KR20130091720A

KR20130091720A - 악성종양 세포의 검출방법

Info

Publication number: KR20130091720A
Application number: KR1020137000647A
Authority: KR
Inventors: 히로유키 에비누마; 코헤이 타쿠보; 이사무 후카마치; 사이슈 요시다; 히데아키 부조; 치아키 나카세코; 야스시 사이토
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-08-19
Also published as: JP5879163B2; KR101879225B1; CN103003695A; WO2012008594A1; JPWO2012008594A1; JP4955836B2; EP2594943A4; EP2594943B1; US20130115229A1; CN103003695B; EP2594943A1; US9969802B2; JP2012144550A

Abstract

악성종양 세포 표면에 발현하고 있는 단백질 마커를 측정하는 것에 의한 악성종양 세포의 검출방법을 제공한다.
피험시료 중의 세포 표면의 LR11을 측정하는 것을 특징으로 하는 악성종양 세포의 검출방법.

Description

악성종양 세포의 검출방법 {METHOD FOR DETECTING MALIGNANT TUMOR CELLS}

본 발명은 악성종양 세포의 검출방법에 관한다.

종양 세포의 표면에 특이적으로 발현하고 있는 단백질은 환자의 말초혈(末梢血), 골수 세포, 조직 등을 이용한 암진단의 세포 표면 마커로서 유용하며, 그의 발현의 유무를 검사함으로써, 암치료의 효과 판정이나 재발의 모니터링에도 응용이 가능하다.

게다가 근년, 종양 세포의 표면에 특이적으로 발현하고 있는 단백질을 표적으로 한 항체 의약의 개발이 널리 행해지고 있다. 항체 의약에 의한 치료법은 정상세포에 발현하고 있지 않은지 또는 발현량이 극히 적은 항원을 표적으로서 선택하는 것으로, 정상세포에게 주는 영향이 최소한으로, 그리고 종양 세포에 선택성의 높은 치료 효과를 기대할 수 있는 치료법으로서 주목받고 있다. 항체 의약의 유효성분인 항체의 작용기서(메카니즘)는 다양하며, 예를 들면 B세포에 특이적으로 발현하고 있는 CD20 항원에 대해서 제작된 모노클로날 항체를 사용하는 B세포 임파종의 치료약인 리툭시맵(rituximab)은 종양 세포에 대해서, 아포토시스의 유도, 항체 의존성 세포 상해(antibody-dependent　cellular　cytotoxicity:ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해(complement-dependent　cytotoxicity:CDC) 활성 등의 작용을 가진다. 또한, 항CD20 모노클로날 항체에 방사성 동위 원소를 결합시킨 이트륨(⁹⁰Y) 이부리투모맵(iburitumomab) 치우키세탄은 항체에 의한 종양 세포에의 공격에 더하여 방사선에 의한 치료 효과가 기대되고, 재발이나 난치성 B임파종의 치료의 유용성이 확인되고 있다.

그러나, 종양 치료에 유용한 모노클로날 항체는 전이성 유방암, 급성 골수성 백혈병, 난치성 만성 임파종, 비호지킨림프종(non-Hodgkins's lymphoma), 다발성 골수종 등, 몇 개의 종양종에 한정되어 있는 것이 현상이다.

따라서, 암의 진단이나 항체 의약에 의한 암치료에 응용 가능한, 종양 세포에 특이적인 새로운 세포 표면 마커의 탐색이 널리 진행되고 있다.

LR11(LDL　receptor　relatiｖe　with　11　ligand-binding　repeats)는 LDL 수용체 패밀리에 특징적인 구조를 가지는 신규 LDL 수용체 유사 단백질로서 분류된 것이다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). LR11은 평활근 세포의 유주(遊走) 및 증식에 의해 형성된 혈관내막비후 부위에, 특이적으로 발현이 항진하고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 본 발명자들은 포유동물의 혈액 중에 가용성 LR11이 존재하고 있는 것, 및 동맥 경화성 질환 환자 혈액 중의 가용성 LR11 농도가 정상인과 비교해 유의하게 높은 값인 것 발견하였다(특허문헌 2). 더욱이 본 발명자들은 혈액이나 골수액 중의 가용성 LR11을 간편하고 정확하게 측정하는 방법(특허문헌 3, 비특허문헌 4)을 개발하고, 각종 질환에서의 가용성 LR11의 농도를 측정한 결과, 악성종양, 특히 백혈병이나 악성 임파종과 같은 조혈기 종양 질환으로 이상(異常) 고치(高値)을 나타내는 것을 확인하고, 혈액 중의 가용성 LR11이 새로운 종양마커가 되는 것을 찾아냈다(특허문헌 4). 그렇지만, 모든 조혈기 종양 질환 환자의 혈액 중에서 가용성 LR11이 이상 고치를 나타낸다고 한정할 수 없고, 그 이유는 아직도 분명하지 않다.

한편, 비특허문헌 5에는 광범위한 사람 유래의 조직(신경조직, 간장, 뇌, 말초 백혈구)에서 LR11의 mRNA가 발현하고 있는 것이 보고되어 있다. 또한 사람 골수 세포 중의 줄기세포가 존재하는 CD34＋CD38-획분(골수성 백혈병 세포)에 있어서, LR11의 mRNA 발현이 항진하고 있는 것, 및 데이터는 나타나고 있지 않으나, 일부 조혈기 종양 배양세포에도 LR11의 mRNA가 발현하고 있는 취지의 기술이 있다. 그러나, 비특허문헌 5는 배양세포를 포함한 혈액 전구세포에 있어서의 망라적인 유전자 발현 해석을 한 것뿐인 보고로, 단백질 레벨로 LR11을 발현하고 있는 조직에 대한 기재는 없고, 조혈기 종양과 LR11mRNA의 발현의 관계에 대한 기재도 전혀 없다.

[특허문헌 1] 일본특허공개 평 9-163988호 공보 [특허문헌 2] WO 2008/155891 [특허문헌 3] WO 2009/116268 [특허문헌 4] 일본특허출원 제2009-285492호 공보

[비특허문헌 1] J. Biol. Chem. 1996;271, 24761-24768 [비특허문헌 2] Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1999;19, 2687-2695 [비특허문헌 3] J. Clin. Inｖest. 2008;118, 2733-2746 [비특허문헌 4] Clin. Chem. 2009;55, 1801-1808 [비특허문헌 5] Experimental　Hematology　2000;28, 1286-1296

본 발명의 과제는 악성종양 세포 표면에 발현하고 있는 단백질 마커를 측정하는 것에 의한 악성종양 세포의 검출방법을 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 과제는 악성종양 세포의 표면 단백질에 특이적인 항체를 유효성분으로 하는 악성종양 치료약을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 항LR11 항체를 제작하고, 그의 반응성을 검토한 바, 조혈기 종양 세포주 용해액 중의 LR11 및 당해 조혈기 종양 세포주의 배양상청 중에 분비된 LR11을 각각 검출할 수 있음을 발견했다. 또한, 골수 조직을 면역 염색하면, 혈청 중의 가용성 LR11 농도가 높은 값의 조혈기 종양 환자에 있어 LR11가 양성으로 될 뿐만 아니라, 혈청 중의 가용성 LR11 농도가 정상역(비특허문헌 4 등에 의함)의 조혈기 종양 환자에 있어도, LR11가 양성으로 되는 경우가 있음을 발견했다.

