KR20130084043A - 당귀수산의 추출물을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 9종 복합 생약 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

당귀수산의 추출물을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITON FOR PREVENTING AND TREATING INFLAMMATORY DISEASE CONTAING EXTRACTS OF DANGKWISOO-SAN}

본 발명은 당귀수산의 추출물을 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 9종 복합 생약의 열수 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

“당귀수산(DANGKWISOO-SAN, DGSS)”이란 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피, 감초의 혼합으로 처방되는 한의학상의 처방을 말한다. 주로 타박상으로 인해 기(氣)가 엉기고 혈(血)이 맺혀서 가슴 ·갈비 ·배 등이 결리고 아픈 증세를 다스리는 약재로 처방되어 왔으며 보다 구체적으로 타박(打撲)이나 낙상(落傷)등으로 전신 또는 국소에 혈전(血栓)이나, 혈관 울혈이 생겨서 아프고 복부팽만감이 있을 때 처방되고, 이를 복용함으로써 혈소판 응고가 억제되고, 혈관 울혈을 풀어주며, 진통 작용 및 혈전으로 인한 복부 팽만감을 개선하는 것으로 알려져 있다.

이러한 작용과 관련하여, 당귀수산의 약리작용의 원인으로 당귀, 계지의 혈관 확장능과 작약, 오약, 소목, 홍화, 동인의 항혈전작용을 통한 혈전의 용해, 향부자, 당귀, 작약의 혈전 통증에 대한 진통작용, 향부자, 오약의 장연동 운동 촉진에 의한 복부 팽만감 개선이 추정되고 있다.

현대인들은 오염된 공기에 노출되어 있으므로, 다양한 폐질환의 위험에 노출되어 있다. 특히, 폐질환 중 염증에 의하여 유도되는 염증성 폐질환으로 폐혈증, 패혈성 쇼크, 만성 폐염증 질환, 기관지 염증, 폐렴 등을 대표적으로 들 수 있다.

“폐렴”이란 호흡기의 가장 말단 부위인 폐포와 폐실질에 염증이 생기는 것으로, 발열, 객담을 동반한 기침, 비체 등의 증상과 권태, 식욕 부진 등의 증상이 나타난대. 흔히 볼 수 있는 소아기 질환 중 하나가 폐렴이며, 감기 환자의 약 10%에서 발병되어 중증으로 빠지기 쉽고 이로 한 사망률 또한 다른 감염증에 비하여 현저한 편인 것으로 보고되고 있다.

특히 폐렴에 좋은 한약재로써, 오미자가 처방되고 있으며, 특히 오미자는 초기 폐렴 증상에 효과적인 것으로 알려져있다. 동의보감에서는 오미자가 “주로 기침이 나고 기가 치밀어 오르며 열이 나는 것을 치료한다고 하고 있으며, 오미자는 폐기를 수렴하기 때문에 화기와 열기가 있는 데는 반드시 써야할 약”이라고 하면서 인삼, 오미자, 맥문동을 함께 배합해서 쓰면 폐가 허하여 저절로 땀이 나거나 기가 약하여 숨찬 것을 치료한다고 밝히고 있기도 하다. 동의보감은 “오미자는 허로(虛勞)로 몹시 여윈 것을 보하며 눈을 밝게 하고 신장을 데우며 양기를 서게 한다. 남자의 정을 돕고 음경을 커지게 한다. 소갈증을 멈추고 번열을 없애며 술독을 풀고 기침이 나면서 숨이 찬 것을 치료한다.”라고 말한다.

이 외에도 한의학에서는 금은화, 즉 인동의 꽃이 항균 작용이 강한 것을 이용하여 기관지염 이나 폐렴 등에 처방하고 있으며, 과루인을 처방하여 폐가 건조한 것을 윤택하게 하고 세균성 가래를 제거하도록 하고 있다.

그러나, 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 혼합인 당귀수산의 추출물을 이용하여 염증성 질환을 치료하는 방법에 대해서는 밝혀진 바 없다.

