KR20130060605A - 신규 박테리아 용해 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원하는 위치와 시간에 외래 단백질 또는 핵산 분자를 전달하기 위해, 홀린 비의존성 세균 용해 활성을 갖거나 홀린 의존성 세균 용해 활성을 갖는 신규 폴리펩티드, 그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도를 제공한다.

Description

신규 박테리아 용해 단백질 및 그의 용도{Novel bacterial lysis protein and use thereof}

본 발명은 신규 단백질 및 그의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 박테리아 용해 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.

암은 세포들의 비조절적이고 침습적인 성장으로 정의된다. 이러한 세포들은 신체의 다른 장기에 퍼질 수 있는데, 이를 전이(metastasis)라 한다. 외과적 절제술, 방사선요법 및 화학요법을 포함하는 통상적인 항암치료는 많은 환장의 치료에 있어서 효과적이지만, 암환자의 절반 정도는 이러한 전통적인 치료방법으로 효과를 보지 못한다. 이에, 전통적인 방법을 개선하거나, 보충하거나 또는 대체함으로써 암을 치료할 목적으로 또는 암을 치료할 수 있다고 주장되는 의학적 치료법으로서 대체 기술이 개발되고 있다. 그 중에서, 일부 세균 종은 종양 내에서 증식하고 축척되는 것을 선호하는 것으로 보고된 바 있다. 더구나, 세균은 다중의 치료용 단백질을 동시에 운반하고 발현할 수 있는 능력을 포함하는 유리한 특성들을 가지고 있고, 항생제에 의해 용이하게 제거될 수 있기 때문에, 이러한 점은 세균 치료법이 암 치료에 있어서 희망적인 새로운 전략이 될 수 있음을 시사한다(Nauts et al., Acta Med. Scand. Suppl. 276: 1-103, 1953). 뿐만 아니라, 살아있는 약독화 또는 유전학적으로 변형된 비병원성 세균의 직접적인 종양살해 효과 또는 상기 세균을 이용하여 종양살해 분자를 암 조직에 전달함으로써 항암제로 사용하려는 시도가 있으며, 이러한 접근 방법은 세균이 약물이 효과적으로 도달하지 못하는 종양 조직까지 이동할 수 있다는 점에서 장점을 가지고 있다(Forbes, Nat. Biotechnol., 24: 1484-1485, 2006).

그 중에서도 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)은 운동성을 가진 침습성 그람음성 세균으로서 고형 암에서 군집화할 수 있다(Pawelek et al., Cancer Res., 57: 4537-4544, 1997). 시험관 내 조건에서는 휴지기 종양세포에 의해 생성되는 주화성 화합물이 이러한 효과를 유발하는 것으로 나타났다(Kasinskas and Forbes, Biotechnol. Bioeng., 94: 710-721, 2006). 생체 내 조건에서 살모넬라는 일차적으로 영양성분이 풍부한 괴사 지역에서 군집화하는 것으로 나타났다(Forbes et al., Cancer Res., 63: 5188-93, 2003). 아울러 살모넬라는 프로드러그-변환 효소와 항원과 같은 항암 치료용 분자를 종양으로 전달하는데 성공적으로 이용되어 왔다(King et al., Hum. Gene Ther., 13: 1225-1233, 2002).

그러나, 세균은 일부 예외를 제외하고는 외래단백질을 세포 밖으로 분비하지 않는다(Matsuda et al., Mol. Immunol., 27: 571-519, 1990). 세균으로하여금 외래단백질을 세포 밖으로 분비하기 위해 신호펩티드와의 융합단백질로 재조합 단백질을 이송시키는 것과 같은 다양한 방법이 사용되어 왔다(Blight et al., Trends Biotechnol., 12: 450-455, 1994). 이러한 방법의 가장 큰 문제점은 신호펩티드를 이용한 분비가 외래단백질의 특성에 의존적이라는 점이다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 파지, 특히 람다 박테리오파지의 용해 시스템이 고분자 물질의 방출을 위해 개발되고 사용되어 왔다(Jain and Mekalanos., Infect. Immun., 68: 986-989, 2000). 람다 파지는 세균 세포 용해를 유발하는 두 단백질(S 및 R)을 암호화한다(Garrett et al., Mol. Gen. Genet., 182: 326-331, 1981). 대장균에서, S 유전자의 단백질 산물이 홀린(holin)인데, 세균 내막 내에서 다량체화하여 채널을 형성한다(Krupovic et al., Mol. Microbiol., 69: 781-783, 2008). R 유전자는 상기 채널을 통해 페리플라즘으로 접근하여 세포벽을 분해시켜 용해를 유발하는 트랜스글리코실라제(transglycosylase)를 암호화한다(Young et al., FEMS Microbiol. Rev., 17: 191-205, 1995).

그러나 이러한 종래의 파지 용해 시스템은 그람양성 세균 특이적인 것이 대부분이고, 그람음성 세균 특이적인 것이라도 대장균 특이적 박테리오파지 유래의 것이기 때문에, 현재 암치료용 박테리아로 많이 연구되고 있는 살모넬라에 적용시 효율이 떨어지는 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 살모넬라를 특이적으로 감염시키는 신규 박테리오파지로부터 분리한 신규 홀린 비의존성 세포 용해 활성을 갖는 폴리펩티드 및 홀린 의존성 세포 용해 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

아울러 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 이용한 외래 단백질 전달용 약독화 세균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 갖고 홀린 비의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드가 제공된다. 이때, 상기 폴리펩티드는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 75%의 상동성을 가질 수 있고, 또는 적어도 80%의 상동성 또는 적어도 85%의 상동성, 바람직하게는 적어도 90%의 상동성, 더 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 갖고 홀린 의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드가 제공된다. 이때, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 75%의 상동성을 가질 수 있고, 또는 적어도 80%의 상동성 또는 적어도 85%의 상동성, 바람직하게는 적어도 90%의 상동성, 더 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6으로 기재된 핵산서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 홀린 비의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

아울러, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 기재된 핵산서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 홀린 의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어, "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"는 탐침(probe)가 다른 서열 보다 더 높은 확률로 검출가능하게 표적 서열과 혼성화할 수 있는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며 상이한 상황에 따라서 달라질 것이다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 보다 짧은 서열에 비해 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로 엄격한 조건은 제한된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 이 Tm은 (제한된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서) 표적 서열에 상보성인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서는 평형상태에 도달하면 프로브의 50%가 표적 서열에 의해 점유된다. 통상적으로, 엄격한 조건은 pH 7.0∼8.3에서 염 농도가 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 통상적으로는 약 0.01 ∼ 1.0 M의 나트륨 이온(또는 기타 염)이고, 온도는 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드(예, 10∼50 nt)에 대하여는 약 30℃ 이상이고 더욱 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드에 대하여는 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제 예컨대, 포름아미드를 첨가함으로써 얻을 수 있다. 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있으며 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다.

상기 엄격한 조건의 예로는 45℃에서 6.Ox SSC에서 혼성화 및 약 50℃에서 2.Ox SSC에서 세척하는 조건, 65℃에서 5x SSC 및 1.0% SDS 또는 42℃에서 5x SSC, 0.5% SDS 및 50% 포름아마이드에서 혼성화하는 조건을 들 수 있고, 선택적으로 68℃에서 5x SSC, 5x 덴하르트 용액 및 1.0% SDS로 혼성화하고 상온에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS로 세척하는 조건을 들 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포가 제공된다.

