KR20190024175A - 유전영동 힘분광기법을 이용한 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정방법 - Google Patents

유전영동 힘분광기법을 이용한 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전영동 힘분광기법을 이용한 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 유전영동힘 분광기를 사용하여 생체인공재료와 혈청단백질 간의 흡착력을 측정하고, 단백질의 변성 정도를 변화시킬 수 있는 이황화결합 분해효소의 반응시간 및 농도에 따른 결합력 비교함으로써 측정한 흡착력에 대하여 검증을 수행하였는바, 본 발명의 방법을 단백질 흡착과 연관된 생체재료 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유전영동 힘분광기법을 이용한 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정방법{Method for measurement of binding forces between biomaterials and proteins using dielectrophoresis force spectroscopy}
본 발명은 유전영동기술(dielectrophoresis)을 이용하여 단백질들이 인공생체재료(biomaterial)에 흡착하는 정도 및 상기 흡착을 분리하는 힘을 측정하는 방법에 관한 것이다.
유전영동 힘분광기법(dielectrophoresis force spectroscopy, DEPFS)기술은 유전입자(dielectric particle)가 유체 내 비균등한 전기장(non-uniform electric field) 분포 위에서, 유전입자와 그 입자를 둘러싸고 있는 유체 사이의 분극 차이로 인해 발생하는 힘에 의해 움직이는 현상(유전영동현상)을 이용하여 생체분자사이의 결합력을 측정하는 기법이다.
지금까지 유전영동힘 분광기법으로 단분자 사이의 생체 결합력(수소결합, 정전기적상호인력, 소수성상호결합)을 측정에서 나아가, 특이적 상호결합 중의 하나인 streptavidin-biotin 결합력 측정 및, DNA 와 DNA 사이의 결합력을 측정하여 다양한 생체분자 사이의 결합력을 측정할 수 있는 유용한 힘분광기법 도구로써 검증 및 응용이 진행되고 있다.
또한, 이러한 유전영동 힘분광기법은 interdigitated 전극을 사용하여 주기성을 띄는 비균일한 전기장을 형성시킨 뒤, 유전영동힘에 반응하는 다수의 입자(프로브)를 활용하여 한번에 수많은 입자들과 전극표면사이의 결합력을 측정할 수 있다는 장점이 있다. 하지만, 지금까지의 유전영동힘분광기법은 단순히 생체분자사이의 상호작용력 측정에 국한되어 사용되어 왔을 뿐, 비교적 넓은 표면 (1cm×1cm) 위에서 존재하는 수백 개의 미세입자들의 움직임과 결합력을 측정할 수 있는 유전영동 힘분광기법을 이용하여 인체에 삽입될 수 있는 세라믹 계열 물질들에 대한 단백질 흡착 반응을 관측할 수 있는 방법에 대해서는 알려진 바 없다.
지금까지의 유전영동 힘분광기법에서 전극으로부터 발생되는 열로 생체분자의 변성을 방지하고, 전극으로부터 발생된 열이 유체에 전달되어 유체의 흐름을 발생시키는 thermal effect flow를 방지하기 위하여 전극위 표면물질로 silicon dioxide(SiO2)을 증착 과정을 진행하는데, 이러한 SiO2는 세라믹 고분자 물질중의 하나로 인체 내에 삽입되는 의료용 기구 및 임플란트 재료로써 사용되는 물질이기도 하다. 인체 내에 삽입되는 세라믹고분자물질의 경우 그 표면이 혈액 및 체액과 반응하여 염증반응을 발생시킬 수 있는데, 이러한 염증반응을 일으키기 위한 전조 과정으로 혈청 단백질들이 흡착되는 과정을 거치게 되며, 따라서 혈청 단백질이 세라믹 고분자 물질 표면 위에 흡착되는 과정을 관측하는 것은 중요하다고 볼 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 SiO2 표면 위에서 혈액 내에 가장 많이 존재하는 serum albumin 과의 흡착 반응을 관측하였다. 구체적으로 시중에 판매되는 소혈청단백질인 bovine serum albumin(BSA)가 고정된 polystyrene microsphere을 사용하여 전극 위 SiO2 표면과 일정시간 반응시킨 뒤, 유전영동 힘분광기법을 이용하여 단백질이 결합된 microsphere와 SiO2 결합력을 측정하였고, 또한 BSA의 구조를 변형시킬 수 있는 이황화결합 분해 물질(disulfide reduction agent)을 사용하여 변형된 BSA가 부착된 microsphere와 SiO2 결합력을 측정할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 방법을 인체에 삽입되는 세라믹계열고분자물질의 단백질 흡착 정도 및 그 상호작용력을 판단할 수 있는 도구로써 응용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유전영동력을 이용하여 인공생체재료 및 혈청단백질 간 결합력을 측정하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 전극과 세라믹 고분자가 증착된 절연기판을 포함하는 미세유체칩을 제작하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 세라믹 고분자 표면에 챔버(camber)를 부착시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 챔버 내에 단백질이 결합된 마이크로스피어(microsphere)가 포함된 용액을 넣는 후 전압을 인가하는 단계; 및
(d) 현미경이 부착된 CCD 카메라 또는 CCD 고속 카메라로 세라믹 고분자와 단백질의 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(FU; unbinding force)을 구하는 단계를 포함하는, 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법을 제공한다.
