KR20130075324A

KR20130075324A - 유전적으로 변형된 박테리오파아지를 이용한 파아지 자가 조립 구성물, 그 형성 방법 및 그 구성물을 활용한 신소재

Info

Publication number: KR20130075324A
Application number: KR1020110143653A
Authority: KR
Inventors: 남창훈; 김용준
Original assignee: 키스트 유럽 에프게엠베하
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2013-07-05

Abstract

본 발명은 A. 세린 유전자를 파아지의 8번 표면단백질 유전자 앞부분에 집어넣어 파아지 게놈을 재구성하는 단계; B. 상기 세린 유전자 함유 파아지 게놈을 박테리아에 주입하고 증폭시키는 단계;C. 재구성된 파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양하여 세린을 몸통에 진열시킨 파아지(fd-p8SSG)를 다량으로 분리 정제하는 단계;D. 정제된 재조합 파아지를 포함한 용액에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)을 침지하여 파아지에 양극성을 부여하도록 변형시키는 단계;E. 상기 변형된 파아지와 fd파아지를 이온결합시키는 단계;를 포함하는 파아지 번들 또는 파아지 네트워크 형성방법을 제시한다. 본 발명에 의하면 파아지 번들링을 통하여 길이가 길고 두꺼운 파아지의 장섬유 형태의 합성기술 개발 및 소재의 물리적, 화학적 연구를 통한 신소재 및 신소자 개발에 이용할 수 있다. 또한 나노 구조 기반의 일정하고 통제 가능한 형태와 크기의 파아지 장섬유 제조 기술 개발을 통한 초 고민감 바이오센서 특성 연구에 활용할 수 있다.

Description

유전적으로 변형된 박테리오파아지를 이용한 파아지 자가 조립 구성물, 그 형성 방법 및 그 구성물을 활용한 신소재{Self assembly material of genetically modified bacteriophage and its Methods and Materials of phage fabrication}

본 발명은 박테리오파아지를 이용한 파아지 구성물, 그 형성 방법 및 그 구성물을 활용하여 생성되는 신소재에 관한 것으로, 유전자 재조합 기법에 의해 파아지 게놈을 변형시킴으로써 파아지의 몸통 표면이 양성 전하를 띠도록 하여 이를 몸통에 음성 전하를 띠는 변형 전 파아지와 반응시켜 번들 또는 네트워크 구조를 가지는 박테리오파아지를 이용한 파아지 구성물, 그 형성 방법 및 그 구성물을 활용하여 생성되는 재료에 관한 것이다.

파아지 진열 기법은 1985년 George Smith 박사가 처음으로 그 아이디어를 제안함으로써 시작되었다(Smith GR. 1985 Science. 228(4705): 1315-1317). 이는 파아지가 그 전체 게놈의 길이가 길지 않아 이를 유전자 조합 기법으로 변형시킴으로써 그것의 표면 단백질 외부에 목적하는 펩타이드나 단백질을 진열시킬 수 있다는 원리로부터 시작된 아이디어이다. 파아지는 3, 6, 7, 8, 9번과 같이 모두 5가지 종류의 표면 단백질을 보유하고 있는데 그 중 3번과 8번 단백질이 이러한 진열에 널리 활용되고 있다. 우선 파아지 게놈 내에 있는 3번이나 8번 단백질 유전자의 앞쪽에 해당 응용에 적합한 형태의 물질(단백질이나 펩타이드)에 해당하는 염기서열을 적당한 규모의 임의성을 견지한 채 첨가하고, 이로부터 만들어진 재조합 파아지 유전자군을 박테리아에 주입함으로써 첨가된 물질을 3번이나 8번 표면단백질의 표면에 진열한 파아지군을 얻을 수 있게 된다. 이 군 속에 들어 있는 어떤 개체가 목적하는 타겟물질을 고선택성과 고친화도를 견지한 채 붙잡는지 스크리닝 과정을 통해 선별해내게 된다. 이 기법을 활용하여 특정 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 분자 인지물질의 개발이 이뤄져 왔다.

본 발명은 길이가 800nm이고 직경이 5nm 정도인 생체로서 파아지를 파아지 다발을 통하여 길이가 길고 두꺼운 파아지를 만듦으로써 산업용 제품으로 응용 가능케 하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 서로 다른 극성을 지니는 파아지끼리 반응하여 번들을 구성함으로써 장섬유 형태의 나노구조체를 제조하고 이를 다양하게 응용하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, (A) 제1 물질 대응 유전자를 파아지의 기설정된 단백질의 기설정된 부위에 집어넣이 질 수 있도록 파아지 게놈을 재구성하는 단계; (B) 상기 제1 물질 대응 유전자를 함유하는 재구성된 파아지 게놈을 박테리아에 주입하고 증폭시키는 단계; (C) 상기 재구성된 파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양하여 상기 제1 물질을 몸통에 진열시킨 파아지를 다량으로 분리 정제하는 단계; (D) 정제된 제1 물질을 몸통에 진열시킨 파아지를 포함한 용액에 제2 물질을 침지하여 파아지에 양극성을 부여하도록 변형시키는 단계; 및 (E) 양극성이 부여된 파아지와 음극성을 띄는 파아지를 결합시키는 단계;를 포함하며, 상기 제1 물질은 상기 제2 물질과의 결합을 유도할 수 있는 기능기를 가지는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법을 제시한다.

상기 제1 물질이 포함하는 기능기는 하이드록실기인 것이 바람직하다.

상기 제1 물질은 세린인 것이며, 상기 제1 물질 대응 유전자는 세린을 합성할 수 있는 것인 것이 바람직하다.

상기 제2 물질은 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)인 것이 바람직하다.

상기 기설정된 단백질은 3번 단백질 및 8번 단백질 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

상기 기설정된 단백질의 기설정된 부위는 파아지의 8번 표면단백질 앞부분인 것이 바람직하다.