본 발명의 목적은 종래에는 신체적 외상에 의하여 유발되는 합병증에 처방되거나, 어혈 제거에 처방되어왔던 당귀수산의 추출물을 염증성 질환의 치료 및 예방을 위한 새로운 용도로 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 9종 복합 생약의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 약학적 조성물을 이용하여 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 9종 복합 생약의 추출물을 포함하는 조성물을 처방함으로써 폐의 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 쥐 (실험군당 12마리)를 이용한 실험을 시작하기 전후의 몸무게를 측정한 결과이다. 식염수를 먹이기 전과 15동안 먹인 후 (1, 2 column), 그리고 당귀수산(DSSS)의 추출물을 먹이기 전, 후 (3, 4 column) 몸무게의 변화를 나타낸다.
도 2는 식염수 또는 당귀수산의 추출물을 공급한 쥐를 각각 다시 2그룹으로 나눈 후, LPS를 이용하여 폐렴을 유발한 쥐의 폐 사진을 도시한다. A와 B는 각각 LPS를 처리하지 않은 식염수 투여군과 당귀수산 추출물 투여군을 도시한다. LPS를 처리한 경우 식염수 투여군에서는 폐로 염증세포의 유입이 증가되어 폐렴이 유발된 것을 확인할 수 있고(C), 당귀수산(DSSS)의 추출물을 처리할 경우, LPS에 의해 유발된 폐렴 유발 증상이 감소되었음을 확인할 수 있다(D).
도 3의 당귀수산(DGSS)의 추출물을 처리 할 경우, 폐로 염증성 세포의 유입이 줄어든 결과를 도시한다. 당귀수산의 추출물을 처리하지 않은 LPS 처리군의 경우 염증성 세포인 호중구(Neutrophils)이 수가 증가되며 이에 따라 염증성 세포의 총량이 증가되는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 폐에 염증이 유발되었음을 알 수 있다. 또한 LPS 및 당귀수산 추출물을 처리한 실험군의 경우 당귀수산 추출물 비처리군에 비하여 호중구의 세포수가 줄어든 것을 확인할 수 있다. 따라서, 당귀수산의 추출물을 처리한 경우 폐렴이 억제될 수 있음을 확인할 수 있다.
도 4는 MTT 에세이를 실시하여 당귀수산의 추출물 농도에 따른 세포독성을 확인한 결과를 도시한다. 10 내지 100μg/ml 농도의 당귀수산 추출물을 처리한 결과 RAW 264.7 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았으며 이를 통해 당귀수산 추출물이 세포독성이 없음을 확인하였다.
도 5a는 항염증 인자인 Nrf2의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 도시한다. 당귀수산의 추출물을 처리를 할 경우, 양성 대조군과 유사하게 Nrf2의 발현이 증진된다(DGSS: 당귀수산의 추출물, SFN: Sulforaphane)
도 5b의 A와 B는 당귀수산의 추출물을 처리한 경우 Nrf2의 발현과 Nrf2의존적 유전자의 발현 증가가 일치하는 것을 도시한다.
도 6은 당귀수산의 추출물에 의해 ROS 생성이 되지 않음을 보여준다. LPS를 처리한 경우 많은 세포에서 ROS가 생성되나 당귀수산의 추출물을 처리한 경우, 대조군과 유사하게 변화가 없었다.
도 7는 당귀수산의 추출물을 처리한 경우 상대적인 루시퍼라아제 활성을 나타냄으로써, 당귀수산의 추출물이 NF-κB의 활성을 억제할 수 있음을 도시한다.
도 8은 세포주에 reporter construct와 IKK-beta 발현 벡터를 함께 트랜스펙션한 후, 당귀수산의 추출물의 효과를 reporter assay를 통해 조사한 결과를 도시한다.
도 9는 당귀수산의 추출물이 NF-kB 전사인자에 의해 조절되는 염증성 사이토카인인 TNF-alpha, MCP-a, IL-6 등의 발현에 영향을 주는 지를 조사하기 위한 실험 결과이다. 당귀수산의 추출물에 의해 위 3가지 유전자의 발현이 억제됨을 확인할 수 있다.

본 발명은 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 9종 복합 생약 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기의 9종의 복합 생약은 물, 에탄올 등 일반적인 추출 용매에 의하여 추출될 수 있으나, 바람직하게는 물을 이용하여 열수 추출하여 제조될 수 있다.

이하, 본 발명에서 포함하고 있는 재료들의 약리 효과에 대하여 상세히 살피면 다음과 같다.

