은 규소, 산화 규소, 질화 규소, 탄화 규소, 산화 철, 산화 알루미늄, 산화 이리듐, 텅스텐, 스테인리스강, 은, 백금, 금, 및 유리와 같은 전도성, 반도성, 및 절연성 물질을 포함하는 임의의 물질로 만들어질 수 있다. 전기 전도성 층은 낮은 세포독성을 가지는 물질 (예를 들어, 금, 은, 및 백금)로 만들어진다.
다른 실시태양에서, Si NW는 세포 내로 생체분자의 부위 특이적 전달이 가능하도록 개별적인 세트로서 기질에서 자란다. 각 개별적인 세트는 다른 세트로부터 전기적으로 절연되어 있다. 오직 같은 세트에 있는 NW만 전기적으로 연결되어있으며 다른 세트로부터 독립적으로 전압 파형에 의하여 다룰 수 있다. 세포 다발 중에서, 오직 한 세포만 수직 NW의 개별적으로 다룰 수 있는 세트의 맨 위에 있으며 전기천공법을 통하여 형광 염료를 받는다. 이러한 방법으로, 세포-세포 또는 세포-네트워크 상호작용은 상호작용 시스템 내에서 개별적인 세포로 특정한 동요의 제공에 의해 연구될 수 있다.
NW 위에 코팅된 절연층은 낮은 세포독성을 가지는 물질 (예를 들어, 산화 규소, 산화 알루미늄, 및 질화 규소)로 만들어진다.
두 가지 접근법이 기질에 있는 NW의 어레이를 얻기 위하여 폭넓게 사용된다. 하나는 전구체 물질로부터 NW를 성장시키는 것을 필수적으로 수반하는, 소위 상향 방식이다. 예를 들어 화학 기상 증착법(chemical vapor deposition; CVD)을 받으면, NW 성장 과정이 기질 맨 위에 씨드 입자 (보통 1 ㎚ 내지 수 백 나노미터의 직경을 가짐) 또는 촉매를 패터닝하거나 위치시켜 시작하고; 그 다음에, 전구체 물질이 촉매 또는 씨드 입자에 추가되고; 그리고 입자가 전구체로 포화되면, NW는 장치의 에너지를 최소화시키는 형태로 자라기 시작한다. 전구체, 기질, 촉매/씨드 입자들 (예를 들어, 크기, 밀도 및 기질 상의 증착 방법), 및 성장 조건을 변화시킴으로써, NW는 선택 부위에서 다양한 물질, 크기, 및 모양으로 만들어질 수 있다. 또 다른 접근법, 하향 과정은 담지한 기질으로부터의 소정의 구조 제거 (예를 들어, 에칭(etching)에 의한 것)를 필수적으로 수반한다. 예를 들어, NW가 형성되어야 하는 부위는 소프트 마스크 (예를 들어, 포토레지스트)로 처음 패터닝되고, 이어지는 에칭 동안 NW가 형성될 부위를 보호하기 위하여 또는 하드 마스크를 패터닝하기 위하여 사용되며; 에칭 단계가 이어서 삼차원의 와이어로 패터닝된 부위를 개발하기 위하여 (습식 또는 건식 중 하나로) 수행된다.
다른 세포 유형으로의 분자 전달 효율은 NW 크기 또는 밀도의 변화에 의하여 조작될 수 있다.
위에 기술된 전기천공 방법의 고려된 사용은 하기를 포함한다:
(1) 특히 형질감염시키기 어려운 세포로의 높은 처리량 생체분자 전달. 인가는 형질감염, 세포 리프로그래밍, 줄기 세포 분화 및 세포 내부 및 사이 신호 캐스캐이드 프로빙(probing)을 포함한다.
(2) 네트워크 또는 상호작용성 세포의 시스템 내에서 생체분자의 세포-특이적 전달.
(3) 재현탁하기 어려운 (뉴런과 같은) 부착 세포의 전기천공법.
(4) 다른 시간 지점에서 다른 양의 동일 분자 또는 여러 양의 다른 분자들로 동일 세포에 반복적인 전기천공법. 이들 세포들은 세포내 전극처럼 세포막에 침투한 NW가 세포 생육성을 손상시키지 않기 때문에, 전기천공법 사이의 NW 기질에 남아있을 수 있다.