상기 형질전환 숙주세포에서 상기 숙주세포는 그람음성 세균일 수 있고, 상기 그람음성 세균은 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속 (Salmonellae sp.), 헬리코박터 속(Helicobacter sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 레지오넬라 속(Legionella sp.), 헤모필러스 속(Hemophilus sp.), 네이세리아 속(Neisseria sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로테우스 속 (Proteus sp.), 브루셀라 속(Brucella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.), 모락셀라 속(Moraxella sp.), 브델로비브리도 속(Bdellovibrio sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.) 세균일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 속, 헬리코박터 속, 에스케리치아 속, 예르시니아 속, 쉬겔라 속에 속할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 살모넬라 속에 속할 수 있다. 아울러, 상기 숙주세포는 약독화 균주일 수 있으며, 상기 약독화 균주는 ppGpp 생산능이 결여된 균주일 수 있고, 상기 ppGpp 생산능이 결여된 균주는 spoT 및/또는 relA 유전자가 결손된 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 spoT 및 relA 유전자 모두가 결손된 균주일 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 홀린 비의존성 세균 용해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트; 및 외래 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 발현저해용 핵산분자가 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 유전자 변형된 외래 단백질 전달용 약독화 세균이 제공된다.

이 때, 상기 제1유전자 컨스트럭트는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 더 나아가 서열번호 1 및/또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 상기 홀린 의존성 세균 용해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트; 외래 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 발현저해용 핵산분자가 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트; 및 그람음성균에서 작동 가능한 홀린(holin) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 원핵 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트를 포함하는 유전자 변형된 외래 단백질 전달용 약독화 세균이 제공된다.

이 때, 상기 제1유전자 컨스트럭트는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 더 나아가 서열번호 2 및/또는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 약독화 그람음성 세균에 있어서, 상기 제1유전자 컨스트럭트, 상기 제2유전자 컨스트럭트, 또는 선택적으로 제3유전자 컨스트럭트 중 전부 또는 일부는 단일 프로모터의 조절 하에서 동시에 발현되는 폴리시스트론(polycistron)이거나, 동일 벡터에 삽입되거나, 별개의 벡터에 삽입되거나, 또는 세균의 염색체에 삽입될 수 있다. 상기 염색체 삽입을 위해서는 통상의 상동성 재조합 방법, 트랜스포존 매개 유전자 삽입 또는 Cre-LoxP 재조합 시스템이 사용될 수 있다.

아울러, 상기 유도성 프로모터는, 광-유도 프로모터, 온도-유도 프로모터, 당-유도 프로모터, 알코올-유도 프로모터, 항생제-유도 프로모터, 스테로이드-유도 프로모터 또는 금속-유도 프로모터일 수 있다.

상기 광-유도 프로모터는 대두의 SSU 프로모터(미국 특허 제5,750,385호), Myxococcus xanthus 유래의 carQRS 프로모터(Letouvet-Pawlak et al., Res. Microbiol., 141(4): 425-435, 1990), 담배 유래의 rbcS-rolC 프로모터(Fladung et al., Plant Mol. Biol., 23(4): 749-757, 1993), Fremyella diplosiphon 유래의 cpcB2A2 프로모터(Casey, E. S. and Grossman, A., J. Bacteriol., 176(20): 6362- 6374, 1994), 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus) 유래의 hliA 프로모터(Kappell et al., Arch. Microbiol., 186(5): 403-413, 2006)일 수 있다.

상기 온도-유도 프로모터는 콩 유래의 열충격 프로모터(미국 특허 제 5,447,858호), Bacillus subtilis 유래의 P2 또는 P7 프로모터(Li et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 358(4): 1148-1153, 2007), 벼 유래의 hsp82 또는 hsp70 프로모터(van Breuseqem et al., Planta., 193(1):57-66, 1994), 래트 유래의 hsp70 프로모터(Lisowska et al., Acta. Biochim. Pol., 41(2): 110-112, 1994), 애기장대 유래의 HSP18.2 프로모터(Yoshida et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 44(3-4): 466-472, 1995), 람다 파지 유래의 P_L 프로모터(Gupta et al., J. Biotechnol., 68(2-3): 125-134, 1999) 또는 Haloarchaea 유래의 hsp5 프로모터(Lu et al., Nucleic Acids Res., 36(9): 3031-3042, 2008)일 수 있다.

상기 당-유도 프로모터는 글루코스-, 락토스-, 자일로스- 또는 아라비노스-유도 프로모터일 수 있으고, 상기 글루코스-유도 프로모터는 GAPDH 프로모터(Ye et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54(1): 90-96, 2000)일 수 있고, S. pombe 유래의 rrg1 프로모터(Kim et al., Mol. Cells, 14(2): 312-317, 2002)일 수 있으며, 상기 락토스-유도 프로모터는 P_lac 또는 P_tac일 수 있고, 상기 자일로스-유도 프로모터는 xylB 프로모터(Nariya et al., Appl. Environ. Microbiol., 77(23):8439-41, 2011) 또는 xylT 포로모터(Miyoshi et al., FEMS Microbiol. Lett., 239(2): 205-212, 2004)일 수 있으며, 상기 아라비노스-유도 프로모터는 대장균 유래의 P_BAD(Smith, B. R. and Schleif, R., J. Biol. Chem., 253(19): 6931-6933, 1978)일 수 있다.

상기 알코올-유도 프로모터는 아스퍼질러스 리둘란스(Aspergillus nudulans) 유래의 alcA 프로모터(EP637339B1), 메틸로박테리움 엑소르켄스(Methylobacterium exorquens) 유래의 moxF 프로모터(Morris, C. J. and Lidstrom, M. E., J. Bacteriol., 174(13): 4444-4449, 1992), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 유래의 AOX1 또는 AOX2 프로모터(Ohi et al., Mol . Gen . Genet., 243(5): 489-499, 1994), 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 유래의 DAS1 또는 AOD1 프로모터(Yurimoto et al., Biochim . Biophys . Acta., 1493(1-2): 56-63, 2000), 메틸로박테리움 엑소르켄스(Methylobacterium exorquens) 유래의 mxaF 프로모터(Choi et al., Appl . Environ . Microbiol., 72(12): 7723-7729, 2006) 또는 벼 유래의 트립토판 디카르복실라제(TDC) 프로모터(Park et al., Bioprocess. Biosyst. Eng., Epub ahead of print, 2011)일 수 있다.

상기 항생제-유도 프로모터는 tetO 시스 작용 인자(cis-acting element)일 수 있다(미국 특허 제5,851,796호).

상기 스테로이드-유도 프로모터는 GRE(glucocorticoid response element, Dong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(3): 767-771, 1988), ERE(estrogen response element, Parker, M. G., J. Reprod. Fertil., 883(2): 717-720, 1990) 또는 엑디손(ecdysone) 유도 프로모터(미국 특허 제6,379,945호)일 수 있다.

상기 금속-유도 프로모터는 마우스 유래의 메탈로티오네인 프로모터(미국 특허 제4,579,821호) 또는 효모 켈라틴(chelatin) 금속 이온 조절 부위(미국 특허 제4,940,661호)일 수 있다.

상기 특허 및 비특허 문헌은 전체로서 본 문서에 참조로 삽입된다.

