JP2022515857A - １つまたは複数の非天然尾部繊維を有する非複製的形質導入粒子および形質導入粒子ベースのレポーターシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、変更された宿主特異性および／または反応性を示す非天然尾部繊維を含有する遺伝子操作されたバクテリオファージ、バクテリオファージ様粒子および非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を含む組成物およびこれらを産生する方法に関する。本発明は、細菌関連疾患用の新規の診断用、治療用および／または研究用試薬の開発のためにこれらのバクテリオファージおよびＮＲＴＰを使用する方法にも関する。

Description

本発明は、標的生物体を検出するためのレポーター分子を含有する非天然尾部繊維を有するバクテリオファージに由来する非複製的形質導入粒子のパッケージングおよび送達のための方法および組成物に関する。

形質導入粒子とは、非ウイルス核酸を細胞中に送達することができるウイルスのことである。ウイルスベースのレポーターシステムは、細胞の存在を検出し、ウイルスの溶原期に依拠して細胞からレポーター分子を発現させるのに使用されてきた。これらのウイルスベースレポーターシステムは、レポーター分子を発現し、標的細胞に検出可能なシグナルを放出させる複製能のある形質導入粒子を使用する。

しかし、ウイルスの溶菌サイクルは、ウイルスベースのレポーターアッセイにとり有害であることが明らかにされている。Ｃａｒｒｉｅｒｅ，Ｃ．ら、Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｈａｇｅｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７年．３５（１２）：３２３２～３２３９頁。Ｃａｒｒｉｅｒｅらはその溶菌サイクルが３０℃では抑制され、３７℃では活性である結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）／カルメットゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））ルシフェラーゼレポーターファージを開発した。この系を使用して、Ｃａｒｒｉｅｒｅら、は、抑制された溶菌サイクルを有するファージレポーターを使用してＢＣＧの検出を実証した。

しかし、バクテリオファージベースのレポーターアッセイにおいてバクテリオファージの複製機能を抑制するが除去しないことに関連する不都合が存在する。第1に、バクテリオファージの複製機能を制御するとアッセイ条件の制約が課せられる。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらが使用したレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌サイクルは、ファージが３０℃の非許容温度で細胞に感染させるのに使用される場合、抑圧された。この温度要求性により、標的細菌に対する最適温度が３７℃であるという点でレポーターアッセイに制約条件が課せられた。これらの制約条件は最適アッセイ性能の妨げとなる。

さらに、ウイルスの複製機能は制御が難しい。ウイルスの複製は、レポーターシステムとして形質導入粒子の使用中は抑制されるべきである。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらが報告したレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌活性は低減されたが除去されておらず、アッセイにおいてルシフェラーゼシグナルの低下を招いた。Ｃａｒｒｉｅｒらは、無傷のファージ発現遺伝子およびアッセイの温度制限などの、レポーターシグナルにおいて生じた低下について考えられる原因を強調し、すべてがファージレポーターの溶菌サイクルが除去されていなかったという事実から生じていた。

ファージの天然の溶原化サイクルに依拠しているレポーターアッセイは、溶菌活性を散発的に示すことを予測可能である。さらに、ファージの溶原化サイクルに依拠しているアッセイは、類似するファージですでに溶原化されている標的細胞からの重感染免疫、ならびに、入ってくるウイルス核酸を標的にする天然に存在する宿主制限システムを有する傾向があり、したがって、これらのレポーターファージの宿主域を制限する。

他の例では、形質導入粒子産生システムは、外来性核酸分子をパッケージングするように設計されているが、形質導入粒子は外来性核酸分子と天然の子孫ウイルス核酸分子の組合せを含有することが多い。天然のウイルスはアッセイ性能にとって妨げとなる溶菌活性を示すことができ、ウイルスの溶菌活性は形質導入粒子を精製するには除去しなければならない。しかし、この精製は一般的には可能ではない。「細菌の検出のためのレポータープラスミドパッケージングシステム（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ）」と題される米国特許出願公開第２００９／０１５５７６８号で、Ｓｃｈｏｌｌらは、そのような形質導入粒子システムの開発を記載している。このシステムの産物は、レポーター形質導入粒子と天然のバクテリオファージの組合せである（参考資料の図８）。筆者らは、形質導入粒子と天然のバクテリオファージは超遠心分離法により分離可能であることを示しているが、この分離は、形質導入粒子と天然のウイルスが超遠心分離法による分離を可能にすると考えられる異なる密度を示す系においてのみ可能である。この特徴は参考資料に記載されているバクテリオファージＴ７ベースのパッケージングシステムにより示されるが、これは、他のウイルス系に一般的に適用可能な特徴ではない。ウイルスパッケージング機構が、超遠心分離法では分離することができない区別できない密度を示す天然のウイルスと形質導入粒子をもたらすと考えられるヘッドフルパッケージングを示すのが一般的である。ウイルスパッケージングシステムは、区別がつかない密度を有する天然ウイルスと形質導入粒子をもたらす適切なウイルス構造組立の要件としての最小量のパッケージングにも依拠している。

最近、本明細書においてスマーティクル（Ｓｍａｒｔｉｃｌｅ）とも称されるレポーター核酸分子を非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）中にパッケージングするための方法およびシステムが、米国特許第９，３８８，４５３号および米国特許出願公開第２０１７／０１６６９０７号に記載されているが、そこでは複製能を有する天然の子孫ウイルス核酸分子の産生は、バクテリオファージゲノムにおけるパッケージング開始部位の破壊のせいで大幅に低減された。

現在、ＮＲＴＰは自然界に見出される天然に存在する溶原性バクテリオファージ、例えば、φ８０αバクテリオファージまたはＰ１バクテリオファージから産生されている。新しいバクテリオファージを見つけ、特徴付け、所望の宿主域特異性で細胞を形質導入することができるＮＲＴＰに改変するのは時間のかかる方法である。

いくつかの最近の研究（Ａｎｄｏら、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０１５年、１：１８７～１９６頁；Ｙｏｓｅｆら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ２０１７年、６６：７２１～７２８頁）が、Ｔ３およびＴ７バクテリオファージならびにバクテリオファージ／形質導入粒子混合物を再プログラムして、ファージが異なる宿主を認識することを可能にすると考えられるＴ３／Ｔ７様ウイルス供給源由来の尾部／尾部繊維を交換することにより所望の宿主を認識することができることを明らかにしている。この目的のため、異なる尾部／尾部繊維をＴ３／Ｔ７シャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）上に構築し、ＤＮＡを異なる宿主中に注入するその能力について試験した。これらの実験は新規の宿主域を有するハイブリッド粒子の産生への道を開いたが、これらの効果が示されたのは、Ｔ３－およびＴ７－様バクテリオファージに見出されるファージ／尾部／尾部繊維を用いた場合のみであった。特に、これらの研究では、Ｔ３／Ｔ７バクテリオファージと違って、長く収縮性のある尾部を有し全く異なる尾部繊維遺伝子を含む、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）などの他のバクテリオファージ科由来のシャーシを土台とするファージゲノムエンジニアリングプラットフォームは可能にならない。

最もよく特徴付けられているマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）ファージの1つは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））および腸内細菌科の他の細菌に感染するＰ１バクテリオファージである。Ｐ１の宿主域特異性は尾部繊維オペロン内で制御されており、このオペロンはおおよそ６ｋｂ長であり（図２）、尾部繊維遺伝子の２つの交互３’末端（ｓ_ｖまたはｓ_ｖ’）のどちらかを逆位領域の外側に位置する定常５’末端（ｓ_ｃ）に融合することができる逆位Ｃ－セグメント領域を含む。２つの交互遺伝子ｕおよびｕ’はＳ遺伝子の外側に位置しており、尾部繊維組立に関与する代替型のシャペロンタンパク質をコードしている。尾部繊維オペロン内の他の２つの遺伝子は、ｒ遺伝子、この遺伝子の産物Ｒは尾部繊維組立に関与すると考えられている、および遺伝子ｃｉｎであり、この遺伝子は、宿主特異性を改変するｃｉｘ部位として知られるＣｉｎ組換え部位間の核酸を「はじく（ｆｌｉｐ）」ことができる配列特異的リコンビナーゼ酵素をコードしており、これら２つの遺伝子はＧｕｉｄｏｌｉｎら、１９８９年 Ｇｅｎｅ、７６：２３９～２４３頁、およびＳａｎｄｍｅｉｅｒら、１９９２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７４（１２）：３９３６～３９４４頁に記載されている。

したがって、多くのタイプのファージの尾部繊維由来の新しいＮＲＴＰを作成する迅速で信頼性が高くスケーラブルな方法の必要性が当技術分野には存在する。それゆえに、本発明は、その宿主特異性を変更するまたは広げるために尾部繊維のみで変更可能であるＰ１バクテリオファージに由来する尾部繊維交換プラットフォーム（またはシャーシ）に関するものであり、このプラットフォームは多くのウイルス科由来の尾部繊維を利用することができる。さらに、本発明は、操作された産生株からのＮＲＴＰの収率を改善する方法および複数の天然または操作された尾部繊維を備えたＮＲＴＰを単回発酵で産生する方法に関する。このアプローチは、宿主域特異性に関して所望の包括性および排他性プロファイルを有する新たなＮＲＴＰを開発するために他の多様なバクテリオファージに対して使用することができる。

本発明は、天然の尾部繊維産生に不可欠な１つまたは複数の因子（例えば、遺伝子ｓ、ｕ、ｕ’、ｒおよびｓ’）の発現が遺伝子的に破壊されているバクテリオファージリソゲンを企図する。これは、当業者に公知である任意の変異誘発手法を通じて、または天然の供給源からの尾部繊維欠損ファージレムナントの単離を通じて達成することができた。補完なしでそれ自体の機能的尾部繊維を発現する能力に欠けているこの遺伝子的に破壊されたファージリソゲンは、シャーシまたは「バルド（Ｂａｌｄ）」シャーシと呼ばれる。一実施形態では、破壊されたリソゲンは、細菌細胞受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質の1つまたは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロンタンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質を尾部に付着させるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子の任意の組合せから選択される遺伝子のうちの1つまたは複数において突然変異または欠失を有する。別の実施形態では、破壊されたリソゲンは、遺伝子のうちの1つまたは複数の発現を破壊する選択マーカーをコードする遺伝子を含有する。さらに別の実施形態では、破壊されたリソゲンは、配列番号９７のヌクレオチド配列を含む。

本発明の1つのさらなる態様は、天然の新しい尾部繊維遺伝子の発現を含む方法、または天然の尾部繊維発現のために遺伝子的に破壊されたリソゲンにおけるハイブリッド尾部繊維に関する。これは、パッケージングプラスミド、二次発現プラスミド、ゲノム発現（ファージリソゲンまたは細菌ゲノム）、または当業者には公知である他の任意の方法を使用して達成することができると考えられる。

それゆえに、本発明は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来のバクテリオファージリソゲン（マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲン）が生来有する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子の発現を妨げる遺伝子破壊を含有するマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンであって、前記1つまたは複数の遺伝子が、細菌細胞受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質の１つまたは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロンタンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質を尾部に付着させるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子の任意の組合せから選択されるマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンと、細菌細胞受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質の１つまたは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロンタンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質を尾部に付着させるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子の任意の組合せから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む補完的核酸分子であって、前記補完的核酸はマイオウイルス科リソゲンの遺伝子破壊を補完し、それによって機能的尾部繊維が産生される、補完的核酸分子とを含むバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームに関する。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属に由来する。一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、Ｐｕｎａ様ウイルス属に由来する。一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、腸内細菌バクテリオファージファージＰ１（Ｐ１バクテリオファージ）である。

一実施形態では、補完的核酸分子上の１つもしくは複数の遺伝子または遺伝子の組合せは、産生される機能的尾部繊維が天然の尾部繊維ではないように、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子に由来しない領域を含有する。そのような実施形態では、産生される尾部繊維は、最初のバクテリオファージリソゲンが生来有するものではない機能的尾部繊維である。別の実施形態では、１つもしくは複数の遺伝子または遺伝子の組合せは、産生される機能的尾部繊維が天然のＰ１バクテリオファージ尾部繊維ではないように、Ｐ１バクテリオファージ由来ではない領域を含有する。

さらに別の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲン上の遺伝子破壊は、１つまたは複数の遺伝子のいずれかにおいて１つまたは複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、１つまたは複数の遺伝子のうちの１つにおいて１つまたは複数の突然変異を含む場合がある。他の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも２つにおいて１つまたは複数の突然変異を含む場合がある。一実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｐ１バクテリオファージ遺伝子ｓ、ｓ’、ｕ、ｕ’およびｒのうちのいずれか１つに、遺伝子ｓ、ｓ’、ｕ、ｕ’およびｒの任意の組合せに、または遺伝子ｓ、ｓ’、ｕ、ｕ’およびｒのホモログ、オルソログもしくはアナログに存在する。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲン上の遺伝子破壊は、１つまたは複数の遺伝子のうちのいずれか１つにおいて１つまたは複数の欠失を含む。一部の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、１つまたは複数の遺伝子のうちの１つにおいて１つまたは複数の欠失を含む場合がある。他の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、１つまたは複数の遺伝子のうちの少なくとも２つにおいて１つまたは複数の欠失を含む場合がある。ある特定の実施形態では、少なくとも1つの欠失は、１つまたは複数の遺伝子のうちの１つの完全なコード配列の欠失である。他の実施形態では、１つまたは複数の欠失のいずれかは、１つまたは複数の遺伝子のうちの１つの完全なコード配列の欠失である。一実施形態では、１つまたは複数の欠失は、Ｐ１バクテリオファージ遺伝子ｓ、ｓ’、ｕ、ｕ’およびｒのうちのいずれか１つに、遺伝子ｓ、ｓ’、ｕ、ｕ’およびｒの任意の組合せに、または遺伝子ｓ、ｓ’、ｕ、ｕ’およびｒのホモログ、オルソログもしくはアナログにある。別の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲン上の遺伝子破壊は、Ｐ１バクテリオファージ遺伝子のいずれか１つの発現を破壊する選択マーカーをコードする遺伝子の挿入をさらに含む。一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、配列番号９７の核酸配列を含む。