상기 (A) 단계는 상기 제1 물질이 상기 파아지의 8번 단백질 또는 3번 단백질 중 어느 하나에 모두 또는 일부에 진열되도록 재구성하는 것인 것이 바람직하다.

상기 (A) 단계는 상기 제1 물질이 상기 파아지의 8번 단백질의 N 첨점에 두개의 세린이 붙어 있도록 처리되는 것인 것이 바람직하다.

상기 (E) 단계에서, 상기 결합은 양극성이 부여된 파아지와 음극성을 띄는 파아지를 기 설정된 비율로 혼합하는 것이며, 상기 비율은 상기 양극성이 부여된 파아지의 양극성의 강도의 정도와 상기 음극성을 띄는 파아직의 음극성의 정도를 고려하여 결정되는 것인 것이 바람직하다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물을 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 파아지 구성물에 있어서, 상기 제1 물질이 몸통에 진열되고, 상기 제1 물질과 결합되는 제2 물질을 통하여 양극성이 부여되는 양극성 파아지; 및 상기 양극성 파아지와 결합되는 음극성을 띄는 음극성 파아지;를 포함하며, 상기 양극성 파아지와 상기 음극성 파아지는 기설정된 비율이 섞여 있는 것이며, 상기 제1 물질은 상기 제2 물질과의 결합을 유도할 수 있는 기능기를 가지는 것인 것이며, 상기 파아지 구성물은 파아지 번들 또는 파아지 네트워크인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물을 제시한다.

상기 제1 물질은 세린인 것이 바람직하다.

상기 비율은 상기 양극성이 부여된 파아지의 양극성의 강도의 정도와 상기 음극성을 띄는 파아지의 음극성의 정도를 고려하여 결정되는 것인 것이 바람직하다.

상기 기설정된 비율은 양극성 파아지 대 음극성 파아지가 10:1 부터 1:10 까지인 것이 바람직하다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기 파아지 구성물을 재료로 사용하여 형성되는 일정하고 통제 가능한 형태와 크기의 생체 폴리머로서의 파아지의 장섬유를 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기 파아지 구성물과 반도체를 포함하는 무기물질이 결합하여 형성된 하이브리드 나노 바이오 소재를 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기 파아지 구성물 위에 SiO₂ 또는 TiO₂ 를 코팅하여 bio-mineralization을 시키고 내부의 파아지는 소거 처리함으로써 기설정된 형태의 나노 구조체를 만드는 탬플릿으로 이용되는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물을 활용하는 나노 구조체 형성용 탬플릿을 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 파아지 구성물 형성 방법에 있어서, (a) 세린 유전자를 파아지의 8번 표면단백질 유전자 앞부분에 집어넣어 파아지 게놈을 재구성하는 단계; (b) 상기 세린 유전자 함유 파아지 게놈을 박테리아에 주입하고 증폭시키는 단계; (c) 상기 재구성된 파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양하여 세린을 몸통에 진열시킨 파아지(fd-p8SSG)를 다량으로 분리 정제하는 단계; (d) 상기 정제된 재조합 파아지를 포함한 용액에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)을 침지하여 파아지에 양극성을 부여하도록 변형시키는 단계; 및 (e) 상기 변형된 파아지와 fd 파아지를 이온 결합시키는 단계;를 포함하며, 상기 파아지 구성물은 파아지 번들 또는 파아지 네트워크인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법을 제시한다.

상기 (a) 단계는, (a-1) 절편 1에 대하여 5' 프라이머 AS for 와 3’프라이머 p8 SS rev 을 첨가하고 dNTP, fd-SN-tet DNA 및 중합효소를 넣어 섞은 후 DNA를 증폭하고 상기 증폭된 DNA를 전기영동한 뒤 추출하고 정제하여 절편 1 - P8SS를 얻는 단계; (b-2) 절편 2에 대하여 5'프라이머 p8 SS for 와 3’프라이머 p10을 첨가하고 dNTP, fd-SN-tet DNA 및 중합효소를 넣어 섞은 후 DNA를 증폭하고 상기 증폭된 DNA를 전기영동한 뒤 추출하고 정제하여 절편 2 - P8SS를 얻는 단계; 및 (c-3) 절편 1-P8SS와 절편 2-P8SS 를 같은 몰 비율로 섞은 후 절편 1-P8SSG의 끝 부분의 DNA 배열과 절편 2-PSSG의 앞부분의 DNA배열이 상보적으로 결합되어 있는 두개의 절편을 템플릿으로 활용하여 절편 1-P8SS의 5'프라이머 AS for 와 절편 2-P8SSG의 3’프라이머 p10 을 첨가하고 dNTP 및 중합효소를 넣어 섞은 후 DNA를 증폭하고 증폭된 DNA를 전기영동한 뒤 추출하고 정제하여 통합절편 3-P8SS를 얻는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 (b) 단계는, (b-1) 상기 통합절편들을 제한효소 BsrGI 과 잘 혼합한 후 기설정된 온도에서 항온 반응한 후 정제를 하고, 제한효소 NotI을 가한 후 기설정된 온도에서 항온 반응한 후 이를 전기영동 하여 가열 추출방식으로 DNA를 분리하는 단계; (b-2) fd-SN-tet를 BsrGI과 NotI 처리 후 탈인산 효소를 첨가하여 기설정된 온도에서 항온 반응을 한 후 정제하는 단계; (b-3) 제한효소로 잘려진 통합절편들과 제한효소 및 탈인산효소로 처리된 fd-SN-tet를 전체 반응액에 가한 후 연결효소(라이게이즈)를 넣어 잘 섞은 후 기설정된 온도에서 항온반응하는 단계; (b-4) 상기 항온반응 결과물을 정제하고 박테리아 세포에 전기충격법을 이용하여 주입하는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 (c) 단계는, 재조합된 파아지가 들어간 것으로 확인된 박테리아를 IPTG와 테트라사이클린을 포함한 2xTY 배지에 넣어 기른 후, 원심분리하고 박테리아는 제거하고, PBS 버퍼에서 투석을 실행한 후 파이지의 정제하는 것이 바람직하다.

