KR20150114177A - 측면 유전영동기술 기반의 힘 분광기법을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 측면유전영동기술(Lateral Dielectrophoretic Technique)을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 불균일한 전기장에 의해 형성되는 유전영동력이 수평인 방향으로 전극 중앙부근으로 이동함에 따라 일정하게 감소되어지는데 이때 생체분자 간에 존재하는 화학 결합력 보다 측면 유전영동력이 작아지는 지점 부근에서 비즈(beads)는 정지한다고 할 수 있기 때문에 비즈가 정지한 지점에서의 유전영동력의 힘을 생체 분자 간 화학 결합력으로 측정하여 적은 반복실험 및 간단한 분석방법으로 신뢰 할 수 있는 화학 결합력을 측정할 수 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 측면유전영동기술(Lateral Dielectrophoretic Technique)을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 불균일한 전기장에 의해 형성되는 유전영동력이 수평인 방향으로 전극 중앙부근으로 이동함에 따라 일정하게 감소되어지는데 이때 생체분자 간에 존재하는 화학 결합력 보다 측면 유전영동력이 작아지는 지점 부근에서 비즈(beads)는 정지한다고 할 수 있기 때문에 비즈가 정지한 지점에서의 유전영동력의 힘을 생체 분자 간 화학 결합력으로 측정하는 방법에 관한 것이다.
분자 간 상호작용과 결합력을 단일 분자 레벨에서 측정하기 위해 주로 사용되는 방법으로는 원자 힘 현미경(Atomic Force Microscope), 광학 트위저(Optical tweezers), 자성 트위저(Magnetic tweezers)등이 있다.
원자 힘 현미경(Atomic Force Microscope)은 작용기가 기능화(functionalize)된 캔틸레버(cantilever) 끝(tip)을 다른 작용기가 기능화된 기판(wafer) 표면에 가져가 분자 간 결합형성을 유도한 후 캔틸레버의 끝을 표면기판에서 띄어내어 결합이 끊어지는 순간의 힘을 측정하는 방식으로 생체 분자 간의 결합력을 측정하는 것이다. 대표적인 예로 형광 표지한 항원을 캔틸레버 끝에 기능화하고 그에 상응하는 항체를 금 기판 표면에 기능화하여 각 항체-항원 분자의 상호결합력을 원자 힘 현미경으로 확인한 것으로 이것은 분자 수준에서 리간드-수용체의 결합력을 원자 힘 현미경을 이용하여 분석한 것이다(Robert Ros, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 95:7402-7405, 1998). 원자 힘 현미경은 힘을 가하고 잴 수 있는 장점이 있기 때문에 힘 스펙트럼을 얻는 것에 이용될 수 있고 최소 작용력이 다른 기술에 비해 크기 때문에 단백질의 풀림, 리간드-수용체의 결합 및 분리, 세포막 등 세포 골격 및 모양에 관련된 구조의 탄성 측정 등에 이용될 수 있다. 하지만 탐침(probe)의 크기가 크기 때문에 측정 대상이 되는 분자뿐만 아니라 다른 분자들이 영향을 받을 수 있다는 점과 약한 힘에 의해 일어나는 생체분자 간 결합력을 측정하기에는 최소 작용력이 수십pN에 달할 정도로 크다는 단점이 있다.
광학 트위저(Optical tweezers)는 작용기가 있는 마이크로 사이즈(micro size)의 비즈(beads)나 세포를 레이저(laser)를 이용해 잡아 다른 작용기가 있는 기판 표면에 가까이 가져가 결합을 유도한 후 비즈나 세포를 기판 표면에서 떼어 내며 비즈와 기판 또는 세포와 기판 사이 분자들의 상호결합이 끊어지는 순간의 결합력을 측정하는 것이다. 대표적인 예로 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 부착 단백질인 BabA와 비즈에 기능화된 위 상피의 혈액항원 Lewis b(Leb) 간의 결합력을 광학 트위저를 이용해 측정한 것이다(Bjornham Oscar, et al., Journal of Biomedical Optics, 10(4):44024, 2005). 광학 트위저는 빛의 초점 위치나 시료의 위치를 제어하면서 포획된 분자에 힘을 가하는 것이기 때문에 초점의 위치를 3차원적으로 자유롭게 조절할 수 있고 0.1 pN의 약한 힘부터 200 pN정도의 강한 힘까지 분자에 가할 수 있으며 집게로 집듯이 레이저를 이용해 생체분자를 잡아서 자유자재로 움직일 수 있기 때문에 활용성이 높은 기술이라 할 수 있다. 하지만 레이저의 세기나 세기의 공간분포에 영향을 주는 상황에 민감하게 반응하고 연구대상 분자뿐만 아니라 주변에 있던 다른 분자도 비특이적으로 따라와서 방해를 받을 수 있으며 형광현미경과 같이 빛을 이용하는 다른 기술을 간섭할 수 있어 주의가 필요하다는 단점이 있다.