一実施形態では、補完的核酸分子はプラスミド分子である。別の実施形態では、補完的核酸分子は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位に組み込まれる。さらに別の実施形態では、補完的核酸分子は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位以外の部位に組み込まれる。さらに別の実施形態では、補完的核酸分子は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンを含有する宿主細菌細胞のゲノム中に組み込まれる。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンのゲノムのパッケージングに関与する１つまたは複数のパッケージング遺伝子にさらなる破壊を含有する。それによって、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンのゲノムのパッケージングに関与する１つまたは複数のパッケージング遺伝子は非機能的になる。一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンにおいて１つまたは複数のパッケージング遺伝子における破壊を補完する１つまたは複数のパッケージング遺伝子は、プラスミド分子中に含有される。別の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンにおいて１つまたは複数のパッケージング遺伝子における破壊を補完する１つまたは複数のパッケージング遺伝子は、前記プラスミド分子から分離しているレポーターまたは治療発現プラスミド中に含有される。

本発明は、配列番号９７の核酸配列を含むＰ１バクテリオファージリソゲンを含む細菌細胞株にも関する。

本発明は、非天然尾部繊維を有するバクテリオファージ粒子または非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を産生するための方法であって、本発明のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を準備するステップであって、補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域を有する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子を含む、ステップ、および細菌細胞にマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、非天然尾部繊維を有するバクテリオファージ粒子を産生するステップを含む方法に関する。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域は、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）内のバクテリオファージから得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む。一実施形態では、尾部繊維可変領域は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）内のバクテリオファージから得られる。別の実施形態では、尾部繊維可変領域は、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属内のバクテリオファージから得られる。一実施形態では、属はＰｕｎａ様ウイルスである。

一実施形態では、補完的核酸分子は、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。一実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）内のバクテリオファージから得られる。別の実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）内のバクテリオファージから得られる。さらに別の実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属由来のバクテリオファージから得られる。一実施形態では、属はＰｕｎａ様ウイルスである。一実施形態では、シャペロンタンパク質は、非複製ウイルス由来構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる。一実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号６７～９６および１１３～１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域は、ファージ尾部様粒子もしくは構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む。一実施形態では、尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３５～６６および１０８～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１～３４、９８、１００、１０２、１０４および１０６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

本発明は、非天然尾部繊維を有する非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を産生するための方法であって、本発明のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を準備するステップであって、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンゲノムのパッケージングに関与する１つまたは複数のパッケージング遺伝子にさらなる破壊を含み、補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域を含有する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子を含み、細菌細胞が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンにおいて破壊されている１つまたは複数のパッケージング遺伝子を含むレポータープラスミドをさらに含む、ステップ、および細菌細胞にマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、非天然尾部繊維を有するＮＲＴＰを産生するステップを含む方法にさらに関する。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域は、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）内のバクテリオファージから得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む。一実施形態では、尾部繊維可変領域はマイオウイルス科内のバクテリオファージから得られる。別の実施形態では、尾部繊維可変領域は、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属内のバクテリオファージから得られる。一実施形態では、属はＰｕｎａ様ウイルスである。

一実施形態では、補完的核酸分子は、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む。一実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、カウドウイルス目（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）内のバクテリオファージから得られる。別の実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）内のバクテリオファージから得られる。さらに別の実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属由来のバクテリオファージから得られる。一実施形態では、属はＰｕｎａ様ウイルスである。一実施形態では、シャペロンタンパク質は、非複製ウイルス由来構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる。一実施形態では、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号６７～９６および１１３～１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域は、ファージ尾部様粒子もしくは構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む。一実施形態では、尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号３５～６６および１０８～１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１～３４、９８、１００、１０２、１０４および１０６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

別の態様では、本発明は、天然のバクテリオファージシャーシの宿主域特異性および／または反応性とは異なる宿主域特異性および／または反応性を示すバクテリオファージおよび／またはＮＲＴＰを作成するキメラ尾部繊維遺伝子を発現することを図る。それゆえに、本発明は、天然のバクテリオファージにより示される細菌宿主細胞特異性とは異なる細菌宿主細胞特異性を示す、操作されたバクテリオファージまたは非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を作製する方法であって、１つの尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子に由来する第１のヌクレオチド配列を、異なる供給源に由来する第２の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子に由来する第２のヌクレオチド配列と融合させて、キメラ尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子を作製するステップ、および本発明のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞においてキメラ尾部繊維構造タンパク質遺伝子を発現させるステップ、および細菌細胞にマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、操作されたバクテリオファージまたはＮＲＴＰを作製するステップを含む方法に関する。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属由来である。一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンはＰｕｎａ様ウイルス属由来である。別の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、腸内細菌バクテリオファージファージＰ１（Ｐ１バクテリオファージ）である。

一実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、遺伝子破壊を含有するマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲン由来である。別の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、Ｐ１バクテリオファージ由来の尾部繊維遺伝子ｓのｓ_ｃ領域を含む。さらに別の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号５３のアミノ酸配列１～２５０をコードするヌクレオチド配列に少なくとも９０％配列同一性を有する配列を含む。さらに別の実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、配列番号５３のアミノ酸配列１～５００をコードするヌクレオチド配列に少なくとも９０％配列同一性を有する配列を含む。一実施形態では、第1のヌクレオチド配列は、プラスミドｐ１５Ｂ（Ｉｋｅｄａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、５０：４５７～４７０頁に記載されている）由来のまたは肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｋｐｎ）中のＰ１様１１型バクテリオファージ由来のｓ_ｃ領域を含む。

別の態様では、本発明は、単一の細菌細胞株由来の複数のタイプの尾部繊維を有し、尾部繊維タイプの少なくとも１つが非天然尾部繊維である、操作されたバクテリオファージまたは非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を作製する方法であって、本発明のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を準備するステップであって、補完的核酸分子が、尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子に由来する１つまたは複数の尾部相互作用領域に融合されている尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子に由来する少なくとも２つの受容体結合領域を含み、受容体結合領域の少なくとも１つが、尾部相互作用領域の１つの供給源とは異なる供給源に由来する、ステップ、および細菌細胞にバクテリオファージリソゲンの溶菌期を誘導するする条件を提供して、複数のタイプの尾部繊維を有するバクテリオファージまたはＮＲＴＰを産生するステップを含む方法に関する。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属由来である。一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンはＰｕｎａ様ウイルス属由来である。別の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンは、腸内細菌バクテリオファージファージＰ１（Ｐ１バクテリオファージ）である。

一実施形態では、補完的核酸分子はマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位に組み込まれる。別の実施形態では、補完的核酸分子は、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位以外の部位に組み込まれる。さらに別の実施形態では、補完的核酸分子は細菌細胞のゲノム中に組み込まれる。さらに別の実施形態では、補完的核酸分子はプラスミド分子中に組み込まれる。

一実施形態では、尾部相互作用領域への２つ以上の受容体結合領域の融合は、ｃｉｎリコンビナーゼにより、複数のｃｉｘ組換え部位の存在下で実施される。一実施形態では、尾部相互作用領域への２つ以上の受容体結合領域の融合は、ｃｉｎリコンビナーゼまたはｃｉｎリコンビナーゼのホモログ、オルソログ、もしくはパラログにより、複数の関連する組換え部位の存在下で実施される。一実施形態では、２つ以上の別個の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子はオペロンにおいて発現される。別の実施形態では、２つ以上の別個の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子は、独立したプロモーターから発現される。さらに別の実施形態では、２つ以上の別個の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子は、独立したゲノム位置から発現される。

別の態様では、本発明は、細胞中への導入のために非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）中にレポーターまたは治療核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、宿主細菌細胞；天然の尾部繊維の産生に不可欠な１つもしくは複数の遺伝子の発現を妨げる遺伝子破壊を含有するバクテリオファージリソゲンであって、前記１つもしくは複数の遺伝子が、受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質、尾部繊維構造タンパク質の１つもしくは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロン、尾部構造物に尾部繊維構造タンパク質を付着させるのに必要なタンパク質をコードするか、またはこれらの遺伝子の任意の組合せであり；ＮＲＴＰ中へのバクテリオファージゲノムの優先的パッケージングを妨げる非機能的パッケージング開始部位配列を含有する第1のバクテリオファージ遺伝子をも含むバクテリオファージリソゲン；受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質、尾部繊維構造タンパク質の１つもしくは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロン、尾部構造物に尾部繊維構造タンパク質を付着させるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子の任意の組合せから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む１つまたは複数の補完的核酸分子であって、バクテリオファージリソゲンの遺伝子破壊を補完し、それによって機能的尾部繊維が産生される、１つまたは複数の補完的核酸分子；ならびにレポーターまたは治療核酸分子、およびレポーター核酸分子のレプリコンのＮＲＴＰ中へのパッケージングを促進するための機能的パッケージング開始部位配列を含有する第２のバクテリオファージ遺伝子を含み、前記レポーター核酸分子上の機能的パッケージング開始部位配列がバクテリオファージリソゲンにおける非機能的パッケージング開始部位配列を補完する、細菌細胞パッケージングシステムに関する。

一実施形態では、レポーター遺伝子はｌｕｘＡＢである。別の実施形態では、レポーター遺伝子は蛍光レポータータンパク質である。一部の実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、第１のバクテリオファージ遺伝子および第２のバクテリオファージ遺伝子はｐａｃＡターミナーゼ遺伝子である。別の実施形態では、第１のバクテリオファージ遺伝子および第２のバクテリオファージ遺伝子はｔｅｒＳターミナーゼ遺伝子である。

別の態様では、本発明は、診断または治療用途のために細菌細胞を認識し形質導入することができるマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来ＮＲＴＰを作製する方法であって、本発明のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を準備するステップであって、補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有するものではなくマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）（配列番号５、１０、３２、３３で表される）、またはポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）尾部繊維配列に部分的にまたは全体的に由来する尾部繊維遺伝子を含む、ステップ、および細菌細胞にバクテリオファージリソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、以前、天然のマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来ＮＲＴＰ粒子に抵抗性であった細菌を診断または治療用途のために認識して形質導入することができるマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来ＮＲＴＰを産生するステップを含む方法に関する。

一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来ＮＲＴＰは、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属由来である。一実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来ＮＲＴＰは、Ｐｕｎａ様ウイルス属由来である。別の実施形態では、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来ＮＲＴＰは、腸内細菌バクテリオファージファージＰ１（Ｐ１バクテリオファージ）である。

