CN101486964B - 一种基于微流控芯片的细胞电穿孔方法及专用芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微流控芯片的细胞电穿孔方法及专用芯片，其步骤包括：1)在样品进样口内注入细胞悬液，同时在正极高电导率溶液进样口和负极高电导率溶液进样口内注入高电导率溶液；来自三个进样口的溶液在样品通道中形成流动聚焦区域；将电源正极连接正极高电导率溶液进样口或正极高电导率溶液出样口，电源负极连接负极高电导率溶液进样口或负极高电导率溶液出样口；2)调整细胞悬液和高电导率溶液的流速比，使得流动聚焦区域内细胞悬液的宽度与细胞的尺寸相匹配；3)接通电源；实现细胞悬浊液中的细胞电击穿；4)在样品通道的出样口收集细胞悬液。本发明使细胞分析测试实验的使用成本和分析成本均显著降低，为分析实验室的个人化和小单位化创造了条件。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞分析技术，特别关于一种基于微流控芯片的细胞电穿孔方法及专用芯片。
背景技术
微流控芯片(Microfluidic chip)是近几年飞速发展的领域，它以分析化学为研究分析手段，以微机电加工方法为加工手段，以微米尺度的管道作为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象。微流体芯片技术的目标是把采样、稀释、加试剂、反应、分离和检测等实验室功能集成在一个微芯片上(Lab on a Chip)。微流体芯片相对于普通检测分析设备具有许多优势，例如分析装备的体积小，效率高，容易集成，反应速度快，平行处理程度高，同时试样和试剂的消耗显著下降。
世界上第一个用于毛细管电泳的微流体器件由英国帝国大学的A.Manz在1992年研制成功。美国橡树岭国家实验室的M.Ramsey等科学家在1995年发表的论文中改进了芯片毛细管电泳的进样方法，该方法提高了性能和实用性，使得微流体芯片得到了广大的关注。在接下来的几年中，哈佛大学的G.M.Whitesides等人又提出了一种“软光刻”微加工方法，即在PDMS等有机材料上印制、成型出微结构，从而能方便的加工原型器件和专用器件。
目前，国内外利用微流控芯片进行细胞电穿孔的方法还处于探索和实验阶段，已有的微流控芯片电穿孔方法需要制作微加工的电极，并且利用昂贵的脉冲电源或高压直流电源，成本高，操作繁杂，芯片使用寿命短，不利于微流控芯片大规模的推广应用和产业化。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种不需要制作微电极即可实现细胞电穿孔的基于微流控芯片的细胞电穿孔方法及专用芯片。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于微流控芯片的细胞电穿孔方法，其步骤包括：1)在样品进样口内注入细胞悬液，同时在正极高电导率溶液进样口和负极高电导率溶液进样口内注入高电导率溶液；来自三个进样口的溶液在样品通道中形成流动聚焦区域；将电源正极连接正极高电导率溶液进样口或正极高电导率溶液出样口，电源负极连接所述负极高电导率溶液进样口或负极高电导率溶液出样口；2)调整所述细胞悬液和高电导率溶液的流速比，使得所述流动聚焦区域内细胞悬液的宽度与细胞的尺寸相匹配；3)接通所述电源；实现细胞悬浊液中的细胞电击穿；4)在所述样品通道的出样口收集细胞悬液。
所述流动聚焦区域内两侧的高电导率溶液挤压中间的细胞溶液，形成流向一致、界限明显、状态稳定的三层流动。
一种基于微流控芯片的细胞电穿孔专用芯片，其特征在于：它包括一个样品通道、样品进样口、正极高电导率溶液进样口、负极高电导率溶液进样口、样品出样口、正极高电导率溶液出样口、负极高电导率溶液出样口；所述正极高电导率溶液进样口和负极高电导率溶液进样口分别在所述样品进样口两侧；所述正极高电导率溶液出样口和负极高电导率溶液出样口分别在所述样品出样口两侧；所述样品通道在所述样品进样口和样品出样口之间。
所述样品进样口和样品出样口的宽度分别为150μm和50μm。
所述高电导率溶液进样口和高电导率溶液出样口宽度均为150μm。
所述样品通道的长度为150μm，宽度为100μm。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明利用调整高电导率溶液和细胞悬液的流速比，在微流控芯片的样品通道内形成流向一致、界限明显、状态稳定的三层流动，因此可以对中间流层的细胞施加一个电场，细胞从这个电场中经过后受到一个电脉冲，从而不需要制作微电极即可完成细胞电穿孔。2、本发明的实现过程中只需要注射泵和低压直流电源即可完成微流控芯片细胞电穿孔，试验设备简单，且易于操作。3、本发明的芯片上流动聚焦结构简单，细胞样品和电导率溶液的需求量都很低，因此实验成本低廉。本发明使细胞分析测试实验的使用成本和分析成本均显著降低，为分析实验室的个人化和小单位化创造了条件。
附图说明
图1是本发明的微流控芯片结构示意图
图2是本发明的实验中导电离子的浓度与流层宽度的曲线示意图
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
