KR20130047473A - 유전영동기술 및 포아송 통계 분석방법에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치 - Google Patents

유전영동기술 및 포아송 통계 분석방법에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전영동기술 및 포아송 통계 분석방법에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치에 관한 것이다.
본 발명의 분자간의 결합력 측정시스템은, 비즈들이 들어 있는 저수조; 상기 저수조 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부; 상기 저수조 위 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라; 상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고, 검출된 그레이스케일 값으로부터 평균과 분산을 구하고 상기 평균과 분산을 포아송 통계 분석에 적용하여 단일 결합력을 검출하는 분석부;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

Description

유전영동기술 및 포아송 통계 분석방법에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치{Measurement method of biomolecule binding force by dielectrophoretic technique using poisson statistical analysis method and thereof system}
본 발명은 유전영동기술 및 포아송 통계 분석방법에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치에 관한 것으로, 보다 상세히는, 유전영동기술을 이용한 생체분자간의 상호결합력 측정함에 있어서, 생체분자간의 화학결합력을 포아송 통계(Poisson Statistical) 분석방법을 이용하여 측정, 분석하는, 분자간의 결합력 측정방법 및 그 장치에 관한 것이다.
종래에 생체분자간의 화학 결합력의 측정에 있어, 기계적(mechanical) 혹은 화학적 힘(chemical force)에 의해 결합의 회합/분해(association/dissociation)를 분석한 연구결과가 보고된 바 있으나, 이는 원자간력 현미경(Atomic Force Microscopy, AFM)측정방법에 의한 것으로, 인가되는 힘의 인가속도(Loading rate)에 따라 결합(bond) 파열(rupture)이 일어나는 힘을 측정하고, 측정된 데이터의 평균과 분산을 통해, 결과적으로 다중결합으로부터 단일 결합력(Single binding force)을 얻어내도록 하는 것이다.
그러나 이 방법은 측정시간과 비용이 많이 들고, 특히, 그리고 단일 프로브(Probe)를 통한 힘측정만이 가능하기 때문에 프로브의 크기 변화에 따른 반복실험을 필요로 하여, 비 효율적이었다.
따라서, 이러한 문제를 해소하기위해 유전영동(Dielectrophoresis, DEP)을 통해 분자간 결합 파열력(Bond rupture force)을 측정하는 방법이 제안되었다.
유전영동(Dielectrophoresis, DEP)을 통해 결합 파열력(Bond rupture force)의 측정은, 기존의 AFM측정방법과 비교해볼 때, 측정시간과 비용, 그리고 측정횟수 면에서 매우 효율적이라고 볼 수 있다.
DEP를 이용한 결합 파열(Bond rupture)은 수직방향의 DEP 힘을 이용하여 수정된 비드(beads)와 표면(surface) 간의 파열(rupture)를 유발하는 실험으로 한번의 실험으로 100개 이상의 데이터를 얻을 수 있는 장점이 있다.
그리고 기존 AFM측정방법으로는 프로브의 크기 변화에 따른 반복실험을 필요로 하는 반면, DEP를 이용한 실험은 다양한 크기의 비드를 사용하여 단 한번의 실험으로 다양한 측정이 가능하기 때문에 멀티 프로브방식을 개발할 수 있다.
그러나, AFM의 경우, 결합(Bond)의 파열(Rupture)이 일어날 때 실시간으로 직접적인 힘 측정이 가능하지만, DEP측정방식은 광학적(Optical) 방식으로 측정함으로 인해 파열(Rupture)이 일어나는 지점에서의 힘 측정에 한계가 있다.
