JP4588719B2 - バイオチップ型エレクトロポレーター、及び多重的なサイトでの単一細胞のエレクトロポレーションにおける使用 - Google Patents
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Description
(i)細胞集団のエレクトロポレーション用の技術
(ii)単一細胞のエレクトロポレーション用の技術
上記の第1のクラスの代表として最も頻繁に用いられる懸濁液中の細胞集団のエレクトロポレーションは、トリプシンなどの酵素を用いて培養基質から細胞を除去した後に、規定通り行われる。その後、細胞をエレクトロポレーション用媒体に懸濁し、通常2〜4mmの間隔で配置された2つの大型の金属電極間に高電圧(最大1000V又はそれ以上)を印加する。この細胞懸濁液は、その後、適当な培養チャンバーに移動され、ここで、細胞は、培養される下部の基質上に沈降し且つ接着するように、自由となる。
単一細胞のエレクトロポレーション用の技術は、Rubinskyらによる特許文献1で開発されていた。
接着細胞に対するエレクトロポレーション
同様の培養における複数の異なる単一細胞に対するエレクトロポレーション
各標的細胞用に任意に選択されたタイミングでのエレクトロポレーション
個々の細胞/マイクロ電極の電気的接続性を介して細胞膜を横切って展開する電圧を制御することによる、各標的細胞毎に制御したエレクトロポレーションの頻度(ポア数、寸法及び期間)
異なるマイクロ電極を覆うのに十分大きな細胞の場合、異なるマイクロ電極を使用した同様の細胞についての異なる部位におけるエレクトロポレーション
接着状態に到達した後に細胞を培養するステップと;
上述の細胞の少なくともひとつの単一細胞にエレクトロポレーションを施される少なくともひとつの化合物を培地に添加するステップと;
少なくともひとつの単一細胞を選択し、選択された単一細胞が接着している少なくともひとつのマイクロ電極を選択するステップと;
少なくともひとつの単一細胞にエレクトロポレーションを施される少なくともひとつの化合物をエレクトロポレーションするのに適当で、且つ選択された単一細胞が接着している少なくともひとつのマイクロ電極に電気信号を駆動するのに適当な、少なくともひとつの電気信号を発生させるステップと;
からなる。
オリゴヌクレオチドを用いたCos−7細胞のトランスフェクション
この実験の目的は、二本鎖のDNAオリゴヌクレオチドを用いた、個々の標的細胞へのトランスフェクションである。
本発明による方法を用いて行った他の実験において、その目的は、DNAプラスミドベクターを用いた、個々の標的細胞へのトランスフェクションである。
ラット海馬ニューロンの蛍光物によるエレクトロポレーション
3番目の実験として、本発明による装置を用いて蛍光物によるラット海馬ニューロンのエレクトロポレーションを行った。
エレクトロポレーション中の細胞の電気生理学的活動(Cos−7細胞、ラット海馬ニューロン)
標的細胞をパッチクランプ型電極に接触させた。全細胞の配置を構築した後、細胞内ポテンシャルをモニターした。対応するマイクロ電極に適当なエレクトロポレーション信号を印加することにより、細胞内電圧が一時的に0mVにまで上昇した(この細胞のポテンシャルは、約−70mVと、負の値である)。エレクトロポレーションによるポアの形成と、接地された外部電解質との連続的で電気的な導通とに起因して、この一時的な電圧上昇は、緩徐に低下し、細胞は、1〜2分以内に、静止電位に完全に戻った。これは、ポアの再封鎖に必要な時間と同様のものである。外部電解質から細胞内への蛍光物質(小型蛍光色素)の侵入により、ポアの形成を観察した。
11 スイッチングシステム
12 波形発生器
13 バイオチップ
20 マイクロ電極
21 誘電支持体
22 コネクタ
23 ワイヤボンディング
24 細胞培養チャンバー
25 電極
26 開口部
27 固形基板
28 導電性導線
29 導電パッド
31 基板
32 絶縁層
33 窒化チタン層
34 アルミニウム層
35 絶縁層
36 窒化シリコン層
37 金層
38 接続導線
40 基板
41 n-ドープ領域
42 n-ドープ領域
43 ゲート
44 金属ライン
45 絶縁酸化物
46 プラグ
47 金層
48 保護層
50 マイクロ電極
51 ソース
52 ドレイン
53 ワード線
54 ゲート
55 ビット線
60 絶縁基板
61 導電層
62 絶縁材料
63 保護層
64 絶縁層
Claims (23)
- 波形発生器と、マイクロ電極のアレイを有するバイオチップと、該バイオチップの前もって選択された単一のマイクロ電極に信号を伝送し得る制御システムとを有することを特徴とするエレクトロポレーション用の装置であって、
前記バイオチップは、エレクトロポレーションを施されるべき細胞に寸法適合し得るマイクロ電極のアレイを有し、
該マイクロ電極のそれぞれは、互いに分離して駆動され、エレクトロポレーションの工程を非常に正確に規定通りの制御を可能とすることを特徴とする、前記装置。 - 前記制御システムは、種々の波形信号を設計し得るソフトウェアプログラムを装備したパーソナルコンピュータと、前記波形発生器の出力を制御するスイッチングシステムとからなることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 固形基板上に配設された適当な絶縁層上に備えられたエレクトロポレーションを施されるべき細胞に寸法適合し得る個々に駆動されるマイクロ電極のアレイと;
前記マイクロ電極をスイッチングシステムに電気的に接続する手段と;
前記固形基板上の前記のマイクロ電極のアレイを含む前記絶縁層で形成された表面上に前記のマイクロ電極のアレイと接触して細胞が成長し且つ接着し得る細胞培養チャンバーと;
を有し、かつ、