자성 트위저(magnetic tweezers)는 작용기가 기능화된 자성 비즈를 다른 작용기가 기능화된 기판에 가까이 가져가 결합을 유도한 후 자성 비즈에 자석으로 힘을 가해 비틀거나 당겨 분자 간의 비틀림 특성이나 결합력을 측정하는 것이다. 대표적인 예로 유리 기판과 자성 비즈에 기능화된 DNA 분자 간의 결합력을 자성 트위저를 이용해 측정한 것이 있다(Charlie Gosse and Vincent Croquette, Biophysical Journal, 82(6):3314-3329, 2002). 자성 트위자의 장점은 대부분의 생체계는 자성을 띠지 않아 자기장에 반응하지 않기 때문에 표지된 것만 선택적으로 제어할 수 있다는 점과 1마이크론(micron) 크기의 자성 비즈를 사용해 희토류 자석을 사용하여 수 밀리미터(mm) 이내에서 힘을 가하면 1 내지 2 pN의 매우 약한 힘을 가할 수 있어 DNA연구에 적합하고 영구자석에 의한 자력은 일정하므로 안정적으로 실험할 수 있다는 것이다. 하지만 자석이 샘플 주변에 근접해야 하기 때문에 공간적 제약을 받을 수 있다는 점과 자성 비즈의 형상을 카메라로 기록해서 분석하기 때문에 포토다이오드의 신호를 전기적으로 분석하는 다른 장비들에 비해 속도가 느리고 많은 비용이 필요하다는 단점이 있다.
상기에 기재된 생체 분자 간의 결합력 측정을 위해 주로 사용되는 원자 힘 현미경, 광학 트위저, 및 자성 트위저를 이용한 기술은 모두 숙련된 연구 인력이 필요로 하다는 단점과 자성 트위저를 제외한 원자 힘 현미경과 광학 트위저의 경우 한번에 오직 하나의 결합력만을 측정 할 수 있기 때문에 유의한 수준의 결과를 얻기 위해서 아주 많은 반복실험을 통한 통계 처리가 필요하다는 단점이 있다. 이러한 선행기술의 단점들을 극복한 생체 분자 간 결합력 측정 기술로 한국공개특허 제2013-0047473호는 유전영동력을 이용한 생체분자 간 결합력을 측정하는 측정 방법 및 장치에 대해 게시하고 있다. 유전영동력(dielectrophoresis, DEP)은 쌍극입자(dielectric particle)가 비균등한 전기장 안에 있을 때 입자와 비균등한 전기장과의 상호작용에 의해서 힘이 발생하게 되고 이 힘에 의해 입자가 움직이는 현상을 말한다. 상기 특허는 작용기가 기능화된 비즈와 기판 표면 사이에 결합(bonding)을 유도한 후 수직 방향으로 유전영동력을 인가하여 결합이 끊어지는 순간의 전압에 따른 이미지를 그레이 스케일(grayscale)로 분석함으로써 결합이 파열(rupture)되는 순간의 힘을 찾아내 생체 분자 간 결합력을 측정하는 기술로 단일 탐침(probe)를 통한 측정이 아니기 때문에 한 번의 실험으로 100개 이상의 데이터를 얻을 수 있다. 따라서 동시에 많은 결합을 한 번에 측정하는 것이 가능하고 간단한 전극 구조를 이용해 작은 전원(power)으로 측정이 가능해 가격이 저렴하면서 다양한 결합을 측정 데에 용이하게 적용할 수 있고 유체 속에서도 사용이 가능하며 단순히 전압을 조절하는 것만으로 비즈에 가해지는 유전영동력(dielectrophoresis, DEP)을 조절하는 것이 가능하기 때문에 누구나 쉽게 사용할 수 있는 유전영동력을 이용한 생체분자 간 결합력을 측정하는 기술이다. 그러나 이 방식은 신뢰할 수 있는 결합력 측정을 위해 비즈의 초점이 변화하는 정도를 그레이 스케일(grayscale) 방식으로 분석해야한다는 단점이 있고 종래의 방법과 마찬가지로 생체 분자 간 결합력 측정하는 방식에 있어 결합을 수직으로 파열하는 방식이므로 새로운 차별성을 갖지는 못한다.
