KR20130049757A

KR20130049757A - 고구마잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용

Info

Publication number: KR20130049757A
Application number: KR1020120123845A
Authority: KR
Inventors: 이석찬; 박정안; 정유철; 길의준; 김재덕; 최홍수; 이경열
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2012-11-02
Publication date: 2013-05-14
Also published as: KR101425725B1

Abstract

본 발명은 고구마잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 고구마잎말림바이러스의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 고구마잎말림바이러스의 검출을 위한 등온증폭 반응용 4개의 프라이머 세트와 이를 포함하는 프라이머 조성물 및 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 등온증폭법을 이용하여 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 고구마잎말림바이러스를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 고구마재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 고구마 감염성 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 고구마 바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고구마잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용{Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Sweet potato leaf curl virus, and use thereof}

본 발명은 고구마잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 고구마잎말림바이러스의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 고구마잎말림바이러스의 검출을 위한 등온증폭 반응용 4개의 프라이머 세트와 이를 포함하는 프라이머 조성물 및 검출방법에 관한 것이다.

고구마는 세계적으로 제 7위의 식량 생산을 담당하는 작물로서 중국과 일본 및 우리나라를 비롯한 아시아 지역과, 아프리카, 유럽 및 미국을 포함한 아메리카 대륙에서 널리 재배되고 있는 작물이다. 고구마는 자체로 식량으로 사용하기도 하지만, 전분 및 가공 식품의 원료로서 사용되고 있으며 최근에는 바이오 에탄올 생산의 주정으로 활용하려는 연구도 진행되고 있다. 국내의 고구마 재배 면적은 2010년 현재 192,000ha, 총 생산량은 약 30억톤이며, 총 생산액은 3000억에 이르는 작물이다('10, 농림수산 식품 통계).

이러한 고구마의 수확량과 품질을 저해시키는 요인 중에 대표적인 것이 바이러스 감염이다. 고구마에 감염되는 바이러스의 종류는 15종 이상이 보고되어 있으며, 이들의 대부분은 진딧물과 담배가루이에 의해서 전염이 된다. 이 중에서 담배가루이가 전염시키는 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)는 미국, 일본, 이스라엘, 및 이탈리아와 같은 고구마 재배 국가에서 발병이 보고되었다. 고구마 잎 말림 병은 1985년에 대만과 일본에서 처음 보고되었고, 이후 이스라엘에서도 유사한 증상에 대한 보고가 있었다. 1999년에 미국에서 이 병을 야기하는 병원체가 제미니바이러스의 한 속인 베고모바이러스의 고구마잎말림바이러스로 규명된 후에 페루와 이탈리아, 케냐 및 중국에서도 바이러스의 감염이 보고되었으며, 국내에서는 2003년도에 상기 바이러스의 감염이 처음 확인되었다.

고구마잎말림바이러스는 제미니바이러스(Geminivirus)의 종으로서 4개의 속 (Genus: Mastrevirus, Curtovirus, Begomovirus, and Topocuvirus) 중 베고모바이러스(Begomovirus)에 속하며, 매개충인 담배가루이(Bemisia tabaci)에 의해 전염되며, 접목을 통해서도 전염이 된다.

고구마잎말림바이러스에 의한 병징은 고구마 잎이 위로 말리는 증상이 대표적이지만 고구마가 성장하면서 증상이 사라지는 경향이 있으며, 품종과 환경조건에 따라서 증상이 드러나지 않는 경우도 보고된 바 있다. 이처럼 증상이 드러나지 않는 감염은 병징이 드러나는 감염보다 방제 및 관리가 어려워 고구마 생산량 감소에 더욱 심한 영향을 미칠 수 있다. 고구마잎말림바이러스 감염으로 인한 수량감소는 26% 에서 60%까지 나타날 수 있음이 보고된 바 있다.

