KR20130038832A - 신경 질환의 예후를 위한 ｈｍｇｂ1 및 항-ｈｍｇｂ1 항체 - Google Patents

신경 질환의 예후를 위한 ｈｍｇｂ1 및 항-ｈｍｇｂ1 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자로부터 얻은 샘플, 특히 혈청 샘플 또는 뇌척수액 샘플에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 시험관내 방법, 및 신경 질환의 예후 및/또는 진단에서 이러한 방법의 용도에 관한 것이다. 이들 방법은 특히 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체의 인간 면역결핍성 바이러스(HIV) 감염 모니터링에 적용할 수 있고, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태, 특히 AIDS와 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 그로의 진행 상태의 예후 및/또는 진단에 적용할 수 있다. 마지막으로, 본 발명은 또한 환자, 특히 HIV 감염 환자의 면역 결핍 또는 면역 활성화도를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

신경 질환의 예후를 위한 ＨＭＧＢ1 및 항-ＨＭＧＢ1 항체{HMGB1 AND ANTI-HMGB1 ANTIBODIES FOR THE PROGNOSTIC OF NEUROLOGICAL DISORDERS}
본 출원은 생물학적 샘플, 특히 혈청 및 뇌척수액(CSF) 내 단백질 HMGB1 또는 HBGB1에 특이적인 항체의 정량, 및 신경 질환 특히 HIV 감염과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 그러한 신경 질환으로의 진행 상태의 예후 방법 및 진단 방법과 그들의 개별적 상관성에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질 HMGB1 또는 HMGB1에 특이적인 항체와, HIV 감염의 모니터링 또는 바이러스 존재량(viral load) 및 AIDS의 진행 상태의 예후 방법의 상관성에 관한 것이다.
감염 직후, HIV-1은 뇌로 침투될 수 있고, 결국 중추 신경계(CNS)에서 HIV-1 관련 합병증을 일으키게 된다. HIV와 관련된 치매(HAD)는 발병 6개월 내에 발작, 혼수 및 사망을 초래하는 운동 및 행동 이상을 임상적 특징으로 한다. HAD와 병리적으로 상관있는, HIV-뇌염은 광범위한 성상교세포증, 산화 스트레스, 사이토카인/케모카인 이상조절, 및 신경세포 퇴행을 특징으로 한다(Gonzalez-Scarano and Martin-Garcia, Nat Rev Immunol 2005, 5: 69-81 ). 뉴런이 HIV에 의해 감염되지 않으므로, 현재는 이들 세포가 활성화된 교질 세포에 의해 방출된 향염증성 케모카인에 의해 간접적으로 손상된다고 생각된다. IP-10(CXCL10)는 성상세포에서 상향조절되되는 신경독성 케모카인이고 레트로바이러스 감염을 증가시키고 신경세포 손상을 매개한다고 제안된 바 있다. CSF에서 IP-10의 상승이 HIV 감염에서 보고되었고, 그 수치는 CSF의 HIV 바이러스 존재량과 상호관련있다(Cinque P et al. J Neuroimmunol 2005, 168:154). 또한 진행성 HIV 감염을 앓는 HAART-경험 코호트에서 HAD의 발병과 CSF 대식세포 화학주성 단백질 1(MCP-1 또는 CCL2) 간의 가능한 연관성이 보고되었다(Sevigny JJ, Albert SM, McDermott MP; et al. Neurology. 2004;63:2084). 다른 연구에서는 혈장 MCP-1 수치와 HIV 관련 치매간 연관성이 보고되었다(Sevigny et al. Arch. Neurol. 2007, 64:97).
HMGB1(high mobility group box 1) 단백질은 활성화된 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 또는 다른 세포, 예컨대 NK 세포로부터 활발하게 분비되는 경우 강력한 향염증성 사이토카인으로 작용하는 비히스톤 염색체 단백질이다. HMGB1 염증, 염증 세포 유인, 및 조직 회복, 줄기 세포 동원 및 그들 증식 촉진의 촉발인자로서 작용한다. 또한 HMGB1은 수지상 세포(DC)를 활성화시키고 그들의 기능성 성숙화 및 림프절 케모카인에 대한 반응을 촉진시킨다. 활성화된 백혈구는 미세환경에서 HMGB1을 활발하게 분비한다. 따라서, HMGB1은 자가분비/주변분비 방식으로 작용하며 장기간 회복을 지속시키고 프로그램을 방어한다(Bianchi and Manfredi, 2007; Lotze and Tracey, 2005).
