KR20130078227A - 신규 폴리엔 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항진균제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 니스타틴 유사 신규 폴리엔 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항진균제에 관한 것으로, 상기 니스타틴 유사 폴리엔 화합물인 NPP는 하나의 당을 포함하는 니스타틴과 비교할 때 300배 높은 용해도와 10배 감소한 용혈성(세포독성)을 나타내면서도 항진균 활성을 유지하기 때문에 약물동력학적으로 용해성이 향상되고 독성이 감소한 신규 폴리엔 항진균제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 폴리엔 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항진균제{New polyene compound, preparation method thereof and antifungal agent comprising the same}
본 발명은 생물학적인 공정을 통해 제조된 수용성이 개선되고 낮은 용혈 활성을 갖는 니스타틴 유사 신규 폴리엔 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항진균제에 관한 것이다.
진균(fungi)은 핵과 세포소기관을 가진 전형적인 진핵생명체로, 피부조직에 침투해 유발시키는 진균 감염성 피부질병(Dermatomycoses), 폐를 통해 우리 몸 안으로 들어와 인체를 감염시켜 질병을 유발시키는 전신성 진균병(systemic mycoses), 또는 AIDS나 장기이식 환자들처럼 면역력이 떨어진 사람들에게 발병하는 기회성 진균감염병(opportunistic mycoses) 등의 형태로 인체에 감염되어 다양한 질병을 일으킨다.
이러한 질병들의 치료를 위한 항진균제의 필요성에도 불구하고, 전신 감염증을 치료하기 위한 시판의 의약품의 수는 극히 적어 최근 세포벽의 특정 구성 요소를 타겟으로 하는 항진균제 예를들어, 에키노칸딘(echinocandins)이 개발되었지만, 암포테리신 B, 니스타틴을 포함한 아졸 및 폴리엔 등 대부분은 진균막의 구조적 완결정을 타겟으로 한다.
아졸(azole) 계열의 항진균제는 부작용이 적어 널리 사용되었지만, 최근 아졸(azole) 내재성 내성균의 증가와 이들 내성균에 의한 감염이 증가하면서 치료에 어려움을 겪고 있고, 새로운 항진균 치료제 개발이 절실한 상황이다.
그리고, 폴리엔 계열은 이들의 항진균 활성으로 인해 매우 흥미로운 폴리케톤 마크로라이드계 약제로서, 이들 화합물은 자외선/가시광선 영역에서 특징적인 스펙트럼으로 발색단을 형성하는 다수의 콘쥬게이트된 이중결합을 가진 거대 락톤 환을 포함한다.
항진균제으로서 암포테리신 B, 니스타틴 등의 항진균 활성은 폴리엔 분자와 스테롤을 함유하는 막 사이의 상호작용에 의한 것으로 알려져 있고, 이러한 상호작용은 이온의 채널을 형성하고, 그 막이 투과성으로 되어 전기화학적 구배가 파괴되어 그 결과 세포 죽음을 초래한다. 이들 화합물은 콜레스테롤을 함유하는 막(포유동물의 세포)보다 에르고스테롤(트리파노소마(Trypanosoma) 및 리슈마니아(Leishmania) 등의 기생충 및 진균의 막에 존재하는 주요 스테롤)을 함유하는 막에 대하여 상당히 큰 친화성을 나타낸다. 그러나, 폴리엔과 콜레스테롤을 함유하는 막 사이의 상호작용도 무의미하지 않아서 저용해도와 함께 용혈 활성과 같은 부작용을 유발하여, 이러한 화합물들은 전신성 진균 감염 치료에 전체적으로 만족스럽지 못한 것으로 알려져 있으며, 특히 최근 생겨난 진균 감염에 대항하는데 사용할 수 있는 더 좋은 대안이 없는 실정이다.
현재 사용되는 항진균제들의 상기 문제들로 인하여, 본 발명자는 내성균을 유발하는 아졸(azole) 계열 항진균제보다는 암포테리신 B(amphotericin B)나 니스타틴과 같은 폴리엔(polyene) 계열의 항진균 물질이 임상적으로 실용적이라 판단하여 폴리엔(polyene) 계열의 신규 항진균 활성 물질을 밝혀내고자 하였으며, 특히 항균 활성이 유지되면서도 수용성이 개선되고 용혈 활성이 감소된 폴리엔 계열 신규 항진균 활성 물질을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 항균 활성이 유지되면서도 수용성이 개선되고 용혈 활성이 감소된 니스타틴 유사 신규 폴리엔 화합물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 항균 활성이 유지되면서도 수용성이 개선되고 용혈 활성이 감소된 니스타틴 유사 신규 폴리엔 화합물의 생물학적 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 항균 활성이 유지되면서도 수용성이 개선되고 용혈 활성이 감소된 니스타틴 유사 신규 폴리엔 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균제를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 식에서,
상기 R은 마이코사민, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 푸코오스, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 푸락토오스로부터 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 당류를 글라이코사이드 결합으로 연결하여 동종 또는 이종의 2 내지 5개의 당류를 포함할 수 있다.