“당귀”는 비타민 B12, 엽산, 철분이 있어서 조혈작용을 하며 혈허를 개선하며 비타민 E가 함유되어 있어 비타민 E결핍증에 작용하며 자궁의 발육을 촉진(促進)하고 자궁기능조절작용이 있어서 자궁이 수축되었을 때는 이완(弛緩)시키고, 불규칙한 수축을 할 때는 수축력을 강화하여 유산(流産)을 방지하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 정유(精油)는 혈관을 확장하여 혈압을 저하시키고 뇌혈류를 증진하며, 말초혈관의 혈류(血流)를 원활히 하므로 써 말초순환장애를 개선하는 것으로 알려져 있다.

“작약”은 뿌리에 안식향산과 아스파라긴 등이 함유되어 있어 진통, 해열, 진경, 이뇨, 조혈, 지한 등의 효능을 가지고 있으며 복통, 위통, 두통, 설사 복통, 월경 불순, 월경이 멈추지 않는 증세, 대하증, 신체 허약증 등에 효과가 있으며, 여성의 쳬경, 어혈복토으 심장병 등에 주로 처방되는 약재로 알려져있다.

“오약“은 Lindera aggregata의 뿌리로 기(氣)를 순조롭게 운행시키고 울결(鬱結)을 풀어주며 한(寒)을 제거하고 통증을 멎게 하는 효능을 가진 약재로 알려져 있다. 또한, 장연동 운동을 촉진하며, 항혈전작용, 지혈 작용에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

“소목”은 혈액 순환을 촉진하고 어혈을 없애며 부기를 가라앉히고 복통을 진정시키는데 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 부인들의 심복통, 무월결, 산후 어혈로 배가 아픈 경우, 이질, 파상풍, 부스럼 등에 처방되고 있다.

“향부자”는 신경성 식욕부진, 신경성 위무력증에 작용하여 소화, 흡수를 촉진하므로 복부팽만감의 개선, 간기능을 강화를 통한 만성 간염의 개선, 자궁근육경련을 억제에 효과가 있는 약재로 알려져 있다. 또한, 향부자의 Cyperene 등의 정유가 식욕을 증진하고 대뇌피질을 흥분시켜 우울증을 개선하는 것으로 알려져 있다.

“홍화”는 뇌혈전 억제작용 및 항혈전 작용이 있는 것으로 알려져 있어 통경이나 어혈을 다스리는 약으로 처방되어 왔으며, 다량의 칼슘을 함유하고 있어 뼈가 아프거나 골절되었을 경우 민간요법으로 널리 처방된다. 특히 홍화씨는 골절과 골다공증, 생리불순 등에　좋은 것으로 알려져 있다.

“도인”은 Prunus (persica, davidiana)의 종인(種仁)으로써 어혈(瘀血)이 뭉친 것을 풀어주고 혈행(血行)을 돕고 마른 것을 윤기있게 하고, 장(腸)을 부드럽게 하는 효능이 있는 약재로 알려져 있다.

“계피” Cinnamic aldehyde성분이 혈관을 확장하여 말초세포에 혈액과 영양공급을 원활히 하며, 항보체활성화(抗補體活性化)작용이 있어서 말초혈관 확장작용과 더불어 신경통, 관절통, 좌골신경통 등의 증상을 완화하고 위장관 점막에의 혈류부족에 의한 소화불량과 한냉통(寒冷痛)에 작용하여 소화를 촉진하고 소화관의 온난감(溫暖感)을 상승시키는 것으로 알려져 있다.

“감초”란 관상동맥의 운동능을 강화하므로 계지의 혈관확장 작용과 함께 심장의 기외수축을 완화하고 Glycyrrhetic acid가 Phospholipase A2 활성(活性)을 억제하고 Prostaglandin 생성을 저해(沮害)하여 진통작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 기관지평활근 경련을 억제하여 진해(鎭咳)작용을 하며, 과도한 위액분비를 억제하고 궤양을 수복하기도 한다.

본 발명이 목적하는 염증성 질환 예방 및 치료용도를 위해서 상기 9종의 복합 약재는 혼합비를 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 바람직한 성분비로 당귀 18 내지 19 중량%, 작약 10 내지 12 중량%, 오약 10 내지 12 중량%, 소목 10 내지 12 중량%, 향부자 10 내지 12 중량%, 홍화 9내지 10 중량 %, 도인 7 내지 8 중량 %, 계피 6내지 8 중량%, 감초 5 내지 7 중량%으로 처방될 수 있다.