더욱이, 본 발명자들은 제작한 항LR11 항체를 이용하여 플로우 사이토메트리를 행한 바, 많은 조혈기 종양 유래 세포주의 표면에 LR11가 발현하고 있음을 처음으로 확인했다. 또한, 급성 골수성 백혈병 환자의 말초혈 중의 미숙한 단구 획분에 LR11가 발현하고 있는 것, 그리고 급성 림프성 백혈병 환자의 말초혈 중의 성숙한 B세포에서는 LR11는 발현하고 있지 않지만, 분화 과정의 미숙한 B세포획분에는 LR11가 발현하고 있는 것을 확인했다. 한편, 상피성 악성종양 유래 세포주에 있어서도, 세포 표면에 LR11가 발현하고 있는 것을 확인했다. 이러한 발견으로부터, 피험시료 중의 세포 표면의 LR11을 측정함으로써 혈중의 가용성 LR11 농도가 유의로 높은 값으로 되어 있지 않은 경우에서도 악성종양 세포의 존재를 특이적으로 검출할 수 있는 것, 및 LR11가 악성종양의 세포 표면에 발현하고 있는 것으로부터, 항체 의약의 표적분자가 될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 피험시료 중의 세포 표면의 LR11을 측정하는 것을 특징으로 하는 악성종양 세포의 검출방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 피험시료 중의 세포 표면의 LR11을 측정하는 것을 특징으로 하는 악성종양의 진단 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체를 유효성분으로 하는 악성종양 치료약을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 악성종양을 치료하기 위한, 악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체를 제공하는 것이다.

또한, 더 본 발명은 악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체의, 악성종양 치료약 제조를 위한 사용을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 악성종양의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면, 침습성의 낮은 수법에 의해, 악성종양, 특히 조혈기 종양 또는 상피성 악성종양이 고정밀도로 검출될 수 있어 악성종양의 존재 및 중독도, 치료방법의 선택 및 효과판정, 재발의 위험성 및 재발의 유무를 판단함에 있어서, 유용한 정보를 얻을 수 있다. 또한, 악성종양 세포를 특이적으로 공격함으로써 악성종양을 치료할 수 있다.

도 1은 조혈기 종양 세포주에 있어서의 LR11의 발현을, 세포 용해액을 이용하여 웨스턴 블롯법으로 검출한 도이다.
도 2는각종 조혈기 종양 세포주에 있어서의 세포 표면에서의 LR11의 발현을, 플로우 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 및 급성 골수 단구성 백혈병 환자의 말초혈에 있어서의 세포 표면에서의 CD14와 LR11의 발현을, 플로우 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 정상인 및 급성 림프성 백혈병 환자의 말초혈에 있어서의 세포 표면에서의 CD19와 LR11의 발현을, 플로우 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 급성 백혈병 환자 유래 골수 조직에 있어서의 LR11의 발현을, 면역 염색으로 검출한 도이다.
도 6은 담낭암 유래 세포주에 있어서의 세포 표면에서의 LR11의 발현을, 플로우 사이토메트리로 해석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 NB-4 세포주를 마우스 복강내에 면역하고, 마우스 혈청 중의 항LR11 항체값을 확인한 그래프이다.
도 8은 각종 상피성 악성종양 세포주에 있어서의 세포 표면에서의 LR11의 발현을, 막획분용해액을 이용하여 웨스턴 블롯법으로 검출한 도이다.
도 9는 악성 임파종 환자 유래 림프절 조직에 있어서의 LR11의 발현을, 면역 염색으로 검출한 도이다.

본 명세서에 있어서, "LR11"란, 특별히 언급하지 않는 한 항LR11 항체와의 반응성을 가지는 단백질을 가리킨다. "전체 길이 LR11"나 "가용성 LR11"로서 공지의 단백질이나, 그것들이 부분적으로 단편화되거나 수식된 것을 말한다. 또, 본 명세서에 있어서, "측정"과 "검출"의 말은 같은 의미를 가지며, 특별히 언급하지 않는 한 "정성"측정, "정량"측정, "반정량"측정의 개념의 어느 것의 모두를 포함한다. 또, "정량", "반정량"을 총칭하여 "정량 등"이라고도 한다.

본 명세서에 있어서, 악성종양의 진단이라고 할 때는, 악성종양의 존재, 중증도, 치료 방법의 선택 또는 효과 판정, 재발의 위험성 또는 재발의 유무를 판정 하는 것을 포함한다.

본 발명의 악성종양 세포의 검출방법은 피험시료 중의 세포 표면의 LR11을 측정하는 것을 특징으로 한다. 피험시료로서는 악성종양 세포의 존재가 의심되는 생체 유래 시료이면 좋고, 말초혈액, 골수액, 조직 절편 등을 들 수 있다. 또 피험시료는 사람뿐 아니라, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 개, 고양이 등의 포유동물 유래의 것을 들 수 있다.

본 발명의 검출 대상이 되는 악성종양으로서는 조혈기 종양 및 상피성 악성종양을 들 수 있다. 여기서 조혈기 종양으로서는 백혈병 및 악성 임파종을 들 수 있다. 백혈병에는 급성 백혈병 및 만성 백혈병이 포함되며, 악성 임파종에는 비호지킨 림프종을 들 수 있다. 한편, 상피성 악성종양으로서는 위암, 간암, 췌장암, 폐암, 전립선암, 방광암, 식도암, 유방암, 자궁경암, 난소암, 결장암, 대장암, 신장암, 담낭암, 신경 종양(글리오마, glioma), 악성 흑색종(멜라노마, melanoma) 등을 들 수 있다. 본 발명에 의한 구체적인 검출 대상으로서는 조혈기 종양에 대해서는 백혈병 가운데, 급성 백혈병이 보다 바람직하고, 악성 임파종 가운데, 비호지킨 림프종이 보다 바람직하다. 또, 상피성 악성종양에 대해서는 간암, 췌장암, 결장암, 대장암, 담낭암이 바람직하다.

세포 표면의 LR11의 측정 방법으로서는 세포 표면의 LR11에 특이적으로 결합하는 단백질, 예를 들면 항LR11 항체, LR11 리셉터 관련 단백질(RAP)을 이용하는 방법을 들 수 있다. 이 중, 항LR11 항체를 이용해, 세포 표면의 LR11을 측정하는 수단이 정밀도, 특이성의 점으로서 바람직하다.