이런 문제점을 해결하기 위해, 본 발명에서는 마이크로스코프(microscope)를 통해 얻은 인가된 전압에 따른 이미지를 그레이 스케일(grayscale)로 분석함으로써 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아내는 것을 가능하도록 하였다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 유전영동기술을 이용한 생체분자간의 상호결합력 측정함에 있어서, 생체분자간의 화학결합력을 포아송 통계(Poisson Statistical) 분석방법을 이용하여 측정, 분석하여, 생체분자간의 화학결합력 측정하는, 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 유전영동기술을 이용한 생체분자간의 상호결합력 측정함에 있어서, 마이크로스코프(microscope)를 통해 얻은 인가된 전압에 따른 이미지를 그레이 스케일(grayscale)로 분석함으로써 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아내는, 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 유전영동기술과 포아송 통계 분석을 이용하여, 다중결합력 측정으로부터 단일 결합력(Single Binding Force)을 측정하는 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 측정하는 카메라의 해상도 향상, 수직방향의 측정과 그레이 스케일의 변화에 따른 수평방향 움직임의 분석을 통해 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아내는, 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 유전영동기술과 포아송 통계 분석을 이용하여, 한 번의 측정으로 100개 이상의 데이터 측정하는 멀티 프로브 방식을 구비하는 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 분자간의 결합력 측정시스템은, 비즈들이 들어 있는 저수조; 상기 저수조 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부; 상기 저수조 위 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라; 상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고 그레이 스케일의 변화에 따른 수평방향 움직임의 분석을 통해 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간을 검출하는 분석부;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 분자간의 결합력 측정시스템은, 비즈들이 들어 있는 저수조; 상기 저수조 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부; 상기 저수조 위 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라; 상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고, 그레이스케일 값이 기설정된 기준치와 비교하여 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간을 검출하는 분석부;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 분자간의 결합력 측정시스템은, 비즈들이 들어 있는 저수조; 상기 저수조 밑에 위치하되,전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부; 상기 저수조 위 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라; 상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고, 그레이스케일 값의 변화에서 이차미분 값의 최대가 되는 지점을 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간을 검출하는 분석부;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 분석부는 상기 그레이스케일 값이 상기 기준치와 비교하여 기준치를 넘는 순간을 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간으로 검출한다.
상기 기준치는, 그레이스케일 값이 결합이 끊어지지 않을 때의 변화량의 표준편차를 구하고, 상기 변화량의 표준편차의 2배의 값을 기준치로 설정한다.
상기 기준치는 최대 그레이스케일(maximum grayscale)값의 e-1, 최대 기울기(maximum gradient), 최대 그레이스케일의 10 내지 60%이내에서 설정된 값 중 어느 하나로 구해질 수 있다.
또한, 본 발명의 분자간의 결합력 측정시스템은, 비즈들이 들어 있는 저수조; 상기 저수조 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부; 상기 저수조 위에 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라; 상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고, 검출된 그레이스케일 값으로부터 평균과 분산을 구하고 상기 평균과 분산을 포아송 통계 분석에 적용하여 단일 결합력을 검출하는 분석부;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
상기 단일 결합력은
Figure pat00001
(단, F는 단일 결합력(single binding Force)이고, σ는 표준편차(standard deviation)이고, m은 평균(mean)이며, 또한 N은 결합된 수(number of bond)임)
에 의해 구하여진다.
상기 비드는 카르복시기(Carboxyl, COOH), 아민(Amine, NH2), 스트렙아비딘(Streptavidin)중 어느 하나로 기능화(Functionalize)된 비드이며, 상기 비드의 사이즈는 15um, 12um, 10um 중 어느 하나일 수 있다.
상기 전계생성부는 절연기판 위에 전극부가 형성되며, 상기 전극부는 이븐전극과 오드전극이 서로 교번하여 위치되어 있으며, 상기 절연기판은 SiO2로 이루어진 다.
상기 전극 표면은 APTES(NH2), 엘라이신(L-lysine(2NH2)), 석신산무수물(Succinic Anhydride(COOH)), BBSA(Biotin) 중 하나의 물질을 사용하여 기능화한 다.
이븐전극의 패드와 오드전극의 패드 사이에 교류 전원이 인가된다.
상기 전극부에서 전압을 검출하는 전압검출수단을 더 구비한다.
상기 분석부는 비드의 수직이동뿐만 아니라 미세한 수평이동도 검출한다.
절연기판의 폭은 50um이하이며, 오드전극과 이븐전극의 이격거리는 상기 절연기판의 폭의 1/4배로 이루어진다.
상기 전극부는 석신산무수물(Succinic Anhydride)를 사용하여, 표면을 COOH로 코팅하여 COOH가 기능화(Functionalize)된 비드를 사용하여, PH4에서 결합을 이루어 수소결합을 이루도록 한다.