본 발명의 염증 질환 예방 및 치료용 조성물을 얻기 위해서는 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피, 감초의 열수 추출물을 이용할 수 있으며, 열수 추출은 바람직하게는 약 100℃에서 1시간 내지 3시간 동인 추출하여 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물은 당귀 추출물, 작약 추출물, 오약 추출물, 소목 추출물, 향부자 추출물, 홍화 추출물, 도인 추출물, 계피 추출물 및 감초 추출물의 혼합물을 이용할 수 있다.

본 발명은 염증성 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 패혈증, 패혈성 쇼크, 만성 폐염증 질환, 기관지 염증, 폐렴에 대하여 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다.

또한 본 발명은 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 9종 복합 생약의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 이용함으로써 폐의 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1.1 재료의 준비

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 와 Sulforaphane은 모두 시그마(Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고 TLR4-특이적 Escherichia coli LPS 는 Alexis Biochemical (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. 본 실시예에 사용되는 모든 항체는 모두 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.

특이적 SPF(specific pathogen-free)를 근친교배한 수컷 C57BL/6 마우스는 Samtaco Bio Korea, Ltd. (Osan, Korea)에서 구입하였으며, 실험 전에 동물들은 표준 실험 케이지에 사육하고 음식과 물을 자유롭게 섭취하도록 공급하였다. 모든 과정은 NIH of Korea Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 수행되었으며, 모든 과정은 부산대학교의 윤리위원회의 승인을 받아 이루어졌다.

1.2. 당귀수산 추출

“당귀수산”이란 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초 9종의 식물성 약재를 포함하는 처방법을 말한다. 당귀수산을 구성하는 상기 9종의 약재는 모두 한국 울산 소재의 광명제약에서 구입하였다. 9가지 식물성 약재의 구성은 표 1에 나타내었으며, 이하 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피, 감초의 복합 제재를 당귀수산이라고 한다.

당귀수산	Scientific name	Herbal name	Amount (g)
당귀	Angelica gigas Nakai	Angelicae gigantis Radix	5.625
작약	Paeonia lactiflora Pall	Paeoniae Radix	3.75
오약	Lindera strichnifolia Fernandez-Villar	Linderae Radix	3.75
소목	Caesalpinia sappan L.	Sappan Lignum	3.75
향부자	Cyperus rotundus L.	Cyperi Rhizoma	3.75
홍화	Carthamus tinctorious L.	Carthami Flos	3.0
도인	Prunus persica Batsch	Persicae Semen	2.655
계피	Cinnamomum cassia Presl	Cinnamomi Cortex	2.25
감초	Glycyrrhiza uralensis Fisch	Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	1.875
	총량		30.405

당귀수산 60g을 취하여 한약추출기(대원당, 한국)를 이용하여 1L의 증류수로 가열한 후 100 ^oC 에서 2시간 동안 추출하고 최종적으로 당귀수산의 추출물 200ml를 얻었다. 원심분리 및 -80^oC 에서 증발을 이용한 감압 동결건조를 수행하여 무균상태에서 상등액 4.6g 최종적으로 얻었다. 감압 동결건조된 당귀수산의 추출물은 멸균된 인산완충식염수에 용해시켰다.

1.3. 폐염증의 평가

그람 음성의 Escherichia coli LPS (serotype 055:B5) 주입 전에 1g/kg으로 당귀수산의 추출물을 마우스에 경구적으로 15일 동안 주입하였다. 이는 일반적으로 한의학에서 처방되는 당귀수산의 추출물의 양보다 약 8배 정도 많은 양으로 마우스들은 LPS 를 주입한지 24시간 후에 희생되었다.

정중절개와 멸균된24-gauge 혈관 내 카테더(intravascular catheter)에 의해서 기관을 드러냈다. PBS 1.0ml를 2번 연이어 떨어뜨림으로써 기관지 폐포 세척(Bilateral bronchoalveolar lavage, BAL)을 수행하고 BAL 플루이드에 존재하는 세포 수를 혈구계수기로 계수하였다. 그리고 BAL 플루이드의 세포는 원심분리기의 일종인 사이토스핀(cytospin)에 의하여 분리되어 준비되었으며 대식세포, 림프구 또는 호중구의 구별을 위하여 Hemacolor(Merck, Darmstadt, Germany)로 염색하였다.

총 300개의 세포를 계수하고 각각의 현미경 필드에 100개씩 나누었다. 이후의 실험 결과는 각 필드에 존재하는 세포 수의 평균값으로 나타낸다.