추가적인 정교화 없이, 위의 기술은 충분히 본 발명을 가능하게 한다고 믿어진다. 다음의 실시예는, 따라서 단지 예시적이고, 어떠한 방법으로도 개시사항의 나머지를 제한하는 것이 아니라고 해석된다. 여기에 인용된 공보는 전체적으로 여기에서 참조로 포함되었다.
실시예 1: 전기천공법을 위한 NW 전극 기질의 제조
규소 기질 위 NW의 어레이를 200 ㎚ 두께의 열 성장된 산화 규소 층으로 코팅된 규소 웨이퍼의 건조-에칭에 의하여 형성하였다. NW를 넓은 면적에 걸쳐 제조하기 위하여, 콜로이드성 금 나노입자 (평균 직경 100 ㎚, 테드 펠라(Ted Pella)로부터 구입하였고, 구입한 샘플을 약 17 배 농축한 뒤에 사용함)를 현탁액을 만들기 위하여 클로로벤젠 중의 3 % 폴리메틸-메타크릴레이트(PMMA) 용액에 재현탁하였다. 규소 웨이퍼를 그 다음에 웨이퍼의 표면에 100 ㎚ 두께의 PMMA-나노입자 필름을 생성하도록 현탁액으로 3000 RPM에서 회전 코팅시켰다. 웨이퍼를 그 다음에 직접적으로 금 나노입자 하에 있지 않은 구역에서 산화 규소를 에칭하기 위하여 반응성 이온 에칭 (RIE) 장치 (넥스 장치 시러스 150 (NEXX DEVICES CIRRUS 150))에서 3 분 동안 CF4 플라즈마로 처리하였다. 금 나노입자를 그 다음에 불연속 산화 규소 도트의 패턴을 생성하기 위하여 TFA 금 에칭제(etchant)로 에칭시켜 냈다. 규소 웨이퍼를 코팅하고 있는 이 패턴은, 수직 NW를 형성하기 위하여 웨이퍼를 에칭하기 위한 마스크로 작용하였다. 웨이퍼를 수직으로 배열된 Si NW (평균 길이: 1000 ㎚; 평균 직경: 150 ㎚; 밀도: 0.5 와이어/㎛2)의 어레이를 형성하기 위하여 유도성으로-결합된 HBr:O2 플라즈마로 10 분 동안 또 다른 RIE 장치 (표면 기술 장치 ICP RIE)에서 에칭하였다. 산화 규소 마스크를 5:1로 완충된 산화물 에칭제에서 웨이퍼를 담그어 제거하였다. 웨이퍼를 NW의 표면 및 기질이 100 ㎚의 Pt로 코팅된 전자빔 증착기로 즉시 로딩하였다. 웨이퍼의 뒷면으로 금속성 접촉을 유사한 방식으로 형성하였다.
실시예 2: NW 어레이에 세포 평판배양
80-100 % 사이의 융합성의 HEK293 세포 또는 섬유아세포를 오 분 트립신 처리를 통하여 배양 플라스크로부터 제거하였다. 배지와 효소를 켄칭(quenching)한 후에, 세포를 1 백만 세포/mL의 농도로 재현탁하였다. 그 다음, 200 μL의 세포 현탁액을 실시예 1에서 제조한 수직으로 에칭된 NW와 규소 기질을 포함하는 48 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포 배양 플레이트를 인큐베이터 (5 % CO2, 90 % 상대 습도)에 두었다. 15 분의 인큐베이션 후에, 150 μL의 추가 배지를 첨가하였다. 18 시간의 추가 인큐베이션 후에, 샘플을 이미지화하였다. 도 1a에서 보이듯이, 사람 섬유아세포를 기질에 부착하였고 수많은 NW에 의해 침투되었음에도 불구하고, 생존가능한 세포로 퍼졌다.