최근의 연구들에서, HMGB1은 HIV에 감염된 DC에서 HIV-복제를 촉발시켜서, DC 내 바이러스 병원소 형성의 한 원인이 되는 것으로 확인되었다(Saidi H, Melki M-T, Gougeon M-L, PLoS One 2008). DC가 점막 감염의 처음 수시간 동안 HIV의 제1 표적이고, 이어서 HIV가 T 세포로 전염되는 2차 림프 기관으로 이동하게 되므로, 이러한 발견은 바이러스 복제의 촉발 및 바이러스 병원소의 보충에 있어 HMGB1의 생체내 관여 여부에 대한 물음을 제기한다. HMGB1은 역시 NK 사멸에 대해 HIV에 감염된 DC가 내성을 갖게되는, HIV에 감염된 DC와 활성화된 NK 세포간 교차-작용 동안 생산된다. DC 생존은 HMGB1에 의해 유도되는 프로세스인, 감염된 DC에서 2종의 아폽토시스 억제제, C-IAP2 및 c-FLIP의 상향조절과 연관있다(Melki M-T et al. PLoS Pathogens 2010, 6 (4) e1000862). 특이적 억제제, 예컨대 글리시리진 또는 차단 항체에 의한 HMGB1 활성 차단은 감염된 DC에서 HIV 복제를 제거시켰고(Saidi H, Melki M-T, Gougeon M-L, PLoS One 2008), NK 사멸에 대한 감염된 DC의 감응성을 회복시켰다(Melki M-T et al. PLoS Pathogens 2010, 6(4) e1000862). 이러한 발견들은 바이러스 전파를 촉진하고 장기간 병원소의 생존능을 유지하기 위해 어떻게 HIV가 DC를 이용하는지에 대한 새로운 통찰력을 제공하며, 특허 출원 PCT/EP2009/06828의 목적이다.
이러한 발견은 또한 바이러스 복제의 촉발 및 바이러스 병원소의 보충에 있어서 HMGB1의 생체내 관여 여부에 대한 물음을 제기한다. 이러한 물음에 답하기 위해, HIV 감염 환자에서 유래하는 혈청 내 HMGB1 수치를 정량하여(Elisa, Shino 검사법, IBL) 혈장 HIV 바이러스 존재량 및 질환 진화에 대한 순환 HMGB1의 생체내 기여를 평가하였다 또한, HMGB1에 특이적인 자가 항체가 자가 면역 질환, 예컨대 SLE(루푸스)에서 발견될 수 있다는 점을 고려하여(Hayashi et al., 2009), HIV 감염 환자에서 유래된 혈청 내 항-HMGB1 특이적 항체가 HIV 질환에서 검출되는지 여부를 검토하기 위한 특이적 ELISA 어세이가 개발되었다.
환자 혈청 내 HMGB1 및 항-HMGB1 항체 둘 모두의 측정은 특허 출원 PCT/EP2009/06828에 보고되었다. 이하의 결론이 도출되었다:
(i) 만성 HIV 감염은 이어서 중화 항체의 생성을 유도하는, 감염된 환자 유래 혈청 내에서 높은 수치로 검출되는, HMGB1의 생성을 촉발시킨다;
(ii) HMGB1 및 항-HMGB1 항체(Ab) 간에 역상관성이 검출되고, 이는 HMGB1이 항체에 결합되면, 더 이상 혈청 샘플에서 검출되지 않음을 의미한다;
(iii) 혈청 내에 항-HMGB1 항체가 많을수록(초기에 보다 많은 HMGB1이 생성되었음을 의미), CD4 T 세포는 적으며, 이는 혈청 항-HMGB1 항체의 높은 수치는 질환 진화와 연관됨을 시시한다;
(iv) 강력한 항-레트로바이러스 요법(HAART)은 HMGB1 및 항-HMGB1 항체 둘 모두의 혈청 수치를 저하시키고 이들을 기본 수치 이하로 정상화시킬 수 있다.
특허 출원 PCT/EP2009/06828은 또한 혈청 내 항-HMGB1 항체가 많을수록, 혈청 바이러스 존재량이 적다는 가설을 만들었다. 그러나, 이러한 가설은 보다 큰 환자 코호트 및 철저한 실험 분석의 수행을 통해 검증되지 않았다. 또한, 특허 출원 PCT/EP2009/06828에 개시된 항-HMGB1 항체 및 혈청 바이러스 존재량 간에 확립된 상관성은 미치료 환자 및 치료 환자(바이러스 존재량에 영향을 주는 치료) 둘 모두를 포함하는 환자 코호트에서 유도된 결과에 대한 부적절한 통계적 분석에 의한 것으로 추가 확인되었다.
도 1: HIV 감염 환자 유래 CSF에서 HMGB1 및 항-HMGB1 항체 검출. A-좌측 패널. HMGB1 수치는 10명의 건강한 기증자(HD) 및 23명의 신경질환이 있는 HIV-1 감염 환자 유래 CSF에서 Elisa(Shino 검사법, IBL)를 통해 정량하였다. 상자-수염 그래프는 2개 그룹 CSF HMGB1 수치의 평균±SD로 나타냈다(검출 한계치 0.25 ng/㎖)[HD의 0.5 ng/㎖(범위 0.25-1.47) vs 환자에서 1.67 ng/㎖(범위 0.25-15.9)]. A-우측 패널. HIV 감염 환자는 신경 질환 중증도에 따라 2기 내지 3기로 계층화하였고, CSF는 3기 및 4기 환자에서만 얻었다. HMGB1은 HD에 비해 3기 환자의 CSF에서 높은 수치로 검출되었으나, 수치 가변성 때문에, 양쪽 그룹으로부터의 HD 미치 환자 간 차이가 통계적으로 유의하지 않았다. B-좌측 패널. 항-HMGB1 Ab 수치는 10명의 건강한 기증자(HD) 및 23명의 신경 질환이 있는 HIV-1 감염 환자 유래의 CSF에서 Elisa로 정량하였다. 상자-수염 그래프는 CSF 항-HMGB1 수치의 평균±SD로 표시하였다(평균값 및 범위값을 상자 위에 표시하였다). 유의차의 p 값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법). B-우측 패널. 3기(n=12) 및 4기(n=11) 환자의 CSF를 항-HMGB1 Ab에 대해 검사하고 HD(n=10)와 비교하였다. 상자-수염 그래프는 항-HMGB1 수치의 평균±SD로 나타냈다. 유의차의 p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법).