폐 조직을 모으기 위하여 마우스에 살린을 살포하였고 전체 폐를 고정제(fixatives)를 이용하여 부풀게 하였다. 파라핀에 담근 후, 5μm 섹션으로 절단하였으며, 각각을 charged slide에 위치시켰다. 그리고 hematoxylin 과 eosin (H&E) 염색법을 통하여 단편을 염색하였다. 3가지 분리된 H&E-염색 섹션이 200배율의 현미경을 통하여 마우스 별로 평가되었다.

1.4. 세포배양

RAW 264.7 세포와 HEK 293세포를 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) 로부터 구입하였고, 10 % (v/v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)이 보충된 L-글루타민(200 mg/L) (Hyclone; Logan, UT, USA) 과 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에서 배양하였다.

세포들은 배양 후, humidified 인큐베이터에서 5 % CO_{2 ,,} 37 ℃로 유지되었다.

1.5. 새포 생존력 평가

MTT 에세이를 통해 세포의 생존력을 평가하였다. Griess 반응 이후, MTT 용액(2.0 mg/ml)를 96 well plate에서 배양되는 각각의 세포 웰(well)에 첨가하였다.

CO₂ 세포배양인큐베이터 에서37 ℃로 배양하고 4시간 후, 상등액을 제거하고 살아있는 세포에서 microplate reader를 이용하여 formazan crystals 형태를 540nm에서 측정하였다. 살아있는 세포의 퍼센트는 상기 처리가 되지 않은 세포를 대조군으로 계산하였으며, 모든 실험은 독립적으로 3번 반복 수행되었다.

1.6. 세포로부터 RNA 분리 및 RT - PCR 수행

총 RNA는 Trizol reagent를 사용하여 제조업자의 방법에 따라서 분리하였다.

RNA의 농도를 스펙트로포토미터로 측정한 후, 3μg의 RNA를 M-MLV 역전사효소(Promega, Madison, WI, USA)에 의해 역전사 시킨 후, 특이적 프라이머(표2)를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭시켰다.

Target gene	Oligonucleotide sequences (5' to 3' direction )	Expected size	Accession Number
GCLC	CACTGCCAGAACACAGACCC ATGGTCTGGCTGAGAAGCCT	239 bp	NM010295
HO-1	TGAAGGAGGCCACCAAGGAGG AGAGGTCACCCAGGTAGCGGG	373 bp	NM010442
NQO1	ACTACGCCATGAAGGAGGCT TTCCAGCTTCTTGTGTTCGG	224 bp	NM008706
GAPDH	GGAGCCAAAAGGGTCATCAT GTGATGGCATGGACTGTGGT	203 bp	NM008084

PCR 증폭을 위하여, TaqPCRx DNA 폴리머라아제, Recombinant(Invitrogen) 를 이용하였으며 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 초기 denaturation을 95 ℃에서 5분간 수행한 후, denaturation을 95 ℃에서 30초 동안 28싸이클 동안 수행하였다. 이후 58 ℃ (NQO1: 55 ℃)에서 30초간 annealing하였으며, 72 ℃에서 40초간 extension하였다. 최종 extension은 8분 동안 72℃에서 수행하였다.

Amplicon이 1×TBE 버퍼의 1.5% 아가로스 겔에서 100V로 30분 동안 분리되었으며, ethidium bromide로 염색되어 UV 광원 하에서 시각화되었다. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)가 GCLC, HO-1 및 NQO1의 상대적인 발현을 측정하기 위한 내부 대조군으로써 사용되었다.

1.7. 웨스턴 블랏 분석

5×10⁶ cells의 총 세포 추출물이 준비되었고 핵단백질은 NE-PER nuclear extraction kit를 이용하여 제조업자의 프로토콜(Thermo Scientific, IL, USA)에 따라 분리되었다.

단백질의 양은 Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 의하여 측정되었다. 단백질 동일 양을 SDS-PAGE에 의하여 분획하고 PVDF 막(Bio-Rad Laboratories)으로 이동하였다. 블랏은 Nrf2, β-actin 및 lamin A/C에 대한 폴리크로날 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양되기 전에 적어도 1시간 동안 5%의 무지방 dry milk로 블록되었다.

HRP 와 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한 후, chemiluminescence (SuperSignal^® West Femto, Thermo Scientific)에 의하여 밴드가 나타났다.