본 발명은 유전영동 힘분광기를 사용하여 생체인공재료와 혈청단백질 간의 흡착력을 측정하고, 단백질의 변성 정도를 변화시킬 수 있는 이황화결합 분해효소의 반응시간 및 농도에 따른 결합력 비교함으로써 측정한 흡착력에 대하여 검증을 수행하였는 바, 본 발명에서 확립한 방법을 단백질 흡착과 연관된 생체재료 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 단백질 흡착력을 측정하기 위한 유전영동 힘분광 측정 모식도를 나타낸 도이다:
a: microscope의 objective lens를 chamber 표면에 초점을 맞춘 뒤, 이를 CCD camera로 촬영한 예시 및 모식도;
b) 유전영동힘 분광측정을 위해 사용되는 재료 모식도; 및
c) 사용된 전극구조사양 및 그 표면 위에서의 유전영동 힘(nDEP force)의 크기 및 그 힘의 방향(Cr-IDA에 1 Vp-p 인가).
도 2는 전극 위 다양한 종류의 microsphere의 움직임 관측 및 결과를 나타낸 도이다:
a: 전극 위에서 microsphere를 촬영한 사진;
b: 각 microsphere들의 촬영된 사진을 분석하여 궤적을 나타낸 예시; 및
c: 해당 microsphere의 궤적들을 분석하여 중심점으로부터 이동한 확률밀도 그래프.
도 3은 전극 너비(width) 및 간격(gap) 크기 변화에 따른 수평, 수직방향의 DEP force 변화를 관측한 도이다:
a: 개선된 chip; 및
b: 기존 유전영동힘분광기에서 사용된 전극 chip.
도 4는 유전영동기술을 이용한 단백질 흡착력 측정방법을 검증한 도이다:
a: 이황화결합 분해물질들에 의한 BSA-microsphere/SiO2 흡착력 변화;
b: 이황화결합 분해효소와의 반응시간에 의한 BSA-microsphere/SiO2 흡착력 변화; 및
c: 이황화결합 분해효소의 농도에 의한 BSA-microsphere/SiO2 흡착력 변화.
도 5는 유전영동기술을 이용한 단백질 흡착력 측정방법의 유용성을 검증한 도이다:
a: BSA-microsphere/SiO2 단일 흡착력 분석; 및
b: 분석된 단일 흡착력으로부터 파생되는 흡착력에 참여하는 BSA 입자 수 추정.
도 6은 DTT 반응 농도에 따른 free-BSA의 흡광도 변화 관측 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 전극과 세라믹 고분자가 증착된 절연기판을 포함하는 미세유체칩을 제작하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 세라믹 고분자 표면에 챔버(camber)를 부착시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 챔버 내에 단백질이 결합된 마이크로스피어(microsphere)가 포함된 용액을 넣는 후 전압을 인가하는 단계; 및 (d) 현미경이 부착된 CCD 카메라 또는 CCD 고속 카메라로 세라믹 고분자와 단백질의 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(FU; unbinding force)을 구하는 단계를 포함하는, 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법을 제공한다.