제1항에 있어서, 상기 단계 (e) 에서 파아지 구성물 형성을 위한 이온 결합시 상기 변형된 fd-p8SSG 파아지와 fd파아지의 혼합비율은 9:1 인 것이 바람직하다.

파아지 구성물 형성을 위하여 (f) 두 개의 다른 파아지를 동량의 농도로 물리적인 교반하는 단계;를 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 (c) 단계에서 상기 정제된 재조합 파아지는 표면에 하이드록실기가 형성된 것이 바람직하다.

상기 (e) 단계에서 상기 변형된 파아지의 외부의 아민기와 와 fd파아지의 카르복실기가 결합하는 것이 바람직하다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기의 방법에 의해 형성된 파아지 구성물을 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기 파아지 구성물에 의해 형성되는 일정하고 통제 가능한 형태와 크기의 생체 폴리머로서의 파아지 장섬유를 제시한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 달성하기 위하여, 상기 파아지 구성물 구조체 위에 SiO₂ 또는 TiO₂ 를 코팅하여 bio-mineralization을 시키고 내부의 파아지는 소거 처리함으로써 특정 형태의 나노구조체를 만드는 탬플릿으로 이용되는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물을 활용하는 나노 구조체 형성용 탬플릿을 제시한다.

본 발명을 활용하면, 파아지 번들 또는 파아지 네트워크와 같은 파아지 구성물을 생성할 수 있다.

본 발명에 의하면 파아지 번들링을 통하여 길이가 길고 두꺼운 파아지의 장섬유 형태의 합성기술 개발 및 소재의 물리적, 화학적 연구를 통한 신소재 및 신소자 개발에 이용할 수 있다.

또한 파아지 양극과 음극의 정전기적 결합을 이용한 생체 폴리머 개발과 이를 이용한 세포배양 템플릿 및 세포부착개발을 통하여 포유류 세포의 growth, division, differentiation 연구에 적용할 수 있다.

또한 나노 구조 기반의 일정하고 통제 가능한 형태와 크기의 파아지 장섬유 제조 기술 개발을 통한 초 고민감 바이오센서 특성 연구에 활용할 수 있다.

반도체를 비롯한 제반 무기물질과 파아지 구조체(1D: 번들, 2D: 네트위크)와의 화학적 결합을 이용한 차세대 맞춤형 하이브리드 바이오 나노 소재를 개발하는데 이용할 수 있다.

또한 형성된 구조체 위에 SiO₂, TiO₂ 등을 코팅하여 바이오-mineralization을 시키고 내부의 파아지는 소거 처리함으로써 특정 형태의 나노구조체를 만드는 탬플릿으로 활용이 가능하다.

도 1은 파아지 구성물을 형성하는 방법는 일 실시예적 방법에 관한 도면,
도 2는 파아지 구성물을 형성하는 방법는 일 실시예적 방법에 관한 도면,
도 3은 세린유전자가 도입되어 있는 fd-p8SSG phage와의 정전기적 결합을 설명하는 그림,
도 4는 이온 가교된 fd-p8SSG phage 와 fd-phage 에 의한 phage 자가 조립된 네트워크(network) 형성을 보여주는 사진,
도 5는 APTES 가 도입되어 있는 fd-p8SSG phage 와 fd-phage 결합으로 인한 파아지 다발(bundle) 형성을 보여주는 사진이다.
도 6은 fd-SN-tet vector와 두개의 세린이 들어간 fd-p8SSG-tet vector 사이의 염기 서열의 비교를 위한 참고 이미지이다.

이하, 도면을 참조하면서 더욱 더 상세하게 설명한다. 도 1에서 예시되어 있듯이, 본 발명의 파아지 구성물을 형성하는 방법은 (A) 제1 물질 대응 유전자를 파아지의 기설정된 단백질의 기설정된 부위에 집어넣이 질 수 있도록 파아지 게놈을 재구성하는 단계(S11); (B) 상기 제1 물질 대응 유전자를 함유하는 재구성된 파아지 게놈을 박테리아에 주입하고 증폭시키는 단계(S12); (C) 상기 재구성된 파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양하여 상기 제1 물질을 몸통에 진열시킨 파아지를 다량으로 분리 정제하는 단계(S13); (D) 정제된 제1 물질을 몸통에 진열시킨 파아지를 포함한 용액에 제2 물질을 침지하여 파아지에 양극성을 부여하도록 변형시키는 단계(S14); 및 (E) 양극성이 부여된 파아지와 음극성을 띄는 파아지를 결합시키는 단계(S15);를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 파아지 구성물 형성하는 다른 방법은 도 2에서 예시되어 있듯이, (a) 세린 유전자를 파아지의 8번 표면단백질 유전자 앞부분에 집어넣어 파아지 게놈을 재구성하는 단계(S21); (b) 상기 세린 유전자 함유 파아지 게놈을 박테리아에 주입하고 증폭시키는 단계(S22); (c) 상기 재구성된 파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양하여 세린을 몸통에 진열시킨 파아지(fd-p8SSG)를 다량으로 분리 정제하는 단계(S23); (d) 상기 정제된 재조합 파아지를 포함한 용액에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)을 침지하여 파아지에 양극성을 부여하도록 변형시키는 단계(S24); 및 (e) 상기 변형된 파아지와 fd 파아지를 이온 결합시키는 단계(S25);를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 사용된 배경기술은 유전자 재조합기법과 단백질 분리 기법 그리고 전기전도성 측정 기법 등으로 정리될 수 있다. M13 섬사상 박테리오파아지와 같은 파아지의 8번 단백질 유전자에 세린 유전자를 집어넣기 위해서는 우선 파아지 유전자를 원형으로 삼아 돌연변이 PCR을 수행하고 이로부터 얻어진 세린 유전자를 함유하는 파아지 유전자를 박테리아에 집어넣어 대량으로 증폭시켜야 한다. 이를 통해 세린 유전자가 첨부된 파아지 유전자를 얻을 수 있다. 다음 이 재조합 유전자를 박테리아에 집어넣은 후 거기서 발생되는 파아지를 정제하는 과정이 요구된다. 이를 위해서 PEG/NaCl 침전을 통한 단백질 분리기법이 쓰인다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

실시예 1: fd - SN - tet vector 를 원형으로 PCR 을 수행하여 통합절편을 얻는 과정

fd-SN-tet vector (염기 서열 1 참조) 를 원형으로 다음과 같은 조건으로 PCR 을 수행하여 절편 1과 절편 2를 얻었다.