1.8. 웨스턴 블랏 분석

NF-κB 전사활성을 측정하기 위하여, NF-κB 리포터 구조를 가지고 안정적으로 트렌스펙션될 수 있는 264.7 세포를 제조하였다. 리포터 구조는 HSV minimal thymidine kinase promoter의 상부에 위치하는 5' HIV-long terminal repeat (2개의 NF-Κb 결합부위, GGGACTTTCC를 포함)로부터 36-base enhancer의 4개 tandem 카피를 가지고 있으며 복제되어 pEGFPLuc (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 삽입되었다

리포터 구조는 Lipofectimine (Invitrogen)에 의하여 RAW 264.7세포로 삽입되었고, 트렉스펙션된 세포들은 G418 (600 μg/ml, Invitrogen)하에서 선택되었다.

NF-κB reporter construct를 포함할 수 있는 후보 세포라인은 루시퍼라아제 활성의 유도를 테스트하였다. HEK 293 세포들은 tk-Renilla 루시퍼라아제 구조와 IKK-β 발현 플라스미드(a gift from Dr. Michael Karin at University of California, San Diego, USA)와 마찬가지로 일시적으로 NF-κB 리포터 구조가 트렌스펙션되었다.

루시퍼라아제 에세이는 듀얼 루시퍼라아제 에세이 키트를 가지고 수행되었고 제조업자의 매뉴얼에 따라 수행되었다. NF- κB 매개 루시퍼라아제 활성은 안정된 세포 라인의 총 세포 용해물에서의 단백질의 양에 의하여 표준화되거나 HEK293세포의 tk-Renilla 루시퍼라아제 활성에 의하여 표준화 되었다.

1.9. 활성산소종 생성 및 염증성 싸이토카인의 측정

RAW 264.7 세포 내의 활성 산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성을 carboxy-H₂DCFDA (5-(6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, OR, USA))에 의하여 측정하였다.

다양한 약학적 처리 이후에, 배지에서 RAW 264.7 세포에 100 μM carboxy-H₂DCFDA를 처리하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였으며, 배양 이후, 세포들을 PBS로 세척하고 BD FACS Canto Ⅱ (BD Biosciences)를 이용하여 형광을 측정하였다.

각각의 염증성 사이토카인들을 ELISA 키트를 사용한 제조업자(BD Biosciences)의 프로토콜에 따라 측정되었다.

1.10. 통계학적 분석

최소 3번의 분리 실험의 mean ± SEM (Std. Err.)로 결과값을 나타내었다.

각 그룹간의 비교를 위하여, paired T tests 또는 unpaired T tests 그리고 one-way analysis of variance (ANOVA) 테스트를 사용하였다(with the assistance of InStat, Graphpad Software, Inc., San Diego, CA). 적어도 0.05 이하의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 보았으며, 모든 실험은 최소 3번 독립적으로 수행하였다.

2.1 당귀수산의 수용성 추출물의 폐 염증 완화

당귀수산의 추출물이 세포 내에서 염증반응을 조절하는 지 확인하기 위하여, 당귀수산의 수용성 추출물을 준비하고 당귀수산의 추출물이 동물 모델의 폐 염증을 완화시킬 수 있는지 확인하였다.

첫째로, 7주령의 C57BL/6 마우스 2개의 그룹을 설정하였으며, 1개의 그룹(average weight 22.58±0.45 g, n=12)은 PBS를 공급하고 나머지 그룹은 체중당(average weight 22.47±0.43 g, n=12) saline 내의 1g 의 당귀수산 추출물을 15일 동안 공급하였다.

15일째, 마우스는 9주령이 되었으며, 부작용을 확인하기 위해서 마우스의 무게를 다시 측정하였다. 도1 에서 도시하는 바와 같이 당귀수산의 추출물을 공급한 마우스는 체중 증가가 뚜렷하지 않았다(2^nd and 4^th columns; PBS-fed: DS-fed = 24.66±0.44 g: 24.49±0.48 g, p=0.7839). 또한, 투약 기간 동안 죽은 개체도 없었다.

이러한 결과는 투여되는 당귀수산 추출물의 복용량이 마우스에 어떠한 부작용도 유발하지 않는다는 것을 나타낸다.

다음, 인산완충식염수 또는 당귀수산의 추출물을 공급했던 각각의 마우스 그룹을 다시 반으로 나누어 각 그룹의 반에 intranasal LPS (5mg LPS/kg body weight, n=6)를 투여하였다.