종서나 고구마 순을 옮겨 심는 영양번식을 통해서 보급되는 고구마의 특성상, 이 바이러스에 감염된 개체를 통해서 생산된 고구마는 바이러스가 지속적으로 축적될 수 있으며 이 과정을 통해서 획득한 종서는 바이러스 감염에 의한 고구마의 수량감소가 더욱 심하게 나타날 수 있기 때문에 바이러스의 감염여부를 조기에 진단하기 위한 신속 정밀한 진단법이 필요하다. 또한 매개충에 의한 바이러스 전염이 가능하기 때문에 바이러스 무독묘를 도입하여 조성한 포장이라 하여도 고구마잎말림바이러스의 감염과 확산이 나타날 수 있기 때문에 활용이 용이한 바이러스 진단법이 요구되는 상황이다. 현재 바이러스의 진단에 사용되는 방법은 바이러스 유전자를 특이적으로 증폭하여 특정 유전자를 확인하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 가장 선호하고 있다. 이 방법은 전자현미경과 혈청학적 방법 (ELISA)을 사용한 진단에 비하여 더욱 정확하고 정밀한 진단을 할 수 있는 장점이 있다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하, PCR이라 함) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다.

등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소를 사용함으로서 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 고구마잎말림바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 고구마잎말림바이러스의 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 4로 구성되는, 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다. 또한 본 발명은 서열번호 16 내지 19로 구성되는, 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 고구마잎말림바이러스는 국내에서 분리 동정된 HM754635 변이주(strain), HM754636 변이주(strain), HM754641 변이주(strain), 및 FJ560719 변이주(strain)와 브라질 HQ393473 변이주(strain), 미국 HQ333142 변이주(strain), 일본 AB433788 변이주(strain), 중국 JF768740 변이주(strain), 중국 JF736657 변이주(strain), 스페인 EU856364 변이주(strain) 및 인도 NC_013640 변이주(strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 고구마잎말림바이러스의 (Sweet potato leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 고구마에서 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 상기 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 고구마잎말림바이러스의 (Sweet potato leaf curl virus) 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물 및 이를 이용한 검출방법으로 인하여, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 고구마잎말림바이러스를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 고구마재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 고구마 감염성 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 고구마 바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1 은 국내에서 분리 동정된 4개의 고구마잎말림바이러스 분리주인 HM754635 변이주(strain), HM754636 변이주(strain), HM754641 변이주(strain), FJ560719 변이주(strain)와 브라질 HQ393473 변이주(strain), 미국 HQ333142 변이주(strain), 일본 AB433788 변이주(strain), 중국 JF768740 변이주(strain)과 중국 JF736657 변이주(strain), 스페인 EU856364 변이주(strain) 및 인도 NC_013640 변이주(strain)의 염기서열 유사부위를 나타낸 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 고구마잎말림바이러스의 등온증폭을 위한 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 3 은 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4 는 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 SYBR Green I을 이용하여 자연광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 는 상기 도 4에서와 동일한 증폭산물을 UV 광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

본 발명자들은 고구마잎말림바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 단시간 내에 전문장비 없이 고구마잎말림바이러스를 검출하기 위하여 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하였다. 등온증폭법은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5’ 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP는 3’ 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4 또는 서열번호 16 내지 19로 이루어진 것이 바람직하나, 고구마잎말림바이러스를 진단할 수 있는 등온증폭 반응용 프라이머 세트라면 이에 한정되지 않는다.

또한 본 발명은 고구마에서 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 포함하는 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus) 검출방법을 제공한다. 고구마로부터 직접 DNA를 추출할 수도 있지만, 검출을 위한 임상 검체 및 배양 세포 등에도 적용가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 universal 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭법을 수행하여 고구마잎말림바이러스를 검출 가능하다는 것을 확인하였으며, 또한 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하면 자연광하에서 육안으로 검출 가능하다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 고구마잎말림바이러스의 유전자 수집