상기 R은 마이코사미닐-(α1-4)-N-아세틸글루코사민일 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 폴리엔 화합물일 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00002
또한, 본 발명은 슈도노카디아 오토트로피카(Pseudonocardia autotrophica)를 이용한 하기 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물의 제조방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 식에서,
상기 R은 마이코사민, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 푸코오스, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 푸락토오스로부터 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 당류를 글라이코사이드 결합으로 연결하여 동종 또는 이종의 2 내지 5개의 당류를 포함할 수 있다.
상기 슈도노카디아 오토트로피카(Pseudonocardia autotrophica)는 KCTC9441 균주인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균제를 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 식에서,
상기 R은 마이코사민, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 푸코오스, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 푸락토오스로부터 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 당류를 글라이코사이드 결합으로 연결하여 동종 또는 이종의 2 내지 5개의 당류를 포함할 수 있다.
하기에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
니스타틴과 같은 폴리엔 항생제는 토양방선균으로부터 생산되는 매우 유용한 항진균 폴리케타이트 화합물로서, 본 발명자들은 이와 유사한 구조를 갖는 폴리엔 화합물을 개발하고자 연구 노력한 결과, 슈도노카디아 오토트로피카 KCTC9441 균주가 신규 화합물인 니스타틴 유사 폴리엔(Nystatin-like Pseudonocardia Polyene; NPP)을 생합성할 수 있으며, 상기 NPP가 니스타틴과 동일한 아글리콘에 독특한 이당인 마이코사미닐-(a1-4)-N-글루코사민을 포함하고 있음을 확인하였다.
NPP 생합성 유전자군 내에 유일하게 존재하는 당 전이 효소 유전자인 nppDI의 기능을 불활성화 시켰을 때 아글리콘이 생합성되고, 이를 유전적으로 다시 보상하였을 때 이당기를 포함하는 완전한 NPP가 생합성 되었으며, 또한 이를 니스타틴의 당전이효소 유전자로 보상하였을 때에도 NPP가 생합성 되는 것으로 보아 NPP 구조 상의 두개의 당은 두개의 다른 당전이효소에 의해 아글리콘에 전이되는 것으로 확인되었다.
또한, 하나의 당을 포함하는 니스타틴과 비교했을 때 NPP는 300배 높은 용해도와 10배 감소한 용혈성(세포독성)을 나타내면서도 항진균 활성을 유지하는 것으로 확인됨에 따라 약물동력학적으로 용해성이 향상되고 독성이 감소한 신규 폴리엔 항진균제 개발을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 항진균제의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.
본 발명에 따른 항진균제는 조성물 총 중량에 대하여 상기 NPP를 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항진균제는 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
이러한 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 항진균제는, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 NPP의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/㎏, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한, NPP의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 항진균제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 니스타틴 유사 폴리엔 화합물인 NPP는 하나의 당을 포함하는 니스타틴과 비교할 때 300배 높은 용해도와 10배 감소한 용혈성(세포독성)을 나타내면서도 항진균 활성을 유지하기 때문에 약물동력학적으로 용해성이 향상되고 독성이 감소한 신규 폴리엔 항진균제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 천연 NPP 관련 산물의 구조를 나타낸 것으로서, A에서 1은 NPP, 2는 니스타틴 A1, 3은 ESK601 돌연변이로부터 축적된 화합물의 구조를 의미하며, B는 중요한 1H-1H 상관관계 및 long-range 1H-13C 상관관계를 나타내며, C는 ESK604 돌연변이에서 축적된 화합물의 구조를 나타낸다.
도 2는 슈도노카디아 오토트로피카에서 nppDI 유전자의 비활성화에 관한 것으로서, A는 △nppDI 돌연변이 ESK601을 생산하기 위한 NppDI에서의 464개 아미노산의 인프라임 결실의 모식도, B는 야생형 및 돌연변이 게놈 DNA의 PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 nppDI 및 nysDI를 갖는 ESK601 돌연변이에서 nppDI 유전자의 보상성에 관한 것으로서, A는 ermE*pSET152 벡터 내로 nppDI 및 nysDI의 클로닝을, B는 슈도노카디아 오토트로피카 ESK602 YEME 액체 배지로부터 유래한 DNA 시료를 이용한 PCR 결과를, 슈도노카디아 오토트로피카 ESK603 YEME 액체 배지로부터 유래한 DNA 시료를 이용한 PCR 결과를 나타낸다.
도 4는 슈도노카디아 오토트로피카 야생형, ESK601, ESK602 및 ESK603 돌연변이에 의해 생산된 대사물의 분석에 관한 것으로서, A는 야생형, B는 ESK601, C는 ESK602, D는 ESK603을 의미한다.
도 5는 NPP 및 니스타틴의 항진균 활성을 산출하기 위한 회귀곡선이다.
도 6은 NPP 및 니스타틴의 용혈 활성을 산출하기 위한 회귀곡선이다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 균주, 플라스미드, 성장 조건 및 DNA 조작 준비
본 실시예에서는 다음 표 1에 개시된 박테리아 균주 및 플라스미드를 사용하였다.
