CN110499332B - 用于为细胞递送目标物的自供电系统及方法 - Google Patents

用于为细胞递送目标物的自供电系统及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于为细胞递送目标物的自供电系统，包括：摩擦纳米发电机，用于产生交流脉冲电；整流桥，用于将所述交流脉冲电转换为直流脉冲电；第一电极，与所述整流桥的正输出端相连；第二电极，与所述整流桥的负输出端相连，其中，所述第一电极与第二电极之间存在脉冲电场，且还放置有包含有目标物和细胞的缓冲液，所述细胞在所述脉冲电场的作用下进行电穿孔，使得所述目标物进入细胞中。此外，本发明还提供了一种用于为细胞递送目标物的自供电方法。本发明通过摩擦纳米发电机和整流桥，产生直流脉冲电，实现自供电，同时，还利用直流脉冲电对细胞进行电穿孔产生瞬时孔，从而递送目标物进入细胞。

Description

用于为细胞递送目标物的自供电系统及方法
技术领域
本发明涉及目标物递送领域，尤其涉及一种用于为细胞递送目标物的自供电系统及方法。
背景技术
基于蛋白质和核酸的生物治疗药物在许多疾病的治疗中具有重要作用。然而，将外源物质(小分子、蛋白、遗传物质等)高效地递送到细胞内是富有挑战性的。电穿孔是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术。通过高强度的电场作用，在细胞膜表面产生瞬时孔，使外源分子进入细胞。由于电穿孔过程不依靠生物化学过程，因此可以避免溶酶体降解，减少免疫刺激，有利于提高递送效率其不改变细胞特性。但是传统的电穿孔所需的电压高，所以细胞的高转染率和高活力很难同时实现。此外，传统的电刺激器价格昂贵，不易携带，需要外部电源供给。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种用于为细胞递送目标物的自供电系统及方法，以解决上述的至少一项技术问题。
(二)技术方案
本发明的一方面，提供了一种用于为细胞递送目标物的自供电系统，包括：
摩擦纳米发电机，用于产生交流脉冲电；
整流桥，用于将所述交流脉冲电转换为直流脉冲电；
第一电极，与所述整流桥的正输出端相连；
第二电极，与所述整流桥的负输出端相连；
其中，所述第一电极与第二电极之间存在脉冲电场，且还放置有包含有目标物和细胞的缓冲液，所述细胞在所述脉冲电场的作用下进行电穿孔，使得所述目标物进入细胞中。
在本发明一些实施例中，所述摩擦纳米发电机为转盘式摩擦发电机。
在本发明一些实施例中，所述转盘式摩擦发电机包括：
固定部件，包括第一摩擦导电单元与第二摩擦导电单元，且所述第一摩擦导电单元包括由导电单体组成的第三电极，所述第二摩擦导电单元包括由导电单体组成的第四电极；
与所述固定部件同心对应放置的旋转部件，包括摩擦单元；
其中，所述固定部件与旋转部件发生转动摩擦，第三电极和第四电极上产生电势差，得到所述交流脉冲电。
在本发明一些实施例中，所述固定部件还包括支撑层，贴合于所述摩擦导电单元的外侧，为所述摩擦导电单元提供支撑；和/或
所述旋转部件还包括：
缓冲层，贴合于摩擦单元的外侧，用于缓冲在旋转部件转动时所述摩擦单元受到的压力；和/或
支撑层，贴合于缓冲层的外侧，为所述摩擦单元和缓冲层提供支撑；和/或
摇杆，贴于旋转部件支撑层的中心处，通过手摇控制旋转部件的转动。
在本发明一些实施例中，所述第一电极和/或第二电极为多孔电极；所述多孔电极的长度为0.1～3cm，宽度为0.1～3cm，厚度为1～50mm，孔径为50～2000μm。
在本发明一些实施例中，所述多孔电极为表面覆盖有导电聚合物和/或导电纳米线的多孔金属，所述导电聚合物为聚3，4-乙撑二氧噻吩/聚苯乙烯磺酸盐、聚吡咯、聚噻吩及其衍生物中的一种；所述导电纳米线为银纳米线和/或碳纳米管；所述多孔金属的材料为镍、铜、铝、钛、铁镍合金、钴镍合金中的一种。