고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)의 검출방법을 연구하기 위하여, 고구마잎말림바이러스를 수집하고 클로닝(cloning)하고자 하였다. 각각의 바이러스는 노지에서 이병된 고구마에서 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 통하여 증폭한 후 pGEM-T easy 유전자 클로닝 벡터(Promega Corporation, USA)에 삽입하여 사용하였으며 4종류의 변종 고구마잎말림바이러스를 클로닝하였다 (HM754635 변이주, HM754636 변이주, HM754641 변이주, FJ560719 변이주). 국내 미 발병 변종에 대해서는 유전자 정보는 미국 national center for biotechnology information의 Genbank에 등록되어 있는 브라질 HQ393473 종 정보, 미국 HQ333142 종 정보, 일본 AB433788 종 정보, 중국 JF768740 정보 및 JF736657 정보, 스페인 EU856364 정보, 인도 NC_013640 정보를 이용하였다. 각각의 염기서열은 서열번호 5내지 서열번호 15에 표기하였다.

실시예 2. 프라이머 작성

고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)를 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하여 검출하기 위해 PrimerExplorer V4를 이용하여 프라이머(primer)를 작성하였다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용해야 한다. PrimerExplorer V4를 이용하여 작성된 프라이머 세트는 도 2A 및 도 2B에 각각 나타내었다.

실시예 3. 식물 검체의 채집

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 고구마잎말림바이러스를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 고구마 재배 온실에서 식물 검체를 채집하였다. 식물 검체는 외형적으로 바이러스 증상이 나타나지 않은 건전주와 고구마잎말림바이러스의 증상을 보이는 이병주의 두 가지 집단으로 나누어 채집하였으며, 채집된 검체의 잎 조직 1g에서 전체 게놈 DNA를 추출하고 이후 등온증폭법의 주형으로 사용하였다.

본 발명에서는 식물체에서 게놈 DNA(gDNA)를 쉽고 빠르게 분리할 때 사용하는 델라포타법(Dellaporta's method)을 이용하여서 바이러스에 감염된 식물시료로부터 gDNA를 분리였다. gDNA 분리에 사용할 추출 버퍼(extraction buffer)를 50 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM EDTA, pH8.0, 10 mM NaCl, 1 % SDS 조성으로 만들어 주었다. 식물조직을 막자 사발에 담고 액체질소를 넣은 후, 질소가 증발하면 즉시 조직을 고운 가루가 될 정도로 갈고 미리 액체질소에서 냉각시킨 약수저(spatula)를 사용하여 상기 조직을 추출 버퍼가 500ul 들어있는 튜브에 옮겨 담았다. 가루로 된 조직을 넣은 후 튜브 뚜껑을 닫고 7~8번 심하게 흔들어 준 다음 65 ℃에서 적어도 10분간 반응시켰다. 반응시킨 후 5M 아세트산 칼륨(potassium acetate) 용액을 166ul를 첨가하고 뚜껑을 닫은 후 강하게 흔들어 혼합한 후에 4 ℃, 8,000 ×g의 조건에서 10분간 원심분리하였다. Pipette을 사용하여 상층액을 수거하여 miracloth 로 거른 다음 상층액과 동량의 이소프로판올(isopropanol)이 든 튜브에 담아 주었다. 뚜껑을 닫고 DNA를 침전시키기 위해 여러 번 가볍게 흔들어 혼합한 후, 8,000 ×g에서 10분간 원심분리 하여 DNA를 침전시켰다. 침전물(pellet)을 70% 에탄올 용액으로 세척하고 튜브를 paper towel에 거꾸로 방치하여 건조시킨 후 DNA를 멸균수 혹은 용출 버퍼(elution buffer, TE buffer) 50ul에 녹였다.