절편 1의 경우 50㎕의 전체 반응액에 2.5㎕의 5' 프라이머 AS for 와 2.5㎕의 3’프라이머 p8 SS rev 을 첨가하고 dNTP 1㎕, fd-SN-tet DNA 0.5㎕ 그리고 중합효소 1㎕를 넣어 잘 섞은 후 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30회 사이클을 반복하여 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 아가 젤에 전기영동한 뒤 예측한 크기의 DNA를 가열 추출기법으로 정제하였다. 이로부터 절편 1 - P8SS를 얻었다.(S는 세린의 약어이다.)

절편 2의 경우 50㎕의 전체 반응액에 2.5㎕의 5'프라이머 p8 SS for 와 2.5㎕의 3’프라이머 p10을 첨가하고 dNTP 1㎕, fd-SN-tet DNA 0.5㎕ 그리고 중합효소 1㎕를 넣어 잘 섞은 후 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30회 사이클을 반복하여 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA를 아가 젤에 전기영동 한 뒤 예측한 크기의 DNA를 가열 추출기법으로 정제하였다. 이로부터 절편 2 - P8SS를 얻었다.

다음, 절편 1-P8SS와 절편 2-P8SS 를 같은 몰 비율로 섞은 후 Assembly PCR을 수행함으로써 원하는 길이의 통합절편 3-P8SSG를 얻었다. 이 때 두개의 짧은 단편들에는 서로 겹쳐지는(Overlapping) 부분들이 포함되어야 하며, 이를 10분간 중탕 가열하여 90분동안 천천히 반응시켜 겹쳐지는 부분 즉 절편 1-P8SSG의 끝 부분의 DNA 배열과 절편 2-PSSG의 앞부분의 DNA배열이 상보적으로 결합되어 있는 두개의 절편을 템플릿으로 활용하여 절편 1-P8SS의 2.5㎕의 5'프라이머 AS for 와 절편 2-P8SSG의 2.5㎕의 3’프라이머 p10을 첨가하고 dNTP 1㎕ 그리고 중합효소 1㎕를 넣어 잘 섞은 후 전체 반응액을 50㎕으로 맞춘 후 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초간 30회 사이클을 반복하여 DNA를 증폭하였다.

증폭된 DNA를 아가 젤에 전기영동한 뒤 예측한 크기의 DNA를 가열 추출기법으로 정제하고 이로부터 통합절편 3-P8SS를 얻었다.

실시예 2: 재조합 파아지 DNA 제조

상기 실시예 1에서 만들어진 통합절편들과 fd-SN-tet를 100㎕의 전체 반응액에 4㎕의 제한효소 BsrGI 과 잘 혼합한 후 3시간 30분간 37℃에서 항온 반응한 후 정제를 하고, 이에 2.5㎕의 제한효소 NotI을 가한 후 37℃에서 4시간 동안 항온 반응한 후 이를 아가 젤에 전기영동 하여 가열 추출방식으로 DNA를 분리하였다. fd-SN-tet의 경우는 BsrGI과 NotI 처리를 마친 다음 여기에 2㎕의 탈인산 효소를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 항온 반응을 한 후 정제하였다.

제한효소로 잘려진 통합절편들과 제한효소 및 탈인산효소로 처리된 fd-SN-tet를 전체 반응액 20㎕에 각각 2㎕와 3㎕씩 가한 후 여기에 1㎕의 연결효소(라이게이즈)를 넣어 잘 섞은 후 16℃에서 18시간 동안 항온반응을 하였다. 상기 항온반응 결과물을 정제하고 미리 준비된 MC1061 박테리아세포에 전기충격법을 이용하여 주입하였다. 전기충격법의 반응조건은 12.5kV/cm, 200오옴, 25mF였다.

전기충격작업이 끝난 후 항생제인 테트라사이클린을 함유한 아가 배지 플레이트에 박테리아들을 발라준 뒤 그 중 살아남은 클론들을 골라내는 방식을 통하여 전기충격법을 통해 제대로 재조합 DNA가 그 안으로 들어간 박테리아들을 선별하였다.

선별된 박테리아들을 2xTY 배지에 넣어 기른 후 그 속에서 재조합 DNA를 정제하고 이를 fd-tet VIII Hoon 프라이머(5'- TCT TTA GTC CTC AAA GCC TCC -3') 를 써서 시퀀싱을 실시하여 제대로 두 개의 세린 유전자가 재조합 DNA에 들어갔는지 확인하였다.

실시예 3: 파아지 정제

실시예 2에서 세린 유전자를 파아지의 8번 표면단백질 유전자 앞부분에 집어 넣어 재조합된 파아지가 들어간 것으로 확인된 선별된 박테리아를 1mM IPTG와 테트라사이클린을 함유한 2xTY 배지에 넣어 기른 후, 원심분리에 의해 supernatant는 새로운 튜브에 옮겨 담고 박테리아는 제거한다.