아울러, 상기 약독화 그람 음성 세균은 상기 유도성 프로모터의 작동에 필요한 전사인자 등 트랜스 작용인자(trans-acting factor)를 포함하고 있을 수 있다. 이들 트랜스 작용인자에 관한 예는 상술한 특허 및 비특허 문헌에 개시되어 있다.

상기 진핵성 프로모터는 효모 프로모터, 식물 프로모터, 바이러스성 프로모터 또는 동물 프로모터일 수 있고, 상기 효모 프로모터는 3-포스포그리세레이트 키나아(PGK-3) 프로모터, 에놀라제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(GAPDH) 프로모터, 헥소키나아제 프로모터, 피루베이트 디카르복실라제 프로모터, 포스포프럭토키나아제프로모터, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 프로모터, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터, 피루베이트 키나아제 프로모터, 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터, 포스포글루코스 이소머라제 프로모터, 글루코키나아제 프로모터, 알코올 디히드로게나제 2 프로모터, 이소시토크롬 C 프로모터, 산성 포스파타제 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애 GAL1 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애 GAL7 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애 GAL10 프로모터, 또는 피치아 패스토리스 AOX1 프로모터일 수 있으며, 상기 바이러스성 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 가금류 폭스바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 소 파필로마 바이러스 프로모터, 조류 사르코마 바이르서 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, B형 간염 바이러스 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터일 수 있고, 상기 동물 프로모터는 열충격 단백질 프로모터, 프로락틴 프로모터, 진핵 변역 신장 인자 2(eukaryotic translation elongation factor 2) 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터일 수 있다.

아울러, 상기 원핵 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, 열충격 단백질(HSP) 70 프로모터, β-락타마제 프로모터, lac 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, trp 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, T3 프로모터, Tet 프로모터 pepT 프로모터, sulA 프로모터, pol 11(dinA) 프로모터, ruv 프로모터, uvrA 프로모터, uvrB 프로모터, uvrD 프로모터, umuDC 프로모터, lexA 프로모터, cea 프로모터, caa 프로모터, recN 프로모터, pagC 프로모터 또는 tac 프로모터일 수 있다.

아울서 상기 유전자 컨스트럭트에는 효율적인 전사종결을 위한 전사종결인자(transcription termination element)가 추가적으로 포함될 수 있고, 이러한 전사종결인자의 예로는 rrnB를 들 수 있다.

상기 세균용해 홀린 단백질은 자체적으로 세포 밖으로 분비될 수 없는 라이신 단백질을 세포 밖으로 분비시키도록 세포막에 구멍을 형성하는 막통과 단백질로서, 그람 음성균의 세포막에 구멍을 낼 수 있는 것이라면 그람 양성균의 홀린 단백질도 사용이 가능하나 그람 음성균 유래의 홀린 단백질을 사용하는 것이 더 바람직하며, 예로는 T4 파지 유래의 홀린 단백질 또는 람다 파지 유래의 S 단백질(Rietsch et al., FEMS Microbiol. Lett., 153(2):393-398, 1997), PRD1 파지 유래의 홀린 단백질(Ziedaite et al., J. Bacteriol., 187(15): 5397-5405, 2005)을 들 수 있다.

상기 외래 단백질은 질병 치료용 단백질 또는 진단용 표지 단백질일 수 있고, 상기 질병 치료용 단백질은 항암 단백질 또는 경색조직 치료용 단백질일 수 있으며, 상기 항암 단백질은 단백질 독소, 암항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 유전자(tumor suppressor gene) 또는 항혈관생성인자(antiangiogenic factor)일 수 있다. 이 때, 상기 단백질 독소는 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 테타누스 독소(Tetanus toxin), 시가 독소(Shiga toxin), 디프테리아 독소(Diphtheria toxin, DT), 리신(ricin), 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin, PE), 사이토라이신 A(cytolysin A, ClyA), r-Gelonin일 수 있고, 상기 경색조직 조직 치료용 단백질은 혈관생성인자일 수 있으며, 상기 혈관생성인자는 VEGF(vscular endothelial growth factor), 안지오포이에틴1(angiopoietin 1, Ang1), 안지오포이에틴2(Ang2), 형질전환 성장인자-(transforming growth factor-, TGF-), 인테그린(integrin), 혈관 내피 캐드헤드린(VE-cadherin), 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator, PA), 에프린(ephrin), AC-133, 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 단핵구 주화성 단백질-1(MCP-1, monocyte chemotactic protein-1), 섬유아세포 성장인자(FGF) 또는 태반성장인자(placenta growth factor, PIGF)일 수 있다. 상기 종양 억제 유전자는 종양의 발생을 억제하는 유전자로서, 대표적으로 VHL(von HippelLindau), APC(Adenomatous polyposis coli), CD95(cluster of differentiation 95), ST5(Suppression of tumorigenicity 5), YPEL3(Yippee like 3), ST7(Suppression of tumorigenicity 7) 및 ST14(Suppression of tumorigenicity 14)를 들 수 있다. 상기 항신생혈관생성 단백질은 항-VEGF 항체, 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 아포리포프로테인의 크링글 V 도메인 등을 들 수 있다. 상기 진단용 표지 단백질은 발광단백질, 형광단백질, 양전자단층촬영을 위한 마커 단백질, 아비딘 또는 수용체를 암호화하는 유전자를 들 수 있고, 상기 발광단백질에는 개똥벌레 루시퍼라제(firefly luciferase), 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase), 메트리디아 루시퍼라제(Metridia luciferase), 세균성 루시퍼라제(bacterial luciferase) 등이 속하며, 상기 형광단백질에는 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)이 포함될 수 있다. 상기 세균성 루시퍼라제에는 Vibrio harveyi(Belas et al., Science, 218: 791-793, 1982), Vibrio fischeri(Engebrecht et al., Cell, 32(3): 773-781, 1983), Photobacterium phosphoreum(Mancini et al., J. Biol. Chem., 263(28): 14308-14314, 1988), P. leiognathi(Delong et al., Gene, 54(2-3): 203-210, 1987), P. luminescens(Frackman et al., J. Bacteriol., 172: 5767-5773, 1990) 또는 Aliivibrio fisheri(Mel'kina et al., Mol. Biol(Mosk)., 45(3): 524-528, 2011) 유래의 lux 오페론일 수 있다. 그러나, 본 발명에 사용될 수 있는 발광단백질 또는 형광단백질이 상기에서 제시된 것으로 한정되는 것은 아니다. 상기 인용문헌들은 모두 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.

상기 핵산 분자는 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센트 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있다. 상기 표적 유전자는 그 발현을 억제하고자 하는 대상 유전자로서 질병이 발생이나 발달 과정과 그 과발현이 관련되어 있는 유전자를 의미한다. 그러한 표적 유전자의 예로는 허혈성 질환의 경우 FIH-1(Factor Inhibiting HIF) 또는 프롤릴 히드록실라제-2(PH2)를 들 수 있고, 종양의 경우에는 발암유전자(oncogene)일 수 있다. 상기 발암유전자의 예로는 대표적으로 HER2/neu를 들 수 있다. 상기 혈관생성인자는 상술한 바와 같다.