실시예 3: NW 전기천공법을 통한 분자 전달
위에서 기술한 방법을 사용하여, HEK293 세포들을 평판배양하고 실시예 1에서 제조한 수직으로 에칭된 NW와 규소 기질 맨 위에서 배양하였다. NW 전극들을 기질에 후측 전기 접촉을 형성함에 의하여 접지하였다. 세포 배양을 둘러싸는 PDMS 웰을 1 nM의 막 비침투성 염료 (칼세인(calcein))를 포함하는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)의 용액을 넣는데에 사용하였다. Ag/AgCl 상대 전극을 NW 기질 약 0.5 cm 위 PBS에 위치시켰다. 이상성 100 Hz 구형파 전압 트레인은 30 초 전압 트레인을 반복한 뒤에, 0.4 초 동안 NW 기질 및 상대 전극 사이에 인가하였다. 삼십 초 후에 기질을 염료가 로딩된 PBS로부터 제거하였고 깨끗한 PBS로 세척하였고 이미지화하였다. 전압 펄스의 진폭은 대조군 및 전달 실험에서 각기 0 및 5.75 V이었다. 세포 생육성을 검정하기 위해, 전기천공법 이후에, 세포를 EthD-1에서 20 분 동안 실온에서 인큐베이션하였고 형광으로 이미지화하였다. 핵 DNA에 결합하는 EthD-1 때문에 세포막이 전기천공법으로부터 회복되지 않았거나 그렇지 않으면 다공성인 세포들은 강한 핵 형광을 보인다. 이러한 세포들을 죽은 것으로 세었고, 호에슈트 핵 표지를 통하여 세어 본 세포의 총 수와 비교하였다.
도 2에서 보이듯이, 이 NW 전기천공 방법은 HEK293 세포로 막 비침투성 염료 (칼세인)의 전달에서 97 % 초과의 효율을 보여주며 85 % 초과의 세포 생육성을 유지하였다. 게다가, 세포들은 NW 기질 맨 위에서 생존가능하게 유지되었고 필요하다면 반복적으로 전기천공할 수 있었다.
실시예 4: 개별적으로-다룰 수 있는 NW 전극의 제조
규소 기질 위의 Si NW의 어레이를 몇몇의 리소그래프, 에칭, 및 증착 단계를 통하여 만들었다.
처음에 에칭 마스크를 전자빔 리소그래피 (EBL)를 통하여 정하였다. 절연기 웨이퍼 위 규소를 대략 200 nm 두께 레지스트의 층을 만들기 위해서 2000 RPM에서 XR-1541 6 % 고체 네가티브 E-빔 레지스트(도우 코닝(Dow Corning))로 코팅하였다. 웨이퍼를 그 다음에 전자빔 노출 이전에 2 분 동안 225 ℃에서 구웠다. 레이스(Raith)-150 EBL 도구를 NW 형성에 바람직한 위치에서 100 nm 직경 원을 정하기 위하여 사용하였다. 1000 μC/㎠의 선량에서 노출한 이후에 웨이퍼를 다시 225 ℃에서 4 분 동안 구웠다. 그 다음에 패턴을 25 % 테트라메틸암모늄 히드록시드 (TMAH)에서 15 초 동안 발생시켰다. 발생 이후에 뒤에 남은 레지스트는 이어지는 에칭 과정을 위한 하드 마스크로서 작용했다. HBr:O2의 유도 결합 플라즈마 (ICP)를 Si NW의 어레이 (평균 길이: 1000 ㎚; 평균 직경: 150 ㎚; 밀도: 0.5 와이어/㎛2)를 제공하기 위하여 ICP-RIE 시스템 (표면 기술 시스템)에서 10 분 동안 인가하였다. 레지스트 마스크를 그 다음에 웨이퍼를 49 % 플루오르화수소산에 담금으로써 제거하였다. NW를 그 다음에 SiO2의 저압 화학 기상 증착법 (LPCVD)을 이용하여 800 ℃에서 절연하였다. NW 끝에서 SiO2를 제거하기 위하여, S1818 포토레지스트 (마이크로켐(Microchem))를 3000 RPM에서 회전시켰고 그 다음에 Si 기질에 500 nm 필름을 남기기 위하여 O2 플라즈마 (유나시스(Unaxis) RIE)를 사용하여 후측을 스트리핑하였다. 이 층 위에 튀어나온 NW의 끝을 그 다음에 끝을 코팅하고 있는 SiO2를 제거하기 위하여 CF4 플라즈마를 이용하여 에칭하였다 (STS ICP-RIE). 장치를 그 다음에 1 분 O2 플라즈마 데스컴으로 처리하였고 뒤이어 완충 산화물 에칭액(buffered oxide etch; BOE) 5:1에 10 초 담그었다. 기질을 그 다음에 전자빔 증착기를 사용하여 70 nm를 증착시키는 열 증착기에 로딩하였다. 레지스트를 그 다음에 리무버(Remover) PG (마이크로켐)를 이용하여 80 ℃에서 NW 끝에서만 금속 층을 남기고 몇 시간 동안 용해시켰다.