在本发明一些实施例中，所述第一电极与第二电极的间距为0.1～10mm。
在本发明一些实施例中，所述直流脉冲电的频率为1～40Hz，电压为5～200V，脉冲个数为5～500。
在本发明一些实施例中，所述缓冲液的细胞浓度为10-200万/ml；和/或
所述细胞包括哺乳动物细胞；和/或
所述目标物为小分子物质、大分子物质、蛋白物质和基因物质中的至少一种。
本发明的另一方面，还提供了一种用于为细胞递送目标物的自供电方法，应用于以上任一所述的用于为细胞递送目标物的自供电系统，在所述脉冲电场的作用下，对所述细胞进行电穿孔，使得所述目标物进入细胞中。
(三)有益效果
本发明的用于为细胞递送目标物的自供电系统及方法，相较于现有技术，至少具有以下优点：
1、利用摩擦纳米发电机高电压、低电流输出的特点，代替传统的电刺激仪提供电穿孔所需的电脉冲，使整个自供电系统小型化，节约成本，节能经济。
2、同时通过将多孔结构电极引入到电穿孔体系中，可以明显降低电穿孔过程中所需的电压，在提高目标物(可以作为药物)递送效率的同时，减小对细胞的伤害。
3、多孔电极上覆盖有导电聚合物和导电纳米线，可以增强细胞的生物相容性和增强场强，能够快速实现对细胞的电穿孔，使得细胞产生瞬时孔，从而提高目标物递送的效率。
附图说明
图1为本发明实施例的用于为细胞递送目标物的自供电系统的结构示意图。
图2(a)为本发明实施例的固定部件的结构示意图。
图2(b)为本发明实施例的旋转部件的结构示意图。
图3(a)和图3(b)为本发明实施例的直流脉冲电的开路电流和短路电流的示意图。
图4(a)和图4(b)为不同比例下的泡沫镍的扫描电镜(SEM)图。
图4(c)和图4(d)为不同比例下表面包覆PEDOT：PSS和银纳米线后的泡沫镍的扫描电镜(SEM)图。
图4(e)和图4(f)为不同比例下银纳米线的透射电镜(TEM)图和高分辨像。
图5为实施例1向人乳腺癌MCF-7细胞中递送碘化丙啶(PI)分子的效率及细胞活力的结果示意图。
图6为实施例2向MCF-7细胞中递送异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(葡聚糖-FITC，分子量为10kD)的效率及细胞活力的结果示意图。
具体实施方式
基于现有技术的电穿孔所需的电压高，细胞的高转染率和高活力很难同时实现，且传统的电刺激器价格昂贵，不易携带，需要外部电源供给的技术缺陷，本发明提供了一种用于为细胞递送目标物的自供电系统，利用摩擦纳米发电机高电压、低电流输出的特点，代替传统的电刺激仪提供电穿孔所需的电脉冲，使得整个自供电系统小型化，节约成本，节能经济。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
图1为本发明实施例的用于为细胞递送目标物的自供电系统的结构示意图，如图1所示，该系统包括摩擦纳米发电机、整流桥、第一电极、第二电极、以及放置于两个电极之间的缓冲液。摩擦纳米发电机，产生交流脉冲电，并将交流脉冲电输出至整流桥；整流桥将所述交流脉冲电转换为直流脉冲电；第一电极，与所述整流桥的正输出端相连；第二电极，与所述整流桥的负输出端相连；其中，所述第一电极与第二电极之间存在脉冲电场，且还放置有包含有目标物(可以作为药物)和细胞的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)，所述细胞在所述脉冲电场的作用下进行电穿孔，产生瞬时孔，使得所述目标物进入细胞中。
在本发明的一些实施例中，所述第一电极和/或第二电极优选为多孔电极。为了保证两个电极对细胞的生物相容性，电极应选择稳定的材料，其材料可以为镍、铜、铝、钛、铁镍合金、钴镍合金中的一种。举例来说，选择泡沫镍作为第一电极和/或第二电极，代替传统的片状电极，可以增强局部场强，明显降低电穿孔过程中所需的电压，在提高目标物递送效率的同时，减小对细胞的伤害。