새로운 튜브에 옮겨 담은 supernatant에 1/5 볼륨의 PEG/NaCl을 넣고 잘 혼합한 후 1시간 동안 얼음에 넣어 4도 저온실에 놓아둔다. 원심분리에 의해 supernatant를 제거하고 튜브는 뒤집어서 5분 정도 말린다. 파아지 pellet을 PBS 버퍼에 잘 녹이고 다시 한 번 centrifuge에 의해 파아지가 녹아있는 supernatant를 새로운 튜브에 옮겨 담는다. 이러한 과정을 다시 한 번 반복한 후, PBS 버퍼에서 투석을 실행하고 0.45㎕ 크기의 필터를 사용하여 파이지의 정제를 한다.

최종적으로 파아지의 8번 단백질의 앞부분에 두 개의 세린이 붙어있도록 재조합된 파아지를 얻게 되었다. 도 6에서는 fd-SN-tet vector와 두개의 세린이 들어간 fd-p8SSG-tet vector 사이의 염기 서열의 비교 그림이 참고적으로 나와 있다.

첨부된 염기 서열에서 알 수 있듯이, 원래의 fd-SN-tet vector의 염기 서열은 아래 서열을 포함하고 있었다.

caaagcctcc gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380

두개의 세린이 들어간 fd-p8SSG-tet vector 사이의 염기서열은 아래 서열을 포함하고 있다.

caaagcctcc gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctt cttagggtga 1380

두개의 세린이 들어간 fd-p8SSG-tet vector 사이의 염기서열에서 확인 할 수 있듯이, fd-SN-tet vector의 염기 서열에 있던 ctg ctg가 ctt ctt로 바뀌었음을 확인할 수 있다. 바뀐 부분은 밑줄로 표시되어 있다.

실시예 4: fd - p8SSG phage 와 fd - phage 에 의한 phage 네트워크( network ) 형성

유전적으로 변형된 파아지의 표면에 하이드록실기를 노출시킨 후, 실란의 도입을 위해 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)을 1%(v/v)농도로 1x10¹²cfu/mL농도의 파아지가 포함된 용액에 상온에서 이틀 동안 침지하였다. 이후 건조기에서 60℃ 에서 한차례 더 침지하여 표면처리를 완료했다. 이 실험에서는 용액의 pH를 일정하게 유지하기 위하여 PBS 버퍼를 사용하였다. 결과적으로 세린의 하이드록실 그룹이 3-아미노프로필트리에톡시실과 결합하면서 파아지 외곽에 양이온을 띄는 아민기가 포함된 fd-p8SSG 파아지를 얻게 되었다. 이로써 이 변형된 fd-p8SSG 파아지와 음이온을 띄는 fd-파아지의 카르복실기가 이온결합을 형성되게 된다.(도 3 참조) 이때 화학적으로 변형시킨 fd-p8SSG 파아지에 변형되지 않은 fd 파아지를 각각 다른 비율의 농도로 주입하면서 시간에 따른 파아지 네트워크 형성을 측정하였다.

특히 9:1 의 비율로 높은 농도(1x10¹²cfu/mL)의 양이온을 띄는 변형된 fd-p8SSG 파아지와 상대적으로 낮은 농도(1x10¹¹cfu/mL)의 음이온을 띄는 fd 파아지를 혼합하여 이온 가교된 파아지의 네트워크가 형성되어 있음을 알 수 있었다.(도 4 참조)

실시예 5: fd - p8SSG phage 와 fd - phage 에 의한 phage 번들 형성

이온가교를 이용한 파아지 네트워크의 제조방법은 매우 간단하나, 높은 농도의 fd-p8SSG파아지를 사용하거나 적절한 농도의 양이온을 띄는 변형된 파아지 용액과의 충분한 혼합이 이루어지지 않으면 균일한 파아지 다발의 형성이 어렵다. 따라서 파아지의 장섬유상 형태를 제조하기 위해서는 변형된 fd-p8SSG 파아지와 fd파아지를 1:9 의 최적화된 혼합비율을 사용하게 되었다.

이온결합을 이용한 파아지 네트워크에 비해 파아지의 다발형성에는 이온결합적 가교뿐만 아니라 물리적인 교반을 도입하였다. 이는 두 개의 다른 파아지를 혼합 시 동량의 농도(1x10¹²cfu/mL)로, 막대자석을 이용하여 50 rpm 이하로 돌려주면서 24시간 동안 충분히 상온에서 반응시켰다. 혼합반응 시 두 종류의 파아지가 서로 좀더 뭉치게 되고 결국에는 파아지 다발이 형성되는 것이 보여졌다. 파아지 다발 형성의 변화는 특히 양쪽 끝은 계속 꼬여지는 현상을 보였고 그 중간 부분은 촘촘하게 긴 섬유상의 형태를 보였다.(도 5 참조)

상기에서는 본 발명 제1 물질과 관련하여, 하이드록실기를 기능기로 가지는 세린을 예시적으로 설명하였지만, 본 발명의 제1 물질은 세린만에 한정되는 것은 아니다. 3-APTES에 관련하여 하이드록실기와 선택적으로 반응을 하게 되는 관점에서 보면 세린 이외에 트레오닌 과 타이로신이 사용될 수도 있다.

양극성을 이용한 결합의 관점에서 볼 때, 화학적으로 변형하되 않은 아미노산 중 양극을 띄는 아미노 (NH³ ⁺) 기능기를 가지는 히스티딘이나 알지닌 그리고 라이신 등도 고려될 수 있다. 다만, 양극성을 띄는 아미노산인 경우 파아지가 조립되는 프로세스가 아주 드물게 일어나며 양산하는데 문제가 있을 수 있다.

본 발명에서 활용할 수 있는 여러 커플링 시약이 있다. 예를 들면, 3-Chloropropyltriethoxysilane과 반응하여 결과적으로 cl-이 진열될 수 있으며 3-Mercaptopropyltriethoxysilane인 경우 sulfide가 진열될 수 있으며, 그 외에도 3-APTES 와 마찬가지로 3-APMES 3-aminopropyl-methyl-diethoxylsiliane 경우도 결합이 가능하여 외부에 아미노기가 위치하게 된다.