상기 그람 음성세균은 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속 (Salmonellae sp.), 헬리코박터 속(Helicobacter sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 레지오넬라 속(Legionella sp.), 헤모필러스 속(Hemophilus sp.), 네이세리아 속(Neisseria sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로테우스 속 (Proteus sp.), 브루셀라 속(Brucella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 스테노트로포모나스 속(Stenotrophomonas sp.), 모락셀라 속(Moraxella sp.), 브델로비브리도 속(Bdellovibrio sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.) 세균일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 속, 헬리코박터 속, 에스케리치아 속, 예르시니아 속, 쉬겔라 속에 속할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 살모넬라 속에 속할 수 있다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 생체 내에 투입된 치료용 박테리아의 용해를 적절하게 조절할 수 있어서, 상기 치료용 박테리아에 의해 수송되는 약물을 효율적으로 치료부위에서 방출시킬 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 세균 용해 활성을 갖는 신규 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 iEPS5 파지 게놈 DNA 라이브러리의 핵산 서열(서열번호 7)을 나타낸 것이다. 청색은 ORF3, 밑줄친 부분은 ORF2 그리고 이탤릭체는 ORF1을 나타내고, 굵은 글씨로 되어 있는 부분은 개시 코돈을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 iEPS5 파지 게놈 DNA 중 ORF1(a, 서열번호 4), ORF2(b, 서열번호 5) 및 ORF3(c, 서열번호 6)의 핵산서열을 나타내는 그림이다.
도 3는 본 발명에서 분리한 iEPS5 파지 게놈 DNA의 각 ORF를 T4 파지 홀린 유전자의 존재 유무에 따라 세포 용해 활성을 분석한 일련의 그래프들이다:
a: ORF1을 T4 파지 홀린 유전자와 함께 발현시킨 경우;
b: ORF1을 T4 파지 홀린 유전자 없이 발현시킨 경우;
c: ORF2를 T4 파지 홀린 유전자와 함께 발현시킨 경우;
d: ORF2를 T4 파지 홀린 유전자 없이 발현시킨 경우;
e: ORF3을 T4 파지 홀린 유전자와 함께 발현시킨 경우; 및
f: ORF3을 T4 파지 홀린 유전자 없이 발현시킨 경우.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 유전자의 세균 용해활성을 나타낸 그래프이다:
a: ORF1 및 홀린을 발현하는 벡터(pLT1::ORF1), ORF3 및 홀린을 발현하는 벡터(pLT1::ORF3) 또는 ORF3 단독으로 발현하는 발현벡터(pLT34)를 갖고 있는 E. coli DH5α의 접종 2시간 후 단백질 발현 유도시 살아있는 세포의 수
b: 상기 발현벡터를 갖고 있는S. typhimurium SL1344(b)의 접종 2시간 후 단백질 발현 유도시 살아있는 세포의 수.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 세균 용해 단백질 유도 발현 벡터의 플라스미드 맵이다:
a: 본 발명의 ORF1 내지 ORF3가 pBAD 프로모터의 조절하에 발현 가능하게 제작된 pF12 플라스미드; 및
b: pF12의 araC 하류 지역에 lac 프로모터의 조절하에 EGFP를 발현하도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 pF12::GFP 플라스미드.
도 6은 세균 세포 성장에 있어서 본 발명의 세균 용해 단백질의 발현 유도의 효과를 나타내는 그래프이다. 막대그래프는 살아 있는 세포수를 계수한 CFU를 나타내고 선형 그래프는 600 nm에서의 흡광도(A₆₀₀)을 측정한 결과이다.
a: pF12를 보유하고 있는 S. typhimurium을 이용한 실험 결과;
b: pF12를 보유하고 있는 ppGpp 결핍 S. typhimurium을 이용한 실험결과;
c: pBAD18을 보유하고 있는 S. typhimurium을 이용한 실험결과;
회색막대: L-아라비노스 부존재시;
흑색막대: L-아라비노스 존재시;
개방원: L-아라비노스 부존재시; 및
폐쇄원: L-아라비노스 존재시.
도 7은 총 β-베타갈락토시다제 활성 대비 방출된 β-베타갈락토시다제의 비율을 나타내는 그래프이다. 상기 비율은 막대그래프로 나타냈고, 절대적인 효소 활성은 선형 그래프로 나타냈다:
적색: 총 β-갈락토시다제 활성; 및
청색: 방출된 β-갈락토시다제 활성.
도 8은 pF12::GFP를 보유한 L-아라비노스 유도 박테리아에 의한 플라스미드 방출 효율을 정제된 플라스미드로 대장균을 형질전환시킨 후 형질전환체의 수를 콜로니 계수로 측정한 그래프(a) 및 정제된 방출 플라스미드에 대한 PCR 반응 후 한천 겔 전기영동을 통해 분석한 실험결과를 나타내는 사진(b)이다. a 및 b에서 제시된 숫자는 유도 후 경과 시간을 나타낸다.
도 9는 pF12 보유 S. typhimurium 균주가 침투한 HeLa 셀에 다양한 농도의 L-아라비노스로 유도한 후 세포 내에 존재하는 세균의 수를 계수한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 pF12 플라스미드를 보유한 생물발광단백질을 발현 S. typhimurium SHJ2168 균주의 생체 내 조건에서의 암세포 표적화를 보여주는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 pF12::GFP 플라스미드를 보유한 생물발광단백질을 발현 S. typhimurium SHJ2168 균주를 주입한 이종이식 암 모델 마우스의 종양조직에서 방출된 GFP 단백질의 양을 웨스턴 블랏 분석으로 분석한 사진(a) 및 L-아라비노스에 의해 유도되거나 유도되지 않은 쥐의 종양조직을 PBS 및 용해 완충액으로 각각 용해시킨 후, GFP 밴드의 강도를 이미지 분석 소프트웨어로 분석한 결과를 나타내는 그래프(b)이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 살모넬라 특이적 박테리오 파지로부터 용해 유전자 클로닝

박테리오파지 iEPS5(Choi, Y. and Ryu, S., I-9, International Symposium & Annual Meeting, American Socieity for Microbiology, May 21, 2011)는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhymurium) SL1344 균주를 숙주세포로 이용하여 37℃에서 12시간 동안 교반하면서 증식시켰고, 증식된 파지를 정제하기 위해, 6,000 g에서 10분간 원심분리한 후 세포잔해를 제거하고, 0.22 μm 공극 크기의 필터를 이용하여 여과한 후, 파지입자를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6,000(Sigma, USA)을 처리하여 침전시켰다. 최종적으로, 25,000 g, 4℃의 조건으로 2시간 동안 CsCl을 이용한 농도구배 초고속 원심분리(1.3, 1.45, 1.5 및 1.7 g/ml)를 수행하였다.

파지 용해물로부터 박테리오파지 게놈 DNA를 추출하였는데, 구체적으로, 파지 용해물에 RNase와 DNase I을 1시간동안 37℃에서 처리하여 박테리아 DNA 및 RNA를 제거하고 나서 용해 완충용액(0.5% sodium dodecyl sulfate, 20 mmol/L EDTA 및 50 μg/ml proteinase K)를 처리하고 56℃에서 2시간 동안 방치하였다. 이어, 표준 페놀-클로로포름 방법으로 DNA를 정제한 후 에탄올 침전을 통해 게놈 DNA를 추출하였다.