상기 분석부는 분자간의 수소결합력을 측정한다.
상기 전극부는 APTES로 NH3 + 작용 기를 띄도록 코팅을 하고 COO-이 기능화된 비드를 사용하여 PH7에서 이온결합을 이룬다.
상기 분석부는 분자간의 이온결합력을 측정할 수 있다.
상기 전극부는 L-lysine(2NH3 +)을 표면에 코팅하고, COO-이 기능화된 비드를 사용하여 PH7에서 이온결합을 이룬다.
상기 전극부는 표면을 BBSA(biotin)를 코팅하고, Strepavidin이 기능화된 비드를 사용하도록 이루어지며, 상기 분석부는Biotin과 Strepavidin간의 단일 결합력을 측정할 수 있다.
상기 분석부는 단백질과 DNA의 결합력을 측정할 수 있다.
본 발명의 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치에 의하면, 유전영동기술을 이용한 생체분자간의 상호결합력 측정함에 있어서, 생체분자간의 화학결합력을 포아송 통계(Poisson Statistical) 분석방법을 이용하여 측정, 분석하여, 생체분자간의 화학결합력 측정한다.
즉, 본 발명은, 유전영동기술을 이용한 생체분자간의 상호결합력 측정함에 있어서, 마이크로스코프(microscope)를 통해 얻은 인가된 전압에 따른 이미지를 그레이 스케일(grayscale)로 분석함으로써 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아낸다.
이렇게 함에의해, 본 발명은 생체분자간의 화학결합력 측정함에 의해 측정시간과 비용이 적게 들고, 특히, 프로브의 크기 변화에 따른 반복실험을 필요없으며, 효율적이며 정확도가 보다 높은 생체분자간의 화학결합력 측정을 할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 유전영동기술과 포아송 통계 분석을 이용하여, 다중결합력 측정으로부터 단일 결합력(Single Binding Force)을 측정하며, 측정하는 카메라의 해상도 향상 및 수직방향의 측정을 통해 그레이 스케일의 변화에 따른 수평방향 움직임의 분석을 통해 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아내며, 또한 한 번의 측정으로 100개 이상의 데이터 측정하는 멀티 프로브 방식을 구비하는 생체분자간의 화학결합력 측정방법 및 그 장치를 제공한다.
도 1은 AC 전기장에서 쌍극자를 형성하는 중성인 입자의 알짜 힘 발생을 설명하기위한 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정 시스템의 개략적인 구성도이다.
도 2b는 본 발명의 다른 일 실시예에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정 시스템의 개략적인 구성도이다.
도 3은 전계형성부를 설명하기위한 설명도이다.
도 4는 그레이 스케일 시뮬레이션의 결과의 일예이다.
도 5는 수소결합을 이룬 비드가 표면에서 떠오를 때를 그레이스케일로 분석한 비드 사이즈에 따른 결과의 일예이다.
도 6은 수소 결합된 단일 Size의 비드를 사용하여 실험한 결과와 두가지 Size의 비드를 사용하여 실험한 결과의 일예이다.
도 7은 이온결합력을 측정하기 위한 실험결과의 일예이다.
도 8은 리간드와 리셉터간의 결합력을 분석한 실험 결과의 일예이다.
이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
우선, 본 발명 이론적 배경에 대해서 설명한다.
유전영동(DEP)은 유전입자(dielectric particle)가 비균등(non-uniform)한 전기장 안에 있을 때 입자과 비균등한 전기장과의 상호작용에 의해서 힘이 발생하게 되고 이 힘에 의해 입자가 움직이는 현상을 말한다.
예를 들어 도 1의 (a)는 전하를 띄는 입자와 전하를 띄지 않고 중성인 입자(주변의 용액과는 다른 유전율을 갖음)가 균등한 전기장 안에 놓여 있다. 이 경우 전하를 띄고 있는 입자에는 알짜 힘(net force)이 발생하는데 반해서, 쌍극자(dipole)을 형성하는 중성인 입자의 경우에는 알짜 힘(net force)이 발생하지 않게 된다. 이는 각각 반대로 유발된 쌍극자(dipole)가 각각 반대방향으로 같은 크기의 힘을 받게 되어 그 힘들끼리 서로 상쇄되기 때문이다.