이어서, 상기에서 언급된 각 단계의 공정에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 이용되는 미세유체칩은 microfabrication 제작 과정을 통하여 다중선형전극(Interdigitated electrode)이 구현된 것이다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 이용되는 다중선형전극은 크롬(Cr) 또는 백금(Pt)으로 이루어진 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 크롬 전극을 사용할 경우 전극의 두께는 1 내지 2 kÅ 범위 내에 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 미세유체칩은 실리콘 위에 SiO2가 증착된 절연기판에 크롬 전극을 증착시키고, CVD(chemical vapor deposition) 공정을 이용하여 SiO2 등의 세라믹 고분자를 추가적으로 증착된 것으로, SiO2를 추가적으로 증착하지 않을 경우, 혈청 단백질이 직접적으로 전극과 접촉하게 되어, 단백질의 변성으로 인해 야기하므로, 인공생체재료 및 단백질 간 결합력을 특이적으로 측정할 수 없으므로, 크롬 전극을 증착한 후, 필수적으로 SiO2를 0.5 μm 내지 1 μm 증착시켜야 한다. 또한, 추가적으로 증착된 SiO2는 생체재료의 종류에 따라 CVD 및 ALD(atomic layer deposition)와 같은 공정을 통해 Al2O3, TiO2, Si3N4 등으로 치환될 수 있다. 한편, 상기 Al2O3, TiO2, Si3N4, SiO2는 세라믹 고분자 물질중의 하나로 인체 내에 삽입되는 의료용 기구 및 임플란트 재료로써 사용되는 물질이므로, Al2O3, TiO2, Si3N4, SiO2가 증착된 다양한 전열기판은 단백질과 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(a)에서 실리카 절연기판(wafer)을 사용할 경우 기판의 두께는 10 kÅ 이내에 범위에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며 전압 하강(voltage drop)을 초래하지 않고 시스템 균형을 유지할 수 있는 범위 내의 두께일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)의 챔버는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 제조될 수 있으며, PDMS와 PDMS 응고제를 8 내지 12 : 1의 비유로 혼합하여 제조되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(b)의 챔버는 유리 덮개를 구비하며, 이는 표면장력에 의한 빛의 산란과 용액의 증발을 방지하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)의 단백질은 알부민, 글로불린, 피브리노겐 및 트립신으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈청 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 (c)의 마이크로스피어는 polystyrene 마이크로스피어인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 마이크로스피어의 크기는 3 ㎛ 내지 8 ㎛ 이며, 전극의 넓이보다 작으면서 현미경 측정이 가능한 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 혈청 단백질과 마이크로스피어는 N-(3-dmethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)를 사용하여 공유결합된 것이 바람직하나, 마이크로스피어와 단백질을 결합시킬 수 있는 어떠한 방법을 사용하여도 무방하다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)에서 전압이 인가될 때, 다중선형전극(Interdigitated electrode)에 전압이 인가되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(c)는 현미경이 부착된 CCD 카메라 및 CCD 고속 카메라 중 어느 하나 이상을 구비하여, 마이크로스피어의 움직임을 관찰 또는 기록하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계 (d)의 인공생체재료는 세라믹고분자 물질로 임플란트, 인공관절, 인공무릎관절 및 골충전재로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 일 양태에서, 상기 단계(d)에서 현미경이 부착된 CCD 카메라 또는 CCD 고속 카메라로 세라믹 고분자와 단백질의 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 하기 수학식을 이용한 변환과정을 거쳐 파열 힘(FU; unbinding force)을 구할 수 있다.
Figure pat00001
상기 식에서,
εm은 매질의 유전율(permittivity)이며,
Re는 괄호({})안 분수의 실수부에 해당하며,
εp *은 복합체 소분자 유전율(complex particle permittivity)이며,
εm *은 복합체 배지 유전율(complex medium permittivity)이고,
r은 마이크로스피어 반지름(microsphere radius)이며,
E rms 는 유한요소 시뮬레이션(finite element simulation, COMSOL Multiphysics 3.5a)으로부터 얻은 전기장 프로파일(electric field profile).
따라서, 본 발명의 SiO2 등 세라믹 고분자가 증착된 다양한 전열기판은 혈청 단백질과 결합하므로, 유전영동 힘분광기법을 이용하여, 세라믹 고분자와 결합된 단백질의 흡착력 측정을 통해 단백질 흡착과 연관된 생체재료 연구에 유용한 정보를 제공할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 시료의 준비
본 연구에서 사용된 마이크로 유체칩은 microfabrication 제작과정을 통하여 interdigitated electrode 가 구현된 미세유체칩을 제작하였다.