세포 표면의 LR11와 반응하는 항LR11 항체로서는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체의 어느 하나이어도 좋지만, 모노클로날 항체가 바람직하게 이용된다. 당해 항체의 제작은 주지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 폴리클로날 항체의 제작에는 면역하는 동물로서 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 염소, 양, 닭 등이 이용된다. 폴리클로날 항체로서는 항혈청이 바람직하고, 항혈청은 항원을 동물의 피하, 피내, 복강 등에 1회 또는 여러 차례 투여한 후, 면역된 동물의 혈청으로부터 얻을 수 있다. 단백질, 펩티드를 항원으로서 이용할 때는 면역 부활효과를 가지는 보액과의 혼합물의 면역이 보다 바람직하다.

또한, 모노클로날 항체의 제작에는 공지의 모노클로날 항체 제작 방법, 예를 들면, 나가무네고메이, 테라다히로시 공저, "모노클로날 항체" 히로카와쇼텡(1990년)이나, Jame　W.　Golding,　"Monoclonal　Antibody", 3rd　edition, Academic　Press(1996년)에 따라 제작할 수 있다. 또, DNA 면역법에 의해 모노클로날 항체를 제작할 수도 있으며, Nature　1992　Mar　12;356　152-154나 J. Immunol. Methods Mar　1;249　147-154를 참고하여 제작할 수 있다.

항체 제작에 이용되는 항원으로서는 LR11, 또는 그 일부 단편(펩티드), LR11을 세포 표면에 발현하고 있는 세포, 또는 LR11을 코드하는 cDNA를 재조합한 발현 벡터를 이용할 수 있다. LR11의 고차 구조를 인식하는 모노클로날 항체를 얻기 위해서는 사람 LR11 전체 길이 유전자를 삽입한 발현 벡터가 최적이지만, 그 외, LR11 배열의 일부 영역이 삽입된 발현 벡터도 사용할 수 있다. DNA 면역법은 상기 발현 벡터를 단독 또는 혼합하여, 면역 동물에 대해서 각종 유전자 도입법(예를 들면 근육주사, 일렉트로포레이션, 유전자 소총 등)의 어느 하나를 이용하여 동물(마우스, 랫트 등)의 피하에 주입하고, 세포 내에 집어넣음으로써 행할 수 있다.

당해 모노클로날 항체는 통상의 방법에 따라 제작한 하이브리도마를 배양하고, 배양상청으로부터 분리하는 방법, 이 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하고, 복수로서 회수하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

항LR11 항체는 필요에 따라, 항혈청, 배양상청 또는 복수로부터 정제하여 사용할 수 있다. 항LR11 항체를 정제·분리하는 수법으로서는 종래 공지의 방법, 예를 들면, 황산암모늄 침전법 등의 염석, 세파덱스 등에 의한 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 단백질 A 컬럼 등에 의한 어피니티 정제법 등이 있다.

항LR11 항체를 이용한 피험시료 중의 세포 표면의 LR11의 구체적인 측정 방법은 특히 한정되지 않지만, 플로우 사이토메트리, 면역 조직 염색법, 세포막 획분의 웨스턴 블롯법 등을 들 수 있어 이 중 플로우 사이토메트리가 바람직하다. 플로우 사이토메트리를 이용하는 경우에는 형광 색소로 표지된 항LR11 항체를 시료 중의 세포 집단과 반응시키고, 생리식염수나 기타 배지에서 세정한 후, 벡톤·디킨손사 기타 상업적으로 입수 가능한 형광 활성화 셀 소터(FACS)를 이용하여 형광 염색 패턴의 해석 및 세포의 선별을 행한다. 또, 세포 표면의 LR11와 결합하는 것을 한도로, 상기 항LR11 항체의 대체로서, RAP 등의 LR11에 친화성을 가지는 물질을 사용하는 것도 가능하고, 그러한 태양은 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 LR11의 측정에 대해서는 세포 표면의 LR11의 존재의 유무를 측정하는 정성적인 측정 외에, 교정기준으로 되는 LR11 농도 또는 양과 비교하는 것으로 정량측정 또는 반정량측정을 할 수 있다. 이 경우, 교정기준이 되는 LR11 농도 또는 양은 농도 또는 양이 기지의 LR11 발현 세포나 LR11 발현 세포주의 용해액, 배양상청 또는 LR11 고농도 혈액으로부터 회수한 LR11, 리컴비난트 LR11, 또는 항체 제작에서, 면역원으로서 사용할 수 있는 합성 펩티드 등을 사용하여 설정할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 예를 들면, 피험시료 중의 LR11의 측정 결과(정성, 정량 등)를, 미리 측정해 둔 정상인군이나 종양의 종류 등으로 구분하여 놓은 특정의 암환자군의 측정 결과(정성, 정량 등)와 대비시킴으로써, 병태에 관한 상세한 정보를 얻을 수 있다. 예를 들면, 악성종양 세포가 존재하고 있는 경우, 중증화하고 있는 경우, 또는 재발의 위험성이 있는 경우에는 피험시료중의 세포 표면 LR11 농도 또는 양은 정상인군이나 특정의 암환자군의 측정값에 대해서 높은 값인 경우가 있으며, 양자를 대비시킴으로써, 악성종양의 존재 또는 중증도, 치료 방법의 선택 또는 효과 판정, 재발의 위험성 또는 재발의 유무를 판정할 수가 있다.

측정 방법, 판정 방법의 구체적인 예로서 이하의 수단을 들 수 있다. 플로우 사이토메트리에서의 측정에 있어서는, 양성·음성의 컷 오프를 정하고, 일정 세포 집단 중에 있어서의 양성 세포의 존재 비율에 의해 상기 판정을 할 수 있다. 또한, 면역 조직 염색에서의 측정에 대해서는 양성·음성의 컷 오프를 정하고, 일정 조직 범위에 있어서의 양성 영역이 차지하는 비율(광협)이나, 양성 영역의 국재(局在) 상태, 정상 영역과의 경계의 상태 등을 화상 해석함으로써 상기의 판정을 할 수 있다. 또한, 상기한 판정에 있어서, 후기하는 LR11 이외의 세포 표면 마커와 조합하는 등, 종래 공지의 방법을 사용하여, 판정 정밀도를 향상시킬 수 있다.

전술한 악성종양의 중증도라는 것은 암이 어느 정도 진행되고 있는지의 지표가 되는 것이다. 본 발명에 있어서, "악성종양의 존재 또는 중증도를 판정한다"란, 예를 들면, 조혈기 종양의 경우는 WHO 분류로, 백혈병이나 악성 임파종이 상세하게 분류되어 악성도도 평가되고 있는 것으로부터, 종양 세포 표면의 LR11의 측정 결과에 의하여, 이들의 분류로 구분하는 것을 포함한다. 또한, 비호지킨림프종의 경우는 WHO 분류로, 세포 증식의 속도에 의해 "고악성도", "중악성도" 및 "저악성도"로 분류되고 있으며, 종양 세포 표면의 LR11의 측정 결과에 의해, 이들의 분류로 구분하는 것을 포함한다. 각 악성도 각각으로 구분되는 비호지킨림프종의 대표적인 것으로, 여포성(濾胞性) 임파종(저악성도), 비만성 대세포형 B임파종(중~고악성도), T세포 림프액 아구성(芽球性) 임파종(고악성도)을 들 수 있다. 또한, 상피성 악성종양에 관해서는 종양의 크기와 진전도, 소속 림프절로의 전이 상황 및 원격 전이의 유무에 의한 TNM 분류라고 하는 국제적인 병기(病期) 분류에 관한 지표가 사용되며, 또한 이 분류를 기초로, 암의 진행도와 확대의 정도를 한 번에 나타낼 수가 있는 스테이지 분류가 사용되고 있으며, 종양 세포 표면의 LR11의 측정 결과에 의해, 이들의 분류로 구분하는 것을 포함한다.