도 2: CSF 내 HMGB1 및 항-HMGB1 항체에 대한 바이러스 존재량의 영향. A-환자는 CSF 바이러스 존재량(VL)에 따라 2개 그룹으로 계층화하였다: 미검출(즉, < 40 복제수/㎖) 및 양성(VL> 40 복제수/㎖). 평균값은 각 상자 위에 표시하였다. HMGB1와 항-HMGB1 수치를 이들 2개 그룹 간에 비교하고 p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법). B- HMGB1 또는 항-HMGB1 항체의 CSF 수치 및 CSF Log VL간 스페어만(Spearman) 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다. C: 혈장 VL 및 CSF HMGB1 수치(좌측 패널) 또는 CSF VL(우측 패널)의 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 3: 질환 진화와 CSF 내 항-HMGB1 항체의 상관성. A- 주변 CD4 T 세포수는 질환 진화와 관련있다. 환자는 그 혈액 CD4 T 세포수에 따라 3개 그룹으로 계측하였고, HMGB1 및 항-HMGB1 항체 수치를 3개 그룹 간에 비교하고, p값(비모수 만-위트니 검정법)을 기록하였다. B- HMGB1 또는 항-HMGB1 Ab의 CSF 수치 및 CD4 T 세포수 간 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 4: CSF HMGB1 및 항-HMGBI 항체 수치와 면역 활성화의 상관관계. A- CSF VL, % T CD8+ HLA-DR+ 및 T CD8+ CD38+는 그들의 CD4 T 세포수에 따라 계층화한 3개 그룹 간에 비교하였고, p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법). B- CSF 또는 혈청 VL 및 the % of CD8+ CD38+ T 세포 또는 CD8+ HLA-DR+ T 세포의 % 간 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다. 상위 패널: CSF 항-HMGB1 항체 및CD4+ HLA-DR+ T 세포의 %, 또는 CD8+ HLA-DR+ T 세포의 %간 스페어만 상관성. 하위 패널: CSF HMGB1 및 % CD8+ HLA-DR+ T 세포 간 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 5: 3기 환자 및 4기 환자의 CSF에서 24 사이토카인 및 케모카인의 정량. 24 사이토카인 및 케모카인의 패널은 HD, 3기 및 4기 환자의 CSF에서 MAP 방법(Luminex)에 따라 정량하였다. 상자-수염 그래프는 케모카인 패널의 평균±SD로 표시했다. 오직 IP-10 및 MCP-1이 유의한 수준으로 검출되었고, 환자 및 HD 간 통계적 비교를 위해 p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법).
도 6: CSF IP-10 및 MCP-1 수치와 CSF 바이러스 존재량 및 질환 진화의 상관관계.- CSF IP-10 및 CSF VL, % T CD8+CD38+ 및 % CD8+ HLA-DR+ 간 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다. B, C- CSF MCP-1 및 혈액 CD4 T 세포수, % CD8+CD38+ T 세포(B) 및 CSF IL-10(C) 간 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 7: 3기 및 4기 환자에서 CSF IP-10 및 MCP-1와 항-HMGB1 항체의 상관관계. A- 3기 또는 4기 환자 및 HD에서의 상대적인 IP-10(상위 패널) 및 MCP1(하위 패널) 수치. 평균값을 도면 아래에 표시하였고, 환자와 HD 간 통계 비교를 위해 p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법). B- CSF 항-HMGB1 항체 및 CSF IP-10 또는 CSF MCP1 간 스페어만 상관성을 도시하였다. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 8: 2기에서의 혈청 항-HMGB1 항체 수치와 혈장 VL의 상관관계. A- 1기(n=33, 신경질환 없음), 2기(n=41, 경증 신경질환), 3기(n=17) 및 4기(n=13)의 HIV 환자에서 상대적인 혈청 HMGB1(좌측 패널) 및 항-HMGB1 항체(우측 패널) 수치. 환자 그룹 간 통계적 비교를 위해 p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법). B- 환자를 CSF VL에 따라 2개 그룹으로 계층화시켰다: 미검출(즉, <40 cp/㎖, n=55) 및 양성(VL<40 cp/㎖, n=28). 항-HMGB1 Ab 및 CD4 T 세포수를 이들 2개 그룹간에 비교하였고 p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법). C- 환자를 x 축에 표시된 대로 VL에 따라 계층화하였다. 항-HMGB1 항체 및 HMGB1 수치(상위 좌측 및 하위 패널)를 각 그룹 간에 비교하였고 p값을 기록하였다(비모수 만-위트니 검정법). 상위 우측 패널은 105명 환자 상에서 항-HMGB1 항체 및 혈청 VL의 스페어만 상관성을 보여준다. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 9: 혈청 항-HMGB1 항체 수치와 IP-10간 상관관계. A- 106명 환자 유래 혈성에서 항-HMGB1 항체 수치 및 IP-10(좌측 패널) 또는 HMGB1(우측 패널)의 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다. B- 각각 105명 및 86명 유래 혈청에서 IP-10 및 CD4 T 세포수(좌측 패널) 또는 % T CD8+ HLA-DR+(우측 패널)의 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 10: HAART한 VL의 억제는 CSF 항-CSF 항-HMGB1, HMGB1, IP-10, MCP-1 및 면역 활성화와 관련된다. 환자는 HAART를 받았거나 항레트로바이러스 요법을 받지 않았다는 사실에 따라 계층화시켰다. 바이러스 존재량(VL), HMGB1, 항-HMGB1 항체(Abs)의 평균값(A), CD8+CD38+ 및 CD8+HLA-DR+ 세포의 백분율(B), 및 IP-10 및 MCP1의 수치(C)를 2개 그룹 간에 비교하였다(비모수 만-위트니 검정법). p값을 기록하였다.