따라서 상기 유전영동력의 장점들을 잃지 않으면서 새로운 방식으로 단점을 극복 할 수 있는 보다 진보적인 생체 분자 간 결합력 측정 방법이 요구되어 진다.
Robert Ros, Falk Schwesinger, Dario Anselmetti, Martina Kubon, Rolf Schafer, Andreas Pluckthun, and Louis Tiefenauer (1998). Antigen binding forces of individually addressed single-chain Fv antibody molecules, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol.95, 7402-7405
Oscar Bjornham, Erik Fallman, Ove Axner, Jorgen Ohlsson, Ulf J Nilsson, Thomas Boren, and Staffan Schedin (2005). Measurements of the binding force between the Helicobacter pylori adhesin BabA and the Lewis b blood group antigen using optical tweezers, Journal of Biomedical Optics, Vol.10, 44024
Charlie Gosse and Vincent Croquette (2002). Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level, Biophysical Journal, Vol.82, 3314-3329
본 발명에서는 생체 분자 간 화학 결합력을 측정하기 위해 측면유전영동기술(Lateral Dielectrophoretic Technique)을 이용하는 것으로 기존의 생체 분자 간 화학 결합력을 측정하는 기술들은 대부분 단일 프로브(probe)를 통한 힘 측정방식으로 신뢰할 수 있는 화학 결합력을 측정하기 위하여 많은 반복실험이 필요하였고, 표면에서 수직인 방향으로 외력을 인가하여 화학 결합력 측정하였으나, 측면 유전영동기술을 이용한 본 발명은 적은 반복실험 및 간단한 분석방법으로 신뢰 할 수 있는 화학결합력 측정이 가능하고, 지금까지의 힘 분광기법 장치들과 다르게 표면에서 수평인 방향으로 유전영동력을 외력으로 가해 생체 분자 간 화학 결합력을 측정할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에서는 상기 과제 해결을 위하여 (a) 전극과 절연기판을 포함하는 미세 유체 칩을 제작하고 작용기를 기능화(functionalize) 하는 단계와 (b) 저수조(reservoir)에 작용기가 기능화된(functionalized) 비즈(beads) 용액을 넣은 후 전압을 인가하는 단계 및 (c) 결합력을 측정하고 분석하는 단계를 포함하는 측면 유전영동력(Lateral dielectrophoresis force)을 이용하여 생체분자 간 화학 결합력을 측정하는 방법을 제공함으로써, 수평 방향으로 외력을 가하는 측면 유전영동력을 이용해 적은 반복실험 및 간단한 분석방법으로 신뢰 할 수 있는 화학 결합력을 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 생체 분자 간 화학 결합력을 측정 방법은 측면 유전영동 기술(Lateral Dielectrophoretic Technique)을 이용하여 화학 결합력을 측정하는 것으로 복잡한 그레이스케일(grayscale) 분석을 필요로 하지 않으며, 간단한 전극 구조를 이용해 작은 전원(power)으로 측정이 가능해 가격이 저렴하면서 다양한 결합을 측정 데에 용이하게 적용할 수 있고 유체 속에서도 사용이 가능하며 단순히 전압을 조절하는 것만으로 비즈에 가해지는 유전영동력을 조절하는 것이 가능하기 때문에 누구나 쉽게 생체분자 간 결합력을 측정할 수 있다. 또한 사용한 장치에서 수직유전영동 기술을 이용하여 분자 간 화학 결합력을 측정 및 제어가 가능 하므로, 유전 영동기술을 이용한 생체분자 간 이방성 화학결합력 측정 및 기기 구현을 통한 생체분자 간 결합 관계에 대해 폭넓은 시각을 제공할 수 있다. 마지막으로 부하율(loading rate)을 조절하여 실시하는 인장실험의 경우 본 기기를 활용 시, 전극 중앙부분으로 이동 할수록 일정하게 감소되어지는 측면방향에서의 유전영동력 특성으로 생체분자 사이의 결합을 파열시키기 위한 외부 동력원에 가해주는 힘을 증가시키거나 감소시킬 필요가 없다.
도 1은 직류(AC) 전기장에서 쌍극자(dipole)를 형성하는 중성인 입자의 알짜 힘(net force) 발생과정을 나타낸 것이다.