균주, 플라스미드 특성 출처
균주 　 　
Escherichia coli 　 　
DH5α Cloning host 　
ET12567/pUZ8002 Strain for intergeneric conjugation; Kmr,Cmr Gene. 111:61-68, 1992
Pseudonocardia autotrophica 　
KCTC9441 Wild type, NPP producer KCTC
ESK601 ΔnppDImutant
ESK602 nppDI-complemented ESK601
ESK603 nysDI-complemented ESK601
ESK604 Δer5mutant
Fungi
Candida albicans ATCC10231 Yeast-like fungi ATCC
재조합 플라스미드 　 　
T&A cloning vector General cloning plasmid Real Biotech Corporation
pKC1139-tsr E. coli-P.autotrophicaconjugativevector,atemperature-sensitivesuicidevector,Aprr,Thior　 J Ind. Microbiol. Biot. 36:1425-1434, 2009
ermE*pSET152 E. coli-P.autotrophicaconjugativevector　 Gene. 116:43-49, 1992
pMJDI nppDI replacement vector
pMJC5 ER5 replacement vector　
pMJPDI Vector fornppDIcomplementation,Hygr　
pMJYDI Vector for nysDIcomplementation,Hygr　
슈도노카디아 오토트로피카(Psuedonocardia autotrophica) 균주는 포자 형성을 위하여 ISP 배지 2(글루코오스 0.4%, 효모 추출물 0.4%, 말트 추출물 1%, 한천 2%) 하 30℃에서 배양하였다. 슈도노카디아 오토트로피카 포자를 재현탁하고 -20℃에서 20% 멸균 글리세롤 용액에 저장하였다.
총 DNA 분리를 위하여 포자 현탁액을 25ml의 YEME 액체 배지에 접종시킨 후, 30℃에서 2일 동안 배양하였다. 본 실시예에서 사용한 총 DNA 분리 방법은 종래 알려진 방법(Genetic Manipulation of Streptomyces; A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, 1985)에 따라 수행하였다.
모든 대장균 균주는 사용 시에 적절한 항생제로 보강된 LB 배지(Luria-Bertani) 또는 LB 한천에서 37℃에서 배양하였다. DNA 조작을 위한 유전적 기법은 종래 알려진 방법(Molecular Cloning; A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989)을 사용하였다. 대장균 및 아가로오스 겔로부터 DNA 단편의 분리는 LaboPass 키트(Cosmo Genetech, Korea)를 사용하여 수행하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 코스모 제네텍으로부터 구매하였으며, 표 2에 나타내었다. NPP 생합성 유전자 클러스터의 DNA 서열은 이전에 보고된 바 있다(J Ind. Microbiol. Biot. 36:1425-1434, 2009).
올리고뉴클레오타이드 서열 a 제한부위
DI.N.F 5'- GGATCCGGTCGAACAGCGTG-3'(서열 1) BamHI
DI.N.R 5'- ACTAGTCTGATCCTGCGCCT-3'(서열 2) SpeI
DI.A.F 5'- ACTAGTACCCGTCGCGTGGCGC-3'(서열 3) SpeI
DI.A.R 5'- GGTACCGCTGATCCCGAACGA-3'(서열 4) KpnI
DI.checkF 5'- TGACGTAGTCGAGCTCGT - 3'(서열 5)
DI.checkR 5'- ATCAACTACCTGATCGCT - 3'(서열 6)
PDI.comp.F 5'- AGATCTACCGAGGACTAGGGATT -3'(서열 7) BglII
PDI.comp.R 5' - TCTAGATGACTCCCTGGTTCGGT - 3'(서열 8) XbaI
YDI.comp.F 5' - GGATCCACGGGCATTG GCCACA - 3'(서열 9) BamHI
YDI.comp.R 5' - TCTAGAGTCAGTCGGTTGCCAGG - 3'(서열 10) XbaI
Comp.checkF 5' - TGCAGCTGGCACGACAGG - 3'(서열 11)
ER5.AT.F 5'- TCGAGTCCTGGGGGATCCGT- 3'(서열 12) BamHI
ER5.DH.R 5'- CCGTGTCGGTACCTTCACCGT - 3'(서열 13) KpnI
ER5.ER.F 5'- GTGGGTACCCCGCTGCCGGT - 3'(서열 14) KpnI
ER5.KS.R 5'- AGCCCTCTCTAGAGTCGCC - 3'(서열 15) XbaI
ER5.checkF 5'- ACTGTTCGCGCTCGACTGGAC - 3'(서열 16)
ER5.checkR 5'- TGGTCAGCAGCAGATGCCGCA - 3'(서열 17)
a 제한효소 부위를 표시함.
< 실시예 2> nppDI 결실 돌연변이 슈도노카디아 오토트로피카 ESK601 구축
pKC1139-매개 이중교차 재조합에 의해 nppDI 유전자를 파괴시켰다. nppDI 업스트림 영역을 포함한 2.3 kb BamHI/SpeI 단편을 올리고뉴클레오타이드 DI.N.F 및 DI.N.R을 이용하여 슈도노카디아 오토트로피카 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였다. nppDI 다운스트림 영역을 포함한 1.5 kb SpeI/KpnI 단편을 올리고뉴클레오타이드 DI.A.F 및 DI.A.R을 이용하여 슈도노카디아 오토트로피카 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였다. 이렇게 얻어진 2개의 PCR 산물을 T&A 클로닝 벡터(RBC)에서 각각 클론하였고, BamHI/SpeI 및 SpeI/KpnI 각각을 이용하여 이렇게 얻어진 구축물을 절개하고, pKC 1139-tsr로부터 온 7.5kb BamHI/KpnI 단편을 이용하여 연결하여 nppDI 인프라임 결핍용 플라스미드 pMJDI를 얻었다.