실시예 4. 등온증폭법의 시행 및 유용성 확인

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 고구마잎말림바이러스를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 증폭반응용 프라이머 조성물을 제조하였다. 상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 2uL의 10배(10X) Bst 중합효소(polymerase) 반응버퍼(20mM Tris-HCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 10mM KCl, 2mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100), 1.6ul의 10mM dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, dCTP 각각 10mM씩 섞인 혼합물), 0.4ul의 10uM F3와 B3 프라이머(각각 서열번호 1, 2), 1.6ul의 10uM FIP와 BIP 프라이머(각각 서열번호 3, 4), 1ul의 20mM MgSO₄, 1ul(8 Unit) Bst 중합효소, 주형 gDNA 1ul, 및 증류수 11.5ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 65℃ 반응 용기에서 1시간 반 동안 반응시켜 등온증폭하였다. 반응이 완료된 후에는 총 20ul의 반응물 중 8ul를 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 이후 동일한 반응물로 재반응(65℃, 1시간 반)시킨 후에 10,000배로 농축된 SYBR Green I을 반응물 20ul 당 1ul씩 첨가하여 발색 반응을 확인하였다. 그 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다. 상기 바이러스 유전자의 증폭된 양상을 관찰한 전기영동 결과와 SYBR Green I을 이용하여 확인한 결과를 비교하여 유의성을 검증하였다.