치료 방법의 선택 또는 효과 판정은 백혈병 아구(芽球)의 골수 세포 중의 비율의 변화나 발병한 종양의 크기의 변화를 보는 것으로 평가할 수 있다. 또한, 재발의 위험성에 대해서는 치료에 의해 세포 표면 LR11에 관한 지표(농도, 양, 양성 세포의 존재 비율, 조직에 있어서의 양성 영역의 비율 등)가 정상역으로 내려가지 않는 경우에 재발의 위험성이 높다고 판단되는 것, 또한 재발의 유무에 대해서는 간헐기나 치료에 의한 관해(寬解) 후, 전술한 세포 표면 LR11에 관한 지표가 상승 또는 증가하기 시작했을 경우에, 종양이 다시 발생하고 있을 우려가 높다고 평가할 수 있다.

현재, 백혈병의 진단은 말초혈을 이용한 혈액 형태 검사에 의해 이상이 인정되었을 경우, 골수를 천자(穿刺)하여 보통 염색을 행하는 진단을 확정시키고, 다시 상세한 분류를 하기 위하여 세포 표면의 항원 해석 검사가 행하여지고 있다. 본 발명의 항LR11 항체를 이용한 피험시료중의 세포 표면의 LR11의 측정 방법에 의하면, 말초혈을 이용한 검사에 있어서, 백혈병 세포의 검출 정밀도를 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 악성종양 세포의 존재 등을 판정함에 있어서는 세포 표면 LR11의 측정값뿐 아니라, 다른 공지 세포 표면 마커와 조합함으로써 보다 정밀도 높은 판단을 할 수 있다.

혈액 세포에서는 조혈 줄기세포가 각종 계통의 세포로 분화할 때에, 세포 분화 성숙도에 따라 발현하는 항원기(抗原基)의 종류나 발현 시기가 변화한다. 조혈기 세포의 표면에는 항원 리셉터, 세포 접착분자, 사이토카인 리셉터, 보체 리셉터, Fc 리셉터 등 여러 가지 분자가 존재하고 있으며, 이들을 마커로서 세포의 귀속을 추측할 수 있다. 또한, 백혈병의 병형(病型) 진단에서는 세포화학적 수법이 사용되며, 페록시다제 반응(POD)을 이용하여 림프성 백혈병인가 또는 골수성 백혈병인가로 분류가 행하여진다. 급성 백혈병 분류의 하나인 FAB 분류의 M0는 POD　3%이하이고, 종래이면 림프액계 백혈병으로 분류되었지만, 현재는 세포 표면 항원을 검색하고, 마커의 CD13 또는 CD33가 양성에서 CD19, CD20가 음성이면 골수성 백혈병으로서 치료가 개시된다. M7도 M0와 마찬가지로 POD　3%이하이고, 표면 항원 검색이 중요하다. 림프성 백혈병이나 악성 임파종에서는 골수성 백혈병과 같이 형태학적 특징이 그만큼 명확하지 않기 때문에, 세포 표면 항원 검색은 한층 더 중요한 검사항목으로 된다. 이와 같이, 세포 표면 형질의 검색이 종양 세포의 귀속의 결정에 중요한 역할을 하고 있으며, WHO 분류에서는 모든 조혈기 종양의 면역 표현형이 기재되어 있다. 이들 종래의 방법으로 본 발명의 LR11을 세포 표명 마커로서 조합함으로써, 더욱이 상세하게 병태를 파악하기 위한 정보를 얻는 것이 가능하게 된다. 또 상기한 백혈병의 진단이나 분류 등에 관해서는 예를 들면, 아사노 시게루 타카시 등 감수, "삼륜 혈액병학" 문광당(2006년) 등에 상세하게 기재되어 있으며, 본 발명의 측정을 실시할 때, 참조할 수 있다.

본 발명에 의해, 악성종양 세포 표면에는 LR11이 발현하는 것이 확인되었으므로, 악성종양 세포 표면의 LR11을 표적분자로 하는 분자표적치료, 구체적으로는 LR11에 특이적인 항체를 이용한 악성종양의 치료가 가능하다. 상기의 분자 표적 치료는 항LR11 항체를 유효성분으로 하는 악성종양 치료약, 소위 항체 의약의 투여에 의해 실시할 수가 있다. 덧붙여 본 명세서에 있어서, "악성종양 치료약"과 "항체 의약"은 특히 구별하지 않고, 동의어로 사용하고 있다.

상기 항체 의약에 있어서, 당해 항LR11 항체는 방사성 동위 원소, 항암제 또는 독소 등(이하, 총칭하여 "항암제 등"이라고 하기도 한다)을 담지시키는 담체로서 사용할 수가 있다. 여기에서는 항LR11 항체는 표적분자(LR11)가 발현하고 있는 악성종양 세포(표적 세포)에 항암제 등을 운반하는 캐리어로서 작동한다. 항LR11 항체에 담지시키는 항암제 등으로서는 방사성 동위 원소가 바람직하고, ⁹⁰Y(이트륨 90), ¹³¹I(요드 131)가 매우 적합하게 사용된다.

상기 항체 의약에 있어서, 당해 항LR11 항체가 세포 상해 활성을 가지는 경우에는 직접살세포 효과를 얻을 수 있다. 최근의 발견에 의하면, 항체 의약의 작용 기서에 있어서, 세포 상해 활성이 중요하다고 생각되고 있으며, 악성종양 세포 표면에 발현하는 LR11에 결합하여, 세포 상해 활성을 가지는 항체가 바람직하다. 이러한 항체는 전술한 바와 같이 제작된 항LR11 항체를 이용하여 세포 상해 활성을 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 또, 본 발명에 있어서의, "세포 상해"란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 가져오는 것을 말하며, ADCC 활성이나 CDC 활성에 의한 직접적인 세포의 살상해에 머무르지 않고, DNA의 절단이나 염기의 2량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 말한다. 본 발명에 있어서의 "세포 상해 활성"이란 상기 세포 상해를 일으키는 것을 말한다. 또한, 본 발명의 악성종양 치료약의 대상으로 되는 악성종양은 전술한 검출 대상과 같다.