在微流控芯片中，流体在管道内形成流层是一种常见的现象，流体间的物质交换主要依靠流层间交界面的扩散作用。本发明利用这种微流控芯片中的流层效应，将高电导率溶液和细胞悬液分别通过注射泵从三个进样口同时注入微流控芯片的样品通道内。其中细胞悬液通过中间的进样口注入样品通道，高电导率溶液通过两侧的进样口注入样品通道。来自三个进样口的流体在样品通道中的汇合处形成一个流动聚焦区域，流动聚焦区域内两侧的流体会挤压中间的流体，形成流向一致、界限明显、状态稳定的三层流动。通过调整注射泵的注入速度可以调整流动聚焦区域三层流动的流速比，获得不同宽度的细胞悬液流层，从而达到利用调整流速比来调整场强的目的。如常用高电导率溶液和细胞悬液的流速比设置为2，即细胞悬液的流速为1，高电导率溶液的流速为2。
这时将流动聚焦区域内两侧流层的流体分别与电源的正、负极相连，根据欧姆定律，每个流层的电压分布与每一流层的电阻成正比。由于流动聚焦区域内两侧流层的流体为高电导率溶液，此时电源的电压会绝大部分落在流动聚焦区域中间的细胞悬液流层上，形成一个稳定的电场。由于中间流层的宽度非常小，仅约5～20μm，所以一个1.5V的低电压电源便可产生一个约300～1000V/cm的强电场，当细胞悬液中的细胞快速的流过流动聚焦区域时，便会受到一个强场强的脉冲，从而实现细胞电穿孔。
如图1所示，本发明设计并制作了一个适合流动聚焦的微流控芯片，该流控芯片包括样品通道、样品进样口A、正极高电导率溶液进样口M+、负极高电导率溶液进样口M-、样品出样口B、正极高电导率溶液出样口N+、负极高电导率溶液出样口N-。其中正极高电导率溶液进样口M+和负极高电导率溶液进样口M-分别设置在样品进样口A的两侧，正极高电导率溶液出样口N+、负极高电导率溶液出样口N-分别设置在样品出样口B的两侧。样品通道在所述样品进样口A和样品出样口B之间。样品进样口A与样品出样口B的宽度分别为150μm和50μm，长度无特殊要求；样品通道的长度为150μm，宽度为100μm，与电极相连的高电导率溶液进样口和出样口宽度均为150μm，长度无特殊要求。
在操作时，用将细胞悬液注入样品进样口A，同时将高电导率溶液分别注入正极高电导率溶液进样口M+和负极高电导率溶液进样口M-。直流电源的正极可连接正极高电导率溶液通道的进样口M+或正极高电导率溶液通道的出样口N+处，将直流电源的负极可连接负极高电导率溶液通道的进样口M-或负极高电导率溶液通道的出样口N-处。直流电源的正、负极连接方式可有4种，分别为M+N-、M+M-、N+M-、N+N-，但实验表明，M+M-的连接方式结果比较稳定，因此本发明的实施例中采用这种连接方式。当来自不同进样口的流体在流动聚焦区域内形成稳定的三层流动后接通电源，通过调节样品进样口A、正极高电导率溶液进样口M+和负极高电导率溶液进样口M-中流体的流速比，从而在样品通道中的流动聚焦区域内产生需要的场强，实现细胞悬液中的细胞电击穿，并在样品通道的出样口B处收集细胞悬液。
下面以酵母菌细胞电穿孔为例，对本发明的方法进行进一步描述，包括以下步骤：
1)用注射泵将酵母菌细胞悬液注入微流芯片样品通道的进样口A，同时将高电导率的KCl溶液注入正极高电导率溶液进样口M+和负极高电导率溶液进样口M-。将直流电源的正极连接在正极高电导率溶液通道的出样口M+处，将直流电源的负极连接在负极高电导率溶液通道的进样口M-处。
2)调整通道中酵母菌细胞悬液和KCl溶液的流速比，从而调整流动聚焦区域内三个流层的宽度，使得中间流层的宽度与细胞悬液中细胞尺寸相匹配，避免出现细胞尺寸大于中间流层宽度的现象出现。
3)通过外接电源或电池对连接高电导率溶液的电极施加1.5V的低电压，以达到细胞电穿孔所需的场强。
4)在样品通道的出样口B处收集细胞悬液，取出部分细胞样品在荧光显微镜下进行观察并计数，对比明场图和荧光图便可得到细胞的穿孔效率。
如图2所示，实验结果测试中，当高电导率溶液和细胞悬液的流速比分别为1/2、1/1、3/2、2/1、5/2时，样品通道沿截面的导电离子浓度分布情况。可以看出流速比越大，细胞悬液被挤压的流层宽度越小，于是在给定电压情况下，细胞悬液处的场强就越大。
Claims (3)
1.一种基于微流控芯片的细胞电穿孔方法，其步骤包括：
1)在样品进样口内注入细胞悬液，同时在正极高电导率溶液进样口和负极高电导率溶液进样口内注入高电导率溶液；来自三个进样口的溶液在样品通道中形成流动聚焦区域；将电源正极连接正极高电导率溶液进样口，电源负极连接所述负极高电导率溶液进样口；
2)调整所述细胞悬液和高电导率溶液的流速比，使得所述流动聚焦区域内细胞悬液的宽度与细胞的尺寸相匹配；
3)接通所述电源；实现细胞悬浊液中的细胞电击穿；
4)在所述样品通道的出样口收集细胞悬液。
2.如权利要求1所述的一种基于微流控芯片的细胞电穿孔方法，其特征在于：所述流动聚焦区域内两侧的高电导率溶液挤压中间的细胞溶液，形成流向一致、界限明显、状态稳定的三层流动。
3.一种如权利要求1或2所述的基于微流控芯片的细胞电穿孔专用芯片，其特征在于：它包括一个样品通道、样品进样口、正极高电导率溶液进样口、负极高电导率溶液进样口、样品出样口、正极高电导率溶液出样口、负极高电导率溶液出样口；所述正极高电导率溶液进样口和负极高电导率溶液进样口分别在所述样品进样口两侧；所述正极高电导率溶液出样口和负极高电导率溶液出样口分别在所述样品出样口两侧；所述样品通道在所述样品进样口和样品出样口之间；所述样品进样口和样品出样口的宽度分别为150μm和50μm；所述高电导率溶液进样口和高电导率溶液出样口宽度均为150μm；所述样品通道的长度为150μm，宽度为100μm。
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