前記固形基板は、エレクトロポレーションを施されるべき細胞に寸法適合し得る前記の個々に駆動するマイクロ電極のアレイを有する、絶縁層で覆われた半導体基板である
ことを特徴とするバイオチップ。 - 前記固形基板は、誘電材料製の支持体(21)上に開口部(26)を有する細胞培養チャンバー(24)を取り付けており、前記マイクロ電極(20)は、導電性導線(28)を介して、電気的に接続された導電パッド(29)に電気的に接続され、前記開口部(26)を取り囲む前記細胞培養チャンバー(24)の外側部で覆われたワイヤボンディング(23)を介して外部平行コネクタ(22)の対に電気的に接続され、
前記の開口部(26)を有する細胞培養チャンバー(24)は、絶縁層(27)で覆われた前記半導体基板の上部上に配設され、両者は、前記誘電支持体(21)上に付着されていることを特徴とする請求項3に記載のバイオチップ。 - 絶縁層(27)で覆われた前記半導体基板に一体化され、基底規準として作用する、2つのさらなる電極(25)を有することを特徴とする請求項4に記載のバイオチップ。
- 絶縁層(27)で覆われた前記半導体基板は、好ましくはSiO2製の絶縁層で覆われたシリコン基板であることを特徴とする請求項4に記載のバイオチップ。
- 前記固形基板は、透過性を有することを特徴とする請求項4に記載のバイオチップ。
- 前記誘電支持体は、塩化ビフェニル、ガラス又はセラミックであることを特徴とする請求項4に記載のバイオチップ。
- 前記アレイの各マイクロ電極(20)は、細胞膜の全体の少なくとも10%の表面を有する寸法であり、好ましくは、半径が1μm以上50μm以下であることを特徴とする請求項4に記載のバイオチップ。
- 前記マイクロ電極は、導電型又は容量型であることを特徴とする請求項3乃至9のいずれか一項に記載のバイオチップ。
- 前記マイクロ電極は、好ましくはSiO2製の絶縁層(32)で覆われたシリコン基板(31)上に得られる導電性のマイクロ電極からなるマイクロ電極であって、
当該マイクロ電極、及び接続導線(38)は、2つの窒化チタン層であるTiN層(33)とアルミニウム層(34)との挟まれた構造からなり、活性表面上に金層(37)で覆われていることを特徴とする請求項10に記載のバイオチップ。 - 前記マイクロ電極は、金属酸化物半導体MOS技術を用いて実現されていることを特徴とする請求項10に記載のバイオチップ。
- 前記マイクロ電極は、2つのn−ドープ領域であるドレイン(41)、及びソース(42)が従来のマイクロエレクトロニクス技術で埋め込まれ、且つ行(ワード線)において全ての装置に共通な、シリコン製のp型の基板(40)からなるマイクロ電極であって、
これらの電極のゲート(43)は、n+ドープポリシリコンで実現され、
列において全ての装置のドレイン(41)は、金属接触プラグ及び金属ライン(44)を用いて接続され、
トランジスタのソース(42)は、通常はタングステンである金属プラグ(46)を介して活性電極として作用する金層(47)に接続されていることを特徴とする請求項12に記載のバイオチップ。 - 前記マイクロ電極は、絶縁基板(60)と、金属(61)と、薄い絶縁層(64)とから得られる容量型のマイクロ電極からなるマイクロ電極であって、
当該マイクロ電極は、絶縁材料(62)で分離され、且つ保護層(63)により非曝露領域において覆われていることを特徴とする請求項10に記載のバイオチップ。 - 請求項1乃至2のいずれか一項に記載の装置を用いることを特徴とするエレクトロポレーション方法。
- 前記装置は、少なくとも単一の接着性細胞に1回以上のエレクトロポレーションを施すことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記装置は、請求項3乃至10のいずれか一項に記載のバイオチップを有することを特徴とする請求項16に記載の方法。
- 前記バイオチップは、請求項11乃至14のいずれか一項に記載のマイクロ電極を有することを特徴とする請求項15乃至17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記波形発生器は、種々の振幅及び継続時間のパルスの波形を前記の電極に伝送することを特徴とする請求項15乃至18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記波形発生器は、500msの時間間隔で25パルスで1msの継続時間の波形を前記マイクロ電極に伝送することを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記の電極に、1つの波形と他の波形とが5sの間隔で、10パルスからなる三角形の電圧波形を印加することを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 接着状態に到達した後に細胞を培養するステップと;
前記細胞の少なくともひとつの単一細胞にエレクトロポレーションを施される少なくともひとつの化合物を培地に添加するステップと;
少なくともひとつの単一細胞を選択し、選択された単一細胞が接着している少なくともひとつのマイクロ電極を選択するステップと、
少なくともひとつの単一細胞にエレクトロポレーションを施される少なくともひとつの化合物をエレクトロポレーションを施し得る、且つ選択された単一細胞が接着している少なくともひとつのマイクロ電極に電気信号を駆動し得る、少なくともひとつの電気信号を発生させるステップと;
を有することを特徴とする請求項15乃至21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記のエレクトロポレーションを施される化合物は、薬物、遺伝子構築物及びタンパク質であることを特徴とする請求項22に記載の方法。
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