이렇게 얻은 pMJDI를 먼저 전자천공을 통해 E.coli ET12567/pUZ8002로 삽입시킨 후, 컨쥬게이션을 통해 슈도노카디아 오토트로피카 KCTC9441로 도입시켰다. 28℃에서 16시간 동안 배양한 후, 각 플레이트를 치오스트렙톤 및 아프라마이신을 각각 50 ㎍/ml의 농도로 포함한 1ml의 멸균 증류수로 덮었다. 이렇게 얻어진 접합완료체(exconjugant)를 37℃에서 배양하여 유전자 재조합을 유도하였고 항생제 선별을 통해 상동의 재조합체를 획득하였다. 이렇게 얻어진 접합완료체를 항생제가 있는 ISP2 플레이트와 항생제가 없는 ISP2 플레이트 상에 동시에 스트리킹하여 항생제가 없는 플레이트에서만 생장하는 콜로니를 선별하고, 이로부터 DNA를 선별한 후 올리고뉴클레오타이드 DI.checkF-DI.checkR 쌍을 이용하여 PCR 증폭으로 확인하였다.
<실시예 3> nppDI 결핍 돌연변이 ESK601의 보상용 플라스미드 pMJPDI 및 pMJYDI 구축
nppDI 코딩 서열을 포함한 1578 bp 단편을 올리고뉴클레오타이드 PDI.comp.F 및 PDI.comp.R을 이용하여 슈도노카디아 오토트로피카 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 T&A 클로닝 벡터(RBC)에서 클론하였고, 시퀀싱하였으며, 또한 BglII/XbaI 단편을 이용하여 얻어진 구축물을 절개하였고, 통합 벡터ermE*pSET152의 BamHI/XbaI로 연결하여 플라스미드 pMJPDI를 얻었다.
nysDI 코딩 서열을 포함한 1658 bp 단편을 YDI.comp.F 및 YDI.comp.R을 이용하여 S. noursei 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 T&A 클로닝 벡터(RBC)에서 클론하였고, 시퀀싱하였으며, 또한 BglII/XbaI 단편을 이용하여 얻어진 구축물을 절개하였고, 통합 벡터ermE*pSET152의 BamHI/XbaI로 연결하여 플라스미드 pMJYDI를 얻었다.
이렇게 얻어진 재조합 플라스미드를 각각 P.autotrophica ESK601 돌연변이 균주로 각각 삽입시켜 ESK602(pMJPDI로 보상) 및 ESK603(MJYDI로 보상) 유도체를 얻었다.
<실시예 4> NPP 정제 및 LC-MS/NMR 분석
1. NPP 정제
앞서 기술한 바와 같이 YEME 배지(증류수 1L 중 효모 추출물 3 g, 박토-펩톤 5 g, 말트 추출물 3 g, 글루코오스 10 g, 수크로오스 340 g, MgCl2·6H2O 5 mM 포함) 10L에 10% 부피의 포자배양액을 접종하여 8일간 배양한 발효배양액(10 L)을 2.5L 부탄올로 3번 추출하였다. 이렇게 얻어진 유기상을 모으고 진공 증발기를 이용하여 농축하였다. 이러한 조추출물을 메탄올에 용해시키고, 실리카겔(YMC, 50 mm)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 통해 분리하였다. 이때, 이동상으로 메탄올-물 (60:40, v/v)을 사용하였다. 각 분획을 HPLC로 분석하여 NPP 함유 분획을 모으고 농축하고 메탄올에 재용해시켰으며 세파덱스 LH-20으로 충진된 1.2미터 긴 컬럼을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에 로딩하였다. 95% 이상의 순도를 갖는 NPP 함유 분획을 모았다. 진공 증발을 통해 메탄올을 제거한 후, 약 20mg의 NPP를 얻었다.
2. NPP 분석 방법
Agilent 1100 시리즈 LC/MSD 트랩 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여 LC-MS 분석을 수행하였으며, 이때 ZORBAX RX-C18 컬럼(5 μm, 4.6×150 mm, Agilent)을 사용하였다. 상기 컬럼을 50% 용매 A(50 mM 암모늄 아세테이트 pH 6.5) 및 50% 용매 B(메탄올)로 평형시키고, 다음과 같은 구매를 통해 전개시켰다. 즉, 0.6 ml/min의 유속과 380 nm에서 UV/vis 검출로 50% B (0분), 90% B (21분), 100% B (25 내지 30분), 50% B (33 내지 35분)로 전개시켰다.
질량분석기를 양이온 검출 모드로 운전하여 100 내지 1500 m/z 사이로 스캔을 고정시켰다. NMR 데이터는 Bruker NMR 분광분석기(500 MHz) 상에서 기록하였다.