本発明のこれらのおよび他の特長、態様、ならびに利点は、以下の記述および添付の図面に関してさらによく理解されるようになる。

図１は、尾部繊維交換プラットフォームを示す図である。 図２は、天然のＰ１尾部繊維ゲノム領域の図である。遺伝子ｒは、推定では尾部繊維を尾部構造物に付着させるのに関与する尾部繊維クセサリータンパク質をコードする。ｃｉｎ遺伝子は配列特異的リコンビナーゼをコードしており、このリコンビナーゼは、ＤＮＡの単一片から２つの別個尾部繊維の発現を可能にするＣｉｎ組換え部位（ｃｉｘ部位と呼ばれる）間のＤＮＡを反転させ、部位は図では円として表されている。遺伝子ｕおよびｕ’は別個の尾部繊維クセサリータンパク質をコードしており、これらのタンパク質は、それぞれＳおよびＳ’尾部繊維タンパク質の結合ドメイン（それぞれｓ_ｖおよびｓ_ｖ’コード配列によりコードされている結合ドメイン）を折り畳むシャペロンとしての役目を果たすと考えられている。ＳおよびＳ’尾部繊維タンパク質両方の保存された領域は、Ｃｉｎリコンビナーゼの活性に応じてｓ_ｖまたはｓ_ｖ’のどちらかに転写的におよび翻訳的に融合されているｓ_ｃコード配列によりコードされている。 図３は、尾部繊維交換プラットフォームの図である。ｓおよびｕ遺伝子の代わりにスペクチノマイシン抵抗性カセットを有する尾部繊維欠損（バルド）パッケージング株は誘導されてリコンビニアリング機構（配列番号９７）を発現し、オペロンプロモーター、ｒ遺伝子、スペクチノマイシン抵抗性プロモーター、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子、ｕ’遺伝子、ｓｖ’コード領域、ｃｉｎ遺伝子、およびｃｉｎプロモーターを含む。次に、新しい尾部繊維、ハイグロマイシン抵抗性カセット、および隣接ホモロジーアームを有するＰＣＲ断片は誘導ストレイン（この場合、「シャムロック」および「シャムロック」ｕ）に形質転換される。リコンビニアリング機構は、スペクチノマイシン抵抗性カセット－ｕ’－ｓ_ｖ’領域の代わりに新しい尾部繊維オペロンを組み込んで、尾部繊維が付与されたスマーティクルを産生することができる新しい染色体パッケージング株を作成する。 図４は、尾部繊維の染色体組込みに続く改良されたスマーティクル性能を示すグラフである。プラスミド（ＴＦＤＶ）からまたは染色体から発現された尾部繊維を付与されたスマーティクルの性能を比較する図。種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株上にＳ’（左上）、Ｓ（右上）、または「シャムロック」（左下）尾部繊維のみを有するスマーティクルの反応性が示されている。右下、ゲノム組込み対プラスミド発現によるＳ尾部繊維パッケージング株から得られた改良されたスマーティクル収率。Ｖ３スマーティクル（天然の尾部繊維領域）は陽性対照として供給される。 図５は、天然のＵタンパク質ホモログのまたはバクテリオファージゲノムからの発現での改良された尾部繊維活性を示している。Ａ）プラスミドｐ１５Ｂ Ｕタンパク質ホモログＴを発現するまたは発現しないパッケージング株で産生された「インディアン」ＮＲＴＰの性能。Ｂ）バクテリオファージゲノムからまたは別のパッケージングプラスミドから産生された「スカーレット」ＮＲＴＰの性能。 図６は、単一産生株での１つ、２つ、またはそれ以上の尾部繊維の産生を示している。Ａ）１つ、２つ、３つまたはそれ以上の機能的尾部繊維を発現する単一細菌パッケージング株。Ｓ、Ｓ’およびシャムロック尾部繊維は抗生物質マーカーと一緒にパッケージング株に添加した。尾部繊維遺伝子は、新規の位置にｃｉｘクロスオーバー部位を有するように配置することができる。遺伝子は、大きなまたは小さなオペロンでの組換えに依存しない発現のために配置することもできる。Ｂ）ライセートは、単一尾部繊維を発現するパッケージング株（Ｓ、Ｓ’、Ｓｍｒｋとして示される）ならびに操作された二重および三重尾部繊維株（Ｖ３、二重、三重として示される）から作成された。単一尾部繊維に特異的な反応性を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用して、複数の機能的尾部繊維が単一宿主から発現されることを実証した。 図７は、二機能性スマーティクルパッケージング株の分析を示している。二機能性Ｐ１由来スマーティクルは、「ジャズベリー」および「シャムロック」尾部繊維の両方を付与されて作成された。Ａ）ゲノム組込み「シャムジャズ」二重発現システムの遺伝子配置の略画描写。Ｂ）「ジャズベリー」、「シャムロック」、または「Ｖ３」（ＳおよびＳ’）尾部繊維に特異的である株に関する二機能活性の確認。Ｃ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のコレクションに関して選んだ個別のおよび組み合わされたスマーティクルの予測されたおよび／または観察された活性（ＥｃｏＡＤパネル）。パーセント補償範囲が下に描かれており、幹ヒゲ図はパネル上の光分布を描いている。Ｄ）区別がつかない二機能スマーティクルの予測された活性および観察された活性（紫色）の比較。＊は、蓄積的予測補償範囲対実際に実験的に観察された補償範囲を表示する。 図８は、機能的尾部繊維に必要なエレメントの確立を描いている。Ａ）３つの別個の尾部繊維Ｓｃ領域（天然のＰ１、「プラム」、および「タンジェリン」を参照）はＰ１シャーシ上で機能化されており、機能的尾部繊維に必要な決定因子の理解を広げている。すべての構築物がＲタンパク質をコードするＰ１ｒ遺伝子を有していた。それぞれの尾部繊維可変領域（Ｓｖ）は、その同族Ｕアクセサリータンパク質と一緒に発現された場合が最も機能的であった。Ｂ）３つの機能的Ｓｃ領域のタンパク質アライメントは、Ｎ末端２５０アミノ酸が重要であることを示している。 図９は、発酵菌株からの尾部繊維遺伝子の発現のための種々の配置を示している。Ａ）ファージゲノムからの尾部繊維およびウイルスシャーシの発現を表す。Ｂ）ファージゲノムおよびパッケージングプラスミド由来の尾部繊維遺伝子からのウイルスシャーシ発現を表す。Ｃ）ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび独立したプラスミドからの尾部繊維を表す。Ｄ）ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび細菌ゲノムからの尾部繊維を表す。Ｅ）ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび１セットの尾部繊維を表す。第２の独特のセットの尾部繊維は独立したプラスミドから発現される。Ｆ）ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび尾部繊維を表す。第２の独特のセットの尾部繊維はパッケージングプラスミドから発現される。Ｇ）ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび２つの独特のセットの尾部繊維を表す。

定義
特許請求の範囲および明細書で使用される用語は、別段明記されなければ下に示される通りに定義される。

本明細書で使用される場合、「レポーター核酸分子」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むヌクレオチド配列のことである。レポーター核酸分子は、天然に存在するまたは人工もしくは合成分子が可能である。一部の実施形態では、レポーター核酸分子は宿主細胞にとって外来性であり、プラスミドまたはベクターなどの外来性核酸分子の一部として宿主細胞中に導入することができる。ある特定の実施形態では、レポーター核酸分子は、細胞中の標的遺伝子に相補的であることが可能である。他の実施形態では、レポーター核酸分子はレポーター分子（例えば、レポーター酵素、タンパク質）をコードするレポーター遺伝子を含む。一部の実施形態では、レポーター核酸分子は、「レポーター構築物」または「核酸レポーター構築物」と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「治療核酸分子」とは、疾患に関係のある標的核酸（例えば、アンチセンス核酸）の配列特異的認識により、または治療活性を有する遺伝子産物（抗菌性タンパク質）をコードすることにより、疾患を処置する治療効果のあるヌクレオチド配列のことである。一部の実施形態では、治療核酸分子は、プラスミドなどの外来性核酸分子の一部として宿主細胞中に導入することができる。本明細書で使用される場合、「治療発現プラスミド」とは、治療活性を有する遺伝子産物をコードする治療核酸分子を含有するプラスミドのことである。

「レポーター分子」または「レポーター」とは、生物体に検出可能なまたは選択可能な表現型を与える分子（例えば、核酸またはタンパク質）のことである。検出可能な表現型は、例えば、比色、蛍光または発光が可能である。レポーター分子は、蛍光反応を媒介する酵素をコードするレポーター遺伝子（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素をコードする遺伝子（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質をコードする遺伝子（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、アフィニティーペプチドをコードする核酸分子（Ｈｉｓ－タグ、３Ｘ－ＦＬＡＧ）、および選択マーカーをコードする遺伝子（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）から発現させることができる。レポーター分子は、細胞中への核酸分子または外来性配列（プラスミド）の成功した取込みを示すマーカーとして使用することができる。レポーター分子は、本明細書に記載される標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子、または細胞の存在を示すのにも使用することができる。代わりに、レポーター分子は、アプタマーまたはリボザイムなどの核酸が可能である。

本発明の一部の態様では、レポーター核酸分子はプロモーターに動作可能に連結されている。本発明の他の態様では、プロモーターは、他の細胞ではなく、特定の細胞（例えば、特定の種）中のプロモーターの活性に基づくレポーターシステムの反応性および交差反応性に寄与するように選択するまたは設計することができる。ある特定の態様では、レポーター核酸分子は複製開始点を含む。他の態様では、複製開始点の選択は、標的細胞内でのレポーター核酸分子の複製が、他の細胞ではなく特定の細胞（例えば、特定の種）中の複製開始点の活性に基づくレポーターシグナル発生に寄与するまたはこれに必要な場合に、レポーターシステムの反応性および交差反応性に同様に寄与することができる。一部の実施形態では、レポーター核酸分子は、ウイルス複製中に子孫ウイルス中にコンカテマーＤＮＡとしてパッケージングされることができるレプリコンを形成する。

本明細書で使用される場合、「標的転写物」とは、ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列の一部または標的遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子を含む標的細胞により天然に形成されるｍＲＮＡ分子および第一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡのことである。標的転写物は、細胞転写物または天然に存在する転写物と呼ぶこともできる。

本明細書で使用される場合、用語「転写物」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型配列または遺伝子から転写される、ある長さのヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のことである。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されるｃＤＮＡ配列またはＤＮＡ鋳型から転写されるｍＲＮＡ配列が可能である。転写物は、タンパク質コードまたは非コードが可能である。転写物は操作された核酸構築物から転写することも可能である。

レポーター核酸分子に由来する転写物は「レポーター転写物」と呼ぶことができる。レポーター転写物は、レポーター配列およびｃｉｓ抑制配列を含むことができる。レポーター転写物は、転写物が二重鎖を形成する２つの領域（例えば、分子間二重鎖領域）を含むように相補性の領域を形成する配列を有することができる。１つの領域は「ｃｉｓ抑制配列」と呼ぶことができ、標的転写物および／またはレポーター配列の一部またはすべてに相補性を有する。転写物の第２の領域は「レポーター配列」と呼ばれ、ｃｉｓ抑制配列に対する相補性を有することができる。相補性は、完全相補性または実質的相補性が可能である。ｃｉｓ抑制配列の存在および／またはｃｉｓ抑制配列とレポーター配列との結合は、レポーター転写物において立体構造を形成することができ、これはレポーター分子のさらなる発現を遮断することができる。レポーター転写物は、互いに相補的であるレポーター転写物内の領域が互いにハイブリダイズすることができるように、ヘアピン構造などの二次構造を形成することができる。

核酸分子または外来性配列（例えば、プラスミド、ベクター、構築物）に言及する場合、「細胞中に導入する」とは、当業者が理解している通りに、細胞中への取込みまたは吸収を促進することを意味する。核酸構築物または転写物の吸収または取込みは、援助のない拡散または活性細胞プロセスを通じて、またはバクテリオファージ、ウイルス、および形質導入粒子の使用を通して、を含む補助剤もしくは装置により生じることができる。この用語の意味はｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞に限定されず、核酸分子は「細胞中に導入され」てもよく、この細胞は生きた生物体の一部である。そのような場合、細胞中への導入は、生物体への送達を含むことになる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達では、本発明の核酸分子、構築物またはベクターは、組織部位中に注射するまたは全身的に投与することができる。細胞中へのｉｎ ｖｉｔｒｏ導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法を含む。さらなる手法は本明細書に記載されているまたは当技術分野で公知である。

「形質導入粒子」とは、非ウイルス核酸分子を細胞中に送達することができるウイルスのことである。ウイルスはバクテリオファージ、アデノウイルス等が可能である。

「ファージ尾部様粒子」または「ファージ尾部様構造物」とは、形はバクテリオファージ尾部に似ているが、複製ウイルスゲノムをコードも送達もせず、それゆえに、ウイルスではない細菌によって産生された高分子量ファージ尾部様タンパク質複合体のことである。ファージ尾部様粒子または構造物の非限定的例は、多様な細菌型に見られる６型分泌システム（Ｔ６ＳＳ）およびＲ型テイロシン（ｔａｉｌｏｃｉｎ）（ピオシンとしても知られる）を含む。これらの粒子のさらなる記述はＷｉｌｌｉａｍｓら、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、７４：１２、３８６８～３８７６頁、およびＳｃｈｏｌｌら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００９年、５３：７、３０７４～３０８０頁に見られる。これらの構造物例はウイルスカプシドヘッドをコードしていないが、標的細胞への結合および尾部注入を媒介して、標的細胞を殺傷するまたはタンパク質エフェクターを送達することができる。ファージ尾部様粒子または構造物は、尾部繊維などの特異性決定エレメントを有し利用することができ、それゆえに、その遺伝子配列を利用すれば細胞結合特異性の標的を変えることができる。ピオシン由来尾部繊維の一例は、配列番号１１のヌクレオチド配列に示されている。

「非複製形質導入粒子」または「ＮＲＴＰ」とは、非ウイルス核酸分子を細胞中に送達することができるウイルスであるが、それ自体の複製されたウイルスゲノムを形質導入粒子中にパッケージングすることはできない。ウイルスは、バクテリオファージ、アデノウイルス、等が可能である。

「プラスミド」は、細胞内の染色体ＤＮＡから物理的に分離しており、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる小ＤＮＡ分子である。細菌中で小型環状二本鎖ＤＮＡ分子として最もよく見出されるが、プラスミドは古細菌および真核生物体に存在することもある。プラスミドは、適切な宿主内で自律的に複製することができるレプリコンと見なされる。本明細書で使用される場合、用語「パッケージングプラスミド」とは、所与のウイルスカプシド中にパッケージングされるのに必要なエレメント（すなわち、パッケージング遺伝子）と発現できるレポーター遺伝子の両方をコードするプラスミドのことである。本明細書で使用される場合、用語「尾部繊維ディスプレイベクター」および省略して「ＴＦＤＶ」とは、所与のウイルスカプシド中にパッケージングされるのに必要なエレメント、発現できるレポーター遺伝子、および所与のカプシドに結合することができる結合タンパク質を産生する尾部繊維コード配列をコードするプラスミドのことである。本明細書で使用される場合、用語「二次尾部繊維発現プラスミド」とは、所与のカプシドに結合させることができるが、必ずしもレポーター分子またはパッケージング部位／機構を有してはいない機能的尾部繊維をコードするプラスミドである。