구체적으로 사용된 wafer는 5 kÅ 두께로 산화된 silicon이 존재하는 상용제품(i-Nexus, Seongnam, Republic of Korea)을 이용하여 1 kÅ 두께의 chromium interdigitated electrode array (Cr-IEA) 증착시킨 뒤, High density plasma chemical vapor deposition (HDPCVD) 공정을 진행하여 8 kÅ두께의 SiO2를 증착을 진행하였다. BSA microsphere 가 포함된 용액을 전극 위에 담을 수 있는 chamber 제작을 위해 실리콘 고분자물질인 Polydimethylsiloxane(PDMS) 물질과 PDMS 응고제를 사용하였다. 사용된 BSA microsphere는 약 5 μm의 크기를 가졌으며, BSA를 N-(3-dmethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)를 사용하여 polystyrene microsphere와 공유결합으로 연결한 상용제품(micromod Partikeltechnologie GmbH, Rostock, Germany)을 사용하였다. Microsphere 표면 위에 BSA를 손상시키기 위하여 이황화분해효소 Thioredoxin(Trx) 와 Trx 기능을 유지시키는 Thioredoxin reductase, Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate(NADPH), 이러한 이황화분해효소의 작용을 검증하기 위해 이황화분해촉매제 Dithiothreitol(DTT) 를 Sigma-Aldrich 회사(St, Louis, MO)로부터 제공받아 사용하였다.
< 실시예 2> 유전영동 힘분광기법을 이용한 결합력 측정
본 발명의 결합력 측정 방법은 도 1에 나타내었다.
구체적으로 Solvent cleaning 과 piranha cleaning 및 plasma oxidation cleaning 과정을 거친 Cr-IEA 위 SiO2 표면에 PDMS와 PDMS 응고제를 10:1 비율로 혼합하여 만든 chamber를 붙인 뒤, BSA microsphere가 포함된 용액을 투입하고, 물의 표면장력으로 인한 빛의 산란과 용액의 증발을 방지하기 위해 cover glass를 덮었다. 용액내 불특정하게 분포되어 있는 microsphere가 중력에 의해 SiO2 표면 위로 가라앉을 때까지 기다린 후, Cr-IDA 에 function generator와 voltage amplifier 를 통하여 교류 전압을 인가하였으며, 인가된 전압의 크기는 oscilloscope로 측정하였다. 이때 microsphere의 움직임을 현미경에 부착된 Top-view CCD camera 및 High-speed CCD camera를 통해 top-view 방향에서 움직임을 관찰하였다. BSA-microsphere의 흡착강도가 강하여, 같은 교류전압에서 발생되는 유전영동힘을 증가시키기 위해 전극 폭 및 전극 사이 폭을 연구실에서 제작할 수 있는 한계까지 감소시켰다(electrode width: 20 μm, electrode gap width: 5 μm). 해당 전극에서의 1 Vp-p를 인가하였을 때, microsphere에 유도되는 유전영동 힘 및 이동방향에 대하여 도 1 c에 나타내었다.
한편, 변성된 구조를 가진 BSA가 부착된 microsphere를 만들기 위해, BSA가 부착된 microsphere들을 Trx-reductase (농도: 10 nM), NADPH (농도: 2 mM) 존재 하에 Trx 반응시간과 Trx 반응농도를 변화하며 반응시켰다(Trx 농도를 10 μM으로 고정하고 반응시간 (1, 2, 8, 12, 24 시간) 변화 또는 Trx 반응시간을 24 시간으로 고정하면서 반응농도(0.1, 1, 10 μM) 변화). 이후, 반응한 microsphere 용액을 100 kD의 Dialysis kit (Spectrum Labs, Rancho Dominguez, CA)를 사용하여 사용한 효소와 염을 microsphere로부터 제거하였다. 이러한 과정을 거친 microsphere을 유전영동힘분광기를 이용하여 변성된 BSA가 부착된 microsphere의 움직임을 관측하고 및 그 단백질 표면 흡착력을 분석하였다.