또한 본 발명자들은 0.4ul의 10uM F3와 B3 프라이머(각각 서열번호 16, 17), 1.6ul의 10uM FIP와 BIP 프라이머(각각 서열번호 18, 19)를 사용하고 등온증폭 반응 조건 및 재반응 조건을 62℃, 50분으로 하여 상기 실험과 동일한 과정을 수행하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, universal primer set를 사용한 경우에는 비감염균주(lane 1)에서는 유전자가 증폭되지 않은 반면, 국내 분리 동정 HM757635 변이주(lane 2), HM754636 변이주(lane 3), HM754641 변이주(lane 4), FJ560719 변이주(lane 5)를 주형으로 이용한 경우에는 유전자가 증폭된 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, SYBR Green I을 고농도로 농축하여 증폭된 유전자(universal primer set sample)를 염색한 경우에도 국내 분리 동정 종 (strain)을 주형으로 이용한 경우 유전자가 증폭되어 자연광하에서 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호 16 내지 19의 프라이머 세트는국내에서 분리 동정된 4개의 변이주(strain), HM754636 변이주(strain), HM754641 변이주(strain), FJ560719 변이주(strain)와 브라질 HQ393473 변이주(strain), 미국 HQ333142 변이주(strain), 일본 AB433788 변이주(strain), 중국 JF768740 변이주(strain)와 중국 JF736657 변이주(strain), 스페인 EU856364 변이주(strain) 및 인도 NC_013640 변이주(strain)를 모두 검출하는데 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 SYBR GreenI을 10,000배로 농축하여 사용할 경우 자연광하에서 육안으로 감염여부를 확인할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY FOUNDATION FOR CORPORATE <120> Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Sweet potato leaf curl virus, and use thereof <130> PB12-10996 <150> KR 2011/0114826 <151> 2011-11-04 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal SPLCV F3 primer <400> 1 acgagccagg aaccttagg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal SPLCV B3 primer <400> 2 atagcttcgg gcagcaatt 19 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal SPLCV FIP primer <400> 3 cgggaattcg ccctgtcata ctgttcgagc tctgttcgga g 41 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal SPLCV BIP primer <400> 4 atccatatgg ggggagaccg ggtagggcac gatagctgtc t 41 <210> 5 <211> 2829 <212> DNA <213> Sweet potato leaf curl virus HM754635 isolate <400> 5 accggtgccc gccgcgccct ttaaaagtgg gccccacaag gggaccacgc gtcttttccg 60 tactgtcttt 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1500 gaatccatgc tgatacttgc agtttggggt gatgaaggct gaacagccgc aacccttcca 1560 cactatcctt gtcctctgtt caggaacttt cctcttggcc ttcttcgcct ctgcgtgcag 1620 tggctcctga atgggacact tcctcttgat tccagaaggg agattggaca tcgcagaata 1680 tagcgtttgc tgttgcccaa ttcttgagtg ctccttgctc tggtttgtcc aaccagagtt 1740 taaatgagga gccctctcct ggattgcaga ggaagatagt gggaattcca cctttaattt 1800 gaactggctt tccgtattta cagttggatt gccagtcctt ctgggccccc atgaattcct 1860 taaagtgctt taggtattgg gggttgacgt catcaatgac gttataccaa gcactgttgc 1920 tgtatacttt tgggcttaga tctaaatgcc cacacaaata attgtgaggg cccaaagacc 1980 tggcccatac tgttttgcct attctgcttg ggccttcaat aacaatggat atgggtctat 2040 ccggccgcgc agcggcatcc atgacatttt cagcggccca gtcgctgata atgtcaggaa 2100 ctgcattgaa agaagaagat gaaaaaggag aagaatatac agaaggagga ggagaaaaaa 2160 tcctatctaa attactaact aaattgtgaa attgaaacaa atatttttca gggagtttct 2220 ccctaattat ttgcaacgca gcttctttag aacctgcgtt tagagcctct gcggctgcgt 2280 cattagcagt ctgctggcct cctctagcag atctgccgtc gacctggaat tcaccccagg 2340 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cagggtcagg cagtatgaca 300 gggcgaattc ccgtttcgcg gagatttcat ccatatgggg ggagaccggt aagacggagg 360 ctgaacttcg agacagctat cgtgccctac actgggaatg ctgtcccaat tgctgcccga 420 agctatgtcc cggtttcaag aggcgtccgg atgaagagaa ggaggggtga ccgcatcccg 480 aagggatgtg tcggtccctg taaggtccag gactatgagt tcaagatgga cgttccccac 540 acgggaacgt ttgtctgtgt ctcggatttt actaggggaa ctgggcttac ccatcgcctg 600 ggtaagcgtg tttgtgtgaa gtccatgggt atagatggta aggtctggat ggatgacaat 660 gtggccaaga gagatcacac caatatcatc acgtattggc tgattcgtga caggaggccc 720 aataaggatc cgcttaactt tggccagatc ttcacgacgt acgacaatga gcccactact 780 gctaagatcc gaatggatct gagagataga atgcaggtct tgaagaagtt ctcggttaca 840 gtttcaggag gtccatacag ccacaaggag caggccttaa ttaggaagtt ttttaagggt 900 ttgtataatc atgttactta caatcacaag gaagaagcta agtatgagaa tcaattagag 960 aatgcactta tgttgtatag tgctagtagt catgctagta atcccgtgta tcagaccctg 1020 cgttgcaggg cttatttcta tgattcgcac aataattaat aaaattatat tttattaata 1080 gagtaatatc tttacatcat cattacaatc tacagtatct acttcatcta 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tgccagtcct tctgggcccc catgaattcc 1860 ttaaagtgct ttaggtattg ggggttgacg tcatcaatga cgttatacca agcactgttg 1920 ctataaactt tagggcttag atctaaatgc ccacacaaat aattgtgagg gcccaaagat 1980 ctggcccata ctgttttgcc tattctgctt gggccttcaa taacaatgga tatgggtcta 2040 tccggccgcg cagcggaatc catgacattt tcagcggccc agtcgctgat aatgtcagga 2100 acggcattga aagaagaaga agaaaaaggt gaagaatata cagaaggtgg aggagaaaaa 2160 atcctatcta aattagaaac taaattatga aactgaaata aatatttttc agggagtttc 2220 tccctaatta tttgcaacgc agcttcttta gaacctgcgt