본 발명의 악성종양 치료약(항체 의약)에 이용되는 항LR11 항체는 LR11와 특이적으로 결합하는 것을 한도로 하여, 특히 제한은 없다. 구체적으로는 마우스 등 면역 동물 유래의 항체, 치료 대상으로 하는 포유동물과 같은 동물 유래의 항체, 키메라 항체, 사람화 항체, 완전 사람 항체 등을 들 수 있다. 이들은 투여 대상인 포유동물에의 투여량, 투여 빈도, 항원성 등을 고려하여, 상기로부터 적의 선택할 수 있다. 항체 의약의 투여 대상이 사람인 경우에는 키메라 항체, 사람화 항체, 완전 사람 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 키메라화, 사람화 등은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기한 ADCC 활성이나 CDC 활성은 공지의 방법을 이용함으로써 항LR11 항체에 부여 또는 증강시킬 수 있다. ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 항LR11 항체에 부여 또는 증강시키는 방법으로서는 예를 들면, 항체의 Fc영역의 아미노산 배열을 개변하는 방법(Shields　R. L. , et. al.; J. Biol. Chem., 276, 6591-6604(2001)), Fc영역 중의 당사슬을 개변하여 Fcγ수용체 IIIA에의 결합력을 높이는 방법(Umana　P., et. al; Nat. Biotechnol., 17, 176-180(1999), Shields　R. L., et. al,; J. Biol. Chem., 277　26733-26740(2002), Shinkawa　T., et. al.; J. Biol. Chem., 278, 3466-3473(2003)), Fc영역을 탠덤(tandam)으로 다량체화하는 방법(국제 공개 WO2007/100083), CDC 활성을 증강하는 능력을 가지는 Fc단편을 도입하는 방법(국제 공개 WO2006/114700) 등을 들 수 있다.

또한, 항LR11 항체 중에서, 종양 세포에 있어서의 LR11의 생물 활성을 중화 또는 저해하는 항체를 선택하면, 예를 들면, 악성종양 세포에 아포토시스를 유도하는 것을 작용기서로 하는 항체 의약으로 할 수도 있다.

in　ｖitro에서의 항LR11 항체에 의한 종양 세포에 있어서의 LR11의 생물 활성의 중화 활성은 예를 들면, LR11을 과잉 발현하고 있는 세포의 배양계에, 각종 농도로 항LR11 항체를 첨가하고, LR11이 가지는 접착이나 유주활성의 억제 정도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 또한, 종양 세포의 항암제 감수성의 변화를 측정하는 것에 의해서도 평가할 수 있다. 또한, LR11을 과잉 발현하고 있는 상피성 악성종양 세포를 이용하는 경우에는 포커스 형성, 콜로니 형성 및 스페로이드 증식에 대한 억제 활성을 측정하는 것으로 평가할 수도 있다.

in　ｖitro에서의 항LR11 항체에 의한 종양 세포의 상해 활성은 예를 들면, LR11을 과잉 발현하고 있는 세포에 대해서 항LR11 항체가 나타내는 항체 의존성 세포 상해 활성, 보체 의존성 세포 상해 활성 또는 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 측정하는 것으로 평가할 수 있다. 예를 들면, LR11을 과잉 발현하고 있는 세포를 배양하고, 배양계에 각종 농도로 항LR11 항체를 첨가하고, 다시 마우스 등의 비장 세포를 첨가하여 적당 시간 배양 후의 LR11 과잉 발현 세포에 대한 세포사 유도율을 측정하는 것으로 평가할 수 있다.

in　ｖitro에서의 실험동물을 이용한 항LR11 항체의 종양에 대한 치료 효과는 예를 들면, WT1 유전자 트랜스 적합 마우스 등의 백혈병 모델 동물 중, LR11을 과잉으로 발현하고 있는 트랜스 적합 모델 동물에 항LR11 항체를 투여하고, 종양 세포의 변화를 측정하는 것으로 평가할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 LR11의 생물 활성을 중화하는 항체 또는 LR11을 발현하는 종양 세포를 특이적으로 상해하는 항체는 의약으로서, 특히 암 치료를 목적으로 한 항체 의약의 유효성분으로서 유용하다.

본 발명은 치료에 유효한 양의 항LR11 항체와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유하는 의약 조성물도 제공한다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서, 허용되는 제제에 이용하는 물질로서는 바람직하기로는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물을 투여되는 사람에 대해서 비독성의 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은 pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방율, 흡수율, 침투율을 바꾸거나 유지하거나 보관 유지하거나보유하기 위한 제제용 물질을 함유할 수 있다. 제제용 물질로서 이하의 것을 들 수가 있지만, 이것들에 제한되는 것은 아니다: 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리진 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르빈산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소, 트리스 염산(Tris-HCl) 용액 등의 완충제, 만니톨 등의 충전제, 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘,β-시클로덱스트린이나 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류나 글루코오스, 만노스나 덱스트린 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염형성 쌍이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로로헥시딘, 소르빈산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 맡니톨 또는 소르비톨 등의 당알코올, 현탁제, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르비테이트 20이나 폴리소르비테이트 80 등 폴리소르비테이트, 트리톤(Triton), 트로메타민(tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면활성제, 슈크로스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨, 소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제. 이들의 제제용 물질의 첨가량은 항LR11 항체의 중량에 대해서 0.01~100배, 특히 0.1~10배 첨가하는 것이 바람직하다. 제제 중의 매우 적합한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적의 결정할 수가 있다.

의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체나 고체이어도 좋다. 적당한 부형제나 담체는 주사용 물이나 생리식염수, 인공 뇌척수액이나 비경구투여에 통상 이용되고 있는 다른 물질이라도 좋다. 중성 생리식염수나 혈청알부민을 포함한 생리식염수를 담체로 이용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH 7.0~8.5의 트리스 버퍼나 pH 4.0~5.5의 아세트산 버퍼나 그것들에 소르비톨이나 다른 화합물을 함유할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성으로 필요한 순도로 적당한 약제로서 동결 건조품 또는 액체로서 준비된다. 항LR11 항체를 함유하는 의약 조성물은 슈크로스와 같은 적당한 부형제를 이용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 비경구투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 의해 결정할 수 있으며, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항LR11 항체의 LR11에 대한 친화성, 즉, LR11에 대한 해리정수(Kd값)에 대해, 친화성이 높을(Kd값이 낮을)수록, 사람에의 투여량을 적게 약효를 발휘할 수가 있으므로, 이 결과에 의해 본 발명의 의약 조성물의 사람에 대한 투여량을 결정할 수도 있다. 투여량은 사람형 항LR11 항체를 사람에 대해서 투여할 때에는 약 0.1~100mg/kg를 1~30일간에 1회 투여하면 좋다.

본 발명의 의약 조성물의 형태로서는 점적을 포함한 주사제, 좌제, 경비제, 설하제, 경피흡수제 등을 들 수 있지만, 점적을 포함한 주사제가 바람직하다.

실시예

다음에 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명한다.