도 2는 다중선형(interdigitated, IDT) 전극의 기하학적 디자인을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 유전영동(dielectrophoresis, DEP) 시스템 모식도이다.
도 4는 측면 유전영동기술(lateral dielectrophoretic technique)을 이용한 생체 분자 간 화학 결합력 측정 장치 작동원리를 나타낸 것으로서, A는 미세유체칩(microfluidics chip)의 측면 구조도를, B는 전극 표면에서 발생하는 유전영동력을 계산한 수치해석 결과를 도시한 것이고, C는 실제 칩(chip)에서 비즈가 측면 유전전기영동력에 의해 전극의 중앙으로 이동하는 모습을 시간에 따라 순차적으로 나열한 것이다.
도 5는 측면 유전영동기술(lateral dielectrophoretic technique)을 이용한 생체 분자 간 화학결합력 측정방법을 검증한 실험결과를 나타낸 것으로서, A는 인가되는 전압의 크기에 따른 비즈(bead)의 이동거리를, B는 A의 비즈가 멈춘 지점에 따른 유전영동력의 크기를 이용하여 도출한 반데르발스 인력(van der Waales force) 측정 결과를, C는 전극 표면에 붙어있는 기능화 된 작용기 농도 수에 따른 비즈의 이동거리를, D는 C의 비즈가 멈춘 지점에 따른 반데르발스 인력 크기에 대한 계산 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 측면 유전영동기술(lateral dielectrophoretic technique)을 이용한 생체 분자 간 화학 결합력 측정 결과를 나타낸 것으로, A는 전극 표면에 붙어있는 기능화 된 작용기 농도 수에 따른 단일 이온결합 측정결과를, B는 전극 표면에 붙어있는 기능화 된 작용기 농도 수에 따른 단일 수소결합 측정결과를 나타낸다.
도 7은 100 Vpp 인가 시 유전영동 기술을 이용한 부하율(loading rate) 측정결과(전극 가장자기에서부터 전극 중앙지점으로의 이동거리)를 나타낸 것이다.
도 8은 실제 칩(chip)에서 비즈가 측면 유전영동력에 의해 전극의 중앙으로 이동하는 모습(a-c)과 이후에 비즈가 중앙에 모아지고 수직 유전영동력에 의해 분자 간 결합이 끊어져 위로 떠오르는 모습(d-f)을 각각 20초씩 경과한 시간에 따라 순차적으로 촬영한 사진이다.
도 2는 다중선형(interdigitated, IDT) 전극의 기하학적 디자인을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 유전영동(dielectrophoresis, DEP) 시스템 모식도이다.
도 4는 측면 유전영동기술(lateral dielectrophoretic technique)을 이용한 생체 분자 간 화학 결합력 측정 장치 작동원리를 나타낸 것으로서, A는 미세유체칩(microfluidics chip)의 측면 구조도를, B는 전극 표면에서 발생하는 유전영동력을 계산한 수치해석 결과를 도시한 것이고, C는 실제 칩(chip)에서 비즈가 측면 유전전기영동력에 의해 전극의 중앙으로 이동하는 모습을 시간에 따라 순차적으로 나열한 것이다.
도 5는 측면 유전영동기술(lateral dielectrophoretic technique)을 이용한 생체 분자 간 화학결합력 측정방법을 검증한 실험결과를 나타낸 것으로서, A는 인가되는 전압의 크기에 따른 비즈(bead)의 이동거리를, B는 A의 비즈가 멈춘 지점에 따른 유전영동력의 크기를 이용하여 도출한 반데르발스 인력(van der Waales force) 측정 결과를, C는 전극 표면에 붙어있는 기능화 된 작용기 농도 수에 따른 비즈의 이동거리를, D는 C의 비즈가 멈춘 지점에 따른 반데르발스 인력 크기에 대한 계산 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 측면 유전영동기술(lateral dielectrophoretic technique)을 이용한 생체 분자 간 화학 결합력 측정 결과를 나타낸 것으로, A는 전극 표면에 붙어있는 기능화 된 작용기 농도 수에 따른 단일 이온결합 측정결과를, B는 전극 표면에 붙어있는 기능화 된 작용기 농도 수에 따른 단일 수소결합 측정결과를 나타낸다.
도 7은 100 Vpp 인가 시 유전영동 기술을 이용한 부하율(loading rate) 측정결과(전극 가장자기에서부터 전극 중앙지점으로의 이동거리)를 나타낸 것이다.