为了提高生物相容性，减小多孔电极的细胞毒性，还可以在多孔电极上覆盖导电聚合物，例如聚3，4-乙撑二氧噻吩/聚苯乙烯磺酸盐(PEDOT：PSS)、聚吡咯、聚噻吩及其衍生物中的一种。此外，还可以在多孔电极表面包覆导电纳米线(例如银纳米线和/或碳纳米管)，一维结构的导电纳米线，会使尖端场强增大，在一定程度上会降低电穿孔所需的电压，有利于提高细胞活力。
一般来说，所述多孔电极的长度为0.2～3cm，宽度为0.2～3cm，厚度为1～30mm，孔径为50～2000μm。
需要注意的是，第一电极与第二电极之间存在一定间距，用于放置缓冲液，间距优选为0.1～2mm。
摩擦纳米发电机可以选择转盘式摩擦发电机或者其他类型的摩擦发电机，接着就以转盘式摩擦发电机为例，结合图2(a)和图2(b)进行说明。
在本发明实施例中，摩擦纳米发电机包括固定部件和旋转部件。如图2(a)所示，固定部件包括第一摩擦导电单元与第二摩擦导电单元。旋转部件，与固定部件同心对应放置，如图2(b)所示，旋转部件包括摩擦单元。所述旋转部件和固定部件上还可以设有同心圆孔，使所述旋转部件与固定部件同心转动。
其中，两个摩擦导电单元包括多个导电单体(优选为20个，即每个摩擦导电单元包括10个导电单体)，其中第一摩擦导电单元中的导电单体与第二摩擦导电单元中的导电单体优选等间隔交叉环形排列(也可以不等间隔)，第一摩擦导电单元中的导电单体首端连接形成第三电极，第二摩擦导电单元中的导电单体尾端连接形成第四电极。在本发明中，导电单体的首段可以为靠近圆周的一端，也可以为靠近圆心的一端，在此不作限制。
所述旋转部件在旋转过程中，旋转部件与固定部件相对转动，第三电极和第四电极上产生电势差。所述摩擦导电单元还包括摩擦层，贴合于所述第三电极和第四电极的表面，在旋转部件转动的过程中，与所述摩擦单元发生转动摩擦。
所述固定部件还可以包括支撑层，贴合于所述摩擦导电单元的外侧，为所述摩擦导电单元提供支撑。
所述旋转部件还可以包括缓冲层、支撑层和摇杆。缓冲层贴合于摩擦单元的外侧，用于缓冲在旋转部件转动时所述摩擦单元受到的压力，使各摩擦单体之间接触更为均匀稳定，其中，缓冲层一般为海绵或其他回弹性好的材料，厚度可以为2mm；支撑层贴合于缓冲层的外侧，为所述摩擦单元和缓冲层提供支撑；摇杆贴于旋转部件支撑层的中心处，可通过手摇控制旋转部件的转动。相应地，所述摩擦单元可以包括10个摩擦单体，各所述摩擦单体对应所述第三电极或第四电极的导电单体排列。
如此，所述转盘式摩擦发电机的摩擦导电单元与摩擦单元发生转动摩擦，所述摩擦导电单元上产生交流脉冲电，经过整流桥转化为直流脉冲电，图3(a)和图3(b)为本发明实施例的直流脉冲电的开路电流和短路电流的示意图。一般来说，所述直流脉冲电的频率为2～40Hz，电压为5～200V，脉冲个数为5～500。正极与第一电极连接，负极与第二电极连接，对分散在两个电极之间的细胞产生脉冲电场，达到电穿孔效果。
细胞悬浮在携带有目标物的缓冲液中，缓冲液的细胞浓度优选为10-200万/ml，所述细胞可以为哺乳动物细胞或者其他，所述目标物可以为小分子物质、大分子物质、蛋白物质和基因物质中的至少一种。
在本发明实施例中，在PCB板表面均匀的覆盖一层铜，厚度为0.5mm，然后根据图案要求，等间隔去除一部分PCB板，形成所需的摩擦导电单元或摩擦单元。其中，摩擦导电单元所用的PCB板为硬板，摩擦单元所用的PCB板为软板。
图4(a)和图4(b)为不同比例下的泡沫镍的扫描电镜(SEM)照片，图4(c)和图4(d)为不同比例下表面包覆PEDOT：PSS和银纳米线后的泡沫镍的扫描电镜(SEM)照片，图4(e)和图4(f)为银纳米线的透射电镜(TEM)照片和高分辨像。