LPS 투여 24시간이 지난 후, 마우스들은 폐의 염증 분석을 위하여 안락사 되었다. 도2에서 도시하는 바와 같이, 폐 단편의 조직학적 검사는 폐에서의 염증세포 유입이 증가된 것을 확인할 수 있어 비강내의 LPS 주입이 폐의 염증을 유발하였음을 알 수 있었다. 그러나 당귀수산(DGSS)의 추출물을 처리한 그룹의 경우 뚜렷하게 이러한 증상이 감소되었음을 확인할 수 있었다 .

이러한 결과와 일치하게 BAL 플루이드에서의 세포의 계수는 LPS 처리군이 폐에서의 뚜렷한 염증성 세포의 유입이 나타나는 것을 보여준다. 이러한 염증성 세포의 유입은 당귀수산 처리군의 경우 52.54% 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

이러한 결과들은 당귀수산의 추출물이 폐의 염증을 완화시킨다는 것을 뚜렷하게 보여주며, 당귀수산의 수용성 추출물이 항염증 기능을 수행할 수 있음을 나타낸다.

2.2. 당귀수산의 추출물의 Nrf2 활성화와 Nrf2 조절 유전자의 발현 유도 확인

당귀수산의 추출물이 폐의 염증을 완화하는 것을 확인하고, 당귀수산의 추출물이 폐의 염증을 막는 것으로 알려진 마스터 전사 요소 Nrf2 활성화를 시킬 수 있는 지 여부에 대하여 추가적인 연구를 수행하였다.

이를 확인하여 위하여 쥐과의 매크로파지 세포 라인인 RAW 264.7 세포를 사용하였다.

첫째로, MTT 에세이를 이용하여 뚜렷한 세포 독성을 나타내지 않는 최적의 당귀수산의 추출물의 투여량을 결정하였다.

RAW 264.7 세포들에 다양한 양의 당귀수산의 추출물을 16시간 동안 처리하였다. 그리고 세포 독성을 MTT 에세이를 통하여 결정하였다. 도 4에서 도시하는 바와 같이 당귀수산의 추출물 투여량은 10 내지 100 μg/ml 범위에서 RAW 264.7 세포의 생존력에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

다음으로 Nrf2 활성화에 의하여 매개되는 당귀수산의 추출물의 항염증 효과 가능성을 확인하였다. 이 후 세포들에 당귀수산의 추출물을 같은 양으로 처리하였다. 처리 후 16시간이 경과하고, 처리된 세포의 핵 분획을 핵 Nrf2를 위한 웨스턴 블랏을 통하여 분석하였다. Nrf2의 잘 알려진 활성 촉진자인 Sulforaphane(SFN)과 같이 당귀수산의 추출물이 Nrf2의 핵 위치화를 유도한다는 것을 확인하였다(도5a) 도5a 와 같이 당귀수산의 추출물10 μg/ml을 처리한 경우 핵 Nrf2가 검출되었고50 μg/ml의 당귀수산의 추출물을 처리한 경우 당귀수산의 추출물이 Nrf2의 활성화를 유도한다는 것을 뚜렷하게 확인할 수 있었다.

Nrf2가 당귀수산에 의하여 활성화되는지 검증하기 위하여 Nrf2 의존적 유전자의 발현을 검사하였다. GCLC, HO-1 및 NQO-1는 Nrf2 의존적 유전자라는 것이 알려져 있다. GCLC, HO-1 및 NQO-1의 RT-PCR 분석 semi-quantitative 를 수행하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 처리된 세포로부터 총 RNA 를 얻었다. 도5 b의 A와 B에서 도시하는 바와 같이, 당귀수산의 추출물 처리는 Nrf2 의존적 유전자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.

당귀수산의 추출물 활성산소종(ROS)의 생산을 유도하고 그 결과로 Nrf2의 활성화를 유도시키는지 여부에 대하여 검증하기 위하여 당귀수산의 추출물을 처리한 세포로부터 ROS 생산을 측정하였다. RAW 264.7 세포들에 16시간 동안 당귀수산의 추출물을 고농도로(100g/ml) 처리하였다. 또한 flow cytometric 분석 전에 carboxy-H₂DCFDA로 염색되었다. 도 6에서 보이는 바와 같이, ROS를 유도하는 LPS와 달리 당귀수산의 추출물은 ROS 생산을 유도하지 않았다. LPS를 처리한 경우 많은 세포에서 ROS가 생성되나 당귀수산의 추출물을 처리하는 경우 대조군과 유사하게 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 동일 실험을 4시간 동안 수행한 결과 당귀수산의 추출물은 ROS를 유도하지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과들은 당귀수산의 추출물의 항염증 효과가 ROS와 무관하게 직접적으로 Nrf2를 활성화시킴으로써 매개된다는 것을 제시한다.