도 8은 실제 칩(chip)에서 비즈가 측면 유전영동력에 의해 전극의 중앙으로 이동하는 모습(a-c)과 이후에 비즈가 중앙에 모아지고 수직 유전영동력에 의해 분자 간 결합이 끊어져 위로 떠오르는 모습(d-f)을 각각 20초씩 경과한 시간에 따라 순차적으로 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 전극과 절연기판을 포함하는 미세 유체 칩을 제작하고 작용기를 기능화(functionalize) 하는 단계와 (b) 저수조(reservoir)에 작용기가 기능화된(functionalized) 비즈(beads) 용액을 넣은 후 전압을 인가하는 단계 및 (c) 결합력을 측정하고 분석하는 단계를 포함하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법을 제공한다.
이어서, 상기에서 언급된 각 단계의 공정에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 이용되는 미세유체칩은 마이크로 전기-기계 시스템(microelectromechanical systems, MEMS)의 제작 과정을 통하여 다중선형전극(Interdigitated eletrode)이 구현된 것이다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 이용되는 다중선형전극은 크롬(Cr) 또는 백금(Pt)으로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 크롬 전극을 사용할 경우 전극의 두께는 1 내지 2 kÅ 범위 내에 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 절연기판(wafer)은 이산화규소(SiO2, 실리카)가 증착된 실리콘인 것을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 실리카 절연기판(wafer)을 사용할 경우 기판의 두께는 10 kÅ 이내에 범위에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며 전압 하강(voltage drop)을 초래하지 않고 시스템 균형을 유지할 수 있는 범위내의 두께일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 표면은 카르복실(carboxyl) 및 아민(amine) 작용기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 기능화(functionalize)한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 절연기판 표면은 피라나 용액(Piranha(-OH)), 에이피티이에스(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES(-NH2)), 엘라이신(L-lysine(-2NH2)), 석신산무수물(Succinic Anhydride(-COOH)) 및 비오틴(Biotin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질을 사용하여 기능화한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)에서 저수조(reservoir)는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 만들어 지는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)에서 저수조(reservoir)는 유리 덮개를 구비하며, 이는 메니스커스(meniscus)에 의한 빛의 산란과 용액의 증발을 방지하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)에서 비즈는 하이드록실(Hydroxyl, OH), 카르복실(Carboxyl, COOH), 아민(Amine, NH2) 및 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 기능화(functionalize)된 비즈인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)에서 비즈의 크기는 10 내지 30 ㎛ 보다 바람직하게는 10 내지 15 ㎛범위 내에 선택되는 어느 하나 인 것일 수 있으나, 이로 제한된 것은 아니며 전극의 넓이 보다 작으면서 현미경 측정이 가능하고 비즈 움직임을 위해 인가되는 전압에 따른 발열효과를 야기하지 않을 정도로 작은 범위내의 비즈일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)에서 전압이 인가될 때, 다중선형전극(Interdigitated eletrode)에 전압이 인가되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)에서 현미경이 부착된 CCD 카메라 및 CCD 고속 카메라 중 어느 하나 이상을 구비하여, 비즈의 움직임을 관찰 또는 기록하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서 전극 중앙부근에서 정지하는 전압에 의한 비즈의 수평이동에 따른 유전영동력(FDEP)의 힘으로 도출된 값은 생체 분자 간 화학결합력인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서 전극 중앙부근에서 정지하는 전압에 의한 비즈의 수평이동에 따른 유전영동력(FDEP)의 힘으로 도출된 값을 포아송 통계 분석에 적용하여 단일 결합력을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 