< 실험예 1> BSA의 표면 흡착 정도 변화 확인
silicon dioxide 표면 위에서 BSA가 부착된 microsphere (BSA-microsphere)의 흡착 유무를 확인하기 위하여, 유전영동실험전에 BSA-microsphere의 움직임을 관측하였다(도 2).
도 2a에 나타낸 바와 같이, 전극 위 사진(top-view)에서 microsphere의 위치를 Matlab software (Matlab 2017a)의 image processing toolbox 함수를 이용하여 분석하였다. 관측한 입자들의 종류는 약 5μm 크기의 carboxylated microsphere, BSA-microsphere, Trx 효소에 의해 변성된 BSA-microsphere 이며, 해당 입자들의 움직이는 궤적 예시는 도 2b와 같다. 궤적의 특징으로, Cleaning 된 SiO2 표면은 일반적으로 hydroxyl(-OH) group 가장 대두된 상황으로, carboxylated microsphere와 같이 표면에 음전하가 활성화되었을 경우 electrostatic repulsion 현상에 의해 SiO2 표면으로부터 자유롭게 움직일 수 있다. 반면 BSA-microsphere는 carboxylated microsphere와 다르게 매우 제한된(고정된) 궤적 형태를 보이는데, 이는 BSA가 SiO2 표면과 상호작용하여 흡착되었기 때문으로 생각할 수 있다. 특이한 점으로는 Trx 효소에 의해 변성된 BSA-microsphere의 경우, 그 움직임이 정상적인 BSA-microsphere와 다르게 움직임이 덜 제한된 것으로 확인되었는데, 정밀한 비교를 위하여 해당 궤적들을 도 2c 와 같이 확률 밀도 이동분포도로 나타내었다. 중심으로부터 매우 한정된(고정된) 움직임을 보이는 정상적인 BSA-microsphere와 다르게, 손상된 BSA-microsphere의 경우, 더 자유롭게 움직이는 것으로 확인되었다.
< 실험예 2> 이황화결합 분해효소의 반응시간 및 반응 농도에 따른 BSA 표면 흡착력 변화 확인
상기 <실험예 1>에서 관측한 각 microsphere들의 움직임에 따른 흡착력을 측정하기 위해 기존에 연구실에서 사용하던, 40 μm 전극폭, 10 μm 전극사이폭을 가지는 Cr-IDA를 이용하여 우선적으로 관측해보았지만, 연구실내 보유한 voltage amplifier를 사용해서 최대전압을 인가해주었음에도 불구하고, 유전영동힘으로 흡착된 BSA-microsphere를 분리시키지 못하였다. 따라서, BSA-microsphere에 더 큰 유전영동힘을 인가하기 위하여, 전극간격과 전극사이간격이 조밀한 Cr-IDA 위에서 BSA-microsphere의 흡착력 관측을 시도하였다.
유한요소해석 프로그램(Comsol Multiphysics)을 사용하여, 전극 중앙에서 BSA-microsphere에 유도되는 DEP force 크기를 확인하였는데 (그림 3), 시뮬레이션 결과에 따르면, 20 μm 전극폭, 5μm 전극사이폭 가지는 Cr-IDA 경우, 40 μm 전극폭, 10 μm 전극사이폭을 가지는 Cr-IDA 보다 전극중앙위치 (0 μm 해당)에서 수직 DEP force가 약 10 배 이상 증가함을 확인하였고, 또한 수평 DEP force의 경우 20배 증가하는 것을 확인하였는데, 이는 전압을 인가하여 전극 중앙으로 모이도록 하는 수평 DEP force 크기가 커짐으로써, 브라운 운동의 영향을 받는 미세입자를 더욱 잘 트랩 하여 이전에 사용했던 전극보다 vertical DEP force 측정이 용이할 수 있다는 장점이 예상된다. 따라서 더욱 강한 유전영동 힘을 인가시킬 수 있을 것으로 예상되는 Cr-IDA를 제작하여 BSA-microsphere의 흡착력을 관측해보았다. 관측결과, 그 흡착력은 본 연구실에서 관측할 수 있는 최대유전영동힘(186.39 nN) 보다 더 강력한 힘으로써, BSA가 SiO2 표면에 매우 강력하게 부착되어 있는 것으로 확인되었다.