정제된 iEPS5 파지 DNA 라이브러리를 NheI과 EcoRI 제한효소로 부분절단한 후 동일 제한효소로 절단된 pBAD18 벡터(Guzman et al., J. Bacteriol., 177(14): 4121-4130, 1995)에 클로닝하였다. 상기 재조합 플라스미드를 S. typhymurium SL1344 균주에 형질도입하였다. 형질전환체를 선택하여 96웰 플레이트에서 50 μg/ml 앰피실린을 첨가한 LB 배지에 접종하였다. 정지기에 도달하였을 때, 상기 라이브러리를 앰피실린만 첨가한 LB 한천 배지 또는 앰피실린과 0.2% L-agarose를 첨가한 LB 한천 배지위로 복제도말하였다. 8시간 동안 배양한 후 아라비노스 함유 배지에서만 성장 저해를 보인 클론을 선택하였다. 상기 클론에서 추출된 플라스미드를 F12로 명명하였고(도 5의 a), 삽입된 유전자에 대한 염기서열 결정을 통해, 세포 성장 저해와 관련된 하나의 단편(1,856 bp, 서열번호 7)이 선별되었다(도 1).

iEPS5 파지 DNA로부터 용해 활성을 보인 클론의 삽입 DNA 단편과 iEPS5 전체 게놈을 비교하였다. 그 결과, 상기 DNA 단편에서 세 개의 개방해독틀(ORF)이 발견하였으며, 이를 ORF1(255 bp, 도 1에서 이탤릭체 부분, 서열번호 4), ORF2(714 bp, 도 1에서 밑줄친 부분, 서열번호 5) 및 ORF3(339 bp, 도 1에서 청색 부분, 서열번호 6)로 명명하였고(도 2), 이들은 각각 서열번호 1 내지 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 이 중 ORF1과 ORF2는 프레임이 상이하지만 4 bp 중복되었고, ORF2와 ORF3은 동일 프레임에 3 bp 떨어져 있었다(도 1 참조). 이들 ORF에 대하여 BLAST 분석 결과, Staphylococcus phage SA1의 게놈 DNA 서열 중 일부와 상당한 수준(약 98%)의 상동성을 나타냈으나, 상동성을 보인 부분은 Staphylococcus phage SA1의 게놈 DNA 상에서 단순한 이론상의 단백질 암호화 지역이거나(ORF2), 단백질 암호화 지역과는 상관이 없는 부분이었고(ORF1 및 ORF3), 단백질 수준에서는 상동성을 가진 단백질이 전혀 발견되지 않았다. 이에, 본 발명자들은 상기 ORF1 내지 OFR3에 관한 서열정보를 2011년 6월 1일자로 미국생명공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank에 등록하였다(각각 등록번호 JF304023, JF304024 및 JF304025). 흥미로운 점은 Staphylococcus는 살모넬라와는 달리 그람 양성균이라는 점이다. 이들 ORF로부터 용해 관련 유전자를 찾기 위해, 몇몇 벡터를 제작하였다. 프라이머 세트 iEPS5 sub F1, 2, 3 및 R1, 2, 3를 이용한 iEPS5 박테리오파지의 PCR 산물을 EcoRI으로 절단한 후, EcoRI으로 절단된 pBAD18 또는 홀린(holin) 발현벡터 pLT1에 각각 연결하였다. 형성된 재조합 플라스미드로 DH5α를 형질전환시켜, 앰피실린이 함유된 LB 한천배지 상에서 형질전환체를 선별하였다. 상기 클로닝에 사용된 프라이머 및 플라스미드는 표 1 및 2에 제시되어 있다.

클로닝에 사용한 프라이머 세트

프라이머	서열번호	핵산 서열(5'→3')
iEPS5 sub F1	8	GCGGCCACAATCGGAATTCGCCTGTACA
iEPS5 sub F2	9	CAAAGCGTGAATTCCCTATCT
iEPS5 sub F3	10	CTTTGTGTACTGAGAATTCACGGGTTAAT
iEPS5 sub R1	11	CTGTCAGCACGAATTCCTCGCCGATG
iEPS5 sub R2	12	CCGTCTGAATTCGGGCGA
iEPS5 sub R3	13	TTGTTATTGCGAATTCCGCGCGGCT

밑줄은 EcoRI 제한부위임

실험에 사용한 플라스미드 벡터

벡터	유전자형 및 특징
pBAD18	Ampr, araC, PBAD, pBR322 ori, 발현벡터
pLT1	T4 박테리오파지 홀린 발현 pBAD18
pLT1::ORF1	iEFS5 ORF1 및 홀린 발현 pBAD18
pLT1::ORF2	iEFS5 ORF2 및 홀린 발현 pBAD18
pLT1::ORF3	iEFS5 ORF3 및 홀린 발현 pBAD18
pLT33	iEFS5 ORF2 발현 pBAD18
pLT34	iEFS5 ORF3 발현 pBAD18
pLT35-1	iEFS5 ORF1 발현 pBAD18

각각의 서브클론을 50 μg/ml 앰피실린이 함유된 LB 배지에서 중간-지수성장기까지 배양한 후, L-아라비노스를 최종농도 0.2%가 되게 첨가하여 용해 단백질 발현을 유도하였다. 용해 활성은 광학밀도 감소를 측정함으로써 평가하였다. 그 결과, ORF1은 홀린과 함께 작용할 때만, 용해 활성을 나타냈다. 반면 ORF3 단백질의 용해 활성은 홀린 기능과 독립적이었다(도 3).

용해 단백질의 활성이 '저해'인지 아니면 '용해'인지 조사하기 위해, 본 발명자들은 각 용해단백질이 T4 파지 홀린 단백질과 함께 발현되도록 고안된 단백질 발현벡터(pLT1::ORF1 및 pLT1::ORF3)와 ORF3만 발현하도록 고안된 발현벡터(pLT34)로 각각 형질전환된 E. coli DH5α와 S. typhymurium SL1344 균주의 살아있는 세포를 계수하였다(도 4). 그 결과 도 4에서 나타난 바와 같이, 생존 세포의 수는 단백질 발현 후에 감소하였다. 따라서, iEPS5 용해 단백질의 활성은 단순한 '성장 저해'가 아니라 '세포 용해'임을 알 수 있었다.

실시예 2: 파지 라이신 유전자 함유 살모넬라 균주 제조

상기 실시예 1에서 제조된 1865 bp 크기의 세 개의 ORF를 포함한 발현벡터 pF12 플라스미드를 야생형인 Salmonella serovar Typhimurium 14028s(sch2005)와 이의 ppGpp 결핍 돌연변이(SMR2130, Song et al., J. Biol. Chem., 279: 34183-34190, 2004)에 도입하였다. 한편, 대조 플라스미드로는 pBAD18(Guzman et al., J. Bacteriol., 177: 4121-4130, 1995)을 사용하였다.

실시예 3: 파지 라이신 유전자 함유 형광단백질 발현 살모넬라 균주 제조

한편, 본 발명자들은 본 발명의 세균 용해 시스템에 의해 손상되지 않은 플라스미드의 배양배지로의 방출이 가능한지 여부를 확인하기 위해, 상기 세 개의 ORF 외에 lac 프로모터의 조절하에 EGFP를 발현하는 벡터를 제조하였다. 구체적으로 pEGFP(Clontech, USA)을 주형으로 포워드 프라이머(서열번호 14: 5'-ggatcgatCCCAATACGCAAACCGCCT-3')와 리버스 프라이머(서열번호 15: 5'-ccatcgatGTCGCGGCCGCTTTACTTG-3')를 사용한 PCR을 통해 lac 프로모터와 EGFP 유전자를 포함하는 PCR 산물을 얻은 후 이를 ClaI으로 절단 후 ClaI으로 절단한 pF12에 클로닝하였다. 그 후 DH5α에 형질전환 시킨 후 엠피실린 배지에서 배양된 콜로니는 다시 형광현미경을 통해 GFP 발현을 확인한 뒤, 상기 플라스미드를 pF12::GFP로 명하였다(도 5의 b). 한편, 상기 pF12::GFP 외에 본 발명의 세 ORF를 포함하지 않는 GFP 발현벡터를 제조하기 위해, pBAD18의 ClaI 제한 부위에 상기와 같이 수행하여 수드한 PCR 산물을 삽입하여 pBAD18::GFP를 제조하였다.