「ベクター」とは、外来性遺伝物質を別の細胞中に人為的に運ぶ媒体として使用される核酸分子であり、その細胞ではベクターを複製するおよび／または発現することができる。

「ウイルス」とは、他の生物体の生きた細胞の内部でのみ複製する小さな感染病原体である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られる）は、２つまたは３つの部分：すなわち、ｉ）遺伝情報を保有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子から作られる遺伝物質；ｉｉ）これらの遺伝子を保護するタンパク質膜；および一部の場合は、ｉｉｉ）脂質の外被９３８８を含む。

本明細書で使用される場合、用語「補完体」とは、破壊されている同一の配列の存在下での非破壊配列、または非破壊配列と破壊配列の関係のことである。一実施形態では、補完体は、細胞中のポリヌクレオチド上にコードされ、機能的で発現することができる遺伝子を含み、破壊に先立ってバクテリオファージ上の破壊された遺伝子と同じ機能を持つタンパク質を発現する。一部の実施形態では、補完遺伝子は、破壊される前の破壊されるバクテリオファージ遺伝子、すなわち、天然のバクテリオファージ遺伝子に８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも大きな配列同一性を有する。一部の実施形態では、補完遺伝子は、破壊される前の破壊されるバクテリオファージ遺伝子、すなわち、天然のバクテリオファージ遺伝子と同一である。一部の実施形態では、補完遺伝子は、バクテリオファージから欠失されているポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、補完遺伝子は、プラスミド上のバクテリオファージのパッケージング機構をコードする遺伝子のことであり、同じ遺伝子がバクテリオファージでは破壊されている。したがって、プラスミドは、ポリヌクレオチドを形質導入粒子中にパッケージングするのに必要な必須パッケージング機構を提供するためには変異したパッケージング機構遺伝子を持つバクテリオファージの存在下であることが必要とされる。

本明細書で使用される場合、用語「パッケージング関連酵素活性」とは、ポリヌクレオチドを形質導入粒子中にパッケージングするためのパッケージング開始部位配列との相互作用にとって重大である１つまたは複数のポリペプチドのことである。一部の実施形態では、ターミナーゼ遺伝子の対がそのような相互作用には必要であり、それぞれのターミナーゼはパッケージング関連酵素活性をコードしている。一部の実施形態では、酵素活性は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）バクテリオファージφ１１またはφ８０α由来のｔｅｒＳおよび／またはｔｅｒＬ遺伝子、フェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）バクテリオファージφＥｆ１１由来のｔｅｒＡおよびｔｅｒＢ遺伝子、または腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）バクテリオファージＰ１のｐａｃＡおよびｐａｃＢ遺伝子によりコードされている。これらの実施形態では、ターミナーゼ遺伝子の対のそれぞれがパッケージング関連酵素活性を発現し、両方の機能的バージョンはパッケージング開始部位を有するポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる。一部の実施形態では、パッケージング関連酵素活性に関連する複数の遺伝子の遺伝子の１つが破壊されると、パッケージング関連酵素活性が除去される。一部の実施形態では、ターミナーゼ遺伝子の対の両方がバクテリオファージ上で破壊され、したがって、バクテリオファージ上のパッケージング関連酵素活性コード遺伝子の全セットが破壊される。

用語「ｉｎ ｓｉｔｕ」とは、生きた生物体とは離れて成長する、例えば、組織培養で成長する生細胞で起こるプロセスのことである。

用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」とは、生きた生物体で起こるプロセスのことである。

本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、ヒトと非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタを含むがこれらに限定されない。

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」それぞれが一般に、それぞれの塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は本明細書では互換的に使用され、核酸塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボチミンのことである。しかし、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」は、下でさらに詳述されるように、改変ヌクレオチド、または代用交換部分も指すことができることは理解される。当業者であれば、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルは、そのような交換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変更せずに他の部分と交換しうることを承知している。例えば、限定せずに、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合しうる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドで置き換えうる。そのような交換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。

本明細書で使用される場合、用語「相補的な」は、第２のヌクレオチド配列との関係で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者であれば理解するように、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとある特定の条件下でハイブリダイズして二重鎖構造物を形成する第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力のことである。相補的配列は、互いに結合するとも記述され、結合親和性により特徴付けられる。

例えば、２つの配列が厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（アニールする）場合、第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列に相補的であると記述することができる。ハイブリダイゼーション条件は、アニーリングおよび／または洗浄工程のための温度、イオン強度、ｐＨ、および有機溶媒濃度を含む。用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、その条件下では、第１のヌクレオチド配列がその標的配列、例えば、第２のヌクレオチド配列に優先的にハイブリダイズし、他の配列へのハイブリダイズは比較的低い、または全くハイブリダイズしない条件のことである。厳密なハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下では異なる。一般に、厳密なハイブリダイゼーション条件は、限定されたイオン強度およびｐＨでヌクレオチド配列についての熱融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔ_ｍは、第１のヌクレオチド配列の５０％が完全に適合する標的配列にハイブリダイズする温度である（限定されたイオン強度およびｐＨ下で）。核酸のハイブリダイゼーションへの広範な手引きは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ――Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ、ｃｈａｐ．２、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ、」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見出される。生物体の内部で遭遇する場合がある生理的に関連する条件などの他の条件が適用されることが可能である。当業者であれば、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終適用に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適した条件のセット決定することができる。

これは、第１と第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書では互いに関して「完全に相補的な」と呼ぶことができる。しかし、第１の配列が本明細書の第２の配列に関して「実質的に相補的である」と呼ばれる場合、２つの配列は完全に相補的になることができる、または第１の配列と第２の配列はハイブリダイズすると、その最終適用に最も適切な条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、１つまたは複数の、しかし、一般的には４、３または２以下の不適正塩基対を形成する場合がある。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズすると、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとは見なさないこととする。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含み、長いほうのオリゴヌクレオチドが短いほうのオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的のために「完全に相補的である」とまだ呼んでもよい。

「相補的な」配列は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイズするその能力に関する上記要件が満たされているという条件で、非ワトソンクリック塩基対および／または非天然で改変されたヌクレオチドから形成された塩基対を含む、または完全にこれらの塩基対から形成されていてもよい。そのような非ワトソンクリック塩基対は、Ｇ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対合を含むがこれに限定されない。

本明細書の用語「相補的な」、「完全に相補的な」および「実質的に相補的な」は、その使用の文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡの二本鎖間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間、一本鎖ＲＮＡ配列もしくは一本鎖ＤＮＡ配列の相補鎖の間の塩基適合に関して使用しうる。

本明細書で使用される場合、「二重鎖構造物」は２つの逆平行で実質的に相補的核酸配列を含む。２つの転写物間の、転写物内の２つの領域間の、または転写物と標的配列の間の核酸構築物中の相補的配列は、「二重鎖構造物」を形成することができる。一般には、それぞれの鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されているように、それぞれのまたは両方の鎖は少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または改変ヌクレオチドも含むことができる。二重鎖構造物を形成する２つの鎖は、１つのもっと大きなＲＮＡ分子の異なる部分でもよく、またはこの２つの鎖は別々のＲＮＡ分子でもよい。２つの鎖が１つのもっと大きな分子の部分であり、それゆえに、二重鎖構造物を形成する１つの鎖の３’末端とそれぞれ他の鎖の５’末端の間の途切れのないヌクレオチド鎖により連結されている場合、連結するＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。２つの鎖が二重鎖構造物を形成する１つの鎖の３’末端とそれぞれ他の鎖の５’末端の間の途切れのないヌクレオチド鎖以外の手段により共有結合的に連結されている場合、連結する構造物は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は同じまたは異なる数のヌクレオチドを有する場合がある。塩基対の最大数は、二重鎖の最も短い鎖中のヌクレオチドから二重鎖に存在するいかなるオーバーハングも引いた数である。一般に、二重鎖構造物は、１５～３０または２５～３０、または１８～２５、または１９～２４、または１９～２１、または１９、２０、もしくは２１塩基対長である。一実施形態では、二重鎖は１９塩基対長である。別の実施形態では、二重鎖は２１塩基対長である。２つの異なるｓｉＲＮＡが組み合わせて使用される場合、二重鎖長は同一であることが可能である、または異なることが可能である。

本明細書で使用される場合、用語「相補性の領域」とは、本明細書で定義される配列、例えば、標的配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域のことである。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域で最も許容的であり、存在する場合には、一般的には、末端領域（単数または複数）、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３、または２ヌクレオチド内にある。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列という文脈での用語「パーセント同一性」とは、下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者が利用できる他のアルゴリズム）の１つを使用してまたは目視検査により測定した場合、比較し最大一致するように整列させたときに、同じである特定のパーセンテージのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列（単数または複数）のことである。適用次第で、パーセント「同一性」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在する、または、代わりに、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。

配列比較では、典型的には１つの配列は試験配列が比較される参照配列としての機能を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列はコンピュータに入力され、必要であれば、それに続いて座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指示されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べて試験配列（複数可）についてパーセント配列同一性を計算する。

比較のための配列の最適アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４頁（１９８８）の類似検索手法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行により（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、または目視検査（一般には下記Ａｕｓｕｂｅｌら、参照）により行うことができる。

パーセント配列同一性および配列類似性を判定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁（１９９０）により記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般公開されている。

用語「十分な量」とは、所望の効果を生じるのに十分な量、例えば、細胞から検出可能なシグナルを出すのに十分な量を意味する。

用語「治療有効量」とは、疾患の症状を寛解させるのに効果的である量である。治療有効量は、予防を治療と見なすことができるので「予防有効量」であることが可能である。

明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明白に指示しなければ、複数の参照対象を含む。

ウイルスの溶原化および溶菌サイクル
ウイルスは宿主細胞において溶原化および溶菌サイクルを受ける。溶原化サイクルを受け入れる場合、ファージ染色体は細菌染色体中に組み込まれることができる、またはファージ染色体は宿主において安定したプラスミドとして定着することができ、そこで長期間休止状態のままでいることができる。リソゲンが誘導される場合、ファージゲノムは細菌染色体から切り取られて溶菌サイクルを開始し、結果的に細胞を溶解してファージ粒子を放出する。溶菌サイクルにより新しいファージ粒子が産生され、この粒子は宿主の溶解により放出される。

さらに、ファージベースのレポーターなどの、ウイルスベースのレポーターアッセイは、宿主ベースおよびプロファージ由来ファージ抵抗性機序により引き起こされるファージ宿主域の制限のせいで限られた反応性（すなわち、分析的包括性）を被ることがある。これらの抵抗性機序は天然のファージ核酸を標的にして、ファージＤＮＡおよび機能の分解またはその他の点では阻害をもたらすことがある。そのような抵抗性機序は、ファージＤＮＡを切断する制限系およびファージ由来転写物を阻害するＣＲＩＳＰＲ系を含む。

溶菌活性とファージ抵抗性の両方は、レポーターファージに基づくアッセイに対して抑制的になることがある。溶菌活性は、検出可能なシグナルを生じる細胞のその能力を破壊するまたはその他の点では阻害し、したがって検出可能なシグナルの量を低減するまたは検出可能なシグナルの発生を妨げることによって検出限界に影響を与えることによりシグナルを阻害することができる。ファージ抵抗性機序は、ファージの宿主域を制限し、ファージベースのレポーターの包括性を制限して、同様に、検出可能なシグナルの量を低減するまたは検出可能なシグナルの発生を妨げることにより検出限界に影響を与えることができる。レポーターファージでのファージＤＮＡの組込みにより引き起こされる溶菌活性とファージ抵抗性の両方は、これらのファージレポーターを組み込むアッセイの偽陰性結果をもたらすことがある。

ＩＩＩ．非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を産生するための方法
非複製形質導入粒子を産生するための破壊／補完ベースの方法
ウイルス産生中にゲノムパッケージングが開始される起点のエレメントとしてウイルスパッケージング機構により認識されるウイルスのゲノムの成分の破壊に基づく非複製形質導入粒子パッケージングシステムが本明細書で開示される。実施形態では、この破壊はバクテリオファージからパッケージング開始部位を破壊し、ターミナーゼ機能も破壊する。破壊されるエレメントの例は、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位配列およびｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位配列を含む。ファージ内のパッケージング開始部位配列が破壊されると、ファージは機能的ターミナーゼを産生できなくなる。例として、ｐａｃ部位はｐａｃＡ遺伝子配列内にコードされており、ターミナーゼ機能は機能的ＰａｃＡとＰａｃＢの両方を必要とする。プラスミドＤＮＡは、前記破壊されたターミナーゼを補完しプラスミドＤＮＡ上に認識可能なパッケージング開始部位を含むことによりファージカプシド中にパッケージングされる。バクテリオファージは、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）バクテリオファージＰ１もしくはφＥＦ１１、または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）バクテリオファージφ８０αもしくはバクテリオファージφ１１などのいかなるバクテリオファージでも可能である。