3. NPP 분석 결과
1) NPP는 이당류 마이코사민 (α1-4)-N-아세틸-글루코사민을 갖는 니스타틴 유사 테트라엔 폴리엔이었다.
NPP의 UV/Vis 흡광도 프로파일은 니스타틴과 동일하였으며, 1H-NMR 및 13C-NMR 분석을 통해 전형적인 이중결합인 12개의 프로톤 신호(δH: 5.39-6.20 ppm)와 관련 탄소 원자(δC: 129.4-135.4 ppm)를 포함하며, NPP가 니스타틴 유사 폴리엔 화합물임을 확인하였다(도 1A 및 도 2 참조).
그러나, 고성능 ESI-MS 부석을 통해 NPP의 정확한 질량이 1129.6006 [C55H89N2O22]+(cacld. 1129.5901)으로, 니스타틴의 203 Da보다 큰 것으로 확인되었다. DEPT, 1H-1H COSY, HSQC 및 HMBC을 포함한 1D 및 2D NMR 분석을 이용하여 NPP의 구조를 도 1A와 같이 결정하였다.
500 MHz 분광분석기에서 측정된 화합물 1 및 화합물 2의 1H 및 13C 화학적 시프트는 표 3(DMSO-d6) 및 표 4(CD3OD)에 각각 나타내었다. D2O가 첨가되었을 때 1H-NMR 분석(DMSO-d6)에서 δH 7.81 (d, J=7.5Hz,1H)의 프로톤 신호가 사라졌으며, 어떤 탄소에 대한 이러한 프로톤의 비상관성이 HSQC 분석에서 확인되었다. 따라서, 이러한 결과는 아마이드 프로톤의 존재를 나타내는 것이다. 암포테리신 A의 알려진 NMR 데이터와 비교하여, δH 1.79에서 일중항 메틸 프로톤 신호, 메틸탄소에 대한 δC 23.0와 카보닐탄소에 대한 δC 169.0에서 관련 탄소 신호의 관찰을 통해 아세틸기의 존재가 관찰된 점에서 명확한 차이를 나타낸다.
프로톤(δH 7.81)과 탄소(δC 169.0) 간의 상관관계는 N-아세틸기의 존재를 컨펌하였다. 다른 유의적인 차이는 δH 4.35 (d, J=8.0Hz, 1H)에서 이중항 프로톤 신호의 존재를 포함한다. 이는 HSQC 및 HMBC와 함께 1H-1H COSY 분석에서 N-아세틸-글루코사민의 아노머 프로톤으로 결정되었다(도 1B). 이당류 형성을 위하여 4'-위치에서 마이코사민에 N-아세틸-글루코사민의 부착은 C-4'의 화학적 시프트가 82.4 ppm, H-4' 및 C-1'' 뿐 아니라 H-1'' 및 C-4' 간의 상관관계를 통해 입증되었다(도 1b). 따라서, NPP는 마이코사민에 N-아세틸-글루코사민을 1→4 연력하여 형성된 이당류를 가지며, 니스타틴과 동일하게 테트라엔 폴리엔 마크로락톤 코어를 포함하는 것으로 확인하였다.
위치
 Chemical shift(ppm)a 프로톤 Chemical shift (ppm)
1H NMR 13C NMR 1H NMR 13C NMR
1 170.4 32 5.96 129.4
2 2.33 42.5 33 5.51 135.4
3 4.02 65.7 34 2.24 40.4
4 1.50 44.3 35 3.15 75.6
5 3.80 67.9 36 1.79 39.9
6 1.36-1.42 44.3 37 5.07 70.3
7 3.59 69.4 38 1.11 16.6
8 1.36-1.46 28.4 39 0.87 12.0
9 1.38 34.5 40 0.97 16.9
10 3.22 73.3 41 172.0b
11 3.90 70.2 1' 4.46 97.1
12 1.55, 1.68 42.2 2' 3.73 68.7
13 97.5 3' 2.78 54.6
14 1.16, 1.88 44.3 4' 3.16 82.4
15 3.99 65.9 5' 3.15 76.7
16 1.88 57.8 6' 1.16 17.5
17 3.98 65.5 1'' 4.36 102.0
18 1.70, 1.78 37.5 2'' 3.40 55.7
19 4.32 75.5 3'' 3.40 73.7
20 5.74 134.2 4'' 3.06 70.5
27 5.68 134.2 5'' 3.15 71.3
28 2.18 31.8a 6'' 3.45, 3.75 61.0
29 2.18 31.6a COCH 3 1.79 23.0
30 5.51 131.2 CO 169.0
31 5.96 131.1
위치
 Chemical shift (ppm)a 위치
 Chemical shift (ppm)
1H NMR 13C NMR 1H NMR 13C NMR
1 173.0 19 4.38 71.4
2 2.44 43.9 20 5.69 136.7
3 4.20 68.6 27 5.67 135.7
4 1.62 45.2 28 2.20 33.7
5 4.01 70.8 29 2.20 33.7
6 1.47 45.2 30 5.54 133.0
7 3.78 72.2 31 5.97 132.9
8 1.42 39.0b 32 6.02 131.9
9 1.44 39.5b 33 5.47 136.3
10 1.44, 1.52 38.8b 34 2.40 42.3
11 4.17 68.5 35 3.28 78.8
12 1.66 48.0 36 1.92 42.1
13 99.2 37 5.20 73.3
14 1.32, 2.04 45.1 38 1.19 17.4
15 4.24 67.8 39 0.96 12.9
16 2.14 59.1 40 1.04 17.5
17 4.15 69.4 41 177.0
18 1.77, 1.86 42.4
2) 슈도노카디아 오토트로피카에서 nppDI의 불활성화는 니스타티놀라이드와 동일한 NPP 아글리콘 생산을 야기하였다.