对比图4(a)和图4(c)中可知，泡沫镍表面包覆PEDOT：PSS和银纳米线之后，颜色变为黑色；从图1中的扫描电镜(SEM)图可知，表面包覆PEDOT：PSS和银纳米线后基本不影响泡沫镍的孔径大小，但复合后的泡沫镍表面会更加粗糙，而且表面可以看到一些分散的银纳米线。从图4(e)中可知，银纳米线的直径约为50nm。
以下，将结合实施例1和实施例2对本发明的用于为细胞递送目标物的自供电系统的效果进行说明。
实施例1
将多孔电极经过75％酒精浸泡30min后，紫外照射杀菌30min，然后用PBS清洗3次。将多孔电极置于1*1*0.3cm的孔槽中，并与摩擦纳米发电机整流后的正极连接，与泡沫镍电极平行放置的铝电极与摩擦纳米发电机整流后的负极连接。之后将MCF-7细胞消化并分散在含有0.1mg/ml碘化丙啶(PI)的PBS缓冲液中，细胞密度为200万/ml。吸取200ul细胞悬液加入到放有多孔电极的孔槽中。然后通过手摇或用电机带动摩擦纳米发电机的摩擦层转动，转速为1转/秒，共10秒，对泡沫镍电极中的细胞进行200个脉冲的电刺激，对照组不进行电刺激，孵育15min后，将细胞离心，并用PBS缓冲液清洗后，重新接种于共聚焦皿中，15小时后，通过钙黄绿素染色，用于表征细胞的活力，然后通过共聚焦显微镜观察，结果如图5所示，图中PI为递送的外源物质，钙黄绿素染活细胞，从图5以及统计结果可以看出，所述自供电电穿孔系统对碘化丙啶的递送效率约为89.26％，同时，细胞仍保持较高的活力，死亡率约为5.93％。
实施例2
实施例2的方法参照实施例1，与实施例1之间的区别具体如下：
将实施例1中递送的PI分子变为分子量为10kD的葡聚糖-FITC，浓度为0.5mg/ml；实施例中通过钙黄绿素染色表征细胞活力变为使用PI进行死细胞染色表征细胞活力。结果如图6所示，图中葡聚糖-FITC为递送情况，PI染色表明细胞为死细胞。从图6以及统计结果可以看出，所述自供电电穿孔系统对分子量为10kD的葡聚糖-FITC的递送效率约为80.32％，细胞死亡率约为6.42％，表明所述自供电电穿孔系统在保持较高递送效率的同时，有利于提高细胞的活力。
通过以上两个实施例，利用摩擦纳米发电机高电压，低电流输出的特点，代替传统的电刺激仪提供电穿孔所需的电脉冲，使整个系统小型化，节约成本，节能经济。使用多孔结构电极代替传统电穿孔使用的平面电极，可以明显降低电穿孔过程中所需的电压，在提高目标物(可以作为药物)递送效率的同时，减小对细胞的伤害。因此，该自供电目标物递送系统在目标物递送领域具有广阔的应用前景。
本发明实施例的另一方面，还提供了一种用于为细胞递送目标物的自供电方法，应用于前述的用于为细胞递送目标物的自供电系统，在所述脉冲电场的作用下，对所述细胞进行电穿孔，使得所述目标物进入细胞中。该方法大致流程为：
S1、将所述第一电极灭菌后置于大小合适的孔槽中，并与所述摩擦纳米发电机整流后的正极连接，与第一电极平行放置的第二电极与摩擦纳米发电机整流后的负极连接。
S2、将细胞分散在含有目标物的PBS缓冲液中。吸取合适体积的细胞悬液加入到放至孔槽中。
S3、摩擦纳米发电机的摩擦层相互摩擦产生交流脉冲电，经整流桥作用后，对分散在两个电极之间的细胞进行电刺激，在细胞表面产生瞬时孔，使环境中的目标物进入细胞。
S4、孵育5-30min后，将细胞离心，并用PBS清洗后重新接种。
综上，本发明的用于为细胞递送目标物(例如作为药物)的自供电系统及方法，利用摩擦纳米发电机高电压、低电流输出的特点，代替传统的电刺激仪提供电穿孔所需的电脉冲，使整个自供电系统小型化，节约成本，节能经济。此外，本发明通过将采用表面覆盖有导电聚合物和导电纳米线多孔电极，能够减小对细胞的伤害、以及提高目标物递送的效率。
除非有所知名为相反之意，本说明书及所附权利要求中的数值参数是近似值，能够根据通过本发明的内容所得的所需特性改变。具体而言，所有使用于说明书及权利要求中表示组成的含量、反应条件等等的数字，应理解为在所有情况中是受到“约”的用语所修饰。一般情况下，其表达的含义是指包含由特定数量在一些实施例中±10％的变化、在一些实施例中±5％的变化、在一些实施例中±1％的变化、在一些实施例中±0.5％的变化。