따라서, 유전영동기술을 이용하여 인공생체재료에 흡착된 단백질의 흡착력을 측정가능 여부를 확인하기 위하여, BSA의 표면구조를 일부 변성시키는 대안이 제기되었고, 이에 따라 BSA의 표면구조를 변성시킬 수 있는 이황화결합 분해효소인 Trx를 사용하여, BSA-microsphere를 반응시킨 후, 흡착력 변화 유무를 확인하였다. 이황화결합 분해효소의 작용을 검증하기 위하여, 이황화결합 분해촉매제인 DTT를 사용하여 흡착력 변화 유무를 재확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 <실험예 1>에서 관측한 움직임 양상과 동일하게, 충분한 시간과 이황화결합 분해효소 또는 그 분해촉매제가 존재할 경우, BSA-microsphere의 흡착력이 감소되는 것을 확인하였다(도 4a). 이러한 경향이 분해촉매효소에 의존적인지 확인하기 위하여, BSA-microsphere와 이황화결합 분해효소(Trx)와의 반응시간에 따른 SiO2와의 흡착력 변화와 이황화결합 분해효소(Trx)의 농도를 조절하여 SiO2와의 흡착력 변화를 관측하는 실험을 진행하였다. 실험결과, 반응하는 시간이 감소 및 반응하는 농도 감소에 의존하여 BSA-microsphere와 SiO2 표면의 흡착력(BSA-microsphere/SiO2 흡착력)이 빠르게 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 흡착력의 균일한 정도가 차이가 발생하는 것도 목격하였다(도 4 b, c) 따라서, BSA-micropshere와 SiO2 표면 사이에 형성되는 흡착력은 이황화결합 분해효소에 의존적으로 변화하는 것으로 판단할 수 있으므로, 유전영동 힘분광기를 사용하여 이러한 세라믹고분자물질 표면 위에서 단백질의 흡착 정도 와 그 흡착력을 관측할 수 있음을 확인하였다.
< 실험예 3> 이황화결합 분해효소 투여 후 표면 흡착에 참여하는 BSA 입자수 분석
이황화분해효소와 충분한 반응기회를 가지는 microsphere의 경우 그 결합력이 약 2 pN 정도로 매우 약한 결합력을 가지고 있기 때문에, 변성된 BSA는 SiO2 표면 위에 흡착하지 않는다고 가정하면, BSA-microsphere 표면 위에 변성되는 BSA 비율에 따라서 그 흡착력이 변화된다고 가정할 수 있다. 즉, 유전영동 힘분광기로 측정한 BSA-microsphere/SiO2 흡착력은 정상적인 BSA들에 의해서 의존적으로 변화한다고 볼 수 있다. 이러한 가정을 확인하기 위하여, 하기 수학식의 Poisson statistics 이론에 근거한, 이황화결합 분해효소의 농도에 의한 BSA-microsphere/SiO2 흡착력 변화실험에서 관측한 평균 흡착력 및 표준편차를 사용하여 SiO2 표면 위에서의 BSA-microsphere의 단일 흡착력을 분석하였다(도 5a).
[포아송 통계분석방법]
m = nF, σ= nF2
F = σ 2 / m
상기 식에서 F는 결합력이고,
m 은 파열 힘(FU)의 평균이며,
σ 2 은 표준편차의 제곱(variance)임
분석결과, 다양한 농도조건 및 측정된 흡착력이 혼재됨에도 불구하고, 관측값 대비 선형회귀분성방법에 의하여 피팅된 기울기(이는 곧 단일 흡착력을 의미)는 매우 높은 신뢰도 (R2=0.97)를 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 단일겹합력을 이용하여, 유전영동힘분광기로 측정한 흡착력(도 4c)에 나눠줄 경우, 흡착력에 관여하는 BSA의 수를 추정할 수 있게 된다(도 5b).
이러한 분석방법의 신뢰도를 높이기 위하여, BSA-microsphere 을 제조한 회사로부터 제공받은 자료에 근거하여 microsphere 표면에 붙어있는 BSA 입자 수 및, SiO2 표면과 반응하는 BSA의 입자 수에 대하여 하기 수학식을 이용하여 계산하였으며 그 결과를 표 1에 나타내었다(표 1).
Figure pat00002
여기서, r은 microsphere의 반지름이고, L은 표면에 붙어있는 BSA의 크기(물(H2O)안에서 존재하는 BSA의 크기는 약 3.80 nm.