パッケージング開始部位は、ウイルス産生に不可欠である遺伝子のコード領域内に見出されることが多い。バクテリオファージゲノムの領域は、パッケージング開始部位を破壊する挿入、置換、欠失、または突然変異により破壊することができる。これを実現する破壊の例は、パッケージング開始部位配列を含有するバクテリオファージゲノム上の配列を抗生物質耐性遺伝子の配列などの別の配列と交換する対立遺伝子交換イベント、または小および大ターミナーゼ遺伝子の完全欠失を含むがこれらに限定されない。ターミナーゼ遺伝子ｐａｃＡおよびｐａｃＢを用いる例では、ｐａｃＡを、ｐａｃＢ発現ならびに／またはＰａｃＡおよびＰａｃＢにより媒介される全体的ターミナーゼ機能も破壊する極性効果を引き起こす方法で破壊することができる。ターミナーゼ遺伝子を含むことができる他の例は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）バクテリオファージφ１１もしくはφ８０α由来のｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝子、またはフェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）バクテリオファージφＥｆ１１由来のｔｅｒＳおよびｔｅｒＬ遺伝子も含むことができる。

一例では、細胞ゲノムは、パッケージング開始部位が破壊されているウイルスゲノムにより溶原化される。一部の実施形態では、細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞、またはフェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）細胞が可能である。細胞はグラム陰性またはグラム陽性が可能である。補完するプラスミド（またはレポーター核酸分子）は細胞中に導入され、プラスミドＤＮＡは、少なくともバクテリオファージにおいて破壊されている遺伝子、ならびに、パッケージング開始部位配列、および任意選択で、追加のバクテリオファージ遺伝子およびレポーター遺伝子を含み、レポーター遺伝子は検出可能および／または選択マーカーをコードすることができる。プラスミドは、米国特許第９，３８８，４５３号に、および米国特許出願公開第２０１７／０１６６９０７号に見られる方法を使用して構築することができる。プラスミドの１つまたは複数の遺伝子は、誘導性プロモーター（バクテリオファージを誘導することによりパッケージングが開始されるときに誘導することができる）などのプロモーターに動作可能に連結されることができる。一部の実施形態では、プロモーターは、小ターミナーゼ遺伝子または大ターミナーゼ遺伝子の天然のプロモーターが可能である。天然のプロモーターは、バクテリオファージにより制御することができ、したがって、パッケージング中に誘導される条件プロモーターとして効果的に機能する。

一部の例では、破壊／補完は、突然変異ウイルスＤＮＡと補完外来性ＤＮＡの間にホモロジーが存在しないように設計されるのが好ましい。これは、突然変異ウイルスＤＮＡと補完外来性ＤＮＡの間にホモロジーの欠如により、ウイルスゲノム中へのパッケージング配列の再導入をもたらすことができる２つのＤＮＡ分子間での相同組換えの可能性が回避されるからである。ホモロジーの欠如を達成するため、１つの戦略は、ウイルスゲノムからパッケージング開始部位配列を含有する全遺伝子（単数または複数）を欠失させ、次に、なるべくならウイルスから欠失された正確にＤＮＡ配列だけを含有する外来性ＤＮＡ分子でこの遺伝子を補完することである。この戦略では、補完ＤＮＡ分子は、ウイルスから欠失された遺伝子を発現するように設計される。そのようなシステムの別の例は、バクテリオファージφ８０α、ｐａｃ型ファージを使用して提供される。ファージゲノムは宿主細菌細胞において溶原化され、ファージゲノムは、ｐａｃ型プロファージφ８０αのｐａｃ部位が欠失されている小ターミナーゼ遺伝子を含む。天然のｐａｃ部位を有する補完的小ターミナーゼ遺伝子を含むプラスミドが細胞中に形質転換される。溶原化されたプロファージの溶菌サイクルが誘導されると、バクテリオファージパッケージングシステムは、天然のバクテリオファージＤＮＡをパッケージングするよりも、プラスミドＤＮＡを子孫バクテリオファージ構造成分中にパッケージングする。したがって、パッケージングシステムは、プラスミドＤＮＡを保有する非複製形質導入粒子を産生する。

レポーター遺伝子は検出可能マーカーまたは選択マーカーをコードする。例では、レポーター遺伝子は発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、アフィニティーペプチド（Ｈｉｓ－タグ、３Ｘ－ＦＬＡＧ）、および選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）からなる群から選択される。実施形態では、レポーター遺伝子はｌｕｘＡである。一部の実施形態では、抵抗性マーカーは抗生物質耐性遺伝子を含む。一部の実施形態では、抵抗性マーカーはカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）である。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、Ｐｂｌａｓｔを含む。一部の実施形態では、バクテリオファージゲノム破壊は、パッケージング開始部位配列を含有するバクテリオファージゲノム上の配列を交換するまたは破壊する対立遺伝子交換エベントにより達成される。

例では、バクテリオファージゲノム上のターミナーゼ遺伝子の対、例えば、ｐａｃＡとｐａｃＢ、ｔｅｒＡとｔｅｒＢ、またはｔｅｒＳとｔｅｒＬは、ターミナーゼ遺伝子の１つの発現および／またはターミナーゼ遺伝子により媒介される全体的ターミナーゼ機能も破壊する極性効果を引き起こすように破壊することができる。破壊されたバクテリオファージは、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子、例えば、ｐａｃＡとｐａｃＢ、ｔｅｒＡとｔｅｒＢ、またはｔｅｒＳとｔｅｒＬを含むプラスミドで補完することができる。突然変異したウイルスが溶菌サイクルを受けているとき、バクテリオファージゲノムまたは（破壊されている場合は）補完プラスミドから産生されるウイルスパッケージングタンパク質は、プラスミドＤＮＡのレプリコンをパッケージングユニット中にパッケージングする。なぜならば、プラスミドＤＮＡはパッケージング開始部位を含有しており、非複製形質導入粒子は複製されたプラスミドＤＮＡを保有したまま産生されるからである。

レポーター
一部の実施形態では、本発明のＮＲＴＰおよび構築物は、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。レポーター遺伝子は、レポーター分子をコードすることができ、レポーター分子は検出可能マーカーまたは選択マーカーが可能である。ある特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、細胞で発現されると検出可能シグナルを出すレポーター分子をコードする。

ある特定の実施形態では、レポーター分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙ、ならびに近赤外蛍光タンパク質などのしかしこれらに限定されない蛍光レポーター分子が可能である。

他の実施形態では、レポーター分子は発光反応を媒介する酵素（ＬｕｘＡ、ＬｕｘＢ、ＬｕｘＡＢ、Ｌｕｃ、Ｒｕｃ、ｎＬｕｃ、等）が可能である。レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、比色反応に適している酵素（ＬａｃＺ、ＨＲＰ）、アフィニティーペプチド（Ｈｉｓ－タグ、３Ｘ－ＦＬＡＧ）などの免疫検出に適したタンパク質、アプタマーとして機能するもしくは酵素活性を示す核酸（リボザイム）、または抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）を含むことができる。当技術分野で公知の他のレポーター分子は、標的核酸または細胞を検出するシグナルを出すために使用することができる。

他の態様では、レポーター分子は核酸分子を含む。一部の態様では、レポーター分子は特定の結合活性を有するまたは酵素活性を示すアプタマー（例えば、アプタザイム、ＤＮＡザイム、リボザイム）である。

レポーターおよびレポーターアッセイは本明細書のセクションＶでさらに記載されている。

Ｖ．ＮＲＴＰおよびレポーターアッセイ
誘導物質レポーターアッセイ
一部の実施形態では、本発明は、生細胞内で遺伝子プロモーターを標的にする外来性または天然の誘導物質と一緒に使用するためのレポーター分子としてのＮＲＴＰの使用のための方法を含む。本発明のＮＲＴＰは、セクションＩＩＩおよび下の実施例１～２に記載される方法を使用して操作することができる。

一部の実施形態では、方法はＮＲＴＰをレポーターとして用いることを含み、ＮＲＴＰは、標的細胞内で標的遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターに動作可能に連結されているレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子を含むＮＲＴＰが標的細胞中に導入されると、レポーター核酸分子において標的遺伝子プロモーターの誘導を介してレポーター遺伝子の発現が可能になる。

転写物
上記の通り、転写物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型配列または遺伝子から転写された一連のヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されたｃＤＮＡ配列またはＤＮＡ鋳型から転写されたｍＲＮＡ配列が可能である。転写物は、操作された核酸構築物から転写することができる。転写物は、転写物が分子内二重鎖を形成することができる２つの領域を含むように、それ自体の内部に相補性領域を有することができる。１領域は、レポーター配列に結合してレポーター配列の翻訳を遮断する「ｃｉｓ抑制配列」と呼ぶことができる。転写物の第２の領域は、検出可能または選択マーカーなどのレポーター分子をコードする「レポーター配列」と呼ばれる。

本発明の転写物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長が可能である転写物配列が可能である。他の実施形態では、転写物は、少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれよりも多いヌクレオチド長が可能である。ｃｉｓ抑制配列およびレポーター配列は同じ長さまたは異なる長さが可能である。

一部の実施形態では、ｃｉｓ抑制配列は、レポーター配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれよりも多いスペーサーヌクレオチド分離されている。

ベクター
別の態様では、本発明の転写物（アンチセンスおよびセンス配列を含む）は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現される（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａら、ＴＩＧ．（１９９６）、１２：５～１０頁；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａら、国際ＰＣＴ公開第００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄ、国際ＰＣＴ公開第００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号参照）。これらの配列は、バクテリオファージベースのベクターを含む、線形構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これらの配列は取り込まれ、宿主ゲノム中に組み込まれたトランス遺伝子として受け継がれることができる。転写物は、それが染色体外プラスミドとして受け継がれることができるように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２頁）。

転写物配列は、発現プラスミド上に位置するプロモーターにより転写させることができる。一実施形態では、ｃｉｓ抑制およびレポーター配列は、転写物がステムおよびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列により連結される逆方向反復として発現される。

組換え発現ベクターを使用すれば本発明の転写物を発現することができる。組換え発現ベクターは一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。転写物を発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（概説は、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７～１２９頁）参照）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６頁）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１～４３４頁）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）、Ｃｅｌｌ ６８：１４３～１５５頁）参照）、またはアルファウイルスならびに当技術分野で公知のウイルスに基づいて構築することができるがこれらに限定されない。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで、上皮細胞を含む、多くの異なる細胞型中に種々の遺伝子を導入するのに使用されてきた（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５～１３９８頁；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０～６４６４頁；Ｗｉｌｓｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４～３０１８頁；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１～６１４５頁；Ｈｕｂｅｒら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９～８０４３頁；Ｆｅｒｒｙら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７～８３８１頁；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２～１８０５頁；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０～１９頁；Ｋａｙら、１９９２年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１～６４７頁；Ｄａｉら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２～１０８９５頁；Ｈｗｕら、１９９３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４～４１１５頁；米国特許第４，８６８，１１６号;米国特許第４，９８０，２８６号;国際公開第８９／０７１３６号;国際公開第８９／０２４６８号;国際公開第８９／０５３４５号;および国際公開第９２／０７５７３号参照）。細胞のゲノム中に遺伝子を形質導入してゲノム中に挿入された遺伝子を発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムをＰＡ３１７およびＰｓｉ－ＣＲＩＰなどの適切なパッケージング細胞株中にトランスフェクトすることにより作成することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅら、１９９１年、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５～１０頁；Ｃｏｎｅら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９頁）。組換えアデノウイルスベクターを使用すれば、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）において広範囲の細胞および組織に感染することができ（Ｈｓｕら、１９９２年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、１６６：７６９頁）、感染のために有糸分裂的に活性な細胞を必要としない利点もある。

発現される転写物（複数可）のコード配列を受け入れることができるいかなるウイルスベクターも、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス、および同類のもの由来のベクターを使用することができる。ウイルスベクターのトロピズムは、エンベロープタンパク質または他のウイルス由来の他の表面抗原でベクターをシュードタイプ化することにより、または必要に応じて異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することにより、改変することができる。

例えば、本発明の特色となるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ、および同類のもの由来の表面タンパク質でシュードタイプ化することができる。本発明の特色となるＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようベクターを操作することにより、異なる細胞を標的にさせることができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当技術分野内にあり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅら、（２００２）、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１～８０１頁を参照されたい。

本発明において使用するのに適している組換えウイルスベクターの選択、転写物を発現するための核酸配列をベクター中に挿入するための方法、および目的の細胞へのウイルスベクターの送達の方法は当技術分野の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１～３１０頁；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８～６１４頁；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５～１４頁；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５～３０頁；およびＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１～４０６頁．を参照されたい。

ウイルスベクターはＡＶおよびＡＡＶ由来が可能である。本発明の特色である転写物を発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞中に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈら、（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６～１０１０頁に記載されている。本発明の特色である転写物を発現するのに適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞中に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、（１９８７）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６～３１０１頁；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊら、（１９９６）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７０：５２０～５３２頁；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら、（１９８９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２～３８２６頁；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際公開第９４／１３７８８号；および国際公開第９３／２４６４１号に記載されている。

本発明の特色であるＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターにおいて転写物発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターもしくはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、もしくは一般的にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）または原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードしているという条件で、Ｔ７プロモーターでもよい。プロモーターは、膵臓にトランス遺伝子発現を指示することもできる（例えば、膵臓向けのインスリン調節配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉら、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１～２５１５頁）参照）。