NW 전극을 개별적으로 다룰 수 있는 것으로 만들기 위하여, 전극 트랙을 그 다음에 웨이퍼에서 3000 RPM으로 S1818 포토레지스트 (마이크로켐)의 회전에 의해 패터닝하였다. 115 ℃에서 1 분 동안 웨이퍼를 구운 후에, 전극 사이 구역을 노출시키기 위하여 UV 접촉 리소그래피를 사용하였다. 노출된 레지스트를 그 다음에 MF-319 (마이크로켐)를 사용하여 개발하였다. 남아있는 레지스트는 C4F8:SF6 플라즈마를 사용하여 Si 기질의 ICP-RIE 에칭 (STS)을 위한 마스크의 역할을 하였다. 리무버 PG로 레지스트를 스트리핑한 후에, 기질을 원자층 증착장치(atomic layer deposition; ALD) (캠브리지 나노테크(Cambridge NanoTech))를 사용하여 Al2O3의 100 nm로 코팅하였다. 접촉 리소그래피를 사용하여, 접촉 패드를 위하여 1 x 0.5 mm 범위와 20 마이크로미터-직경 범위를 NW 주변에 노출시켰다. 개발 이후에, 이 구역 내 Al2O3를 트랜스에치(TransEtch) (트랜센(Transene))를 이용하여 제거하였다. 포토레지스트를 제거하였고 재인가하였으며 접촉 구역만을 노출시키고 개발하였다. 이 구역에서 BOE 5:1을 사용하여 SiO2를 스트리핑한 이후에, Pt 층을 앞에처럼 증착하였고 포토레지스트를 스트리핑하였다.
실시예 5: 전기천공법을 통하여 유입된 이온 전류
HEK293 세포들을 평판배양하고 실시예 4에서 제조한 수직 NW의 개별적으로 다룰 수 있는 세트와 규소 기질 맨 위에서 배양하였다. 막횡단 전류를 전압 펄스가 NW 전극 (세포외액에서 Ag/AgCl 전극으로부터 대략 0.5 cm 떨어짐)에 인가되는 동안에 전압 클램프 모드에서 종래의 패치 클램프 측정법을 수행하여 측정하였다. 도 3에서 보이듯이, 5.5 V 정도의 낮은 진폭을 가지는 외부 전압 파형은 투과되는 세포막을 통과하여 이온 전류를 만든다.
실시예 6: 부위 특이적 생체분자 전달
HEK293 세포들을 평판배양하고 실시예 4에서 제조한 수직 NW의 개별적으로 다룰 수 있는 세트와 규소 기질 맨 위에서 배양하였다. 세포 특이적 전달을 4.5 V의 진폭으로 도 3과 유사한 전압 자극 후에 달성하였다. 세포외액은 1 mg/mL의 막 비투과성 형광 염료 (알렉사(alexa) 647)를 포함하는 PBS이었다. 전압 펄스 이후에 세포들을 형광 이미지화하기 전에 PBS를 통하여 여러 번 세척하였다. 도 4에서 보이듯이, 세포 비투과성 형광 염료를 전압 파형의 인가 이후에 수직 NW의 개별적으로 다룰 수 있는 세트 맨 위에서 개별적인 HEK293 세포로 전달하였다.
다른 실시예들
본 명세서에서 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징들은 같거나, 등가 또는 유사한 목적으로 쓰이는 대체적인 특징으로 교체될 수 있다.
따라서, 특별히 다르게 표현되어 정해지지 않았으면, 각 개시된 특징은 오직 등가이거나 유사한 특징의 일반적인 일련의 예시이다.
위에 기술된 것으로부터, 당업자는 쉽게 본 발명의 핵심적 특징을 알아낼 수 있으며, 그의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 사용 및 조건에 이를 적용하기 위해 본 발명의 다양한 수정 및 변경을 할 수 있다. 따라서, 다른 실시태양 또한 다음의 청구항 범위 내에 있다.

Claims (28)

  1. 표면을 가지는 기질, 및
    표면에 부착된 다수의 나노와이어
    를 포함하고, 상기 기질은 전기 전도성이고, 나노와이어는 전기 전도성 층으로 코팅된 것인 분자 전달 장치.
  2. 제1항에 있어서, 각 나노와이어가 표면에 대하여 실질적으로 수직 방향을 따라 표면에 부착된 분자 전달 장치.
  3. 제1항에 있어서, 각 나노와이어가 반도체, 화합물 반도체, 산화 금속, 금속, 탄소, 질화 붕소 또는 그의 조합물로 형성된 것인 분자 전달 장치.