도 1의 (b)는 유발된 쌍극자(dipole)을 갖는 입자가 비균등한 전기장 안에 놓여 있으며, 도 1의 (b)는 유발된 쌍극자(dipole)가 각각 반대방향으로 같은 크기의 힘을 받게 되어 그 힘들끼리 서로 상쇄된다. 이 경우에는 반대로 유발된 쌍극자(dipole)가 각각 서로 다른 크기의 힘을 받게 되어, 도 1의 (a)의 중성인 입자와는 다르게 알짜 힘(net force)를 받게 된다. 이때 이 입자가 받게 되는 힘이 유전영동력(dielectrophoretic force)이 된다.
도 1의 (b)에서와 같이, 유발된 쌍극자(dipole)가 비균등한 전기장 안에서 받게 되는 유전영동력(DEP force)(FDEF)은 수학식1을 통해서 계산할 수 있다.
Figure pat00002
다음은 본 발명의 생체분자간의 화학결합력 측정 시스템을 설명한다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정 시스템의 개략적인 구성도이며, 도 2b는 본 발명의 다른 일 실시예에 의한 생체분자간의 화학결합력 측정 시스템의 개략적인 구성도이다.
본 발명의 생체분자간의 화학결합력 측정 시스템은 저수조(100), 전계생성부(200), 제어부(300), 함수발생기(330), 증폭기(360), 오실로스코프(390), CCD 카메라(400), 분석부(450)를 포함한다.
도 2b는 도 2a의 제어부(300)와 분석부(450)를 하나의 컴퓨터로 통합하고, 도 2a의 CCD 카메라(400)대신 상면 CCD카메라(410)와 측면 CCD카메라(420)를 구비한다.
저수조(100)는 기능화된 비드들이 들어있는 저장소이다. 저수조(100)에는 용액속에 지능화된 비드들이 들어 있을 수 있으며, 상기 용액으로 수용액을 사용할 수 있다. 상기 수용액으로 물을 사용할 수 있다.
비드(Beads)(10)는 15um, 12um, 10um Beads를 사용하였으며, 각각 카르복시기(Carboxyl, COOH), 아민(Amine, NH2), 스트레프트아비딘(Strepavidin) 이 기능화(Functionalize)된 비드들을 사용하였다.
전계생성부(200)는 절연기판(220)위 전극부(240)이 형성되되, 전극부(240)는 이븐전극(even)(250)과 오드전극(odd)(260)이 서로 교번하여 위치되고, 이븐전극 패드(255)와 오드전극 패드(265)를 통해 교류 전원이 인가된다. 전극부(240)는 Cr 전극으로 이루어질 수 있으며 절연기판(220은 SiO2로 이루어질 수 있다.
비드와 특정 결합을 이루게 하기 위해서 전극 표면은 APTES(NH2), 엘라이신(L-lysine(2NH2)), 석신산무수물(Succinic Anhydride(COOH)), BBSA(Biotin) 물질을 사용하여 기능화하였다.
상기 교류전원은 함수발생기(330)와 증폭기(360)에 의해 생성된다.
오실로스코프(390)는 전계생성부(200)에서 전압을 측정하여 제어부(300)로 전송한다. 이때 전압 측정은 이븐전극(250)과 오드전극(260) 사이의 전압을 측정할 수 있다.
제어부(300)는 오실로스코프(390)로부터 수신된 측정 전압을 통해 함수발생기(330)와 증폭기(360)를 조절하여 인가 전압을 조절한다. 제어부(300)는 CCD 카메라(400), 오실로스코프(390), 함수발생기(330)를 제어한다. 제어부(300)는 LABVIEW 2010 프로그램을 사용할 수 있다.
CCD 카메라(400)는 저수조(100)내를 촬상하여 분석부(450)로 전송한다. CCD 카메라(400)는 상면 CCD카메라(410)와 측면 CCD카메라(420)로 이루어질 수 있다.