측면 유전영동력을 이용하여 생체 분자 간 화학 결합력을 측정함으로써, 분자 간의 반데르발스 인력, 이온결합, 수소결합, 및 소수성 상호작용으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서 전극중앙에서 측면 유전영동력의 벡터 합은 0이 되므로 전압이 세기를 증가시킬수록 수직 유전영동력의 힘만 증가되어 비즈가 바닥과의 결합을 끊고 떠오르는데 이때 결합을 끊어내는 힘을 그레이스케일 분석방법과 푸아송 분산 방법에 의한 통계적 분석 처리로 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서 비즈의 수평이동 및 수직이동을 검출하고, 이를 이용하여 생체분자 간 이방성 화학 결합력을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서 일정한 전압을 인가하여 전극 가장자리에서부터 전극 중앙부분까지 비즈가 이동하면서 받게 되는 부하율(loading rate)을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 표면을 카르복실(-COOH)로 기능화(Functionalize)하고 카르복실(-COOH)로 기능화된 비즈를 사용하여, pH 6 내지 pH 7의 조건에서 반데르발스 인력(van der waals force)을 이루도록 함으로써, 분자 간의 반데르발스 인력을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 표면을 카르복실(-COOH)로 기농화(functionalize)하고 카르복실(-COOH)로 기능화된 비즈를 사용하여, pH 3 내지 pH 4의 조건에서 수소결합을 이루도록 함으로써 분자 간의 단일 수소 결합력을 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 표면을 카르복실(-COOH)로 기능화(functionalize)하고 아민(-NH2)으로 기능화된 비즈를 사용하여, pH 6 내지 pH 7의 조건에서 이온결합을 이루도록 함으로써, 분자 간의 단일 이온 결합력을 측정하는 것일 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
1. 전극과 절연기판을 포함하는 미세 유체 칩을 제작하고 작용기를 기능화(Functionalize) 하는 단계
1-1. 전극과 절연기판을 포함하는 미세 유체 칩을 제작
마이크로 전기-기계 시스템(Micro Electro Mechanical Systems ,MEMS)의 제작 과정을 통하여 다중선형전극(Interdigitated eletrode)이 구현된 미세유체 칩을 제작 하였다. 기판(wafer)는 8 kÅ 두께의 이산화 규소(SiO2)가 증착되어 있는 상용화 된 실리콘(Silicon)(05-1652-02, I-Nexus, Inc.)을 사용하였다.
1-2. 기판 표면에 작용기 기능화(Functionalize)
이산화 규소 기판(SiO2 Wafer) 표면에 피라나 용액(piranha)을 이용하여 하이드록시기(-OH)를, 에이피티이에스(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES, Sigma-Aldrich, A3648)를 이용하여 아미노기(-NH2)를, 엘라이신(L-lysine, Sigma, L5501)을 이용하여 2개의 아미노기(-2NH2)를, 석신산무수물(Succinic Anhydride, Sigma-Aldrich, 239690)을 이용하여 카르복실기(-COOH)를 또는 비오틴(Biotin)을 작용기로 기능화 하였다.
2. 저수조(reservoir)에 작용기가 기능화된(Functionalized) 비즈(beads) 용액을 넣은 후 전압을 인가하는 단계
ⅰ) 슬라이드 글라스 위에 하이드록실(hydroxyl) 또는 카르복실(carboxyl) 또는 아민(amine) 작용기가 활성화된 전극을 올렸다.
ⅱ) 3×3×3 mm³ 크기의 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 저수조(reservoir)를 만들어 표면에 카르복실(carboxyl) 또는 아미노(amino) 작용기가 기능화된 폴리스티렌 비즈(polystyrene beads) 용액을 그 안에 넣고 1mm 두께의 유리 덮개(cover glass)를 덮어 메니커스(meniscus)에 의한 빛의 산란과 용액의 증발을 방지하였다.
ⅲ) 10분 동안 bead가 전극 표면에 가라앉도록 기다린 후 전극 가장자리 부근에 함수 발생기(function generator)와 전압 증폭기(voltage amplifier)를 통하여 전압을 인가하였으며, 인가된 전압의 크기는 오실로스코프(oscilloscope)로 측정하였다. 이때 비즈(beads)의 움직임을 현미경에 부착된 상면(top-view) CCD 카메라(camera) 및 고속(high-speed) CCD 카메라(camera)를 통해 상면(top-view) 방향에서 움직임을 관찰하였다.
3. 결합력을 측정하고 분석하는 단계 및 결과
CCD 카메라(camera)를 통해 얻은 영상에서 전극 가장자리에 존재하는 비즈들이 외부에서 인가받은 전압에 의해 전극사이의 불균일한 전기장 형성으로 인해 전극 중앙부분으로 이동할 때(도 4C 참조), 컴솔 시뮬레이션(COMSOL Simulation)을 이용한 전극 표면에서 발생하는 유전영동력 계산 수치해석 결과 전극 가장자리에서 전극중앙부분 사이에 존재하는 힘인 유전영동력의 벡터방향은 전극표면과 수평 방향이라는 것을 확인 할 수 있었다(도 4B 참조). 또한 이때 전극의 중앙 부근에서의 측면 유전영동력의 벡터크기는 감소하였다.