NPP 구조는 니스타틴 아글리콘(니스타티놀라이드)과 동일하게 38원자로 이루어진 마크로락톤 고리와 C-19 위치에 이당류 부분을 갖는 폴리엔 마크로라이드이었다. 높은 상동성으로 이전에 확인된 니스타틴 생합성 유전자인 NPP 생합성 유전자 클러스터는 글리코실트랜스퍼라아제를 코팅하는 1470 bp-nppDI 유전자를 포함하며, 이는 C-19 하이드록실에서 NPP 아글리콘에 당 부분의 부착에 기여할 것으로 추정된다.
마이코사민 부착에 대한 NppDI의 역할을 규명하기 위하여, 온도 감응성 자살벡터 pKC1139-tsr를 사용하여 P. autotrophica에서 nppDI의 1392 bp 내부 영역을 제거하여 nppDI의 인프라임 결핍 돌연변이를 제작하고(도 2A), 재조합 균주 ESK601을 얻었다. nppDI 유전자 결실은 관련 NppDI 단백질에서 489개 아미노산 중 464개를 제거시켰다. ESK601 균주에서 결실에 인접한 염색체 DNA 영역의 DNA 서열 분석을 통해 예견된 돌연변이를 확인하였고, 유전자 치환 절차 과정에서 어떠한 예측하지 못한 병소가 도입되지 않음을 확인하였다(도 2B).
ESK601 돌연변이에 의한 폴리엔 마크로라이드 생산을 분석하기 위하여, 균주를 8일 동안 배양하고 DAD(diode array detector)-HPLC를 이용하여 배지 추출물에서 NPP-관련 폴리엔 마크로라이드의 존재를 분석하였다. 이러한 분석을 위해 각각의 돌연변이에 대한 몇몇 독립적인 클론을 사용하였다. 화합물 3은 ESK601에서 축적되었고, 이러한 구조는 LC-MS 및 NMR 분석을 통해 확인되었다. LC-MS 분석은 [C41H63O14]-(calculated mass 763.43)에 대한 m/z 763.31에서 신호를 포함한다(도 4B).
이러한 분석을 이용하여 상기 화합물의 질량이 화합물 1보다 364 Da 정도 작은 것을 확인하여 이당류와 산소 원자 둘다 아글리콘으로부터 없어진 것을 알 수 있었다. 대규모 아글리콘 3의 제조를 위하여 10L 발효 배양액에서 수행하였다. 화합물 1 및 3(8 mg)의 제조 및 정제 후, 1H NMR, 13CNMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC 및 HMBC을 이용하여 구조 분석을 수행하였다. 화합물 3의 프로톤 및 탄소 화학적 시프트는 화합물 1에서 프로톤 및 탄소 원자의 화학적 시프트를 근거로 하여 수행하여 표 3과 같다. p450 모노옥시게나아제에 의해 촉매작용을 받을 것으로 예상되는 C-10 위치에서 하이드록시기를 제외하고, PKS 조합 라인에 의해 도입된 모든 하이드록시기들은 예상대로 확인되었다. MS 및 NMR 분석과 함께, 상기 화합물은 C-10 하이드록시와 C-19 이당류 그룹이 없는 ESK601 돌연변이에서 축적되었다(도 1). 이러한 분석을 통해 이당류 그룹은 화합물 3에는 존재하지 않고, 따라서 NppL은 C-10 위치에서 NPP에 하이드록시기를 부여하지 않았다. 이러한 결과는 마이코사민을 이용한 글리코실화 반응이 암포테리신 생합성에서 C-8 하이드록시화 뿐 아니라 니스타틴 생합성에서 C-10 하이드록실화에 일반적으로 앞서 진행됨을 알 수 있다. 따라서, NppL은 C-10 위치에서 NPP 아글리콘을 하이드록실화 할 수 없을 것이다.
3) ESK601 돌연변이에서의 nppDI 또는 nysDI의 발현은 NPP 생산을 복귀시켰다.
NppDI가 NPP 아글리콘의 글리코실화에 중요한지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 ermE*p 프로모터의 통제 하에서 nppDI를 발현시켜 ESK601 돌연변이의 유전자간 상보성(trans-complementation) 검토를 수행하였다. 본 실험을 위하여, 본 발명자는 nppDI의 코딩 영역이 클론된 통합 접합 벡터인 ermE*pSET152를 사용하여 pMJPDI를 얻었다(도 3A). 상기 플라스미드를 접합에 의해 P. autotrophica ESK601 내로 도입시키고, 얻어진 P. autotrophica ESK602 균주를 PCR 분석을 통해 확인하였다(도 3B).