상면 CCD카메라(410)는 저수조(100)의 상방에 위치되면, 측면 CCD카메라(420)는 저수조(100)의 측면에 위치되어 촬상한다.
분석부(450)는 CCD 카메라(400)로부터 수신된 화상을 분석한다. 즉, CCD 카메라(400)로부터 수신된 화상으로부터 그레이 스케일의 변화에 따른 수평방향 움직임의 분석을 통해 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아낸다. 분석부(450)는 비드의 수직이동뿐만 아니라 미세한 수평이동도 관찰되기 때문에 기존의 Particle tracking algorithm을 이용하여 수평방향으로 움직이는 비드을 계속 추적하여 분석할 수 있도록 이루어져 있다.
분석부(450)는 그레이스케일의 변화 값에 있어서 비드와 표면간의 결합이 깨지는 순간을 그레이스케일 값이 급격하게 증가되는 구간으로 정의한 후 분석을 진행한다.
비드와 표면간의 결합이 깨지는 순간, 즉, Bond rupture가 일어나는 순간이 물리적인 변화량이 가장 클 때라고 가정을 하고, 분석부(450)는 그레이스케일 값이 결합이 끊어지지 않을 때의 변화량의 표준편차 값의 2배가 되는 문턱치를 설정한 후 그 구간을 넘는 점을 결합이 끊어지는 순간으로 분석을 진행한다. 즉, 분석부(450)는 그레이스케일 값이 결합이 끊어지지 않을 때의 변화량의 표준편차를 구하고, 그 표준편차의 2배의 값을 문턱치로 설정하여, 그레이스케일 값이 상기 문턱치를 넘는 시점을 비드와 표면간의 결합이 깨지는 순간으로 결정한다.
그러나 본 발명에서, 비드와 표면간의 결합이 깨지는 순간을, 이로써 한정한 것이 아니며, 다양하게 한정할 수 있다. 예를들어, 분석부(450)는 그레이스케일의 변화 값에 있어서 비드와 표면간의 결합이 깨지는 순간을 최대 그레이스케일(maximum grayscale)값의 e-1 혹은 최대 기울기(maximum gradient) 혹은 임의로 지정된 최대 그레이스케일의 몇%가 되는 지점으로 설정하여 검출할 수도 있으며, 또한, 이차미분 값의 최대가 되는 지점을 Rupture가 일어나는 지점으로 지정해 분석할 수도 있다.
분석부(450)는 측정된 데이터 값으로부터 평균과 분산을 얻어내고 이를 통해 다중의 결합력으로부터 단일 결합력을 분석해 낼 수 있는 방법을 후술되는 포아송 통계 분석에 의해 행하여진다.
분석부(450)는 MATLAB R2008a 로 이루어질 수 있다.
경우에 따라서는 도 2b와 같이, 제어부(300)와 분석부(450)가 하나의 컴퓨터로 이루어질 수 있다.
도 3은 전계형성부를 설명하기위한 설명도이다.
도 3의 (a)에서 절연기판은 폭이 약 40um이고 전극들 사이의 폭, 즉 오드전극(250)과 이븐전극(260)의 이격거리는 약 10um으로 이루어지나, 이로써 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다. 여기서 절연기판의 폭은 약 50um이하로 할 수 있으며 전극들 사이의 폭, 즉 오드전극(250)과 이븐전극(260)의 이격거리는 상기 절연기판의 폭의 약 1/4배로 이루어질 수 있다.
도 3의 (b)는 CCD 카메라(400)로 저수조(100)내를 촬상한 일예로, 오드전극(250)과 이븐전극(260)이 교번되어 위치되고, 오드전극(250)과 이븐전극(260)의 위에 비드들이 위치됨을 알 수 있다.
도 2a, 도2b와 도 3에서와 같이, 가공(Fabrication)을 통하여 만들어진 02.um두께의 전극부(240)에 함수발생기(330)와 증폭기(360)을 사용하여 전극에 전압을 인가하였다. 측정된 전압 값은 오실로스코프(390)로 측정하였으며 CCD 카메라(400)와 오실로스코프(390), 함수발생기(330)는 제어부(300)의 LABVIEW 2010 프로그램을 사용하여 동시 제어를 할 수 있다.