실시예 1　각종 조혈기 종양 세포주의 LR11 발현의 확인

각종 조혈기 종양 세포주에서의 LR11 발현을, LR11의 부분 아미노산 배열을 가지는 합성 펩티드를 면역하여 제작한 항LR11 모노클로날 항체(A2-2-3: 특허문헌 3)에 의한 웨스턴 블롯법으로 확인했다. 세포주는 급성 골수성 백혈병 유래 3주(HL-60, ML-2, NB-4), 급성 림프성 백혈병 유래 3주(CCRF-SB, MOLT-4, NALL-1), 악성 임파종 유래 2주(Daudi, U937)의 합계 8종을 이용했다. 이것들의 세포주는 HT배지 (15%　fetal bovine serum HT supplement, penicillin/streptomycin를 함유하는 RPMI-1640)에 현탁하고, 5%　탄산가스 인큐베이터 내에서 37℃에서 적당한 시간 배양하여 증식시켰다. 각각의 세포주의 세포수를 카운트하여 1×10⁷개가 되도록 분취한 후, 1%　프로테아제 인히비터(시그마 알드릿치사 제; P8340)를 함유하는 RIPA　버퍼(25mM　Tris-HCl　pH 7.6, 150mM　NaCl, 1%　NP-40, 1%　Sodium　deoxycholate, 0.1%　SDS)를 첨가하여 용해시켰다. 불용물을 원심분리로 제거한 후, 세포 용해물 중의 단백질 농도를 측정하고, 1 레인당 20㎍분을 SDS 함유 환원 조건하에서 비등 처리했다. 이 처리액을 SDS-PAGE(2-15%)의 각 레인에 어플라이 하여 전기영동했다. 영동 종료후, 겔로부터 단백질을 PVDF막에 전사하고, 1차 항체로서 항LR11 모노클로날 항체(A2-2-3)를 반응시키고, 마우스 IgG　ABC 킷(Vector사 제)을 이용하여 LR11을 검출했다.

그 결과, 각 세포주의 세포 용해액 중에, 분자량으로 230kDa보다 조금 큰 위치에 약간 크기가 다른 2개의 밴드가 보였다.

실시예 2　각종 조혈기 종양 세포주의 플로우 사이토메트리

실시예 1에서 해석한 세포주 8종에 대해서, 세포 표면에 LR11가 발현하고 있는지 여부를 플로우 사이토메트리로 해석했다. 각 세포주 5×10⁵개를 Staining　Medium(1%　FBS/PBS)에 부유시켜 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상청을 제거ㅎ하고, 펠릿에 1mg/㎖　FITC 표지 항LR11 모노클로날 항체(M3: 특허문헌 3)를 3㎕ 첨가하고, 4℃에서 60분간 반응시켰다. 세포를 Staining　Medium에서 2회 세정한 후, 사용 설명서에 따라 JSAN(Bay　bioscience사 제)를 이용하여, 플로우 사이토메트리 해석을 행했다. FITC 표지 항LR11 모노클로날 항체의 음성 콘트롤에는 정상 마우스 IgG(BD　pharmingen사 제)를 이용했다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 실시예 1에서 LR11의 발현이 확인된 8주 중, HL-60, ML-2, NB-4, MOLT-4, CCRF-SB, U937의 6주에 대해서는 강한 양성으로부터 약한 양성의 반응이 보이는 것으로부터, 이들의 세포주의 표면에는 LR11가 발현하고 있는 것이 확인되었다.

실시예 3　급성 골수성 백혈병(AML) 환자의 말초혈의 플로우 사이토메트리

급성 골수단구성 백혈병 환자(FAB 분류: M4)의 말초혈로부터 Ficoll-Paque PLUS(GE헬스케어사 제)를 이용하여 단핵구을 분리하고, LR11가 세포 표면에 발현하고 있는지 여부를 실시예 2에 준하여 플로우 사이토메트리에 의한 해석을 행했다. 음성 콘트롤은 정상인의 말초혈을 이용했다. 각각의 세포주 5×10⁵개를 Staining　Medium에 부유시키고, 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿에 1mg/㎖　FITC 표지 항LR11 모노클로날 항체(M3) 및 PE 표지 항CD14 항체(BD　pharmingen사 제)를 각각 3㎕ 첨가하고, 4℃에서 60분간 반응시켰다. 세포를 Staining　Medium에서 2회 세정한 후, 사용 설명서에 따라 JSAN(Bay　bioscience사 제)를 이용하여 플로우 사이토메트리 해석을 행했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.

정상인의 말초혈 중의 백혈구에서는 단구의 표면 마커인 CD14의 양성 획분에 LR11가 발현하고 있는 것을 알았고, 동일하게 급성 골수 단구성 백혈병 환자의 말초혈 중의 백혈병 세포에서도, 역시 CD14 양성의 단구계의 아구에서 LR11가 발현하고 있는 것을 알았다. 백혈병에서는 단아구나 전아구 등의 미숙한 단구가 많은 것으로부터, LR11는 정상인으로 보이는 성숙한 단구뿐만 아니라, 백혈병 세포인 미숙한 단구에도 발현하고 있는 것을 알았다.

실시예 4　급성 림프성 백혈병(ALL) 환자의 말초혈의 플로우 사이토메트리

급성 림프성 백혈병 환자(FAB 분류: L2)의 말초혈로부터 Ficoll-paque　PLUS(GE헬스케어사 제)를 이용하여 단핵구를 분리하고, LR11가 세포 표면에 발현하고 있는지 여부를, 실시예 2에 준하여 플로우 사이토메트리에 의한 해석을 행했다. 음성 콘트롤은 정상인의 말초혈을 이용했다. 각각의 세포주 5×10⁵개를 Staining　Medium에 부유시키고, 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿에 1mg/㎖　FITC 표지 항LR11 모노클로날 항체(M3) 및 PE 표지 항CD19 항체(BD　pharmingen사 제)를 각각 3㎕ 첨가하고, 4℃에서 60분간 반응시켰다. 세포를 Staining　Medium에서 2회 세정한 후, 사용 설명서에 따라 JSAN(Bay　bioscience사 제)를 이용하여 플로우 사이토메트리 해석을 행했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.

정상인의 말초혈 유래의 백혈구에서는 B세포의 표면 마커인 CD19 양성 획분에서, LR11는 거의 음성인 것에 대해서, 급성 림프성 백혈병 환자의 말초혈 유래의 백혈구에서는 백혈병 세포화하여 CD19 양성이 되는 림프액 아구세포가 많으므로 LR11가 양성으로 되는 것이 판명되었다.