2.3. NF -κB의 활성화 억제

NF-κB 가 많은 염증성 사이토카인을 조절하는 전사인자로 널리 알려져 있으므로, 당귀수산의 추출물이 이러한 NF-κB의 활성을 억제할 수 있는지 확인하였다. NF-κB-루시퍼라아제 리포터 구조를 안정적으로 전달할 수 있는 RAW 264.7세포라인을 사용하였다. 도7에서 도시하는 바와 같이 TLR4 특이적 LPS (100 ng/ml)를 18시간 동안 처리하자 강한 루시퍼라아제 활성이 나타났으며, 이는 LPS 처리가 NF-κB 매개 전사를 세포 라인에서 활성화시키는 것을 의미한다(도 7의 3번째 칼럼). 세포 라인에 당귀수산의 추출물을 미리 처리한 경우 NF-κB의 활성이 뚜렷하게 억제되는 것을 확인할 수 있었고(도7의 4번째 내지 6번째 칼럼), 이는 당귀수산의 추출물이 TLR4 신호전달에 영향을 미치는 것을 의미한다.

당귀수산의 추출물이 NF-κB의 활성을 조절하는 기작을 확인하기 위해 NF-κB 리포터 구조뿐만 아니라 TLR4를 발현하지 않는 HEK-293세포를 이용하여 트랜스펙션을 수행하였다. NF-κB활성화를 위한 주요 키나아제인 IKK-ß를 코딩하고 있는 플라스미드를 세포에 트렌스펙션하였다. 트랜스펙션 24시간 뒤, 트렌스펙션 된 세포들에 다양한 양의 당귀수산의 추출물을 루시퍼라아제 에세이 전에 16시간 동안 처리하였다. 도 8에서 나타내는 바와 같이 당귀수산의 추출물은 IKK-ß 유도 NK- κB 의 활성화에는 뚜렷한 영향을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 당귀수산의 추출물은 NK- κB 의 전사활성은 억제하나 IKK-ß에 직접적으로 영향을 주지 않으며, TLR4신호전달에서 IKK-ß의 상부 흐름에 의하여 활성을 나타내는 것을 의미한다.

활성화된 매크로파지가 TNF-α, IL-1β, MCP-1, IL-6 과 같은 다양한 염증성 사이토카인과 케모카인을 생산하고 NF-κB가 이러한 유전자들의 발현을 조절하므로, 우리는 당귀수산의 추출물이 매크로파지에서 염증성 분자 의존적 NF- κB 의 생산을 억제하는지 확인해보았다. RAW 264.7세포를 당귀수산의 추출물로 16시간 처리하고 LPS(100 ng/ml)를 처리하였다. LPS 처리 18시간 후, 세포배양상층부에서 염증성 분자가 flow cytometric 분석에 의하여 검출되었다. 도 9에서 도시하는 바와 같이 LPS 처리는 염증성 사이토카인인 TNF-α, MCP-1, 및 IL-6를 RAW 264 세포에서 유도하였다. 이것은 당귀수산의 추출물의 처리에 의하여 뚜렷하게 감소되었다. 이러한 결과들을 당귀수산의 추출물이 NF-κB 활성화를 억제하여 다양한 염증성 사이토카인, 케모카인의 생산을 억제한다는 것을 의미하며 이를 통해 효과적인 염증 치료제로 사용 가능함을 의미한다.

Claims (6)

1. 당귀, 작약, 오약, 소목, 향부자, 홍화, 도인, 계피 및 감초의 9종 복합 생약의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 9종의 복합 생약은 당귀 18 내지 19 중량%, 작약 10 내지 12 중량%, 오약 10 내지 12 중량%, 소목 10 내지 12 중량%, 향부자 10 내지 12 중량%, 홍화 9내지 10 중량 %, 도인 7 내지 8 중량 %, 계피 6내지 8 중량% 및 감초 5 내지 7 중량%의 혼합물인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 9종의 복합 생약의 추출물은 물로써 열수 추출되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 열수 추출은 100℃ 에서 1시간 내지 3시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크, 만성 폐렴 및 기관지 염증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
   
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 폐의 염증을 감소시키는 방법.
   

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