Figure pat00003
계산 결과, 5 μm 크기의 microsphere가 SiO2 표면과 반응하는 접촉면적(contact area)는 약 5.96 ×10- 14 이며, 해당 접촉면적에 존재하는 BSA 입자수는 약 206 개로 추정된다. 이는 Poisson statistics 이론에 근거하여 분석되는 단백질 단일 흡착력에 의해서 추정되는 정상적인 BSA 수보다 높으며, 이러한 추정치들의 비교는 측정된 BSA 수보다, 계산에 근거한 접촉면적에서의 BSA수가 훨씬 많으며, 이에 따라 흡착력이 매우 강하므로, 정상적인 BSA-microsphere의 SiO2 표면과의 흡착력은 유전영동 힘분광기의 측정 최대범위를 증가시키면 관측할 수 있음을 확인하였다.
충분한 반응시간(24시간)이 주어진 상황에서 DTT 농도에 따라서 변하는 BSA의 흡광도는 280 nm 파장대역에서 증가하는 것으로 확인되었는데, 이는 소수성을 띄는 방향족 아미노산계열(트립토판, 타이로신)에서 관측되는 파장대역으로, DTT 에 의하여 BSA의 이황화결합의 분해 될시, 표면에 방향족 아미노산 계열이 드러난다고 판단 할 수 있다. 만약, SiO2가 소수성을 띈다면 소수성 상호작용에 의하여, 변성된 BSA-microsphere/SiO2 흡착력이 증가할테지만, cleaning 된 SiO2는 일반적으로 hydroxyl 작용기가 우세한 표면으로, 친수성을 띄기 때문에, 소수성상호결합을 형성하지 못한다. 따라서, 변성된 BSA 표면이 소수성을 띄는 만큼, 친수성기가 감소하므로, SiO2 표면과의 흡착력이 감소되는 측정결과를 뒷받침하는 근거결과로 여겨질 수 있다.

Claims (12)

  1. (a) 전극과 세라믹 고분자가 증착된 절연기판을 포함하는 미세유체칩을 제작하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 세라믹 고분자 표면에 챔버(camber)를 부착시키는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)의 챔버 내에 단백질이 결합된 마이크로스피어(microsphere)가 포함된 용액을 넣는 후 전압을 인가하는 단계; 및
    (d) 현미경이 부착된 CCD 카메라 또는 CCD 고속 카메라로 세라믹 고분자와 단백질의 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(FU; unbinding force)을 구하는 단계를 포함하는, 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계(a)의 미세유체칩은 다중선형전극(Interdigitated electrode)이 구현된 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 단계(a)의 미세유체칩은 SiO2가 증착된 절연기판에 전극 및 세라믹 고분자가 순차적으로 증착된 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 단계(a)의 세라믹 고분자는 Al2O3, TiO2, Si3N4 및 SiO2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 단계(b)의 챔버는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 제조되는 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단계(b)의 챔버는 유리 덮개(cover glass)가 구비된 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계(c)의 단백질은 알부민, 글로불린, 피브리노겐 및 트립신으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계(c)의 마이크로스피어의 크기는 3 ㎛ 내지 8 ㎛ 인 것을 특징으로 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단계(c)의 전압을 인가하는 단계는 다중선형전극(Interdigitated electrode)에 전압이 인가되는 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (d)의 인공생체재료는 세라믹 고분자인 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 인공생체재료는 임플란트, 인공관절, 인공무릎관절 및 골충전재로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (d)의 변환과정 하기 [수학식 1]을 이용하여 파열힘을 구하는 것을 특징으로 하는 인공생체재료 및 단백질 간 결합력 측정 방법:
    [수학식 1]
    Figure pat00004

    상기 식에서,
    εm은 매질의 유전율(permittivity)이며,
    Re는 괄호({})안 분수의 실수부에 해당하며,
    εp *은 복합체 소분자 유전율(complex particle permittivity)이며,
    εm *은 복합체 배지 유전율(complex medium permittivity)이고,
    r은 마이크로스피어 지름(microsphere radius)이며,
    E rms 는 유한요소 시뮬레이션(finite element simulation, COMSOL Multiphysics 3.5a)으로부터 얻은 전기장 프로파일(electric field profile).
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