DAD-HPLC-MS 분석을 통해 NPP 생산은 ESK602 돌연변이에서 복구되는 것을 확인하였으며(도 4C), ESK601로부터 NPP의 부존재는 nppDI 유전자의 결실에 기인하는 것을 알 수 있었다.
데이터베이스 관련 in silico 분석을 통한 nppDI 유전자 산물의 추가적인 특징은 489개 아미노산 함유 단백질을 코드하여 니스타틴 생산 S. noursei로부터 온 글리코실트랜스퍼라아제 NysDI 및 암포테리신 생산 S. nodosus으로부터 온 글리코실트랜스퍼라아제 AmphDI와 각각 82% 및 78% 아미노산 동일성을 나타내는 것으로 확인되었다.
NPP 및 니스타틴 유전자 클러스트는 글리코실트랜스퍼라아제 유전자인 nppDI 및 nysDI을 각각 포함하기 때문에, NPPDI 또는 NYSDI와 다른 알려지지 않은 글리코실트랜스퍼라아제들을 사용하여 NPP의 C-19 이당류 글리코실화를 확인하였다.
ermE*pSET152에서 ermE*p 프로모터의 통제 하에서 클론된 nysDI으로 보상을 위한 플라스미드 pMJYDI를 얻었다. 상기 플라스미드를 ESK601 돌연변이 균주로 도입시켜 ESK603을 얻었다. DAD-HPLC-MS 분석을 통해 ESK601 돌연변이의 pMJYDI을 통한 보상으로 (ESK603) 화합물 1의 야생형 생산 패턴으로 복구됨을 확인하였다(도 4D).
이러한 결과는 NppDI의 글리코실화 기능이 마이코사민을 C-19 위치로 전달시키는 NysDI에 의해 치환됨을 알 수 있었다. 따라서, NPP에서 N-아세틸-글루코사민의 추가적인 부착은 NPP 생합성 유전자 클러스터 밖에 존재하는 또다른 글리코실트랜스퍼라아제에 의해 처리됨을 알 수 있다.
<실시예 5> 용해도 측정
니스타틴의 폴리엔 영역은 매우 비극성이며, 이는 진균 세포막 내로 스테롤 간의 소수성 상호작용을 증진시키며 분자의 폴리올 성분을 내부 수용성 채널 내로 배열시킨다. 그러나, 나스타틴의 낮은 극성은 인간 치료 동안 투여 시에 의미있는 곤란을 야기하므로, 추가적인 N-아세틸-글루코사민 부분의 효과를 검토하기 위하여, 본 발명자는 분광분석법을 이용하여 니스타틴 A1 뿐 아니라 정제된 NPP의 용해도를 측정하였으며, 이때 표준물로서 10 mmol Tris-HCl(pH 7.0)의 수용성 완충액을 사용하였다.
즉, 니스타틴 A1(Sigma, N6261)의 스탁 용액 표준물(1.2 mg/ml)과 앞선 실시예에서 정제된 NPP(12 mg/ml)를 메탄올에서 준비하였다. 각 스탁의 100㎕를 24시간 동안 진공 하에서 동결건조 시켰다. 10 mmol Tris-HCl 완충액 (pH7.0)을 니스타틴에는 50㎕, NPP에는 2㎕씩 첨가하여 15분 이상 강렬하게 진탕하여 포화시켰다. 원심분리 후, 상기 용액 중 폴리엔 농도를 적절한 희석 후 SHIMADZU UV-1601 UV/Vis 분광분석기를 이용하여 UV 흡광도 분석을 통해 측정하였다. 특히, 306 nm에서 특징적인 테트라엔 UV 피크를 실험적으로 결정된 흡광계수(J. Med. Chem. 49: 2431-2439, 2006)를 사용하여 정량하였다.
그 결과, 니스타틴 A1 및 NPP의 용해도는 각각 0.11 mg/ml 및 34.7 mg/ml로 나타났으며, 추가적인 N-아세틸-글루코사민 그룹을 함유한 NPP는 니스타틴 A1보다 300배 높은 수용해성을 나타내었다. 따라서, NPP에서의 추가적인 N-아세틸-글루코사민 그룹은 이의 수용성을 유의적으로 증가시킴을 알 수 있었다.
<실시예 6> 항진균 활성 분석
폴리엔 마크로라이드 생활성 분석을 위해 테스트 유기체로는 Candida albicans ATCC10231을 사용하였고, 이를 NaCl 없는 YM 배지 120 ㎕(웰당 1,000 CFU의 접종물을 이용함)과 희석된 폴리엔 마크로라이드 시료 30 ㎕에서 배양하였다. 상기 항생제를 메탄올에서 단계 희석하여 테스트 유기체의 성장 억제를 완료하기 위해 어떠한 억제를 초래하지 않는 농도를 사용하였다. 희석된 항생제를 갖는 테스트 유기체 배양물을 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 교반없이 30℃에서 배양하였다. 12시간, 14시간 및 16시간 후, TECAN Infinite F50 마이크로타이터 플레이트 리더를 이용하여 492nm에서 광학밀도를 기준으로 성장을 측정하였다. 광학밀도는 항생제 농도에 대해 플롯하였고, 50% 억제되는 MIC는 50% 성장 억제에서 회귀곡선으로부터 산출하였다.