도 11: 바이러스 존재량이 억제된 환자 유래의 CSF 내 HMGB1, 항-HMGB1, IP-10 및 MCP1의 지속성. HMGB1, 항-HMGB1, IP-10 및 MCP1 수치는 VL<40 cp/㎖인 66명 환자 및 10명의 건강한 기증자(HD)의 CSf에서 비교하였다. 중앙값(25%-75% 백분위수)을 도시하였다. 통계 비교는 비모수 만-위트니 검정법으로 수행하였고, p값을 기록하였다.
도 12: 신경 질환은 VL이 억제된 환자에서 높은 수치의 혈청 항-HMGB1 Ab와 관련된다. 항-HMGBI 항체(Ab) 및 HMGB1의 수치를 상이한 신경 병기(A) 간 또는 2기, 3기 및 4기(n=45) 및 1기 환자(n=21)(B) 간에 비교하였고, 이들 모두는 VL<40 cp/㎖로 나타났다. 평균값을 도시하였고 통계 비교는 비모수 만-위트니 검정법으로 하였으며, p값을 기록하였다. C- B와의 동일 비교(1기 환자 대 2기, 3기 및 4기 환자)를 표시된 매개변수에 대해 수행하였다. 임의의 이들 매개변수에 대해 어떠한 통계차도 존재하지 않았다.
도 13: 2기, 3기 및 4기이고 바이러스 존재량이 억제된 환자에서 항-HMGB1, MCP1, IP-10 및 면역 활성화의 상관관계. A,B,C: 2기, 3기 및 4기이고 VL<40 cp/㎖인 45명 HIV+ 환자에서 표시된 매개변수간 스페어만 상관성. 상관계수(r) 및 p값을 기록하였다.
도 14: 실험에 포함된 환자의 임상 및 면역학적 매개변수. HIV-피험체는 CD4 세포 계측수 및 바이러스 존재량에 무관하게, 18세 이상의 피험체 중에서 무작위 선택하였다. 배제 기준은 이전의 HAND 진단, 활성 기회 감염, 임의의 신경 질환 병력이었다. HAND는 본문에 언급된 바와 같이 정의하였다. HMGB1, 항-HMGB1, IP10 및 MCP1은 본원에 기술된 대로 정량하였다. p값은 만-위트니 검정법으로 정하였다. P<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
도 15: HAND 및 무 HAND 환자는 상당한 임상적 및 바이러스학적 매개변수를보였다. 각 환자에 대해 표시된 마커(내포시 CD4 계측, 최저 CD4, 혈장 HIV-RNA, HIV-DNA, 활성화 마커)를 기록하고 수량화하였다. 이들 마커는 HAND가 있는 환자 및 HAND가 없는 환자에서 비교하였다. 임의의 마커에 대해 유의차가 검출되지 않았다(만-위트니 검정법).