본 발명의 실시 예에서는 8번 단백질에 세린 유전자를 삽입하는 것을 설명했는데, 세린 유전자는 3번 단백질에 삽입될 수도 있다. 3번 단백질인 경우 효소를 사용하여 DNA를 자른 다음 바로 연결 효소를 통해 3번 코딩부분을 통해 3번 단백질이 발현이 되지만 8번 단백질인 경우 그 부근에 제한 효소로 자를 수 있는 부분이 없다. 그래서, 8번 단백질을 코딩하는 부분에서 양쪽 끝에서 300에서 400 base pair 떨어진 곳에 제한 효소로 자를 수 있는 부분을 찾아서 8번 코딩 부분을 포함한 약 700 base pair 의 DNA를 주입하게 된다. 따라서, 부가적인 PCR을 병행하게 된다.

상기 제1 물질이 상기 파아지의 8번 단백질 또는 3번 단백질 중 어느 하나에 진열되는 것은 모두 진열되는 방식과 일부 진열되는 방식이 있을 수 있다. 전체를 진열하는 경우, 파아지가 조립이 어려운 문제가 있다. 모든 코팅 단백질인 경우 그만의 여러 가지 물리적 화학적 성질을 가지게 되는데 전체를 바꾸게 되면 파아지의 조립이 되지 않는 경우가 많게 된다. 따라서, 적은 양으로 큰 효과를 보는 경우는 부분적으로 진열하는 것이 더욱 바람직하다.

한편, N 첨점에 즉 파아지의 외곽 쪽에 아미노산인 세린이 한 개에서 5개까지 진열할 수가 있다. 이는 한 개만 진열한 경우도 효과를 보겠지만 많이 진열할수록 더 많은 반응이 일어날 확률이 높게 된다. 외곽에 한 개 또는 2개를 진열할 수 있으며, 3개에서 5개까지 진열할 수도 있다.

양극성이 부여된 파아지와 음극성을 띄는 파아지의 비율은 상기 양극성이 부여된 파아지의 양극성의 강도의 정도와 상기 음극성을 띄는 파아직의 음극성의 정도를 고려하여 결정되는 것인 것이 바람직하다. 실험에 관련하여 10:1 부터 9:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:9 그리고 1:10 의 비율로 확인해본 결과 9:1인 경우가 네트워크 구조 형성에 최적 조건이었다. 9:1인 경우 파아지 네트워크 구조가 형성되었으면 1:9 조합의 경우 파아지 다발이 형성되었다. 이 범위를 벗어날 경우 파아지가 부분적으로 네트워크를 형성하긴 하지만 일정하지 않고 한쪽 극성의 지나친 농도로 인해 반발력이 생기되어 네트워크 형성을 관찰하지 못했다. 마찬가지로 1:9를 벗어난 경우 single 파아지들이 대다수 관찰되었으며 파아지 다발의 크기도 상당히 제한되었다. 따라서 파아지 자가 조립 구조에 합리적인 양극성이 부여된 파아지와 음극성을 띄는 파아지의 비율은 10:1부터 1:10 범위라 할 수 있다. 이러한 최적 비율은 양극성을 부여하는 물질에 따라 달라질 수 있음은 물론일 것이다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 이와 같은 특정 실시예에만 한정되는 것은 아니며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능한 것이다.

본 발명은 바이오 산업, 소재 산업 등에 광범위하게 활용할 수 있다.