그 결과, 도 5와 같이 NPP의 MIC50은 1.08 ㎍/ml인 반면, 동일 조건 하에서 니스타틴의 MIC50은 0.43 ㎍/ml로서, NPP의 항진균 활성이 약 2배 정도 낮았으며, 항진균 활성이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
<실시예 7> 인비트로 용혈 활성 측정
폴리엔 마크로라이드용 용혈 활성을 마크로라이드가 탈섬유소 말혈액에서 적혈구의 용출을 야기하는 능력을 모니터링하여 측정하였다(Gene. 111: 61-68, 1992). 다른 폴리엔 마크로라이드 농도(10 내지 500 ㎍/ml in DMSO)를 갖는 시료(0.1 ml)를 정제 폴리엔의 스탁 용액(5 mg/ml in DMSO)으로부터 준비하였다. 희석된 시료를 2.5% 탈섬유소 말혈액(KisanBiotech, Korea)을 포함한 말혈액-인산-완충 생리식염수(PBS) 0.9 ml로 혼합하였고, 37℃에서 수욕상에서 배양하였다. 시료를 30분에 모아 5,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 OD540를 측정하였다. 100% 용혈을 증류수 중 2.5% 말혈액의 현탁액으로부터 얻어진 OD540 값으로 정의하였고, 0.1 ml DMSO를 첨가한 0.9 ml 말혈액-PBS를 블랭크로 사용하였다. 각 실험은 3회 반복되었고, 니스타틴 함유 시료를 표준물로 사용하였다.
그 결과, 도 6과 같이 NPP의 HC50은 403.7 ㎍/ml인 반면, 동일 조건 하에서 니스타틴의 HC50은 33 ㎍/ml으로 나타나서 NPP의 용혈 활성은 10배 정도 더 낮은 것으로 확인되었다.
이러한 결과로부터 추가적인 N-아세틸-글루코사민 부분은 폴리엔 마크로라이드계 항생제의 용혈 활성을 감소시키는 것으로 확인되었다.
니스타틴 NPP 배 (NPP/ Nystatin)
용해능 (mg/ml) 0.11±0.03 4.7±0.45 315.5
항진균 활성 (IC50,㎍/ml) 0.43±0.02 1.08±0.06 2.5
용혈 활성 (HC50,㎍/ml) 33±0.54 403.7±0.97 12.2
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> New polyene compound, preparation method thereof and antifungal agent comprising the same <130> DP-2011-0785 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DI.N.F <400> 1 ggatccggtc gaacagcgtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DI.N.R <400> 2 actagtctga tcctgcgcct 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DI.A.F <400> 3 actagtaccc gtcgcgtggc gc 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DI.A.R <400> 4 ggtaccgctg atcccgaacg a 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DI.checkF <400> 5 tgacgtagtc gagctcgt 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DI.checkR <400> 6 atcaactacc tgatcgct 18 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI.comp.F <400> 7 agatctaccg aggactaggg att 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDI.comp.R <400> 8 tctagatgac tccctggttc ggt 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YDI.comp.F <400> 9 ggatccacgg gcattggcca ca 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YDI.comp.R <400> 10 tctagagtca gtcggttgcc agg 23 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Comp.checkF <400> 11 tgcagctggc acgacagg 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER5.AT.F <400> 12 tcgagtcctg ggggatccgt 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER5.DH.R <400> 13 ccgtgtcggt accttcaccg t 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER5.ER.F <400> 14 gtgggtaccc cgctgccggt 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER5.KS.R <400> 15 agccctctct agagtcgcc 19 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER5.checkF <400> 16 actgttcgcg ctcgactgga c 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ER5.checkR <400> 17 tggtcagcag cagatgccgc a 21

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00005

    상기 식에서,
    상기 R은 마이코사민, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 푸코오스, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 푸락토오스로부터 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 당류를 글라이코사이드 결합으로 연결하여 동종 또는 이종의 2 내지 5개의 당류를 포함함.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 R은 마이코사미닐-(α1-4)-N-아세틸글루코사민인 것을 특징으로 하는 폴리엔 화합물.
  3. 슈도노카디아 오토트로피카(Pseudonocardia autotrophica)를 이용한 하기 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00006

    상기 식에서,
    상기 R은 마이코사민, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 푸코오스, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 푸락토오스로부터 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 당류를 글라이코사이드 결합으로 연결하여 동종 또는 이종의 2 내지 5개의 당류를 포함함.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 슈도노카디아 오토트로피카(Pseudonocardia autotrophica)는 KCTC9441 균주인 것을 특징으로 하는 폴리엔 화합물의 제조방법
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 폴리엔 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균제:
    [화학식 1]
    Figure pat00007

    상기 식에서,
    상기 R은 마이코사민, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 푸코오스, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 푸락토오스로부터 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 당류를 글라이코사이드 결합으로 연결하여 동종 또는 이종의 2 내지 5개의 당류를 포함함.

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GB0712881D0 (en) * 2007-07-03 2007-08-15 Biosergen As Compounds
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