さらに、転写物の発現は、例えば、ある特定の生理的調節因子、例えば、循環グルコースレベル、またはホルモンに感受性である調節配列などの誘導性調節配列および発現系を使用することによって、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら、１９９４年、ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０～２４頁）。そのような誘導性発現系は、細胞においてまたは哺乳動物においてトランス遺伝子発現の制御に適しており、エクジソンによる、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質、およびイソプロピル－ベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節を含む。当業者であれば、ｄｓＲＮＡトランス遺伝子の意図的用途に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選ぶことができると考えられる。

一般に、転写物分子を発現することができる組換えベクターは下記のように送達され、標的細胞にとどまる。代わりに、転写物分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現された後は、転写物は標的ＲＮＡに結合してその機能または発現を調節する。転写物発現ベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与により、患者から外植された標的細胞への投与続いて患者中への再導入により、または所望の標的細胞中への導入を可能にする他の任意の手段によりなど、全身的が可能である。

転写物発現ＤＮＡプラスミドは典型的には、カチオン性脂質キャリアー（例えば、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ））または非カチオン性脂質ベースのキャリアー（例えば、トランジット－ＴＫＯ（Ｔｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ）（商標））との複合体として標的細胞中にトランスフェクトされる。1週間またはそれよりも長い期間にわたる単一ＰＲＯＣ遺伝子または複数のＰＲＯＣ遺伝子の異なる領域を標的にするｄｓＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも本発明により意図されている。宿主細胞中へのベクターの導入が成功すれば、種々の公知の方法を使用してモニターすることができる。例えば、一過性トランスフェクションは、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーターを用いてシグナルを送ることができる。ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の安定なトランスフェクションは、ヒグロマイシンＢ耐性などの、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性をトランスフェクトされた細胞に与えるマーカーを使用して確かめることができる。

組換えＤＮＡを含有するベクターの送達は、リポソーム、ウイルス様粒子、ファージまたはウイルス由来の形質導入粒子、およびコンジュゲーションを含むがこれらに限定されない、非生体系または生体系により実施することができる。

転写物アッセイのためのレポーター
一部の実施形態では、核酸構築物はレポーター配列（例えば、レポーター遺伝子配列）を含む。レポーター遺伝子は、細胞で発現されるとシグナルを生じるレポーター分子をコードする。一部の実施形態では、レポーター分子は、検出可能マーカーまたは選択マーカーが可能である。ある特定の実施形態では、レポーター分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光レポーター分子が可能である。他の実施形態では、レポーター分子は化学発光タンパク質が可能である。

レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、比色検出に適した酵素、免疫検出に適したタンパク質、免疫検出に適したペプチドまたはアプタマーとして機能するもしくは酵素活性を示す核酸が可能である。

選択マーカーもレポーターとして使用することができる。選択マーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子が可能である。

実施例１：非天然尾部繊維を有する非複製形質導入粒子を産生するための破壊／補完ベースの方法
尾部繊維交換プラットフォームの図は図１に示されている。その標的細菌細胞へのＮＲＴＰの結合はバクテリオファージ尾部繊維に媒介される。天然のＰ１ ＮＲＴＰ尾部繊維遺伝子を取り除くことにより、「バルド」シャーシを作成して異種尾部繊維の機能性を試験した。次に、新しい尾部繊維は、尾部繊維ディスプレイベクター（ＴＦＤＶ）を使用して「バルド」バックグラウンドにおいて発現された。Ｐ１ベースのスマーティクルゲノムは、Ｍｕｒｐｈｙら、（１９９８）からのλ－ＲＥＤリコンビニアリング法を使用して改変されて、Ｓ構造尾部繊維タンパク質およびＵ尾部繊維センブリーシャペロンタンパク質をコードする遺伝子に欠失を作り出した。この破壊は、いかなる所望の尾部繊維でもトランスで発現するプラットフォームを作り出した。細菌株は、ルリア－ベルターニ（ＬＢ）ブロスおよびＬＢ寒天上、以下の抗生物質濃度ゲンタマイシン１５μｇ／ｍＬ、カビニシリン（Ｃａｂｉｎｉｃｉｌｌｉｎ）１００μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ、ゼオシン１００μｇ／ｍＬおよびハイグロマイシン１５０μｇ／ｍＬで生育させた。ニューイングランドバイオラボ（ＮＥＢ）クローニング株ＮＥＢ５αを使用してプラスミドを増殖させ保管した。プラスミド用のＤＮＡのアセンブリーならびにリコンビニアリング用の線形ＤＮＡ産物は、ＮＥＢ Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して産生された。ＥＭＤミリポアＫＯＤ Ｘｔｒｅｍｅホットスタートポリメラーゼは、すべてのＰＣＲ反応においてＤＮＡの増幅用に使用した。

実施例２：「バルド」Ｐ１シャーシの構築
λ－ＲＥＤコードリコンビニアリングプラスミドｐＫＭ２０８は最初、細菌株ＢＡＡ－１００１（ｐａｃＡＢ遺伝子はハイグロマイシンカセットで置き換えられている）中に形質転換されて、リコンビニアリング反応を促進した。株は、組換えタンパク質の発現のために、エレクトロコンピテントにされ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導された。次に、抗生物質耐性マーカースペクチノマイシンを含有する線形ＤＮＡを株中に形質転換し、このＤＮＡはＰ１のｓおよびｕ遺伝子の周囲の領域に対するホモロジーを含有している。３０℃での回収後、形質転換細胞はスペクチノマイシンを含有するＬＢ寒天上に蒔かれ、パッチした。ｓおよびｕ遺伝子の除去のためのコロニーＰＣＲ続いてサンガー配列決定を使用して、所望の改変が行われたことを確かめた。構築中、ｕ’およびｓ_ｖ’領域は無傷のままにしておいたが、ｓ_ｖ’は完全構造タンパク質をコードしていないので、Ｓ’尾部繊維は産生することができない。この細菌リソゲンは、補完なしでそれ独自の機能的尾部繊維を発現する能力を欠く「バルド」Ｐ１シャーシを表した。バルドＰ１シャーシを含有する得られた細菌株は、ＳＥＧ＿１７０細胞株と名付けた。シャーシの機能試験は、天然のＳおよびＵタンパク質にコード配列を有するおよびなしのパッケージングプラスミドからなっていた。スマーティクル機能性の喪失は、パッケージングプラスミド上に尾部繊維のないパッケージング株由来のライセートから見られた。パッケージングプラスミド上に尾部繊維のあるパッケージング株由来のライセートから活性が回復され、トランスでの補完が成功した。

実施例３：尾部繊維ディスプレイベクター（ＴＦＤＶ）の構築
尾部繊維ディスプレイベクター（ＴＦＤＶ）を利用して、バルドバクテリオファージＰ１シャーシにおいて天然のおよび／または新規の尾部繊維を発現させた。これらのディスプレイベクターは、ｐＴａｃ ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下でゲンタマイシンまたはゼオシン耐性カセット、ｐＵＣ／ＲＯ１６００複製開始点、および尾部繊維遺伝子を利用した。すべてのベクターが、形質導入および光アッセイ用のＰ２３－ｌｕｘＡＢ－ＴＴ（ルシフェラーゼ）カセットと一緒にｐａｃＡＢ遺伝子／パッケージング部位も含有していた。尾部繊維候補は、ＩＤＴで新規に合成されるまたは細菌ｇＤＮＡからＰＣＲ増幅され、ＰＣＲ増幅ベクター中にギブソンアセンブリーされ、ＮＥＢ細胞中に形質転換され、パッチし、コロニーＰＣＲ確認され、配列が確認された。配列が確認されたプラスミドは、特徴がはっきりしたＳＥＧ＿１７０バルドパッケージング株（Ｌｕｃｉｇｅｎから購入したコンピテント細胞）中に形質転換された。形質転換細胞は選択培地上にパッチし、少量のライセートにスクリーニングして、最良のスマーティクル産生クローンを決定した。上位のクローンは大容量ライセート産生、ＱＣ、および細菌パネル上での反応性分析のために引き継がれた。

実施例４：尾部繊維のゲノム発現の構築
天然のおよび/または新規の尾部繊維を有する最適スマーティクル産生を促進するため、尾部繊維およびシャペロン遺伝子をＰ１スマーティクルゲノムのｓおよびｕ遺伝子天然位置に組み込んだ。イントランスの代わりにゲノムからのこの発現は、適切な発現およびＰ１ベースのゲノムの残りの部分とのタイミングを保証し、イントランス発現からの負担を減らす。尾部繊維は先ず、尾部繊維構造遺伝子（ｓ遺伝子）または尾部繊維シャペロン遺伝子（ｕ遺伝子）のＣ末端部分上にハイグロマイシンカセットに対するホモロジーを含有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲを使用してハイグロマイシンカセットも増幅させた。これら２つの断片はギブソンアセンブリーで組立て、ｓが以前見つかったＰ１ゲノムに対するホモロジーならびに天然のｓおよびｕ遺伝子のすぐ下流にあるリコンビナーゼｃｉｎにおけるホモロジーを含有するプライマーを用いてさらに増幅した（図２参照）。このリコンビニアリングエベントは、尾部繊維をＰ１ゲノム上に挿入するならびにｓ尾部繊維遺伝子の可変領域の切り替えに関与するｃｉｎリコンビナーゼを破壊するという二重の機能を果たした。尾部繊維およびハイグロマイシンカセットのこの線形ＤＮＡ産物は、スペクチノマイシン耐性カセットを含有するＢＡＡ－１００１中に形質転換された。形質転換に続いて３０℃で回収し蒔いた。細胞はハイグロマイシンを含有するＬＢ寒天上に蒔き、スペクトロマイシン感受性についてパッチした。有望なコロニーは、コロニーＰＣＲおよびサンガー配列決定を用いて調べた。

次に、非天然尾部繊維およびハイグロマイシン耐性を含有する陽性コロニーにパッケージングプラスミドを形質転換した。細胞は抗生物質を含有する培地で一晩生育した。ライセートは９０分４２℃熱誘導を使用して作成し、Ｐ１マスターリプレッサーを不活化し、スマーティクル産生を促進した。次にライセートは遠心沈殿させ、細菌細胞デブリをペレット化し、次に２μｍフィルターを通して濾過減菌した。ライセートは、上記のＴＦＤＶパッケージング株についての方法に類似して新しい宿主上で適切なスマーティクル機能性について調べた。

単一のスマーティクルゲノムから２つ以上の尾部繊維を発現するパッケージング株を構築するため、類似するリコンビニアリング手法を上記の通りに使用した。第1の尾部繊維はＰ１ゲノム上に類似して配置されていたが、尾部繊維がハイグロマイシン耐性に連結されている代わりに、尾部繊維はカナマイシンまたはゲンタマイシンなどの代わりの抗生物質に結合していた。ｃｉｎリコンビナーゼも、複数の尾部繊維の切り替えを促進するため無傷のままにされた。第２のリコンビニアリング反応を実施して、ハイグロマイシンカセットに結合されている尾部繊維の第２の可変部分を、すでにゲノム上にあるカナマイシン（またはゲンタマイシン）カセットとの交換のために配置した。これを繰り返して、３つ、４つ、５つ、等の尾部繊維をゲノムに付加することができた（図６参照）。

実施例５：ＮＲＴＰアッセイ条件
アッセイは、アッセイ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン＋５ｇ／Ｌの酵母エキス＋５％のＰＥＧ８０００）において５．０Ｅ＋０５ ＣＦＵ／ｍＬの濃度での細菌細胞の最初の２．５時間の事前処理を含んだ。事前処理工程に続いてＮＲＴＰと形質導入塩（１ＭのＭｇＣｌ_２＋０．５ＭのＣａＣｌ_２）の両方を反応に添加し、２時間インキュベートし、これによりルシフェラーゼ遺伝子、ｌｕｘＡＢを含有するレポーター分子の形質導入が可能になった。細菌からの光産生は、ルミノメーターを使用して相対発光量（ＲＬＵ）出力により測定した。

実施例６：操作された尾部繊維を有するＮＲＴＰの性能
種々の種および株に対する操作されたＮＲＴＰの改良された反応性は表１に見ることができる。これらのデータによれば、１）分析された尾部繊維の多様性、２）異なる尾部繊維タンパク質結合ドメインにより観察された頑強な変更反応性、３）一部の尾部繊維はある特定の種に高度に特異的であること、および４）一部の尾部繊維は細菌の多くの多様な種に対して高度に反応性であることがはっきりと示されている。これらの操作されたＮＲＴＰ由来の尾部繊維のヌクレオチドとアミノ酸配列（例えば、「サンセット」、「インディアン」、「タンジェリン」、等）の両方が配列表に収載されている。

図３は、バルド（尾部繊維欠損）Ｐ１リソゲンがどのように変更されてゲノムから新しい尾部繊維を発現するかを図的に描いている。図４は、所与の尾部繊維のゲノム組込みが、ＴＦＤＶからのトランス発現と比べてどのように性能を改良できているかを描いている。光活性は、ＴＦＤＶとゲノムから発現されたバージョンの両方について３つの指示株上での３つの別個の尾部繊維について示されている。さらに、ＴＦＤＶおよびゲノムＳ尾部繊維ＮＲＴＰの形質導入効率もＷＴ Ｐ１ ＮＲＴＰ対照と比較した（Ｖ３）。