ttagggcctc tgcggctgcg 2280 tcattagcag tctgctgacc tcctctagca gatccgccgt cgacctggaa ttcaccccag 2340 gtgatggtat ccccgtcctt atcaacgtag gacttgacat cggacgatga tttagctccc 2400 tggatgttgg ggtgaaagtg agccgacctt gtgggtgaca caaggtcgaa gaatctgcta 2460 tttgtgcaga cgaatttacc ttcgaactgc acaagcacat ggaggtgagg ttccccatcc 2520 tcgtgcagtt ctttggctat gtgcatgtat tttttatttg tgggggtttg gatgttaagt 2580 agttgggaga ggcagtcctc tttagagagc gaacatcgtg gataagtaat aaaatagttt 2640 tttgaagaaa ttctaaaacg tttgggcgga gccatttggt gacactcaga ctttcaaatg 2700 aattggtgac tggtgacaat ttatactatg tcaccaaatg gcatttctgt aatttagaag 2760 atccttttag ctttaattca aattccgaca actctggctc caccaaaagg cgggcaccgt 2820 attaatatt 2829 <210> 15 <211> 2823 <212> DNA <213> Sweet potato leaf curl virus NC_013640 isolate <400> 15 taatattacc ggtgcccgcc gcgccctttt gcgggcccca cagttgggga ccacgcgtct 60 ttagttttaa gtctttaatg atgacttcac tttaaataga ccaatcctgt tgcagtcttg 120 gtcgccaagt atggatttgt gggacccact tcagaaccca ctcccagata ctttatacgg 180 ttttcggtgt atgctttctg taaaatacct gcaaggtatt ttgaagaaat acgagccagg 240 aaccctaggg ttcgagctct gttcggaatt aattcgtatc ttcagggtca ggcagtatga 300 cagggcgaat tcccgtttcg cggagatttc atccatatgg ggggagaccg gtaagacgga 360 ggctgaactt cgagacagct atcgtgccct acactgggaa tgctgtccca attgctgccc 420 gaagctatgt cccggtttca agaagcgtcc agatgaagag aaggaagggt gatcgcattc 480 cgaagggatg cgtgggtcct tgtaaggtac aggattacga attcaagatg gatgtcccac 540 acactgggac ctttggatgt gtgtctgatt tcactagggg aactgggctt acccatcgtt 600 tgggtaagag ggcgtgtatt aagtccatgg gtattgatgg taaggtttgg atggacgaca 660 atgtcgccaa gagggaccac accaacatca ttacttactg gttgatccga gataggagac 720 ccaataagga tcctttgacg tttgcacagg cctttactat gtatgataat gagcccacta 780 ctgctaagat ccgaatggat ctgagagata gaatgcaggt cttgaagaaa ttctctgtta 840 ctgtgtctgg tgggccctat agccacaagg agcaggcgtt agttaggaag ttttttaaga 900 gtttgtcaaa acatgttact tttaatcata aggaggaagc taagtatgag aatcatttag 960 agaatgcatt aatgttgtat tctgctagca gtcatgctag caatcctgta tatcagaccc 1020 tgcgttgcag ggcttatttt tgtgattcgc ccaaaaatta ataagaatta tattttatta 1080 atagagtaat atcttgacat catcattaca atctaccgta tctacttcat ctatccaaga 1140 acaaactctt ggaagatatt taataacaaa aactaaatta actaaactaa aaaaccctaa 1200 atttgctaat tcattacata tgcgccattt aaggcgattg gaaataccag tccaactggg 1260 aataacacca gtcagacgcg ttgttatgat ccggaattgg aggaatatct tctggaatcc 1320 aatttccctc ctgttccggt ggttgacttg aagctgcatc ttgatgaccg gccttctgtt 1380 gaggttgttg gtatggacat acatcaaccg tagatgaaat ggagcagtct gacccacaga 1440 catggggttg gtgaagaact ctactgctct catagtctga gcatgactta gtgattcccc 1500 tgtgcgtgaa tccatgctgg tacttgcagg cttgggtgat gaagactgaa cagccgcaag 1560 ctttccacac tatcctagtc ctcggctcag gaactttcct cttggccttc ttcgcctctg 1620 cgtgcagtgg ctcctgaatg ggacacttcc tcttgattcc agaagggaga ttggacatcg 1680 cagaatatag cgtttgctgt tgcccaattc ttgagtgctc cttgctctgg tttgtccaac 1740 cagagtttaa atgaggaacc ctctcctgga ttgcagagga agatagtggg aattccgcct 1800 ttaatttgaa ctggctttcc gtatttacag ttggattgcc agtccttctg ggcccccatg 1860 aattccttaa agtgctttag gtattggggg ttgacgtcat caatgacgtt ataccaagca 1920 ctgttgctgt aaacttttgg gcttaaatct aaatgcccac acaagtaatt gtgagggccc 1980 aaagacctgg cccatactgt ttttcctatt ctgcttgggc cttcaataac aatggatatg 2040 ggtctatccg gccgcgcagc ggaatccatg acattttcag cggcccagtc gctgataatg 2100 tcaggaacgg cattgaaaga agaagaagaa aaaggagaag aatatacaga aggaggaggt 2160 gaaaaaatcc tatctaaatt agaaactaaa ttatgatatt gaaataaaaa tttttcagga 2220 agtttctccc tgattatttg caacgcagtt tctttagaac ctgcgtttag agcctctgcg 2280 gctgcgtcat tagcagtctg ctgacctcct ctagcaaatc tgccgtcgat ctggaattca 2340 ccccatgtga gggtatcccc gtccttgtca acgtaggact tgacatcgga cgaggattta 2400 ctccctggca tgttgggggg aaaggattcg atctgttcgg tgagaccaga tcgaagaatc 2460 tggaatttgt gcagacgaat ttgccttcga actgcaccaa caccatgagg tgaggttccc 2520 catcctcgtg cagttctctt gctacgtgta tatatttttt gttgctgggt gtttgtatat 2580 ttaggagttg ggctaggcag tcctcttaca gcgaggataa gtaatgaagt aatttttggc 2640 ttggatttta aaacgtttgg gaggagccat ttggagacac tcataagttt aaatgaattg 2700 gagactggag acaatatata ctatgtctcc aaatggcatt ttggtaattt aaagatcctt 2760 ctagctttaa ttcaaattcc gacaactctg ggaccaccaa aaggcgggca ccgtattaat 2820 att 2823 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal SPLCV F3 primer <400> 16 gacccacttc agaaccca 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal SPLCV B3 primer <400> 17 gtctcccccc atatggat 18 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal SPLCV FIP primer <400> 18 tggctcgtat ttcttcaaaa tacctctccc agatacttta tacggtt 47 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal SPLCV BIP primer <400> 19 ggttcgagct ctgttcggaa ttgaaatctc cgcgaaacgg 40