[실험예 1] pH 6 내지 pH 7 사이에서 카르복실기(carboxyl) 작용기로 기능화된 표면과 카르복실기(
carboxyl
) 작용기로 기능화된
비즈
(
beads
) 사이의 상호작용
가해지는 전압의 크기변화에 따라서 비즈(beads)가 전극 가장자리에서부터 이동한 거리는 도 5A에서 확인 할 수 있는 바와 같이 외부에서 인가하는 전압이 증가함에 따라 측면 유전영동력이 증가하여 비즈의 이동거리가 증가했지만, 비즈가 이동해 멈춘 지점에서의 유전영동력의 크기를 컴솔 시뮬레이션(COMSOL Simulation)이용하여 도출한 반데르발스 인력의 크기는 인가한 전압 증가에 따른 비즈 이동거리 증가에 상관없이 같았다(도 5B 참조). 따라서 불균일한 전기장에 의해 형성되는 유전영동력이 전극 중앙부근으로 이동함에 따라 일정하게 감소되어지고 이때 생체분자 간에 존재하는 화학결합력보다 측면유전영동력이 작아지는 지점 부근에서 비즈는 정지한다고 할 수 있기 때문에 비즈가 정지한 지점에서의 유전영동력의 힘을 생체 분자 간 화학결합력이라고 정의 할 수 있었다.
전극 표면의 자기조립(self assembly(SAM))에 의해 형성된 카르복실(carboxyl) 작용기 개수가 증가 될수록, 전극 가장자리에서부터 이동하는 비즈의 움직임은 증가하였다(도 5C 참조). 이는 표면에 카르복실 작용기로 기능화 된 작용기의 개수가 증가할수록, 카르복실 작용기로 기능화 된 비즈 사이의 정전기적 척력(electrostatic repulsion)이 증가하였기 때문이다. 따라서 각 농도별로 멈춘 지점의 힘의 크기는 전극 표면에 위의 작용기가 많이 분포할수록 작아지는 것을 확인하였다(도 5D 참조).
[실험예 2] 단일 이온 결합 측정
pH 6 내지 pH 7 사이에서 카르복실(carboxyl) 작용기로 기능화 된 표면위에 아민(amine) 작용기로 기능화 된 비즈(beads)를 사용하였고 기능화 된 작용기 농도가 다른 전극 표면 위에 일정한 전압을 전극에 인가하였을 때, 전극 가장자리에서부터 이동하여 정지한 지점에서의 유전영동력의 힘을 포아송 통계 분석(poisson statistical analysis)방법에 의하여 단일 결합력을 측정하였다.
실험결과 측면유전영동기술을 이용한 실험방법과 이전 수직유전영동기술을 이용한 단일 이온결합의 차이는 미미하다(도 6A 참조). 따라서 측면 유전영동기술을 이용하여 구한 생체분자간의 화학결합력을 신뢰할 수 있음을 입증하였다.
[실험예 3] 단일 수소결합 측정
pH 4에서 카르복실(carboxyl) 작용기로 기능화 된 표면에서 카르복실 작용기로 기능화 된 비즈(beads)를 사용하였고 기능화 된 작용기 농도가 다른 전극 표면 위에 일정한 전압을 전극에 인가하였을 때, 전극 가장자리에서부터 이동하여 정지한 지점에서의 유전영동력의 힘을 포아송 통계 분석(poisson statistical analysis)방법에 의하여 단일 결합력을 측정하였다.
실험결과 측면유전영동기술을 이용한 실험방법과 이전 수직유전영동기술을 이용한 단일 수소결합의 차이는 미미하다(도 6B 참조). 따라서 측면 유전영동기술을 이용하여 구한 생체분자간의 화학결합력을 신뢰할 수 있음을 입증하였다.
[실험예 4] 부하율(Loading rate) 측정
전극 가장자리 부근에 함수 발생기(function generator)와 전압 증폭기(voltage amplifier)를 통하여 100 Vpp 전압을 인가하여 전극 가장자리에서부터 전극 중앙부분까지의 비즈가 이동하면서 받게 되는 부하율(loading rate) 측정하였다(도 7 참조).
실험결과 전극 가장자리에서부터 전극 중앙지점으로의 이동거리거리가 짧을수록 비즈가 받는 부하율은 증가하였다. 이는 다중선형 (interdigitated, IDT) 전극이 구현된 미세유체 칩의 구조적인 성질로 인하여 전극 중앙부분으로 이동 할수록 불균일한 전기장의 차이가 일정하게 감소되어져 측면방향에서의 유전영동력 또한 감소하기 때문에 생체분자 사이의 결합을 파열시키기 위한 외부 동력원에 일정한 전압만 인가하면 비즈에게 가해지는 외력의 변화를 줄 수 있음을 입증하였다.