도 16: HMGB1 및 항-HMGB1 수치는 바이러스혈증 또는 무바이러스혈증 HAND 및 무 HAND 환자에서 유의하게 다르다. HMGB1 및 항-HMGB1 혈청 수치는 본원에 기술된 방법에 따라 모든 환자에 대해 정량하였다. 그 수치는 바이러스 존재량에 무관하게 HAND 및 무 HAND 환자 간에 비교하거나, 또는 오직 바이러스혈증 또는 무바이러스혈증 환자만을 고려하였다. 통계 분석은 만-위트너 검정법을 사용해 수행하였다. P<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
도 17: IP-10의 혈청 수치는 면역 활성화, MCP1, 항-HMGB1 및 최저 CD4와 상관관계가 있다. 혈청 IP10 수치 및 표시한 면역 매개변수간 상관성을 도시하였다. 스페어만 상관 검정법을 사용하였다. P<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
도 18: MCP-1의 혈청 수치는 면역 활성화, IP-10, HMGB1 및 최저 CD4는 상관관계가 있다. 혈청 MCP1 수치 및 표시된 면역 매개변수간 상관성을 도시하였다. 스페어만 상관 검정법을 사용하였다. P<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
도 19: HAND가 있는 환자에서 기저핵 용적 변화 및 대사 변화와의 상관관계. 기저핵(BG) 용적 변화 및 Cho/NAA 비율은 명세서에 기술된 대로, MRI로 측정하였다. HAND가 있는 환자는 BG의 MRI-분광계 상에서 보다 큰 피각(1 이하의 야코비값(Jacobian value))(A) 및 높은 Cho/NAA 비율을 가졌다(B). 보다 큰 용적의 피각은 높은 Cho/NAA 값(p=0.02)과 상호관련된다(C).
도 20: 신경 손상(Cho/NAA 비율)은 항-HMGB1 Ab 및 IP10 수치와 상관관계가 있다. 높은 면역 활성화(% CD8+CD38+HLA-DR+ T 세포), 및 높은 수치의 항-HMGB1 Ab 및 IP10은 높은 Cho/NAA 값과 상관있다. 통계 분석은 만-위트니 검정법을 사용해 수행하였다. P<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
본 발명은 HIV 감염을 모니터링하고, 일부 경우에서는 바이러스 존재량을 모니터링하는, HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 정량을 기초로 하는 방법의 문제와, AIDS 및 AIDS 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환 발병의 예후 방법에서 그리고 HIV 감염 환자의 진단 방법에서 HMGB1, 항-HMGB1 항체, 및 케모카인의 가능한 영향에 대한 문제를 해결한다. 보다 일반적으로, 본 발명은 또한 HMGB1, 항-HMGB1 항체 및 경우에 따라 케모카인의 정량을 기초로 하는 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태에 대한 예후 방법 및 진단 방법에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 또한 항-HMGB1 항체, 및 경우에 따라 케모카인의 정량을 기초로, HMGB1이 관여하는 것으로 보이는(예를 들면, HMGB1 수치가 건강한 환자 또는 건강한 개체군의 HMGB1 수치보다 높은) 질환 또는 질병의 진행 상태에 대한 시험관내 예후 방법에 관한 것이다.
HMGB1은 핵에 존재하는 잘 알려진 단백질이고 또한 사이토카인으로도 알려져 있다. HMGB1의 물리적 기능적 특징은 문헌 [Lotze, et al., Nature Reviews, Immunology 5:351 (2005)]에 개시되어 있으며, 이를 참조하여 본원에 편입시킨다.
HMGB1에 결합하는 항체가 알려져 있고 당분야에 공지된 방법으로 생성시킬수 있다. 시판되는 항-HMGB1 항체는 인간 HMGB1의 잔기 150부터 C-말단에 이르는 부분에서 유도된 KLH-접합 합성 펩티드에 대해 생성시킨 인간 HMGB1에 대한 토끼 1차 폴리클론 항체이다(Abeam ref. 18256)이들 방법은 HMGB1에 대한 폴리클론 항체 및 HMGB1 또는 HMGB1의 특이적 단편에 대한 모노클론 항체를 생성하는 방법들을 포함한다. 치료 용도로 사용되는 항체는 차단하는 특징을 갖는데, 예를 들면 특히 감염된 수지상 세포 내에서 HMGB1-유도 HIV 복제를 방해한다. 이들 항체는 바람직하게 그들이 투여되고 인지되는 피험체와 동일한 종에서 유도되거나 또는 투여되는 동일 종의 HMGB1에 대해 유도된다. 이들 항체는 상이한 이소타입, 예컨대 IgA, IgG 또는 IgM 이소타입을 가질 수 있다. HMGB1에 결합하는 항체 단편도 사용할 수 있고, Fab, Fab2, 및 단쇄 항체 또는 그들의 단편을 포함한다.
본 발명은 피험체로부터 얻은, 뇌척수액 샘플에 함유된 HMGB1에 특이적인 항체, 특히 전체 항체를 정량하기 위한 시험관내 방법에 대한 것으로서, 이 방법은 (a) 정량하려는 항체가 전체 항체인 경우, 샘플에 존재하는 HMGB1을 포함하는 면역 복합체가 해리되도록 뇌척수액 샘플을 산 처리, 바람직하게는 낮은 pH에서 1.5 M 글리신으로 처리하는 단계; (b) 임의의 경우에서 상기, 경우에 따라 처리된, 생물학적 샘플을 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및 (c) HMGb1에 특이적인 항체, 특히 전체 항체를 정량하는 단계를 포함한다.
표현 "뇌척수액" 또는 "CSP"는 지주막하강 및 뇌 주변과 내부의 뇌실계를 차지하고 있는 유체를 의미한다. CSF는 거미막과 연뇌막 사이를 차지하고 있다. 이는 뇌내실, 뇌수조, 및 대뇌구와 척수 중심관의 내용물을 포함한다. CSF는 일반적으로 요추 천자에 의해 얻는다.