다음은 그레이 스케일 시뮬레이션에 대해 설명한다.
도 4는 그레이 스케일 시뮬레이션의 결과의 일예이다.
이는 본 발명에서 그레이 스케일의 변화에 따른 수평방향 움직임의 분석을 통해 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아내는 것에 대한 시뮬레이션이다.
수직 유전영동력( Vertical DEP force)에 의한 비드의 수직이동을 현미경을 통해 측정할 때 높이에 따른 그레이스케일의 변화를 관찰한다. 저수조(100)의 바닥에 있을 때와, 전극부(240)의 중앙에서 떠올랐을 때, 현미경상에서 초점의 차이가 생기며 이는 곧 그레이스케일의 변화로 나타난다.
도 4의 (a)와 (d)의 두 영상상에서는 확연한 초점의 변화가 보이지만 이는 사실 비드의 높이변화가 10um이상의 차이를 가질 때의 초점거리이며 눈으로 인식하지 못하는 변화의 사이에 rupture가 일어난다는 가정을 할 수 있다.
이러한 사실을 통해 전압에 따른 이미지에서 단일 비드의 그레이스케일 값을 분석해본 결과, 도 4의 (e)와 같이, 전극 표면(surface)에서 높이 떠오를수록 비드의 그레이스케일 평균값이 높아지는 것을 확인할 수 있다.
그리고 실제 실험에서는 비드의 수직이동뿐만 아니라 미세한 수평이동도 관찰되기 때문에 기존의 Particle tracking algorithm을 이용하여 수평방향으로 움직이는 비드을 계속 추적하여 분석할 수 있도록 해주었다.
도 4의 (e)와 같은 전압에 따른 그레이스케일의 변화 값에 있어서 비드와 표면간의 결합이 깨지는 순간을 그레이스케일 값이 결합이 끊어지지 않을 때의 변화량의 표준편차 값의 2배가 되는 문턱치를 설정한 후 그 구간을 넘는 점을 결합이 끊어지는 순간으로 분석을 진행한다.
이러한 지점 설정을 통해서 각각의 비드에 대한 rupture Force를 찾아낼 수 있으며 Gaussian 분포를 띄는 것을 확인할 수 있었다. 이미지로부터 그레이스케일 평균값을 차출해 내는 메커니즘은 MATLAB R2008a 로 구현해 내었다.
다음은 포아송 통계 분석(Poisson statistical analysis)을 설명한다.
분자간의 상호 작용과 힘을 측정하는데 있어 다중의 여러 결합이 이루어져 있는 전체적인 힘으로부터 단일 결합력을 측정하는 연구 결과가 있다. 측정된 데이터 값으로부터 평균과 분산을 얻어내고 이를 통해 다중의 결합력으로부터 단일 결합력을 분석해 낼 수 있는 방법을 포아송 통계 분석이라고 한다. 이 방법은 무엇보다도 적은 량의 데이터의 분산으로도 단일 결합력을 분석해 낼 수 있어 샘플의 손상이 적다는 점과 에러 요인을 무시할 수 있다는 장점이 있다. 사용되는 분석 수식은 수학식 2와 같다.
Figure pat00003
여기서, F는 단일 결합력(single binding Force)이고, σ는 표준편차(standard deviation)이고, m은 평균(mean)이며, 또한 N은 결합된 수(number of bond)이다.
다음은 수소결합(Hydrogen bond)에 대해서 설명한다.
도 5는 수소결합을 이룬 비드가 표면에서 떠오를 때를 그레이스케일로 분석한 비드 사이즈에 따른 결과의 일예이다.
석신산무수물(Succinic Anhydride)를 사용하여, 표면을 COOH로 코팅하여 COOH가 기능화(Functionalize)된 비드를 사용하여, PH4에서 결합을 이루었을 때 수소결합을 이루게 된다. 비드가 표면에서 떠오를 때를 그레이스케일로 분석하면 도 5와 같은 분산이 비드 사이즈에 따라 다르게 나오게 되며, 포아송 통계 분석 방법을 이용하여 단일 결합력(Single binding Force)를 계산해본 결과, 95.6pN이 나왔다. 이 값은 기존에 연구한 수소결합력(50~100pN)과 유사한 값이 나왔다는 것을 확인할 수 있었다.