상기 pF12::GFP를 야생형 Salmonella 및 ppGpp 결핍 돌연변이 균주인 SMR2130와 Salmonella typhimurium SHJ2168(WO2010/137900A, KCTC10787BP)에 형질도입하여, 파지 라이신 함유 형광단백질 발현 살모넬라 균주를 제조하였다.

실험예 1: L-아라비노스에 의한 세균 용해 유도

상기 제작된 형질전환 살모넬라 균주에 대한 L-아라비노스-유도 세포 용해에 대한 조사를 수행하였다. 구체적으로, 각 균주를 LB 배지에서 37℃의 온도조건으로 지수기 상태로 배양한 후(A₆₀₀≒1.0), L-아라비노스를 최종농도 0.02%가 되게 첨가하였다. 세포 용해 정도를 평가하기 위하여 배양 세균의 광학밀도를 측정하였다(도 6). L-아라비노스를 2시간 정도 처리한 후, pF12를 보유한 배양 세균의 A₆₀₀은 약 0.3 내지 0.6 정도로 감소하였다. L-아라비노스가 존재하지 않을 경우에는 pF12를 보유한 세균의 성장은 정상적이었으며, 이는 L-아라비노스가 세포 용해를 유발하였음을 시사하는 것이다(도 6의 a 및 b). 대조 플라스미드인 pBAD18을 보유한 균주는 L-아리비노스 존재하에서도 세균 용해 또는 성장 저해가 발생하지 않았다(도 6의 c). L-아라비노스가 세균 용해를 유발하는지 추가적으로 검증하기 위하여 표준 도말 방법(도 7)으로 유도 전후의 세균 수(CFU)를 측정하였다. L-아라비노스로 2시간 가량 유도한 후, 세균 수는 비유도 배양 세균의 ~10⁹ CFU보다 10⁴ 내지 10⁵ 배 더 많이 감소한 ~10⁴ CFU를 기록하였다. 종합적으로, 이러한 결과는 P_BAD 프로모터의 조절하의 잠재적 파지 용해 시스템이 세균 세포사멸을 충분히 초래할 수 있음을 시사하는 것이다.

실험예 2: 세포 용해에 따른 세균으로부터 고분자 물질의 방출

이어, 본 발명자들은 상기 용해 시스템이 박테리아 세포질로부터 배양배지로 고분자 물질의 방출을 야기하는지 여부를 조사하였다. 우선, L-아라비노스 유도 세포 용해에 따른 단백질 방출을 변형된 β-갈락토시다제 분석을 통해 측정하였다. hdeABp-lacZYA 융합 컨스트럭트를 λ 부착 부위에 보유하고 있고, 세균 성장의 모든 시기 동안 β-갈락토시다제를 높은 수준으로 발현하는 균주인 MS005 균주(Kim et al., J. Microbiol., 42: 103-110, 2004)에 pF12 플라스미드를 도입한 후 L-아라비노스가 존재하는 경우 및 존재하지 않는 경우의 β-갈락토시다제의 발현 양상을 조사하였다. 배양배지에서의 β-갈락토시다제의 발현 수준은 배양배지에서는 물론 SDS, 톨루엔, MnSO₄ 및 β-머캅토에탄올을 포함하는 통상적인 용해 완충액(Putnam, S. L. and Koch, A. L., Anal. Biochem., 63: 350-360, 1975)을 이용하여 준비된 총 세포 용해물(total cell lysate)에서도 L-아라비노스의 첨가 후 측정하였다(도 8). 상기 β-갈락토시다제 활성 측정은 Koch's 용해 용액(Putnam, S. L. and Koch, A. L., Anal. Biochem., 63: 350-360, 1975)으로 세포를 투과가능하게 한 것을 제외하고는 Miller 등(Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1972)에 의해 개시된 방법에 의해 수행되었다. 용해 시스템에 의한 유도에 따라 배양배지에서 유의한 수준의 β-갈락토시다제의 활성이 검출되었다. 상기 실험 결과, 전체 β-갈락토시다제 활성(총 용해물) 중 상등액에서의 β-갈락토시다제 활성(방출 β-갈락토시다제)의 비율을 단백질 방출의 정도를 예측하기 위해 계산하였다. pF12 보유 MS005 균주에 의한 β-갈락토시다제의 방출은 L-아라비노스 함유 배지에서만 발생하였다. 유도 3시간 후, β-갈락토시다제 활성의 80% 이상이 배지에서 검출된 반면, 공벡터를 포유한 대조군에서는 아무런 활성이 검출되지 않았는데, 이는 세포질내의 단백질의 대부분이 세균 세포 용해의 결과로 방출됨을 시사한다.

pF12 보유 세균에 대한 L-아라비노스 유도에 의해 명백한 세포 용해와 그에 수반한 단백질의 방출이 야기된다는 것을 확인한 본 발명자들은 상기 세균 용해과정이 배지로 손상되지 않은 플라스미드 DNA의 방출을 야기하는지 여부를 확인하고자 하였다. 플라스미드 방출을 확인하기 위해, 상기 실시예 3에서 제작한 pF12::GFP 플라스미드를 세균에 형질도입하여, GFP 양성 박테리아를 제조하였다. 용해된 세포배양체의 세포외 배지로부터 핵산분자를 정제하였고, 상기 유도성 용해 시스템에 의해 방출된 플라스미드 DNA의 양이 얼마나 되는지 확인하기 위해, 세균을 중간 지수성장기까지 배양한 후 L-아라비노스를 첨가함으로써 세포 용해 시스템을 유도하고 무세포 배양배지로부터 DNA를 정제한 후 이를 표준 방법으로 E. coli DH5α에 형질도입하였다(도 9). 정해진 시간에서의 L-아라비노스의 비첨가시 CFU 당 GFP 발현 형절전환체의 수가 대조 플라스미드, 상기 실시예 3에서 제조한 pBAD18::GFP 또는 pF12::GFP를 보유하고 있는 세균으로부터 L-아라비노스 첨가에 의해 방출된 손상되지 않은 플라스미드 DNA의 정도를 정량적으로 평가하는 지표로 제공되었다. pBAD18::GFP를 보유하고 있는 살모넬라로부터 방출된 손상되지 않은 플라스미드 DNA의 양은 L-아라비노스 존재시 또는 부존재시 모두 미미하였다. 반면, pF12::GFP 보유 살모넬라의 경우 L-아라비노스에 의한 세포 용해 유도시 비유도시에 비하여 플라스미드 DNA 방출 수준이 약 30배 정도 증가하는 것으로 나타났다. 방출된 플라스미드의 양은 유도 2시간 후에 최고조를 나타냈고 이후 감소하였으며, 이는 살로넬라 추출물에 존재하는 DNase 활성에 기인하는 것으로 추측된다. 본 발명자들은 아울러 여과된 무세포 배지에 대하여 pF12에서 araC 에서 ORF3까지 포함하는 3.2 Kb DNA를 증폭하는 프라이머를 이용한 PCR 반응을 수행함으로써 플라스미드 DNA의 방출을 직접적으로 분석하였다. PCR 반응은 10 회전 반응 후 종결되었고, 반응 산물은 0.7% 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 일관되게, 3.2 Kb DNA는 세포 용해 유도 후 검출되었고 그 강도는 유도 2시간 후 최고조에 도달했고 그 이후에는 감소하였다. 상기 결과를 종합한 결과, 본 발명의 파지 용해 시스템의 유도에 따른 살모넬라의 용해가 세균 세포질에 포함된 단백질 및 DNA의 방출을 야기한다는 것이 경험칙에 의거한 것이긴 하지만 명백하다.