실시예 5　급성 백혈병 환자 유래 골수 조직의 면역 염색

급성 림프성 백혈병(ALL) 환자 1명(혈청 중 가용성 LR11 농도　407ng/㎖) 및 급성 골수성 백혈병(AML) 환자 3명(각 혈청 중 가용성 LR11 농도　70, 6, 8ng/㎖)의 골수 조직에 대한 면역 염색을 행했다. 음성 콘트롤은 정상 마우스 IgG를 이용했다. 조직 절편은 파라핀포로 채운 병리 검체를, 마이크로톰(microtome)을 이용하여, 두께 4㎛에 얇게 잘라 제작했다. 제작한 절편은 크실렌으로 파라핀을 제거한 후, 에탄올로 수화 처치하고, 이하의 방법으로 면역 염색을 행했다. 조직 절편을 시트르산 버퍼(pH 6.0)에 담그어, 마이크로웨이브 처치를 행하여 항원을 활성화했다. 다음에, 내재성의 페록시다제를 블록킹하기 위해서, 절편을 0.3%　과산화수소 함유 메탄올액으로 30분간 처리했다. 그 후, Protein　Block(Dako사 제) 및 Avidin/biotin　blocking　kit(Vector사제)를 이용하여 블록킹 처리를 행했다. 다음에, 10㎍/㎖의 항LR11 모노클로날 항체를(A2-2-3) 절편에 올려 4℃에서 밤새 반응시켰다. TBS(50mM　Tris-HCl, 150mM　NaCl)로 세정한 후, 500배 희석(최종농도 1.14ng/㎖)한 biotin-conjugated　rabbit　anti-mouse　IgG(Dako사 제)와 실온에서 30분 반응시켰다. 세정 후, Peroxidase　conjugated　streptavidin(Nichirei사 제)와 실온에서 5분 반응시키고, TBS로 세정하고, 발색액(0.3mg/㎖　diaminobenzidine, 0.006%　과산화수소, 50mM　Tris-HCl(pH 7.6))로 발색시켰다. 마지막으로, Mayer's　Hematoxylin(Muto사 제)를 이용하여 핵염색을 행하고, 에탄올 처리로 탈수 및 크실렌으로 완전히 침투시킨 후, Malinol(Muto사 제)로 봉입했다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.

실시예 1에 기재된 항LR11 모노클로날 항체(A2-2-3)를 이용한 면역 조직 염색 결과로부터, 혈청 중 가용성 LR11 농도가 높은 환자 유래의 조직뿐 아니라, 정상역의 환자 유래 조직에서도, LR11의 발현이 보이는 매우 흥미로운 발견을 할 수 있었다. 실시예 3 및 4에서 나타낸 말초혈의 미분화한 단구나 B세포의 표면에서의 발현 검출 이외에, 조직 절편에 있어서의 LR11의 발현을 검출하는 것은 치료의 효과 판정이나 재발의 모니터링에 적용할 수 있을 가능성을 시사하고 있다. 또한, 통상은 말초혈에 암세포가 검출되지 않는 악성 임파종 등에서는 종양의 조직 절편에 의한 정밀 검사를 하고 있는 것으로부터, 적용의 가치는 높다고 생각된다.

실시예 6　상피성 악성종양 세포주의 플로우 사이토메트리

상피성 악성종양중에서, 혈청중 가용성 LR11을 고농도에 검출하는 예가 많은 담낭암에 대해서, 담낭암 유래 세포주 2종(OCUG-1, NOZ)을 이용하여 실시예 2에 준해 세포 표면에 LR11가 발현하고 있는지 여부를 플로우 사이토메트리에서 해석했다. 배양 후 트립신 처리, 나일론 메쉬를 통한 세포를 이용했다. 각 세포주 5×10⁵개를 Staining　Medium에 부유시키고, 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상청을 제거하고, 펠릿에 1 mg/㎖　FITC 표지 항LR11 모노클로날 항체(M3)를 3㎕ 첨가하고, 4℃에서 60분간 반응시켰다. 세포를 Staining　Medium에서 2회 세정한 후, 사용 설명서에 따라 JSAN(Bay　bioscience사 제)를 이용하여 플로우 사이토메트리 해석을 행했다. FITC 표지 항LR11 모노클로날 항체의 음성 콘트롤에는 정상 마우스 IgG(BD　pharmingen사 제)를 이용했다. 그 결과, LR11 양성 세포의 비율이 OCUG-1에서는 약 60%, NOZ에서는 약 20%였다(도 6).

실시예 7　세포 면역

실시예 5의 결과로, LR11가 세포 표면에 강하게 발현하고 있는 조혈기 종양 유래 세포의 하나인 NB-4주를 HT배지에서 확대 배양하고, PBS에서 2회 세정 후, 세포수가 1~2×10⁷개가 되도록 PBS에 현탁하고, BALB/c 마우스(메스)의 복강 내에 주입하여 면역했다. 격주 또는 매주 면역하고, 적절한 시기에, 다음에 나타내는 방법에 의해 마우스 혈청 중의 항LR11 항체값을 확인했다.

마이크로플레이트(NUNC사 제)에, 사람뇨 유래 정제 가용성 LR11을 PBS로 50 ng/㎖에 희석하고, 1웰당 50㎕ 첨가하고 실온에서 2시간 고상화했다. 0.05% Tween20를 함유하는 PBS(PBST)로 세정한 후, 1% BSA를 함유하는 PBST(BSA-PBST)를 1웰당 200㎕ 첨가하고 실온에서 1시간 블록킹했다. 마우스의 꼬리로부터 채혈하여 얻어진 혈청을, BSA-PBST에 의해 200~1600배 희석하고, 1웰당 50㎕ 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 세정 후, HRP 표지 항마우스 IgG 폴리클로날 항체(Rockland사)를 10000배 희석하고, 1웰당 50㎕첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. PBST로 세정 후, 그 다음에 o-페닐렌디아민 기질액을 1웰당 50㎕ 첨가하고 실온에서 20분간 반응시키고, 1.5N 황산을 1웰당 50㎕ 첨가하고 반응을 정지시킨 후, 마이크로 플레이트 리더(Abs. 492nm)로 측정했다.

5회 면역 한 후의 마우스 혈청중의 항LR11 항체값을 확인한 결과를 도 7에 나타낸다.

면역전의 마우스 혈청에서는 고상화한 사람뇨 유래 정제 LR11에의 반응은 거의 보이고 있지 않은데 반해, NB-4 세포주를 면역했을 경우는 고상화한 사람뇨 유래 정제 LR11에의 명확한 반응이 보이고 있는 것으로부터, LR11에 대한 항체가 산생되고 있는 것이 확인되었다. 악성종양 세포의 표면에 발현하고 있는 LR11에 결합하는 항체, 더욱이 세포 상해성을 가지는 항체에 대해서는 항체값이 충분히 높은 시점에서, 통상의 방법에 따라 비장을 꺼내 세포 융합을 행하고, 항LR11 모노클로날 항체를 수립하고, 그 중에서, 종양 세포 표면의 LR11 결합 활성과 LR11의 생물 활성의 중화 활성 및/또는 세포 상해성 활성을 가지는 항체를 선택하는 것으로 얻어진다. 또한, 세포 상해성 활성은 공지의 방법에 의해 부여 또는 증강할 수가 있다.