바람직한 구체예에서, 산 처리는 항체의 결합능을 변화시키지 않으면서, 뇌척수액 샘플 내에서 면역적으로 결합되어 있는 항체로부터 HMGB1 단백질을 분리하기 위해 선택된, 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3의 산성 해리 용액과 뇌척수액 샘플을 접촉시키는 것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 산성 해리 용액은 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3(예를 들면, 1.85)의 글리신(예를 들면, 1.5 M)이다. 산 처리를 이어서 중화 용액(예컨대 Tris, 예를 들면 1.5 M Tris, pH 9)를 사용해 중지한다. 다른 바람직한 구체예에서, 이전의 것과 조합하거나 또는 조합하지 않고, 산성 해리 용액과의 항온반응을 20 내지 37℃, 바람직하게는 25℃의 온도에서 수행하고/하거나, 중화 단계는 얼음에서 수행한다.
본원에서, 용어 "정량하는(quantitating)"은 용어 "수량화하는(quantifying)" 및 HMGB1 단백질 또는 특이적 항체에 대한 임의의 적절한 유용한 측정을 포함한다.
"순환하는(circulating)"이란, 샘플, 특히 혈청 또는 CSF에 존재하는 잔류 항체, 특 비-복합체 형태(단백질 HMGB와의)로 존재하는 항체를 의미한다. 용어 "순환하는"은 또한 처리없이 정량된 잔류 HMGB1 단백질에 적용된다.
"전체(total)"란, 순환 항체 및 면역학적 복합 항체의 총합 또는 조합량을 의미한다.
CSF에서 구현되고 본원에 개시된 모든 방법들은 유사하게, 즉 다른 생물학적 샘플, 및 특히 혈청, 혈액, 혈장, 타액 또는 조직에 대해 비슷하게 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 또한 HIV에 감염된 피험체로부터 얻은 혈청 샘플 또는 뇌척수액 샘플 또는 두 샘플 모두인 유체 샘플(들)에 함유된, 하이 모빌리티 그룹 박스 I(High Mobility Group Box I: HMGB1)에 특이적인 항체, 특히 HMGB1에 특이적인 전체 항체를 정량하는 것에 의해 HIV 감염을 모니터링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
a) 상기 유체 샘플(들)을 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는단계; 및
b) HMGB1에 특이적인 항체를 정량하는 단계를 포함하고, 검출된 항-HMGB1 항체의 양은 감염의 예후와 상호관련있고, 특히 상기 상호관련성은 상기 피험체 내 바이러스 존재량과는 독립적이다.
뇌척수액 샘플 내 HMGB1에 특이적인 전체 항체를 준비하기 위한 본원에 개시된 처리 단계는 혈청 샘플로부터 이러한 항체를 얻기 위해 유사하게 적용된다.
본 발명의 방법은 HIV, 특히 HIV-1 또는 HIV-2에 감염된 피험체의 병태를 모니터링하는데 적합하다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 무바이러스혈증 환자(즉, 혈액 mL 당 40 복제수(copy) HIV RNA)이고/이거나 레트로바이러스 요법을 받고 있는 HIV 감염 환자에서 구현된다. 레트로바이러스 요법을 받고 있는 HIV 감염 환자는 전형적으로 억제된 바이러스 존재량, CD4 계측 및 최저(nadir) CD4 계측으로 측정된 중간정도의 면역 결핍성, 및 활성 마커 CD38 및 HLA-DR을 발현하는 CD8+ T 세포에 의해 측정된 중간정도의 면역 활성화를 나타낸다. 예를 들면, 도 14에 도시한 바와 같이 "모든 환자"의 임상 매개변수를 나타내는 HIV 감염 환자, 보다 구체적으로 1.6 log10 HIV RNA/㎖(무바이러스 혈증 환자)의 평균 바이러스 존재량, 및/또는 300 내지 800 CD4+ T 세포/mm3를 보이는 HIV 감염 환자는 대체로 레트로바이러스 요법을 받고 있는 HIV 감염 환자(HAART)이다.
피험체의 "병태(condition)"는 HIV 감염 후 피험체의 임상적 상태 또는 그 피험체가 AIDS로 또는 HIV 관련 신경 질환으로 진행될 위험성을 위미한다.
본 발명은 또한 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체에서 HIV 감염을 모니터링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 이러한 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계를 포함하고, 여기서 정량의 대상 항체는 HMGB1에 특이적인 전체 항체이거나 또는 그들의 순환 분획(순환 항체)이거나 또는 그들의 면역학적 복합 분획이다.
상기 방법이 바이러스 존재량의 동시 측정과 함께 수행되는 경우를 포함하는 본 발명에 개시된 면역 결핍 평가 또는 면역 활성화도 측정을 위해, HIV 감염을 모니터링하기 위한 방법 및 본원에 개시된 예후 및/또는 진단 방법은 HMGB1에 특이적인 순환 항체(잔류 항체)의 정량, 또는 HMGB1에 특이적인 전체 항체의 정량 또는 면역학적 HMGB1/특이적 항체 복합체 분획의 정량을 기초로 한다.