図５Ａは、プラスミドｐ１５Ｂ Ｕタンパク質「ｔシャペロン」を発現するパッケージング株をこのタンパク質を発現しないパッケージング株と比べて、操作された「インディアン」ＮＲＴＰの改良された尾部繊維活性を光産生（ＲＬＵ）として示すグラフを描いている。図５Ｂは、分離したパッケージングプラスミド（ＴＦＤＶ）から産生された「スカーレット」ＮＲＴＰと比べてバクテリオファージゲノムから産生される「スカーレット」ＮＲＴＰの改良された性能を示すグラフを描いている。

図６Ａは、０、１つ、２つ、または３つの別個の尾部繊維遺伝子を有する産生株のゲノム配置を表示し、リソゲンがどのように操作されて単一の発酵から複数のＮＲＴＰを産生するのかを示している。尾部繊維遺伝子は、ｃｉｘ交差部位を新規の位置に置いて配置することができる。遺伝子は、大きなまたは小さなオペロンでの組換えに依存しない発現用に配置することもできる。図６Ｂは、所与のＮＲＴＰを持つ個々の尾部繊維により特異的に検出される指示株を描いている（左）。右パネルは、複数の尾部繊維を発現するパッケージング株が複数の指示株を検出できることを示しているが、特異性が異なる複数の機能的ＮＲＴＰを一度に産生できることを実証している。

図７は、二機能性（２つの尾部繊維）発現株由来のＮＲＴＰの性能を分離した産生ランで産生される個々のＮＲＴＰと比べている。上の画像は、ジャズベリーおよびシャムロック尾部繊維由来の二機能性尾部繊維領域のゲノム配置を示している。左中は、異なる尾部繊維に特異的である指示株上での個々に産生されたＮＲＴＰと二機能性ＮＲＴＰを比べている。右中は、他のＮＲＴＰ（Ｖ３と呼ばれる天然のＰ１ ＮＲＴＰなどの）と混ぜ合わせてカクテルにすることに加えて二機能性産生株を作成することにより大腸菌株の大きなパネル上で検出および光産生がどのように改良されたかを示している。図７の下部は、二機能性産生ＮＲＴＰの性能を別々に産生された個々の尾部繊維の累積性能と直接比べている。

図８は、ウイルスシャーシ上で新しい尾部繊維に機能を持たせるのに必要なエレメントを同定した実施された実験結果を示している。パネルＡは、Ｐ１ｒ遺伝子が必要とされることおよび最大活性のためには尾部繊維可変領域（Ｓ_ｖ）はその同族ｕホモログアクセッサリータンパク質と対になるべきであることを図解している。さらに、パネルＡは、３つの別個の尾部繊維保存領域は新しいシャーシ上での非天然尾部繊維の機能付与を可能にすることができたことを示している。パネルＢは、Ｐ１バクテリオファージ、１１型Ｋｐｎバクテリオファージ、およびｐ１５Ｂプラスミド（Ｐ１に関係している）由来の３つのＳｃ領域のアミノ酸配列のアライメントを示しており、高度に保存されたＮ末端１５０アミノ酸配列モチーフを強調している。

図９は、発酵株由来の尾部繊維遺伝子の発現のための種々の配置を表示している。Ａ）は、ファージゲノムからの尾部繊維およびウイルスシャーシの発現を示している。Ｂ）は、ファージゲノムからのウイルスシャーシ発現およびパッケージングプラスミドからの尾部繊維遺伝子を示している。Ｃ）は、ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび独立したプラスミドからの尾部繊維を示している。Ｄ）は、ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび細菌ゲノムからの尾部繊維を示している。Ｅ）は、ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび1セットの尾部繊維を示している。第２の独特のセットの尾部繊維は独立したプラスミドから発現される。Ｆ）は、ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび尾部繊維を示している。第２の独特のセットの尾部繊維はパッケージングプラスミドから発現される。Ｇ）は、ファージゲノムからのウイルスシャーシおよび２つの独特のセットの尾部繊維を示している。

本開示は、特に、好ましい実施形態および種々の別の実施形態を参照して明らかにされ記述されてきたが、形式および詳細な点に種々の変更を加えることができることは当業者であれば理解するが、本発明の本当の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。

配列表に収載される配列の説明
Ｐ１シャーシ上で機能的に発現される尾部繊維のヌクレオチド配列
アスパラガス尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１
バナナ尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２
ビタースウィート尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号３
コバルト尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号４
コーンフラワー尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号５
デニム尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号６
エッグプラント尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号７
ファーン尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号８
フクシャ尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号９
ファジー尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１０
インチワーム尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１１
インディアン尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１２
インジゴ尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１３
ジャズベリー尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１４
ジャズベリー－シャムロック二重尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１５
ジャングル尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１６
マンゴー尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１７
マルーン尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１８
マルベリー尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号１９
Ｐ１＿Ｓ’遺伝子ヌクレオチド配列 配列番号２０
Ｐ１Ｓ－Ｐ１Ｓ’－シャムロック二重尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２１
パイン尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２２
プラム尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２３
クイーン尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２４
ラズマタズ尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２５
サーモン尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２６
スカーレット尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２７
シャムロック尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２８
サンセット尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号２９
タンジェリン尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号３０
アザミ尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号３１
トロピカル＿ｐＮＳ８８尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号３２
トロピカル＿ｐＮＳ９２尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号３３
バイオレット尾部繊維ヌクレオチド配列 配列番号３４
Ｐ１シャーシ上で機能的に発現される尾部繊維のアミノ酸配列
アスパラガス＿－＿Ｐ１Ｓｃ－（Ｐ１Ｓｖ－ＭｕＳ＿ハイブリッド）＿翻訳 配列番号３５
バナナ＿－＿Ｐ１Ｓｃ（ａａ１－１１４）－Ｅｃｌ１１２（ａａ２１８－エンド）＿翻訳 配列番号３６
ビタースウィート＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｓｃ－ｐ１５ｂ＿ＳｖＱ＿翻訳 配列番号３７
コバルト＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－Ｋｐｎ＿ＳＣＫＰ＿ＴＦ４＿翻訳 配列番号３８
コーンフラワー＿－＿Ｐ１Ｓｃ（ａａ１－２０８）－Ｋｐｎ４７８＿尾部＿繊維（ａａ１３１－４９９）＿翻訳 配列番号３９
デニム＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－Ｋｐｎ＿ＳＣＫＰ＿ＴＦ１＿翻訳 配列番号４０
エッグプラント＿－＿Ｄ６Ｓｃ－Ｄ６Ｓｖ’＿翻訳 配列番号４１
ファーン＿－＿Ｐ１Ｓｃ－（Ｐ１Ｓｖ－Ｄ１０８Ｓ＿ハイブリッド）＿翻訳 配列番号４２
フクシャ＿－＿Ｐ１Ｓｃ－Ｄ６Ｓｖ＿翻訳 配列番号４３
ファジー＿－＿Ｐ１Ｓｃ（ａａ１－２０８）－Ｋｐｎ０５１＿ＴＦ（ａａ４０－３８２）＿翻訳 配列番号４４
インチワーム＿－＿Ｐ１Ｓｃ－Ｒ２＿ピオシン＿翻訳 配列番号４５
インディアン＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－ｐ１５ｂＳｖＮ＿翻訳 配列番号４６
インジゴ＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－Ｋｐｎ＿ＳＣＫＰ＿ＴＦ３＿翻訳 配列番号４７
ジャズベリー＿－＿Ｐ１Ｓｃ－ＫｐｎＳｖ＿翻訳 配列番号４８
ジャングル＿－＿Ｐ１Ｓｃ－（Ｐ１Ｓｖ’－ＭｕＳ’＿ハイブリッド）＿翻訳 配列番号４９
マンゴー＿－＿Ｐ１Ｓｃ（ａａ１－２１４）－Ｅｃｌ１１７Ｂ（ａａ２１４－７６４）＿翻訳 配列番号５０
マルーン＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－ｐ１５ｂＳｖＰ＿翻訳 配列番号５１
マルベリー＿－＿Ｄ６Ｓｃ－Ｄ６Ｓｖ＿翻訳 配列番号５２
Ｐ１＿Ｓ’＿－＿Ｐ１Ｓｃ－Ｐ１Ｓｖ’＿翻訳 配列番号５３
Ｐｉｎｅ＿－＿Ｐ１Ｓｃ（ｎｔ１－９８７）－Ｐ２Ｈ＿翻訳 配列番号５４
プラム＿－＿ＫｐｎＳｃ－ＫｐｎＳｖ＿翻訳 配列番号５５
クイーン＿－＿Ｓ－クイーン＿Ｓｖ＿翻訳 配列番号５６
ラズマタズ＿－＿Ｐ１Ｓｃ－Ｐ７Ｓｖ＿翻訳 配列番号５７
サーモン＿－＿Ｐ１Ｓｃ－Ｐ７Ｓｖ’＿翻訳 配列番号５８
スカーレット＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－ｐ１５ｂＳｖＩ＿翻訳 配列番号５９
シャムロック＿－＿Ｐ１Ｓｃ－（Ｐ１Ｓ－ＳｆＭｕＳ’＿ハイブリッド）＿翻訳 配列番号６０
サンセット＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－ｐ１５ｂＳｖＲ＿翻訳 配列番号６１
タンジェリン＿－＿ｐ１５ｂＳｃ－ｐ１５ｂＳｖ０＿翻訳 配列番号６２
アザミ＿－＿Ｐ１Ｓｃ－ＫｐｎＳｖ＿翻訳 配列番号６３
トロピカル＿ｐＮＳ８８＿－＿Ｐ１Ｓｃ（ａａ１－２１４）－Ｅｃｌ１１７Ａ（ａａ９１－４３７）＿翻訳 配列番号６４
トロピカル＿ｐＮＳ９２＿－＿Ｐ１Ｓｃ（ａａ１－２１４）－Ｅｃｌ１１７Ａ（ａａ９６－４３７）＿翻訳 配列番号６５
バイオレット＿－＿ＲＣＳ４７Ｓｃ－ＲＣＳ４７Ｓｖ＿翻訳 配列番号６６
シャペロンタンパク質のアミノ酸配列
アスパラガス＿－＿ＭｕＵ＿翻訳 配列番号６７
バナナ＿－＿Ｅｃｌ１１２＿Ｕ＿シャペロン＿翻訳 配列番号６８
ビタースウィート＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｔ＿翻訳 配列番号６９
コバルト＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｔ＿翻訳 配列番号７０
デニム＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｔ＿翻訳 配列番号７１
エッグプラント＿－＿Ｐ１＿Ｕ＿翻訳 配列番号７２
ファーン＿－＿Ｄ１０８＿Ｕ＿翻訳 配列番号７３
フクシャ＿－＿Ｐ１＿Ｕ’＿翻訳 配列番号７４
ファジー＿－＿ＰＲＯＫＫＡ＿０００４３＿（Ｋｐｎ４７８＿シャペロン）＿翻訳 配列番号７５
インチワーム＿－＿ＰＡ０６２１＿翻訳 配列番号７６
インディアン＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｔ＿翻訳 配列番号７７
インジゴ＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｔ＿翻訳 配列番号７８
ジャズベリー＿－＿Ｋｐｎ＿Ｕ＿翻訳 配列番号７９
ジャングル＿－＿Ｍｕ＿Ｕ’＿翻訳 配列番号８０
マンゴー＿－＿Ｅｃｌ１１７Ｂ＿Ｕ＿シャペロン＿翻訳 配列番号８１
マルーン＿－＿ｐ１５＿Ｔ＿翻訳 配列番号８２
マルベリー＿－＿Ｐ１＿Ｕ’＿翻訳 配列番号８３
Ｐ１＿Ｓ’＿－＿Ｐ１＿Ｕ’＿翻訳 配列番号８４
パイン＿－＿Ｐ２＿Ｇ＿翻訳 配列番号８５
プラム＿－＿Ｋｐｎ＿Ｕ＿翻訳 配列番号８６
クイーン＿－＿Ｑｕｅｅｎ＿Ｕ＿シャペロン＿翻訳 配列番号８７
ラズマタズ＿－＿Ｐ７＿Ｕａ＿翻訳 配列番号８８
ラズマタズ＿－＿Ｐ７＿Ｕｂ＿翻訳 配列番号８９
サーモン＿－＿Ｐ７＿Ｕ’＿翻訳 配列番号９０
スカーレット＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｔ＿翻訳 配列番号９１
シャムロック＿－＿ＳｆＭｕＵ’＿翻訳 配列番号９２
サンセット＿－＿ｐ１５ｂ＿Ｔ＿翻訳 配列番号９３
タンジェリン＿－＿ｐ１５＿Ｔ＿翻訳 配列番号９４
アザミ＿－＿ＫｐｎＵ＿翻訳 配列番号９５
バイオレット＿－＿ＲＣＳ４７＿Ｕ＿翻訳 配列番号９６
他の配列
ボールド＿シャーシ＿尾部＿繊維＿領域＿Ｐ１＿ｓ－ｕ：：ａａｄＡ 配列番号９７
リオ 尾部繊維＿ｓ＿ハイブリッド＿ヌクレオチド配列 配列番号９８
リオ シャペロン＿ｕ＿ヌクレオチド＿配列 配列番号９９
リモン 尾部繊維＿ｓ＿ハイブリッド＿ヌクレオチド配列 配列番号１００
リモン シャペロン＿ｕ＿ヌクレオチド＿配列 配列番号１０１
オーキド 尾部繊維＿ｓ＿ハイブリッド＿ヌクレオチド配列 配列番号１０２
オーキッド シャペロン＿ｕ＿ヌクレオチド配列 配列番号１０３
ゴールド 尾部繊維＿ｓ＿ハイブリッド＿ヌクレオチド配列 配列番号１０４
ゴールド シャペロン＿ｕ＿ヌクレオチド配列 配列番号１０５
ブルーティフル 尾部繊維＿ｓ＿ハイブリッド＿ヌクレオチド配列 配列番号１０６
ブルーティフル シャペロン＿ｕ＿ヌクレオチド配列 配列番号１０７
リオ 尾部繊維＿Ｓ＿ハイブリッド＿アミノ酸配列 配列番号１０８
リモン 尾部繊維＿Ｓ＿ハイブリッド＿アミノ酸配列 配列番号１０９
オーキッド 尾部繊維＿Ｓ＿ハイブリッド＿アミノ酸配列 配列番号１１０
ゴールド 尾部繊維＿Ｓ＿ハイブリッド＿アミノ酸配列 配列番号１１１
ブルーティフル 尾部繊維＿Ｓ＿ハイブリッド＿アミノ酸配列 配列番号１１２
リオ シャペロン＿Ｕ＿アミノ酸配列 配列番号１１３
リモン シャペロン＿Ｕ＿アミノ酸配列 配列番号１１４
オーキッド シャペロン＿Ｕ＿アミノ酸配列 配列番号１１５
ゴールド シャペロン＿Ｕ＿アミノ酸配列 配列番号１１６
ブルーティフル シャペロン＿Ｕ＿アミノ酸配列 配列番号１１７