Claims

서열번호 1 내지 4로 구성되는, 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
서열번호 16 내지 19로 구성되는, 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
제 1 항 또는 제 2항에 있어서,
상기 고구마잎말림바이러스는 한국 HM754635 변이주(strain), 한국 HM754636 변이주(strain), 한국 HM754641 변이주(strain), 한국 FJ560719 변이주(strain), 브라질 HQ393473 변이주(strain), 미국 HQ333142 변이주(strain), 일본 AB433788 변이주(strain), 중국 JF768740 변이주(strain), 중국 JF736657 변이주(strain), 스페인 EU856364 변이주(strain) 및 인도 NC_013640 변이주(strain)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
청구항 1의 프라이머 세트 또는 청구항 2의 프라이머 세트를 포함하는, 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
고구마에서 게놈 DNA(gDNA)를 추출하는 단계;
상기 gDNA를 주형으로 제4항에 따른 조성물을 이용하여 60℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 고구마잎말림바이러스(Sweet potato leaf curl virus) 검출방법.
제 6 항에 있어서,
상기 고구마잎말림바이러스는 한국 HM754635 변이주(strain), 한국 HM754636 변이주(strain), 한국 HM754641 변이주(strain), 한국 FJ560719 변이주(strain), 브라질 HQ393473 변이주(strain), 미국 HQ333142 변이주(strain), 일본 AB433788 변이주(strain), 중국 JF768740 변이주(strain), 중국 JF736657 변이주(strain), 스페인 EU856364 변이주(strain) 및 인도 NC_013640 변이주(strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
제 6 항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
제 8 항에 있어서,
상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.