Claims (19)
- (a) 전극과 절연기판을 포함하는 미세유체칩을 제작하고 작용기를 기능화(Functionalize) 하는 단계;
(b) 저수조(reservoir)에 작용기가 기능화된(functionalized) 비즈(beads) 용액을 넣은 후 전압을 인가하는 단계; 및
(c) 결합력을 측정하고 분석하는 단계;를 포함하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(a)에서 미세유체칩은 마이크로 전기-기계 시스템( microelectromechanical systems, MEMS)의 제작 과정을 통하여 다중선형전극(Interdigitated eletrode)이 구현된 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(a)에서 절연기판은 이산화규소(SiO2, 실리카)가 증착된 실리콘인 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(a)에서 미세유체칩 표면은 카르복실(carboxyl) 및 아민(amine) 작용기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 기능화(functionalize)한 것을 특징으로 하는, 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제4항에 있어서,
피라나 용액(Piranha(-OH)), 에이피티이에스(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES(-NH2)), 엘라이신(L-lysine(-2NH2)), 석신산무수물(Succinic Anhydride(-COOH)) 및 비오틴(Biotin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질을 사용하여 기능화한 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(b)에서 저수조(reservoir)는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 만들어 지는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(b)에서 저수조(reservoir)는 유리 덮개를 구비하며, 이는 메니스커스(meniscus)에 의한 빛의 산란과 용액의 증발을 방지하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(b)에서 비즈는 하이드록실(Hydroxyl, OH), 카르복실(Carboxyl, COOH), 아민(Amine, NH2), 및 스트렙타비딘(Streptavidin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 기능화(functionalize)된 비즈인 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(b)에서 비즈의 크기는 10 ㎛ 내지 15 ㎛ 범위 내인 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(b)에서 전압이 인가될 때, 다중선형전극(Interdigitated eletrode)에 전압이 인가되는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(b)에서 현미경이 부착된 CCD 카메라 및 CCD 고속 카메라 중 어느 하나 이상을 구비하여, 비즈의 움직임을 관찰 또는 기록하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(c)에서 전극 중앙부근에서 정지하는 전압에 의한 비즈의 수평이동에 따른 유전영동력(FDEP)의 힘을 하기의 식을 통해 계산하여 구하되, 그 계산값은 생체 분자 간 화학결합력인 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법:
[수학식 1] 유전영동력
.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(c)에서 전극 중앙부근에서 정지하는 전압에 의한 비즈 수평이동에 따른 유전영동력(FDEP)의 힘을 하기의 식을 통해 계산하여 구하고,
이 계산값을 포아송 통계 분석에 적용하여 단일 결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법:
[수학식 1] 유전영동력
.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법을 이용하여 분자 간의 반데르발스 인력, 소수성 상호작용, 이온결합 및 수소결합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 측정하는 것을 특징으로 하는, 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(c)에서 비즈의 수평이동 및 수직이동을 검출하고,
이를 이용하여 생체분자 간 이방성 화학결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계(c)에서 일정한 전압을 인가하여 전극 가장자리에서부터 전극 중앙부분까지 비즈가 이동하면서 받게 되는 부하율(loading rate)을 측정하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용한 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
표면을 카르복실(-COOH)로 기능화(functionalize)하고 카르복실(-COOH)로 기능화된 비즈를 사용하여, pH 6 내지 pH 7의 조건에서 반데르발스 인력(van der waals force)을 이루도록 함으로써, 분자 간의 반데르발스 인력을 측정하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
표면을 카르복실(-COOH)로 기능화(functionalize)하고 카르복실(-COOH)로 기능화된 비즈를 사용하여, pH 3 내지 4의 조건에서 수소결합을 이루도록 함으로써 분자 간의 단일 수소결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용하여 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서,
표면을 카르복실(-COOH)로 기능화(functionalize)하고 아민(-NH2)으로 기능화된 비즈를 사용하여, pH 6 내지 pH 7의 조건에서 이온결합을 이루도록 함으로써, 분자 간의 단일 이온결합력을 측정하는 것을 특징으로 하는 측면 유전영동력을 이용한 생체분자 간 화학결합력을 측정하는 방법.
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