Claims (39)

1. － マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来のバクテリオファージリソゲン（マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲン）が生来有する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子の発現を妨げる遺伝子破壊を含有するマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンであって、前記１つまたは複数の遺伝子が、細菌細胞受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質の１つまたは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロンタンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質を尾部に付着させるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子の任意の組合せから選択される、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲン；および
   － 細菌細胞受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質の１つまたは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロンタンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質を尾部に付着させるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子の任意の組合せから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む補完的核酸分子であって、補完的核酸がマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊を補完し、それによって機能的尾部繊維が産生される、補完的核酸分子
   を含むバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォーム。
2. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが、Ｂｃｅｐ７８１様ウイルス、Ｂｃｅｐｍｕ様ウイルス、ＦｅｌｉｘＯ１様ウイルス、Ｈａｐｕｎａ様ウイルス、Ｉ３様ウイルス、Ｍｕ様ウイルス、Ｐｕｎａ様ウイルス、Ｐｂｕｎａ様ウイルス、ＰｈｉＣＤ１１９様ウイルス、Ｐｈｉｈ様ウイルス、Ｐｈｉｋｚ様ウイルス、Ｖｉｕｎａ様ウイルス、ユーカンピビリナエ（Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ）、Ｃｐ２２０様ウイルス、Ｃｐ８ｕｎａ様ウイルス、ペデュオウイルス（Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ）、Ｈｐｕｎａ様ウイルス、Ｐ２様ウイルス、スポウナウイルス（Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ）、スポウナ様ウイルス、Ｔｗｏｒｔ様ウイルス、Ｔ偶数ウイルス（Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ）、Ｓｃｈｉｚｏｔ４様ウイルス、またはＴ４様ウイルスから選択される属に由来する、請求項１に記載のプラットフォーム。
3. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが、Ｐｕｎａ様ウイルス属に由来する、請求項２に記載のプラットフォーム。
4. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）バクテリオファージファージＰ１（Ｐ１バクテリオファージ）である、請求項３に記載のプラットフォーム。
5. 補完的核酸分子上の１つもしくは複数の遺伝子または遺伝子の組合せが、産生される機能的尾部繊維が天然の尾部繊維ではないように、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子に由来しない領域を含有する、請求項１から４のいずれか１項に記載のプラットフォーム。
6. １つもしくは複数の遺伝子または遺伝子の組合せが、産生される機能的尾部繊維が天然のＰ１バクテリオファージ尾部繊維ではないように、Ｐ１バクテリオファージに由来しない領域を含有する、請求項５に記載のプラットフォーム。
7. 補完的核酸分子がプラスミド分子である；または
   補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位に組み込まれる；または
   補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位以外の部位に組み込まれる；または
   補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンを含有する宿主細菌細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１から６のいずれ１項に記載のプラットフォーム。
8. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンのゲノムのパッケージングに関与する１つまたは複数のパッケージング遺伝子にさらなる破壊を含有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のプラットフォーム。
9. 補完的核酸分子がプラスミド分子であり、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンにおいて１つまたは複数のパッケージング遺伝子における破壊を補完する１つまたは複数のパッケージング遺伝子が、前記プラスミド分子中に含有される、または
   補完的核酸分子がプラスミド分子であり、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンにおいて１つまたは複数のパッケージング遺伝子における破壊を補完する１つまたは複数のパッケージング遺伝子が、前記プラスミド分子から分離しているレポーターまたは治療発現プラスミド中に含有される、請求項８に記載のプラットフォーム。
10. 配列番号９７の核酸配列を含むＰ１バクテリオファージリソゲンを含む細菌細胞株。
11. 非天然尾部繊維を有するバクテリオファージ粒子を産生するための方法であって、
    － 請求項１から９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を提供するステップであって、補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域を有する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子を含む、提供するステップ、および
    － 細菌細胞にマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、非天然尾部繊維を有するバクテリオファージ粒子を産生するステップ
    を含む方法。
12. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域が、カウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目内のバクテリオファージから得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 尾部繊維可変領域が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）内のバクテリオファージから得られる、請求項１２に記載の方法。
14. 補完的核酸分子が、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
15. シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が、カウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目内のバクテリオファージから得られる、請求項１４に記載の方法。
16. シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）内のバクテリオファージから得られる、請求項１５に記載の方法。
17. シャペロンタンパク質が、非複製ウイルス由来構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる、請求項１４に記載の方法。
18. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域が、ファージ尾部様粒子もしくは構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む、請求項１１に記載の方法。
19. 非天然尾部繊維を有する非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を産生するための方法であって、
    － 請求項１から９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を提供するステップであって、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンゲノムのパッケージングに関与する１つまたは複数のパッケージング遺伝子にさらなる破壊を含み、補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する尾部繊維の産生に不可欠な１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域を含有する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子を含み、細菌細胞が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンにおいて破壊されている１つまたは複数のパッケージング遺伝子を含むレポータープラスミドをさらに含む、提供するステップ；および
    － 細菌細胞にマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、非天然尾部繊維を有するＮＲＴＰを産生するステップ
    を含む方法。
20. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域が、カウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目内のバクテリオファージから得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 尾部繊維可変領域がマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）内のバクテリオファージから得られる、請求項２０に記載の方法。
22. 補完的核酸分子が、シャペロンタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が、カウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目内のバクテリオファージから得られる、請求項２２に記載の方法。
24. シャペロンタンパク質をコードする遺伝子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）内のバクテリオファージから得られる、請求項２３に記載の方法。
25. シャペロンタンパク質が、ファージ尾部様粒子もしくは構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる、請求項２２に記載の方法。
26. マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンが生来有する１つまたは複数の遺伝子に由来しない１つまたは複数の領域が、非複製ウイルス由来構造物をコードする細菌ゲノムからまたは核酸送達粒子から得られる尾部繊維構造タンパク質の可変領域（尾部繊維可変領域）を含む、請求項１９に記載の方法。
27. 天然のバクテリオファージにより示される細菌宿主細胞特異性とは異なる細菌宿主細胞特異性を示す、操作されたバクテリオファージまたは非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を作製する方法であって、
    － １つの尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子由来の第１のヌクレオチド配列を、異なる供給源由来の第２の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子由来の第２のヌクレオチド配列と融合させて、キメラ尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子を作製するステップ、および
    － 請求項１から９のいずれか１項に記載のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞においてキメラ尾部繊維構造タンパク質遺伝子を発現させるステップ、および
    － 細菌細胞にマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、操作されたバクテリオファージまたはＮＲＴＰを作製するステップ
    を含む方法。
28. 第１のヌクレオチド配列が、遺伝子破壊を含有するマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンに由来する、請求項２７に記載の方法。
29. 単一の細菌細胞株由来の複数のタイプの尾部繊維を有し、尾部繊維タイプの少なくとも１つが非天然尾部繊維である、操作されたバクテリオファージまたは非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を作製する方法であって、
    － 請求項１から９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を提供するステップであって、補完的核酸分子が、尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子由来の１つまたは複数の尾部相互作用領域に融合されている尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子由来の少なくとも２つの受容体結合領域を含み、受容体結合領域の少なくとも１つが、尾部相互作用領域の１つの供給源とは異なる供給源に由来する、提供するステップ、および
    － 細菌細胞にバクテリオファージリソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、複数のタイプの尾部繊維を有するバクテリオファージまたはＮＲＴＰを産生するステップ
    を含む方法。
30. 補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位に組み込まれる；または補完的核酸分子が、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）リソゲンの遺伝子破壊の部位以外の部位に組み込まれる；または補完的核酸分子が細菌細胞のゲノム中に組み込まれる；または補完的核酸分子がプラスミド分子中に組み込まれる、請求項２９に記載の方法。
31. 尾部相互作用領域への２つ以上の受容体結合領域の融合が、ｃｉｎリコンビナーゼにより、複数のｃｉｘ組換え部位の存在下で実施される；または
    尾部相互作用領域への２つ以上の受容体結合領域の融合が、ｃｉｎリコンビナーゼまたはｃｉｎリコンビナーゼのホモログ、オルソログ、もしくはパラログにより、複数の関連する組換え部位の存在下で実施される、請求項２９または３０に記載の方法。
32. ２つ以上の別個の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子が、オペロンにおいて発現される、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の方法。
33. ２つ以上の別個の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子が、独立したプロモーターから発現される、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の方法。
34. ２つ以上の別個の尾部繊維構造タンパク質コード遺伝子が、独立したゲノム位置から発現される、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の方法。
35. 細胞中への導入のための非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）中にレポーターまたは治療核酸分子をパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムであって、
    － 宿主細菌細胞；
    － 天然の尾部繊維の産生に不可欠な１つもしくは複数の遺伝子の発現を妨げる遺伝子破壊を含有するバクテリオファージリソゲンであって、前記１つもしくは複数の遺伝子が、受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質、尾部繊維構造タンパク質の１つもしくは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロン、尾部構造物に尾部繊維構造タンパク質を付着させるのに必要なタンパク質をコードするか、またはこれらの遺伝子の任意の組合せであり；ＮＲＴＰ中へのバクテリオファージゲノムの優先的パッケージングを妨げる非機能的パッケージング開始部位配列を含有する第１のバクテリオファージ遺伝子をも含むバクテリオファージリソゲン；
    － 受容体への結合に関与する尾部繊維構造タンパク質をコードする遺伝子、尾部繊維構造タンパク質の１つまたは複数の領域の折り畳みに必要なシャペロンをコードする遺伝子、尾部構造物に尾部繊維構造タンパク質を付着させるのに必要なタンパク質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子の任意の組合せから選択される１つまたは複数の遺伝子を含む１つまたは複数の補完的核酸分子であって、バクテリオファージリソゲンの遺伝子破壊を補完し、それによって機能的尾部繊維が産生される、１つまたは複数の補完的核酸分子；ならびに
    － レポーターまたは治療核酸分子、およびレポーター核酸分子のレプリコンのＮＲＴＰ中へのパッケージングを促進するための機能的パッケージング開始部位配列を含有する第２のバクテリオファージ遺伝子を含み、
    レポーター核酸分子上の機能的パッケージング開始部位配列が、バクテリオファージリソゲンにおける非機能的パッケージング開始部位配列を補完する、細菌細胞パッケージングシステム。
36. レポーター遺伝子がｌｕｘＡＢである、またはレポーター遺伝子が蛍光レポータータンパク質である、請求項３５に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
37. 第１のバクテリオファージ遺伝子および第２のバクテリオファージ遺伝子が、ｐａｃＡターミナーゼ遺伝子である、請求項３５または３６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
38. 第１のバクテリオファージ遺伝子および第２のバクテリオファージ遺伝子が、ｔｅｒＳターミナーゼ遺伝子である、請求項３５または３６に記載の細菌細胞パッケージングシステム。
39. 診断または治療用途のために細菌細胞を認識し形質導入することができるマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来の非複製形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を作製する方法であって、
    － 請求項１から９のいずれか一項に記載のバクテリオファージ尾部繊維交換プラットフォームを含有する細菌細胞を提供するステップであって、補完的核酸分子が、マイオウイルス科リソゲンが生来有するものでなく、マイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、またはポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）尾部繊維配列に部分的にまたは全体的に由来する尾部繊維遺伝子を含む、提供するステップ；および
    － 細菌細胞にバクテリオファージリソゲンの溶菌期を誘導する条件を提供して、天然のマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来のＮＲＴＰ粒子に対してそれまで抵抗性であった細菌を診断または治療用途のために認識して形質導入することができるマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）バクテリオファージまたはマイオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）由来のＮＲＴＰを産生するステップ
    を含む方法。

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