본원에 개시된 면역 결핍 평가 또는 면역 활성화도 측정 방법 및 예후 및/또는 진단 방법은 샘플, 예컨대 CSF 샘플 및/또는 혈청 샘플 내에서, HMGB1에 특이적인 항체의 정량을 기초로 한다. 이들 방법 중 일부, 예컨대 진단 방법의 경우, 진단 결과에 이르기 위해 추가 단계가 적절하거나 또는 필요할 수 있다.
본원에 개시된 HMGB1에 특이적인 항체를 정량하기 위한 시험관내 방법, HIV 감염을 모니터링하기 위한 시험관내 방법, 면역 결핍을 평가하거나 또는 면역 활성화도를 측정하기 위한 방법 및 예후 및/또는 진단 방법의 특정 구체예에서, 환자의 정량된 HMGB1에 특이적인는 건강한 개체군(예를 들면, HIV에 감염되지 않음), 신경 질환이 관찰되지 않은 피험체 개체군(아프거나 또는 아프지 않음(예를 들면(HAND가 없는 HIV 감염 환자 개체군) 또는 이 질환의 특정 진행기로 분류된 질환 환자(예를 들면, 1기 내지 4기 HIV 감염 환자) 개체군으로부터 측정된 HMGB1에 특이적 항체의 양과 비교될 수 있다. 환자의 HMGB1에 특이적인 정량 항체는 또한, 다른 시점 또는 다른 시점들에, 동일한 환자에서 측정된 HMGB1에 특이적인 항체의 양과 비교될 수도 있고; 후자의 경우에 있어서, 얻어진 정량값의 비율을 계산하고 HMGB1에 특이적인 항체 양의 전개를 측정할 수 있다. 동일한 비교 단계를 또한 케모카인, 예컨대 IP-10 및/또는 MCP-1의 정량에 적용할 수 있다.
특정 구체예에서, 이러한 모든 방법들은 순환, 소위 잔류, 특이적 항체 또는 전체 특이적 항체의 정량을 기초로 한다(포함한다).
HMGB1에 특이적인 전체 항체의 정량이 바람직할 수 있다.
정량이 HMGB1에 특이적인 전체 항체를 기초로할 경우, 본 발명의 방법은 또한 HMGB1 특이적 항체와 형성된 면역학적 복합체의 해리에 적합한 단계를 포함하고, 예를 들면 본 발명의 방법은 상기 개시된 바와 같고 특히 실시예에 개시된 바와 같은 산성 처리를 기초로 하는 정량 방법을 이용하거나 또는 포함한다. 정량이 HMGB1에 특이적인 순환 항체를 기초로 하는 경우, 상기 해리 단계가 필요하지 않다.
특정 구체예에서, 상기 HMGB1에 특이적인 항체의 정량은 뇌척수액 샘플(피험체에서 얻음)을 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1) 단백질 또는 이의 유도체를 접촉시키는 것에 의해 수행된다. 뇌척수액 샘플과 상기 단백질의 접촉뿐만 아니라 형성된 복합체의 정량은 시험관내에서 수행된다.
특정 구체예에서, 상기 HMGB1에 특이적인 항체의 정량은 혈청 샘플(피험체에서 얻음)을 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 것에 의해 수행된다. 상기 단백질과 혈청 샘플의 접촉뿐만 아니라 형성된 복합체의 정량은 시험관내에서 수행된다.
본 발명의 HIV 감염을 모니터링하기 위해 디자인된 방법에서, 특히 바이러스 존재량의 측정이 수행되는 경우, 면역 결핍의 평가 및 면역 활성화도 측정을 위해 디자인된 방법 및 예후 및/또는 진단 방법에서, 전체 길이 HMGB1 단백질 서열(포유동물 기원, 바람직하게는 인간 기원, 예컨대 기탁 번호 NP_002119로 지정된 것) 또는 그 유도체가 HMGB에 특이적인 항체에 결합 및/또는 항-HGMB1 항체를 정량할수 있는한 HMGB1 단백질에서 유도된 임의의 펩티드(10 내지 30개 아미노산 잔기) 또는 폴리펩티드(30 내지 215개 아미노산 잔기, 바람직하게는 30개 내지 50개, 또는 30개 내지 100개, 또는 30개 내지 150개 잔기)(HMGB1 단백질 유도체)를 사용하는 것이 가능함을 이해한다. 그러한 유도체는 재조합 HMGB1(예를 들면, HMG biotech HM-115로 판매되는 단백질), HMGB1의 면역학적 반응성 부분, 그 서열이 다양한 기원의 HMGB1 단백질과 공통 서열인 HMGB1의 면역학적 반응성 부분으로 이루어진 군에서 선택된다. 그러한 예로는 인간 및 마우스 HMGB1과의 공통 서열에 상응하는 HMGB1 유래 재조합 BOXB(HMG biotech HM-051)가 있다.