<110> KIST-Europe fGMBH <120> Self assembly material of genetically modified bacteriophage and its Methods and Materials of phage fabrication <130> P-2011-1185 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9234 <212> DNA <213> fd-SN-tet vector <400> 1 aacgctacta ccattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120 cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180 gttgcatatt taaaacatgt tgaactacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240 tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactgtctaa tcctgacctg 300 ttggaatttg cttccggtct ggttcgcttt gaggctcgaa ttgaaacgcg atatttgaag 360 tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaattcgct ttgcttctga ctataataga 420 cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480 tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540 aaacatttta caattacccc ctctggcaaa acttcctttg caaaagcctc tcgctatttt 600 ggtttctatc gtcgtctggt taatgagggt tatgatagtg 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ctctctgtaa 3180 aggctgctat tttcattttt gacgttaaac aaaaaatcgt ttcttatttg gattgggata 3240 aataaatatg gctgtttatt ttgtaactgg caaattaggc tctggaaaga cgctcgttag 3300 cgttggtaag attcaggata aaattgtagc tgggtgcaaa atagcaacta atcttgattt 3360 aaggcttcaa aacctcccgc aagtcgggag gttcgctaaa acgcctcgcg ttcttagaat 3420 accggataag ccttctattt ctgatttgct tgctattggt cgtggtaatg attcctacga 3480 cgaaaataaa aacggtttgc ttgttcttga tgaatgcggt acttggttta atacccgttc 3540 atggaatgac aaggaaagac agccgattat tgattggttt cttcatgctc gtaaattggg 3600 atgggatatt atttttcttg ttcaggattt atctattgtt gataaacagg cgcgttctgc 3660 attagctgaa cacgttgttt attgtcgccg tctggacaga attactttac cctttgtcgg 3720 cactttatat tctcttgtta ctggctcaaa aatgcctctg cctaaattac atgttggtgt 3780 tgttaaatat ggtgattctc aattaagccc tactgttgag cgttggcttt atactggtaa 3840 gaatttatat aacgcatatg acactaaaca ggctttttcc agtaattatg attcaggtgt 3900 ttattcatat ttaacccctt atttatcaca cggtcggtat ttcaaaccat taaatttagg 3960 tcagaagatg aaattaacta aaatatattt gaaaaagttt tctcgcgttc 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ccaactgacc 4860 agatattgat tgaaggatta attttcgagg ttcagcaagg tgatgcttta gatttttcct 4920 ttgctgctgg ctctcagcgc ggcactgttg ctggtggtgt taatactgac cgtctaacct 4980 ctgttttatc ttctgcgggt ggttcgttcg gtatttttaa cggcgatgtt ttagggctat 5040 cagttcgcgc attaaagact aatagccatt caaaaatatt gtctgtgcct cgtattctta 5100 cgctttcagg tcagaagggt tctatttctg ttggccagaa tgtccctttt attactggtc 5160 gtgtaactgg tgaatctgcc aatgtaaata atccatttca gacggttgag cgtcaaaatg 5220 ttggtatttc tatgagtgtt tttcccgttg caatggctgg cggtaatatt gttttagata 5280 taaccagtaa ggccgatagt ttgagttctt ctactcaggc aagtgatgtt attactaatc 5340 aaagaagtat tgcgacaacg gttaatttgc gtgatggtca gactcttttg ctcggtggcc 5400 tcactgatta caaaaacact tctcaagatt ctggtgtgcc gttcctgtct aaaatccctt 5460 taatcggcct cctgtttagc tcccgttctg attctaacga ggaaagcacg ttgtacgtgc 5520 tcgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 5580 gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 5640 ttcccttcct ttctcgccac gttctccggc tttccccgtc aagctctaaa 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tggttagcga 7380 tatcttccga agcaataaat tcacgtaata acgttggcaa gactggcatg ataaggccaa 7440 tccccatggc atcgagtaac gtaattacca atgcgatctt tgtcgaacta ttcatttcac 7500 ttttctctat cactgatagg gagtggtaaa ataactctat caatgataga gtgtcaacaa 7560 aaattaggaa ttaatgatgt ctagattaga taaaagtaaa gtgattaaca gcgcattaga 7620 gctgcttaat gaggtcggaa tcgaaggttt aacaacccgt aaactcgccc agaagctagg 7680 tgtagagcag cctacattgt attggcatgt aaaaaataag cgggctttgc tcgacgcctt 7740 agccattgag atgttagata ggcaccatac tcacttttgc cctttagaag gggaaagctg 7800 gcaagatttt ttacgtaata acgctaaaag ttttagatgt gctttactaa gtcatcgcga 7860 tggagcaaaa gtacatttag gtacacggcc tacagaaaaa cagtatgaaa ctctcgaaaa 7920 tcaattagcc tttttatgcc aacaaggttt ttcactagag aatgcattat atgcactcag 7980 cgctgtgggg cattttactt taggttgcgt attggaagat caagagcatc aagtcgctaa 8040 agaagaaagg gaaacaccta ctactgatag tatgccgcca ttattacgac aagctatcga 8100 attatttgat caccaaggtg cagagccagc cttcttattc ggccttgaat tgatcatatg 8160 cggattagaa aaacaactta aatgtgaaag tgggtcttaa aagcagcata 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Claims