  4. 제3항에 있어서, 반도체가 규소인 분자 전달 장치.
  5. 제1항에 있어서, 각 나노와이어가 20-10,000 ㎚의 높이 및 10-500 ㎚의 직경을 가지는 것인 분자 전달 장치.
  6. 제5항에 있어서, 높이가 100-5,000 ㎚이고 직경이 50-250 ㎚인 분자 전달 장치.
  7. 제6항에 있어서, 높이가 800-1,200 ㎚이고 직경이 70-180 ㎚인 분자 전달 장치.
  8. 제1항에 있어서, 전기 전도성 층이 금속, 산화 금속, 반도체, 화합물 반도체, 질화 금속, 또는 그의 조합물로 형성된 분자 전달 장치.
  9. 제1항에 있어서, 나노와이어의 밀도가 0.05-10 ㎛-2인 분자 전달 장치.
  10. 제9항에 있어서, 밀도가 0.1-5 ㎛-2인 분자 전달 장치.
  11. 제10항에 있어서, 밀도가 0.2-2 ㎛-2인 분자 전달 장치.
  12. 표면을 가지는 기질 및 표면에 부착된 다수의 나노와이어 (기질 및 나노와이어는 둘 모두 전기 전도성임)를 제공하는 것;
    하나 이상의 나노와이어가 세포 내로 침투되도록 분자를 포함하는 배쓰 용액에 담그어진 세포와 나노와이어를 접촉시키는 것; 및
    배쓰 용액 내 전극 및 기질 사이에 전류 또는 전압 파형을 인가하여, 이로써 분자가 세포막에 일시적으로 형성된 구멍을 통하여 세포 내로 들어가는 것
    을 포함하는, 세포로의 분자 전달 방법.
  13. 제12항에 있어서, 나노와이어가 전기 전도성 층으로 코팅된 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  14. 제12항에 있어서, 분자가 DNA, RNA, 단백질, 다당류, 또는 작은 분자인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  15. 제12항에 있어서, 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  16. 제15항에 있어서, 진핵 세포가 일차 세포, 형질전환 세포, 또는 암세포인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  17. 제16항에 있어서, 일차 세포가 뉴런, 신경모세포, 베타 세포, 근육세포, 조골세포, 섬유아세포, 각질세포, 단핵구, 면역 세포, 줄기 세포, 또는 난모세포인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  18. 제12항에 있어서, 전압 파형의 진폭이 0.1-10 V인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  19. 제18항에 있어서, 진폭이 3-7 V인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  20. 제19항에 있어서, 진폭이 4-6 V인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  21. 표면을 가지는 기질 및 각각 제1 단부 및 제2 단부를 갖는 다수의 전기 전도성 나노와이어 (기질 및 각 나노와이어는 각 나노와이어의 제1 단부 및 제2 단부를 제외하고는 전기 절연 층으로 코팅되고, 제1 단부는 표면에 부착되고 제2 단부는 전기 전도 층으로 코팅됨)를 제공하는 것;
    하나 이상의 나노와이어가 세포 내로 침투되도록 분자를 포함하는 배쓰 용액에 담그어진 세포와 나노와이어를 접촉시키는 것; 및
    하나는 각 나노와이어의 제1 단부에 연결되고 다른 것은 배쓰 용액에 위치하는 두 전극 사이에 전류 또는 전압 파형을 인가하여, 이로써 분자가 세포막에 일시적으로 형성된 구멍을 통하여 세포 내로 들어가는 것
    을 포함하는, 세포로의 분자 전달 방법.
  22. 제21항에 있어서, 분자가 DNA, RNA, 단백질, 다당류, 또는 작은 분자인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  23. 제21항에 있어서, 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  24. 제23항에 있어서, 진핵 세포가 일차 세포, 형질전환 세포, 또는 암세포인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  25. 제23항에 있어서, 일차 세포가 뉴런, 신경모세포, 베타 세포, 근육세포, 조골세포, 섬유아세포, 각질세포, 단핵구, 면역 세포, 줄기 세포, 또는 난모세포인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  26. 제21항에 있어서, 전압 파형의 진폭이 0.1-10 V인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  27. 제26항에 있어서, 진폭이 3-7 V인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
  28. 제27항에 있어서, 진폭이 4-6 V인 것인 세포로의 분자 전달 방법.
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