실시예 8　각종 상피성 악성종양 세포주의 LR11 단백질의 확인

각종 상피성 종양 세포주에서의 LR11 단백질 발현을 실시예 1에서 이용한 항LR11 모노클로날 항체(A2-2-3)에 의한 웨스턴 블롯법으로 확인했다. 세포주는 HLE(간암 유래), MKN1(위암 유래), T. Tn(식도암 유래), COLO201(대장암 유래), AsPC-1(췌장암 유래), Caki-1(신장암 유래), Oka-C-1(폐암 유래), PC-3(전립선암 유래), KMBC-2(방광암 유래), HeLa(자궁경암 유래), OVISE(난소암 유래), YMB-1(유방암 유래), KINGS1(신경 종양 유래), G-361(악성 흑색종 유래)의 합계 14종을 이용했다. 이것들 세포주는 지정된 배지(예를 들면, 10% fetal　boｖine　serum, penicillin/streptomycin를 함유하는 RPMI-1640)에 현탁하고, 5% 탄산가스 인큐베이터 중, 37℃에서 적당한 시간 배양하여, 증식시켰다. 증식한 세포는 PBS로 수회 세정한 후, 트립신 EDTA 용액(인비트로젠사제; 25200-072)을 이용해 회수되었다. 각각의 세포주의 세포수를 카운트하여 1×10⁷개가 되도록 분취한 후, PBS를 적당량 가하여 현탁하고, 원심분리로 세포를 회수했다. 이 조작을 3회 반복하여 세포를 세정했다. 회수한 세포에, 1% 프로테아제인히비터(시그마 알드릿치사 제; P8340)를 함유하는 PBS 100㎕를 가한 후, 초음파 진동기(호모지나이저)로 세포를 파쇄했다. 세포의 파쇄 단편을 원심분리로 제거한 후, 상청을 초원심분리(100,000g, 10분간)로 막 획분을 침전시켰다. 상청을 제거하고, PBS에서 침전을 세정한 후, 1% 프로테아제 인히비터(시그마 알드릿치사 제; P8340) 및 1% MEGA-9를 함유하는 PBS 100㎕를 가하고, 초음파 진동기(호모지나이저)로 막 획분을 현탁, 용해시키고, 다시 초원심분리(100,000xg, 10분간)로 불용 막 획분을 제거함으로서, 가용화 막 획분 용액을 얻었다.

1레인당 2㎕분의 각 세포주의 가용화 막 획분용액을 SDS 함유 환원 조건하에서 비등 처리하고, 각 처리액을 SDS-PAGE(2-15%)의 각 레인에 어플라이하여 분리했다. 영동 종료후, 겔에서 단백질을 PVDF막에 전사하고, 1차 항체로서 항LR11 모노클로날 항체(A2-2-3)를 반응시키고, 그런 다음, Biotinylated　anti-mouse　IgG　폴리클로날 항체(DAKO) 및 HRP 표지 스트펩토아비딘을 조합하고, 최종적으로 디아미노벤디딘으로 발색시켜, LR11을 검출했다.

그 결과, 이용한 14종 모든 세포주의 막 획분 용해액으로, LR11 단백질을 나타내는 밴드가 보였다(도 8). 이 발견은 상피성 악성종양 질환에서의 환자 병변부의 세포 표면에, LR11 단백질의 발현이 항진하고 있을 가능성을 시사하는 것이다.

실시예 9　악성 임파종 환자 유래 조직의 면역 염색

실시예 5의 방법으로 준해, 악성 임파종으로, 비호진킨림프종으로 분류되는 미만성(diffuse) 대세포형 B세포 임파종(DLBCL) 환자 1명(혈청중 가용성 LR11 농도 79ng/㎖) 및 정상인의 림프절 조직에 대한 면역 염색을 행했다. 음성 콘트롤은 정상 랫트 IgG(Santa　Cruz　Biotechnology사 제)를 이용했다. 조직 절편은 파라핀포로 채운 병리 검체를, 마이크로톰(microtome)을 이용하여 두께 4㎛로 얇게 잘라 제작했다. 제작한 절편은 크실렌으로 파라핀을 벗기고, 에탄올로 수화 처치한 후, 이하의 방법으로 면역 염색을 행했다. 내재성의 페록시다제를 블록킹하기 위해, 절편을 3%　과산화수소 함유 메탄올 액으로 5분간 처리했다. 그 후, Protein　Block(Dako사 제)를 이용하여 블록킹 처리를 행했다. 다음에, 10㎍/㎖의 항LR11 모노클로날 항체(R14; 비특허문헌 4) 및 정상 랫트 IgG를 절편에 올려놓고 실온에서 밤새 반응시켰다. PBS로 세정 후, 3000배 희석한 biotin-conjugated　rabbit　anti-rat　IgG(Dako사 제)와 실온에서 30분 반응시켰다. 세정 후, Peroxidase　conjugated　streptavidin(Nichirei사 제)와 실온에서 5분 반응시키고, PBS로 세정하고, ImmPACT　DAB　Peroxidase　Substrate(Vector　Laboratories사 제)를 이용하여 염색했다. 마지막으로, Mayer's　Hematoxylin(Muto사 제)를 이용하여 핵염색을 행하고, 에탄올 처리로 탈수 및 크실렌으로 완전히 침투시킨 후, Malinol(Muto사 제)로 봉입했다. 그 결과를 도 9에 나타낸다.

항LR11 모노클로날 항체(R14)를 이용한 면역 조직 염색 결과로부터, 악성 임파종의 조직 절편에 있어서도, LR11의 발현이 확인되었다.

Claims

피험시료 중의 세포 표면의 LR11을 측정하는 것을 특징으로 하는 악성종양 세포의 검출방법.
제1항에 있어서, 악성종양이, 조혈기 종양 또는 상피성 악성종양인 악성종양 세포의 검출방법.
제2항에 있어서, 조혈기 종양이, 백혈병 또는 악성 임파종인 악성종양 세포의 검출방법.
제3항에 있어서, 백혈병이 급성 백혈병인 악성종양 세포의 검출방법.
제3항에 있어서, 악성 림프액종이 비호지킨림프종인 악성종양 세포의 검출방법.
제2항에 있어서, 상피성 악성종양이, 위암, 간암, 췌장암, 폐암, 전립선암, 방광암, 식도암, 유방암, 자궁경암, 난소암, 결장암, 대장암, 신장암, 담낭암, 신경 종양 및 악성 흑색종으로부터 되는 군으로부터 선택되는 악성종양 세포의 검출방법.
제1항 내지 제6항의 어느 1항에 있어서, 피험시료가 말초 혈액, 골수액 또는 조직 절편인 악성종양 세포의 검출방법.
제1항 내지 제7항의 어느 1항에 있어서, 세포 표면의 LR11의 측정이 적어도 세포 표면의 LR11에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용하여 행하는 악성종양 세포의 검출방법.
제8항에 있어서, 단백질이 항체 또는 리셉터 관련 단백질인 악성종양 세포의 검출방법.
피험시료중의 세포 표면의 LR11을 측정하는 것을 특징으로 하는 악성종양의 진단방법.
악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체를 유효성분으로 하는 악성종양 치료약.
악성종양을 치료하기 위한, 악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체.
악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체의 악성종양 치료약 제조를 위한 사용.
악성종양 세포 표면의 LR11에 특이적인 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 악성종양의 치료방법.