(A) 제1 물질 대응 유전자를 파아지의 기설정된 단백질의 기설정된 부위에 주입할 수 있도록 파아지 게놈을 재구성하는 단계;
(B) 상기 제1 물질 대응 유전자를 함유하는 재구성된 파아지 게놈을 박테리아에 주입하고 증폭시키는 단계;
(C) 상기 재구성된 파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양하여 상기 제1 물질을 몸통에 진열시킨 파아지를 다량으로 분리 정제하는 단계;
(D) 정제된 제1 물질을 몸통에 진열시킨 파아지를 포함한 용액에 제2 물질을 침지하여 파아지에 양극성을 부여하도록 변형시키는 단계; 및
(E) 양극성이 부여된 파아지와 음극성을 띄는 파아지를 결합시키는 단계;를 포함하며,
상기 제1 물질은 상기 제2 물질과의 선택적인 결합을 유도할 수 있는 기능기를 가지는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제1 물질이 포함하는 기능기는 하이드록실기인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제1 물질은 세린인 것이며, 상기 제1 물질 대응 유전자는 세린을 합성할 수 있는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 제2 물질은 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 기설정된 단백질은 3번 단백질 및 8번 단백질 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 기설정된 단백질의 기설정된 부위는 파아지의 8번 표면단백질 노출되어 있는 끝부분인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (A) 단계는 상기 제1 물질이 상기 파아지의 8번 단백질 또는 3번 단백질 중 어느 하나에 모두 또는 일부 진열되도록 재구성하는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (A) 단계는 상기 제1 물질이 상기 파아지의 8번 단백질의 N 첨점에 두개의 세린이 붙어 있도록 처리 되는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항에 있어서,
상기 (E) 단계에서, 상기 결합은 양극성이 부여된 파아지와 음극성을 띄는 파아지를 기 설정된 비율로 혼합하는 것이며,
상기 비율은 상기 양극성이 부여된 파아지의 양극성의 강도의 정도와 상기 일반적으로 음극성을 띄는 파아지의 음극성의 정도를 고려하여 결정되는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제 1항 내지 제9항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
상기 제1 물질이 몸통에 진열되고, 상기 제1 물질과 결합되는 제2 물질을 통하여 양극성이 부여되는 양극성 파아지; 및
상기 양극성 파아지와 결합되는 음극성을 띄는 음극성 파아지;를 포함하며,
상기 양극성 파아지와 상기 음극성 파아지는 기설정된 비율이 섞여 있는 것이며,
상기 제1 물질은 상기 제2 물질과의 결합을 유도할 수 있는 기능기를 가지는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
제 11항에 있어서,
상기 제1 물질이 포함하는 기능기는 하이드록실기인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
제 11항에 있어서,
상기 제1 물질은 세린인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
제 11항에 있어서,
상기 제2 물질은 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
제 11항에 있어서,
상기 기설정된 단백질은 3번 단백질 및 8번 단백질 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
제 11항에 있어서,
상기 비율은 상기 양극성이 부여된 파아지의 양극성의 강도의 정도와 상기 음극성을 띄는 파아지의 음극성의 정도를 고려하여 결정되는 것인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
제 1항에 있어서,
상기 기설정된 비율은 양극성 파아지 대 음극성 파아지가 10:1 부터 1:10 범위인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물.
제 10항 내지 제17항 중 어느 한 항의 상기 파아지 구성물을 재료로 사용하여 형성되는 일정하고 통제 가능한 형태와 크기의 생체 폴리머로서의 파아지의 장섬유.
제 10항 내지 제17항 중 어느 한 항의 상기 파아지 구성물과 반도체를 포함하는 무기물질이 결합하여 형성된 하이브리드 나노 바이오 소재.
제 10항 내지 제17항 중 어느 한 항의 파아지 구성물 위에 SiO₂ 또는 TiO₂ 를 코팅하여 bio-mineralization을 시키고 내부의 파아지는 소거 처리함으로써 기설정된 형태의 나노 구조체를 만드는 탬플릿으로 이용되는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물을 활용하는 나노 구조체 형성용 탬플릿.
파아지 구성물 형성 방법에 있어서,
(a) 세린 유전자를 파아지의 8번 표면단백질 유전자 앞부분에 집어넣어 파아지 게놈을 재구성하는 단계;
(b) 상기 세린 유전자 함유 파아지 게놈을 박테리아에 주입하고 증폭시키는 단계;
(c) 상기 재구성된 파아지 게놈을 함유하고 있는 박테리아를 배양하여 세린을 몸통에 진열시킨 파아지(fd-p8SSG)를 다량으로 분리 정제하는 단계;
(d) 상기 정제된 재조합 파아지를 포함한 용액에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)을 침지하여 파아지에 양극성을 부여하도록 변형시키는 단계; 및
(e) 상기 변형된 파아지와 fd파아지를 이온결합시키는 단계;를 포함하며,
상기 파아지 구성물은 파아지 번들 또는 파아지 네트워크인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제21항에 있어서,
상기 (a) 단계는,
(a-1) 절편 1에 대하여 5' 프라이머 AS for 와 3’프라이머 p8 SS rev 을 첨가하고 dNTP, fd-SN-tet DNA 및 중합효소를 넣어 섞은 후 DNA를 증폭하고 상기 증폭된 DNA를 전기영동한 뒤 추출하고 정제하여 절편 1 - P8SS를 얻는 단계;
(b-2) 절편 2에 대하여 5'프라이머 p8 SS for 와 3’프라이머 p10을 첨가하고 dNTP, fd-SN-tet DNA 및 중합효소를 넣어 섞은 후 DNA를 증폭하고 상기 증폭된 DNA를 전기영동한 뒤 추출하고 정제하여 절편 2 - P8SS를 얻는 단계; 및
(c-3) 절편 1-P8SS와 절편 2-P8SS 를 같은 몰 비율로 섞은 후 절편 1-P8SSG의 끝 부분의 DNA 배열과 절편 2-PSSG의 앞부분의 DNA배열이 상보적으로 결합되어 있는 두개의 절편을 템플릿으로 활용하여 절편 1-P8SS의 5'프라이머 AS for 와 절편 2-P8SSG의 3’프라이머 p10 을 첨가하고 dNTP 및 중합효소를 넣어 섞은 후 DNA를 증폭하고 증폭된 DNA를 전기영동한 뒤 추출하고 정제하여 통합절편 3-P8SS를 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제21항에 있어서,
상기 (b) 단계는,
(b-1) 상기 통합절편들을 제한효소 BsrGI 과 잘 혼합한 후 기설정된 온도에서 항온 반응한 후 정제를 하고, 제한효소 NotI을 가한 후 기설정된 온도에서 항온 반응한 후 이를 전기영동하여 가열 추출방식으로 DNA를 분리하는 단계;
(b-2) fd-SN-tet를 BsrGI과 NotI 처리 후 탈인산 효소를 첨가하여 기설정된 온도에서 항온 반응을 한 후 정제하는 단계;
(b-3) 제한효소로 잘려진 통합절편들과 제한효소 및 탈인산효소로 처리된 fd-SN-tet를 전체 반응액에 가한 후 연결효소(라이게이즈)를 넣어 잘 섞은 후 기설정된 온도에서 항온반응하는 단계;
(b-4) 상기 항온반응 결과물을 정제하고 박테리아 세포에 전기충격법을 이용하여 주입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제21항에 있어서,
상기 (c) 단계는,
재조합된 파아지가 들어간 것으로 확인된 박테리아를 IPTG와 항생제인 테트라사이클린을 유한 2xTY 배지에 넣어 기른 후, 원심분리하고 박테리아는 제거하고, PBS 버퍼에서 투석을 실행한 후 파이지의 정제하는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (e) 에서 파아지 구성물 형성을 위한 이온 결합시 상기 변형된 fd-p8SSG 파아지와 fd파아지의 혼합비율은 9:1 인 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제21항에 있어서,
파아지 구성물 형성을 위하여 (f) 두 개의 다른 파아지를 동량의 농도로 물리적인 교반하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제21항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 상기 정제된 재조합 파아지는 표면에 하이드록실기가 형성된 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제21항에 있어서,
상기 (e) 단계에서 상기 변형된 파아지의 외부의 아미노기와 와 fd 파아지의 카르복실기가 결합하는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물 형성 방법.
제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 의해 형성된 파아지 구성물.
제29항의 파아지 구성물에 의해 형성되는 일정하고 통제 가능한 형태와 크기의 생체 폴리머로서의 파아지 장섬유.
제29항의 파아지 구성물과 반도체를 포함하는 무기물질이 결합하여 형성된 하이브리드 나노 바이오 소재.
제29항에 있어서, 파아지 구성물 구조체 위에 SiO₂ 또는 TiO₂ 를 코팅하여 bio-mineralization을 시키고 내부의 파아지는 소거 처리함으로써 특정 형태의 나노구조체를 만드는 탬플릿으로 이용되는 것을 특징으로 하는 파아지 구성물을 활용하는 나노 구조체 형성용 탬플릿.