도 6은 수소 결합된 단일 Size의 비드를 사용하여 실험한 결과(빨간색)와 두가지 Size의 비드를 사용하여 실험한 결과(파란색)의 일예이다.
도 6은 멀티 프로브형식이 아닌 단일 사이즈의 비드를 사용하여 실험한 결과가 다양한 사이즈의 비드를 사용하여 동시 실험을 한 결과와 유사한 값이 나오는 것을 나타낸다. 데이터 값을 기준으로 라인 피팅(Linear Fitting)을 해본 결과 유의사(Relation)는 0.90가 나왔다.
다음은 이온결합력을 측정하기 위한 두 가지 실험을 설명한다.
도 7은 이온결합력을 측정하기 위한 실험결과의 일예이다.
먼저 도 7의 (a)에서와 같이 표면을 APTES로 NH3 + 작용 기를 띄도록 코팅을 하고 COO-이 기능화된 비드를 사용하여 PH7에서 이온결합을 만든 후, 단일결합력을 측정한 결과 130.0pN의 결합력을 얻어낼 수 있었다. 도 7의 (a)의 유의사(Relation)는 0.95값이 나왔다.
도 7의 (b)에서는, 도 7의 (a)에서의 실험조건과 다르게, APTES보다 전하 분포(Charge distribution)가 두 배 가까이 되는 L-lysine(2NH3 +)을 표면에 코팅하고, 도 7의 (a)와 같은 조건에서 실험을 하였을 때 이온결합력이 200.4pN으로 더 큰 결합력이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이 실험의 선형 피팅 유의사(Linear fitting relation) 값은 0.89값이 나왔다.
다음은 리간드 리셉터 결합(Ligand-Receptor bond)을 분석한 실험결과를 설명한다.
도 8은 리간드와 리셉터간의 결합력을 분석한 실험 결과의 일예이다.
도 8은 리간드(Ligand)와 리셉터(Receptor)간의 결합력을 분석한 실험 결과의 일예로써, 표면은 BBSA(biotin)를 코팅하고 Strepavidin이 기능화된된 비드를 사용하여 Biotin과 Strepavidin간의 단일 결합력을 측정하였다. 측정값은 138.8pN이 나왔으며 기존 연구결과에 의한 Single binding force(100~200pN)보다 다소 작은 값이 나왔다.
본 발명의 장점은 우선 시간과 비용 면에서 매우 효율적인 방법으로, 기존의 고가의 장비 사용을 통한 측정방법을 유전영동 기법을 이용하여 묘사하고 측정방식의 한계를 넘어 많은 수의 샘플의 동시 측정과 멀티프로브 방법을 통해서 보다 손쉽고 빠르게 데이터를 얻어낼 수 있다.
본 발명에서, 설명의 편이상, 기본적인 화학결합력(수소결합, 이온결합)과 Ligand와 Receptor간의 결합력을 예로 들었지만, 이로써 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며, 본 발명은 단백질과 DNA의 결합력 검출하고 그 특성을 분석할 수 있으며, Ligand/Receptor 혹은 Protein의 결합에 있어서 결합력과 분산을 통해 에너지 지도(Energy landscape)를 나타낼 수 있다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야만 한다.