실험예 3: 세포 내 살모넬라에서의 파지 용해 시스템의 유도

살모넬라는 동물세포 내로 침투하고 거기서 증식할 수 있다(Lee, C. A. and Falkow, S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4304-4308, 1990). 따라서, 본 발명자들은 동물세포인 HeLa 세포 내에 존재하고 있는 살모넬라에서도 본 발명의 파지 용해 시스템의 유도가능성을 조사하였다. 상기 HeLa 세포는 10% FBS(Gibco-BRL) 및 1% 항생제 항진균제 혼합물(Gibco, Invitrogen)이 첨가된 DMEM 배지(Gibco-BRL)에서 배양하였다. 야생형 S. typhimurium 14028s 균주를 pF12로 형질전환하였다. 표준 조건에서 성장한 세균을 HeLa 세포와 10 MOI(multiplicity of infection)에서 37℃ 5% CO₂ 조건하에서 30분간 혼합 배양하였다. 과량의 세균을 PBS(pH 7.4)로 세 번 세척하여 제거한 후 세포를 젠타마이신(20 μg/ml)을 함유한 DMEM 배지에서 배양한 후 다양한 농도의 L-아라비노스를 4시간 동안 처리하였고, 세포내 세균은 용해 완충액(0.05% Triton-X in PBS, pH 7.4)를 이용한 추출을 통해 수확하였고, 뇌 심장 추출 한천 평판 상에서 콜로니 계수를 위해 복제 도말한 후 형성된 콜로니를 계수하였다(도 10). 그 결과, 세포내 세균의 수는 L-아라비노스의 농도에 의존적으로 달라졌다. 본 발명의 파지 용해 시스템을 L-아라비노스로 유도할 경우 세포내 세균의 투여량-의존적 감소를 나타냈다. 100 mM L-아라비노스 이상에서, 본 발명자들은 비유도 세균 배양과 비교하여 90% 이상의 세균이 용해된다고 파악하였다. pF12의 유도 용해 시스템은 심지어 동물세포 내에 존재하는 살모넬라에서도 적절하게 작동한다는 점이 명백하게 규명되었다.

실험예 4: L-아라비노스-유도 세균 용해의 비침습적 in vivo 이미징

본 발명자들은 약독화 S. typhimurium이 다양한 고형암에서 자연적으로 축적되고 복제되는 특성을 가지고 있다는 사실(Pawelek et al., Lancet Oncol., 4: 548-556, 2003)을 활용하여 고형암에 원하는 단백질 또는 플라스미드 DNA를 비특이적으로 전달하기 위한 파지 용해 시스템을 개발하였다. 이를 위해 본 발명자들은 살아 있는 마우스 모델에서 종양으로의 박테리아의 이동 및 그곳에서의 지속의 모니터링할 수 있도록 생물발광(bioluminescence) 신호를 방출하도록 유전자 조작된 S. typhimurium(Hoffman, R. M. and Zhao, M., Nat. Protoc., 1: 2988-2994, 2006; Min et al., Nat. Protoc. 3: 629-636, 2008; Yu et al., Nat. Biotechnol., 22: 313-320, 2004)을 이용하였다. 본 발명자들은 종래 연구를 통해, 야생형 모 균주와 비교하여 마우스에 대한 가상의 비독성도인 LD₅₀이 10⁵ 배나 높은 S. typhimurium ΔppGpp 균주를 개발하였는데(Na et al., Vaccine 24: 2027-2034, 2006), 이를 실험에 이용하였다. 상기 균주의 염색체 내에 세균성 lux 오페론이 삽입된 S. typhimurium ΔppGpp 균주(SHJ2168)을 pF12로 형질전환시킨 후 L-아라비노스가 야생형 균주와 같이 동일하게 세균 세포 용해를 유도함을 확인하였다.

생체 내 조건에서 L-아라비노스가 세균 세포 용해를 유발하는지 확인하기 위해, 면역력이 있는 BALB/c 마우스(Orient, Korea, n=20)에 원발성 종양(primary tumor)를 생성시키기 위해 쥐의 CT-26 대장암 세포를 피하주사하였다. 상기 CT-26 대장암세포는 10% FBS 및 1% 항생제 항진균제 혼합물(Gibco, Invitrogen)이 첨가된 DMEM 배지 M 상에서 배양하였다. 모든 동물의 사육, 실험 및 안락사는 전남대학교 동물연구회에서 승인된 프로토콜에 따라 실시되었다. pF12를 보유한 SHJ2168 균주를 CT-26 대장암을 가진 BALB/c 마우스의 꼬리정맥을 통해 정맥주사로 주입하였다. 상기 종양 보유 마우스는 PBS 50 μl에 현탁된 CT26 세포주를 우측 등쪽에 피하 주입함으로써 제조하였다. 10일 후, 종양 크기가 대략 150 내지 200 mm³에 이른 것을 실험에 사용하였다. 종래에 박테리아가 간 및 비장에서 제거되고 주입 3일째(3 dpi)에 종양에서 증식하는 것으로 보고된 바 있다(Min et al., Nat. Protoc. 3: 629-636, 2008). 따라서, 본 발명자들은 3 dpi에서 L-아라비노스 (120 mg)으로 세균 세포 용해를 유도하였다. lux 신호의 수준을 L-아라비노스 투여 후 냉각 CCD 카메라(IVIS 100 system, Caliper Life Science)를 이용하여 관찰하였다(도 11). 이미징 전에, 메탄올에 용해된 코엘렌테라진(coelenterazine, Biotium, 2 mg/ml) 0.7 mg/kg 체중을 최종 부피 200 μl로 맞춰서 정맥주사하였다. 이미징 신호는 종래에 보고된 바와 같이, 관심영역(ROI)에서의 초당 제곱센티미터당 스테리디안 당 최대 광자수(p/s/cm²/sr)로 정량화 하였다. 실험 결과, L-아라비노스 투여 12시간 후 종양에서 비처리된 마우스에 비하여 생물발광이 약 30% 감소하였다.