再者，“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。位于元件之前的“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。
说明书与权利要求中所使用的序数例如“第一”、“第二”、“第三”等的用词，以修饰相应的元件，其本身并不意味着该元件有任何的序数，也不代表某一元件与另一元件的顺序、或是制造方法上的顺序，该些序数的使用仅用来使具有某命名的一元件得以和另一具有相同命名的元件能做出清楚区分。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于为细胞递送目标物的自供电系统，其中，包括：
摩擦纳米发电机，用于产生交流脉冲电；
整流桥，用于将所述交流脉冲电转换为直流脉冲电；
第一电极，与所述整流桥的正输出端相连；
第二电极，与所述整流桥的负输出端相连；
其中，所述第一电极与第二电极之间存在脉冲电场，且还放置有包含有目标物和细胞的缓冲液，所述细胞在所述脉冲电场的作用下进行电穿孔，使得所述目标物进入细胞中；
其中，所述直流脉冲电的频率为1～40Hz，电压为5～200V，脉冲个数为5～500；
其中，所述第一电极和/或第二电极为多孔电极；所述多孔电极的长度为0.1～3cm，宽度为0.1～3cm，厚度为1～50mm，孔径为50～2000μm；
所述多孔电极为表面覆盖有导电聚合物和/或导电纳米线的多孔金属，所述导电聚合物为聚3，4-乙撑二氧噻吩/聚苯乙烯磺酸盐、聚吡咯、聚噻吩及其衍生物中的一种；所述导电纳米线为银纳米线、铜纳米线、碳纳米管中的一种或一种以上；所述多孔金属的材料为镍、铜、铝、钛、铁镍合金、钴镍合金中的一种。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述摩擦纳米发电机为转盘式摩擦发电机。
3.根据权利要求2所述的系统，其中，所述转盘式摩擦发电机包括：
固定部件，包括第一摩擦导电单元与第二摩擦导电单元，且所述第一摩擦导电单元包括由导电单体组成的第三电极，所述第二摩擦导电单元包括由导电单体组成的第四电极；
与所述固定部件同心对应放置的旋转部件，包括摩擦单元；
其中，所述固定部件与旋转部件发生转动摩擦，第三电极和第四电极上产生电势差，得到所述交流脉冲电。
4.根据权利要求3所述的系统，其中：
所述固定部件还包括支撑层，贴合于所述摩擦导电单元的外侧，为所述摩擦导电单元提供支撑；和/或
所述旋转部件还包括：
缓冲层，贴合于摩擦单元的外侧，用于缓冲在旋转部件转动时所述摩擦单元受到的压力；和/或
支撑层，贴合于缓冲层的外侧，为所述摩擦单元和缓冲层提供支撑；和/或
摇杆，贴于旋转部件支撑层的中心处，通过手摇控制旋转部件的转动。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中，所述第一电极与第二电极的间距为0.1～10mm。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中，所述缓冲液的细胞浓度为10-200万/ml；和/或
所述细胞包括哺乳动物细胞；和/或
所述目标物为小分子物质、大分子物质、蛋白物质和基因物质中的至少一种。
7.一种用于为细胞递送目标物的自供电方法，应用于如权利要求1至4中任一所述的用于为细胞递送目标物的自供电系统，在所述脉冲电场的作用下，对所述细胞进行电穿孔，使得所述目标物进入细胞中。
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