100:저수조 200:전계생성부 220:절연기판
240:전극부 250:이븐전극 260:오드전극
255:이븐전극 패드 265:오드전극 패드 300:제어부
330:함수발생기 360:증폭기 390:오실로스코프
400:CCD 카메라 410:상면 CCD카메라 420:측면 CCD카메라
450:분석부

Claims (26)

  1. 비즈들이 들어 있는 저수조;
    상기 저수조 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부;
    상기 저수조 위 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라;
    상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고 그레이 스케일의 변화에 따른 수평방향 움직임의 분석을 통해 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간을 검출하는 분석부;
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  2. 비즈들이 들어 있는 저수조;
    상기 저수조 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부;
    상기 저수조 위 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라;
    상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고, 그레이스케일 값이 기설정된 기준치와 비교하여 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간을 검출하는 분석부;
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  3. 비즈들이 들어 있는 저수조;
    상기 저수조 밑에 위치하되,전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부;
    상기 저수조 위 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라;
    상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고, 그레이스케일 값의 변화에서 이차미분 값의 최대가 되는 지점을 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간을 검출하는 분석부;
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 분석부는 상기 그레이스케일 값이 상기 기준치와 비교하여 기준치를 넘는 순간을 결합(bonding)이 파열(rupture)되는 순간으로 검출하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 기준치는, 그레이스케일 값이 결합이 끊어지지 않을 때의 변화량의 표준편차를 구하고, 상기 변화량의 표준편차의 2배의 값을 기준치로 설정하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 기준치는 최대 그레이스케일(maximum grayscale)값의 e-1, 최대 기울기(maximum gradient), 최대 그레이스케일의 10 내지 60%이내에서 설정된 값 중 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  7. 비즈들이 들어 있는 저수조;
    상기 저수조 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 교류 전원을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부;
    상기 저수조 위에 또는 일측에 위치되어, 상기 저수조 내를 촬상하는 CCD 카메라;
    상기 CCD 카메라로부터 수신된 영상신호로 부터 그레이스케일 값을 검출하고, 검출된 그레이스케일 값으로부터 평균과 분산을 구하고 상기 평균과 분산을 포아송 통계 분석에 적용하여 단일 결합력을 검출하는 분석부;
    를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  8. 제7항에 있어서
    상기 단일 결합력은
    Figure pat00004

    (단, F는 단일 결합력(single binding Force)이고, σ는 표준편차(standard deviation)이고, m은 평균(mean)이며, 또한 N은 결합된 수(number of bond)임)
    에 의해 구하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비드는 카르복시기(Carboxyl, COOH), 아민(Amine, NH2), 스트렙아비딘(Streptavidin)중 어느 하나로 기능화(Functionalize)된 비드인 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비드의 사이즈는 15um, 12um, 10um 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전계생성부는 절연기판 위에 전극부가 형성되며,
    상기 전극부는 이븐전극과 오드전극이 서로 교번하여 위치되어 있는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 절연기판은 SiO2로 이루어진 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 전극 표면은 APTES(NH2), 엘라이신(L-lysine(2NH2)), 석신산무수물(Succinic Anhydride(COOH)), BBSA(Biotin) 중 하나의 물질을 사용하여 기능화한 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  14. 제11항에 있어서,
    이븐전극의 패드와 오드전극의 패드 사이에 교류 전원이 인가되는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전극부에서 전압을 검출하는 전압검출수단을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석부는 비드의 수직이동뿐만 아니라 미세한 수평이동도 검출하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  17. 제11항에 있어서,
    절연기판의 폭은 50um이하이며, 오드전극과 이븐전극의 이격거리는 상기 절연기판의 폭의 1/4배로 이루어진 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전극부는 석신산무수물(Succinic Anhydride)를 사용하여, 표면을 COOH로 코팅하여 COOH가 기능화(Functionalize)된 비드를 사용하여, PH4에서 결합을 이루어 수소결합을 이루도록 하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 분석부는 분자간의 수소결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전극부는 APTES로 NH3 + 작용 기를 띄도록 코팅을 하고 COO-이 기능화된 비드를 사용하여 PH7에서 이온결합을 이루는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 분석부는 분자간의 이온결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  22. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전극부는 L-lysine(2NH3 +)을 표면에 코팅하고, COO-이 기능화된 비드를 사용하여 PH7에서 이온결합을 이루는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 분석부는 분자간의 이온결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전극부는 표면을 BBSA(biotin)를 코팅하고, Strepavidin이 기능화된 비드를 사용하도록 이루어진 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 분석부는Biotin과 Strepavidin간의 단일 결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.
  26. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석부는 단백질과 DNA의 결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 분자간의 결합력 측정시스템.

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KR20200026169A (ko) * 2018-08-31 2020-03-10 연세대학교 원주산학협력단 유전영동 힘 인가변화 조절에 따른 세포의 전기분극 특성 분석법

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