실험예 5: 고분자 물질의 in vivo 전달

본 발명자들은 용해된 세균으로부터 표적 부위에 치료용 고분자 물질을 방출시킬 가능성을 조사하였다. 상기 실시예 3에서 제조된 pF12::GFP 보유 S. typhimurium ΔppGpp 균주(2 x 10⁷ CFU)를 종양 보유 마우스에 정맥내 주사하였다. L-아라비노스를 3 dpi에 정맥내 주사하여 세균 용해를 유도하였다. 유도 8시간 후 종양 세포를 절제하여 각각 다른 조건의 용해 완충액(Promega, USA) 또는 PBS에서 균질화하였다. PBS에서 균질화된 종양 시료의 경우 비용해된 세균의 제거를 위해 0.45μm 주사기용 필터를 이용하여 여과하였다. 종양 조직내의 존재하던 용해된 세균으로부터 L-아라비노스 유도에 의해 방출된 GFP(29 kDa)를 항-GFP 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석하였다. 구체적으로, 단백질 시료를 15% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동 한 후 니트로셀룰로오스 막(Bio-rad, USA)으로 전이시키고, 상기 막을 5% 탈지유로 차단한 후, 1:50000으로 희석된 마우스 항-GFP 항체(Sigma, G1546)와 밤새 4℃에서 반응시켰다. 반응 후, 이를 알칼라인 포스파타제 결합 항-마우스 IgG 항체(Sigma, A3562)와 동일 조건에서 1시간 반응시키고, 세척하였다. 결합된 항체는 발색시약(SigmaFast BCIP/NBT, Sigma, B5655)를 이용하여 검출하였다. 분석 결과, PBS로 균질화된 종양 시료에서 29 kDa 크기의 GFP 단백질의 존재를 통해 GFP가 세균 용해에 의해 세균으로부터 종양 조직으로 방출되었음이 확인되었다(도 12의 a). 더 나아가 본 발명자들은 블랏된 밴드 강도를 이미지 분석 프로그램(Image J, //rsb.info.nih.gov/ij/index.html)을 이용하여 분석하였다. PBS로 균질화된 유도된 시료의 GFP 밴드의 강도는 비유도 시료와 비교하여 2배 이상 증가하였다(도 12의 b). L-아라비노스의 부존재시 ara 프로모터의 기본적 활성이 GFP의 방출을 초래한 것으로 추측된다. 그러나, 이러한 결과는 조절된 세균 세포 용해를 통해 필요로 하는 치료용 단백질을 고형암 조직에 전달할 수 있다는 이론의 원칙을 증명하고 있다.

종래의 많은 세균기반의 고분자 물질의 방출 시스템이 개발되어 왔으나(Gentschev et al., Trends Microbiol., 10: 39-45, 2002; Roland et al., Curr. Opin. Mol. Ther., 7: 62-72, 1972; Russmann, H. Int. J. Med. Microbiol., 293: 565-569, 2004; Seow, Y., and Wood, M. J., Mol. Ther., 17: 767-777, 2009), 이들 시스템들은 운반체의 크기, 구조 및 양의 관점에서 한계를 가지고 있었다. 이에 반하여 본 발명의 시스템은 종양 및 경색 조직 특이적으로 핵산 분자 및 단백질을 보다 효율적이고 조절적인 방식으로 전달할 수 있는 매우 획기적인 방법을 제공한다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Industry Foundation of Channam National University <120> Novel bacterial lysis protein and use thereof <130> PD11-0224 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 84 <212> PRT <213> Salmonella phage iEPS5 <400> 1 Met Thr Gly Leu Leu Ala Arg Ile Lys Thr Gly Val Leu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Val Phe Val Val Ala Leu Phe Gly Val Trp Arg Ala Gly Arg Thr Lys 20 25 30 Gly Lys Gln Asp Gln Ile Asn Asn Gln Asn Tyr Asp Thr Leu Arg Glu 35 40 45 Gln Ala Asn Ala Asp Lys Asn Val Ala Glu Val His Asn Glu Ile Asn 50 55 60 Lys Leu Pro Asp Gly Gly Ala Asn Asp Leu Leu Arg Arg Lys Trp Met 65 70 75 80 Arg Arg Lys Asp <210> 2 <211> 237 <212> PRT <213> Salmonella phage iEPS5 <400> 2 Met Ala Lys Gln Lys Pro Arg Gly Ile Arg Asn Asn Asn Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ile Glu Trp Gly Ser Pro Trp Gln Gly Leu Ile Pro Arg Asn Glu Ala 20 25 30 Thr Asp Ser Arg Phe Ala Gln Phe Lys Asp Pro Ala Ser Gly Ile Arg 35 40 45 Ala Ile Ala Val Thr Leu Thr Thr Tyr Tyr Asp Lys Arg Lys Ala Asn 50 55 60 Asp Gly Ser Lys Ile Asp Ser Val Arg Glu Val Ile Glu Arg Trp Ala 65 70 75 80 Pro Ala Val Glu Asn Asn Val Ser Ala Tyr Ala Lys Gln Val Ala Ala 85 90 95 Val Leu Ala Val Asp Pro Asn Ser Glu Thr Leu Asn Leu His Asp Tyr 100 105 110 Asp Thr Met Arg Gly Leu Val Glu Gly Ile Ile Arg His Glu Asn Gly 115 120 125 Asn Pro Glu Ala Phe Gly Leu Thr Pro Tyr Ser Asn Ala Asn Met Trp 130 135 140 Tyr Ser Asp Glu Val Ile Glu Glu Gly Leu Arg Arg Ala Gly Ile Val 145 150 155 160 Lys Ala Ala Lys Pro Val Asn Arg Thr Thr Val Ala Ala Thr Ser Val 165 170 175 Ala Gly Leu Gly Ala Ala Gln Leu Val Asp Met Val Gln Pro Val Lys 180 185 190 Ala Ala Met Asp Ser Ala His Gly Asp Ile Ser Ser Gly Asp Trp Val 195 200 205 Arg Ile Ala Phe Gly Ala Ala Thr Ile Ala Ile Gly Leu Tyr Met Gly 210 215 220 Trp Val Ala Tyr Arg Lys His Arg Ala Gly Ala Ala Ala 225 230 235 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Salmonella phage iEPS5 <400> 3 Met Ser Glu Met Glu Arg Glu Arg Pro Gly Asp Thr Ser Gly Gly Ile 1 5 10 15 Lys Leu Asp Leu Ser Val Asn Leu Pro Thr Ile Leu Thr Met Ala Ser 20 25 30 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<220> <223> iEPS5 sub R3 <400> 13 ttgttattgc gaattccgcg cggct 25 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plac GFP forward <400> 14 ggatcgatcc caatacgcaa accgcct 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plac GFP reverse <400> 15 ccatcgatgt cgcggccgct ttacttg 27

Claims (18)

1. 본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 갖고 홀린 비의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,
   서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 75%의 상동성을 갖는, 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서,
   서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드.
4. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성을 갖고 홀린 의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드.
5. 제4항에 있어서,
   서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 75%의 상동성을 갖는, 폴리펩티드.
6. 제5항에 있어서,
   서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
8. 제7항에 있어서,
   서열번호 6으로 기재된 핵산서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 홀린 비의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
9. 제8항에 있어서,
   서열번호 6으로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
10. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
11. 제10항에 있어서,
    서열번호 4로 기재된 핵산서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되며, 홀린 의존성 세균 용해 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
12. 제11항에 있어서,
    서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
13. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
14. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
15. 제13항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포.
16. 제14항의 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환 숙주세포.
17. 제1항의 홀린 비의존성 세균 용해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트; 및
    외래 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 발현저해용 핵산분자가 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 유전자 변형된 외래 단백질 전달용 약독화 세균.
18. 제4항의 홀린 의존성 세균 용해 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트;
    외래 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 발현저해용 핵산분자가 진핵 프로모터 또는 원핵 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트; 및
    그람음성균에서 작동 가능한 홀린(holin) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 원핵 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트를 포함하는 유전자 변형된 외래 단백질 전달용 약독화 세균.

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