"HIV 감염 환자" 또는 "HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체"란, HIV 바이러스에 대해 양성적으로 그리포 정확하게 진단받고, HIV 감염이 후속 관련 검사를 통해 확진된 환자 또는 피험체를 의미한다. HIV 감염 환자는 몇몇 매개변수, 예컨대 바이러스 존재량, CD4 T 세포수 또는 AIDS의 임상 증상에 따라 분류될 수 있다.
신경 질환을 앓는 환자의 경우, 구체적인 분류는 다음과 같이, 임상의 판단에 따라, HIV 감염과 관련된 신경 질환을 기초로한다:
- 1기: 정상 NP(신경심리학적)검사;
- 2기: 1종의 인지 검사에서 적어도 2 SD(표준 편차) 이하의 평균이거나 또는 동일한 도메인을 조사하는 1종이 넘는 검사에서 적어도 1SD 이하의 평균인 경우. 이러한 결과들은 ND(neuropsychological deficit; 신경심리학적 결핍) 병태로 정의된다;
- 3기: ANI(asymptomatic neurocognitive impairment; 무증상 신경인지 손상)에 대한 기준을 갖는 환자를 포함한다;
- 4기: MCD(minor neurocognitive disorder; 경증 신경인지 질병)를 갖는 환자를 포함한다.
이러한 분류는 다음과 같이 [Antinori et al. (Neurology. 2007 Oct 30;69(18):1789-99)]에서 제안된 분류와 연결될 수 있다: HAND(HIV-associated neurological disorder; HIV 관련 신경 질환)이 없는 환자는 1기 및 2기를 포함하는 반면, HAND가 있는 환자는 3기 및 4기를 포함한다.
상기 개시된 바와 같이 혈청 샘플 내 HMGB1 또는 항-HMGB1 항체의 탐지 또는 정량을 수행하는 것에 의한 HIV 감염의 검출 또는 모니터링은 공지의 기술을 통한 바이러스 존재량 측정이 수반될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 바이러스 존재량 측정은 특히 진단 환자가 HIV 감염에 대해 치료되지 않은 경우 본 발명의 방법 자체를 수행하여 실시될 수 있따.
본 발명은 따라서 특정 구체예에서 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체의 HIV 바이러스 존재량을 모니터링하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플 내에서, HMGB1에 특이적인 전체 항체의 정량 방법을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체가 많을수록, 바이러스 존재량이 많다. 이러한 바이러스 존재량(VL)을 모니터링하는 접근은 HIV에 감염되고 바이러스 존재량 모니터링시 그 감염에 대해 치료되지 않은 환자, 또는 VL이 제어되지 않은 환자에서 적절하다.
"바이러스 존재량(viral load)"란, HIV RNA(바이러스 입자에서 유도되고 혈장에 존재) 또는 HIV DNA(세포 게놈에 통합되고 세포에 존재)를 의미한다. 특정 구체예에서, HMGB1에 특이적인 항체의 정량을 기초로 하는 본 발명의 방법은 HIV RNA 바이러스 존재량을 모니터링하는데 적합하다.
"HIV 감염을 모니터링"이란, 시간에 맞춘 HIV 감염의 후속조치를 의미한다. HIV 감염은 다양한 매개변수, 예컨대 바이러스 존재량 측정, CD4 세포 계측 및/또는 질환 진화와 관련된 임상 매개변수에 따라 평가될 수 있다. HIV 감염의 진행, 즉 이전 어세이와 비교하여, 측정된 매개변수의 안정성 또는 증가가 환자를 치유하는 방법을 좌우하게 된다. HIV 감염 진행은 HIV 복제 및/또는 표적 세포 게놈으로 HIV 게놈의 통합을 반영한다.
본 발명은 또한 HIV 감염 환자의 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태, 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환으로의 진행 상태의 시험관내 예후 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 HIV 감염 이후, 바람직하게는 일차 또는 급성 감염 동안, 또는 만성 감염 동안 환자로부터 얻은, 샘플, 구체적으로 혈청 또는 뇌척수액 샘플에서, 상기 개시된 HIV 감염을 모니터링하기 위한 방법 또는 정량 방법을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록, AIDS의 진행 상태 또는 AIDS의 발병 위험성이 높으며, 특히 HIV 감염과 염관된 신경 질환이 발병할 위험성이 높다.
본 발명은 또한 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태에 대한 시험관내 예후 방법에 관한 것이고, 이 방법은
a) 상기 환자로부터 얻은 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계
를 포함하고,
HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록, 신경 질환을 발전시킬 위험 또는 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높다.
특정 구체예에서, 상기 신경 질환이 감염(병원체, 박테리아 또는 바이러스)에 의한 것이거나 또는 감염에 의한 것으로 의심되는 경우, 샘플은 일차 감염 또는 급성 감염 동안 또는 만성 감염 동안 얻는다.
용어 "예후(prognostic)"는 HMGB1에 특이적인 항체정량이 환자로부터 얻은 샘플에 대해 수행될 때, 신경 질환으로 진행하거나 또는 발병될 환자의 위험성, 또는 HIV 감염 환자에서, AIDS 발병 또는 AIDS로 진행될 위험성을 평가하기 위한 가능성을 의미한다.
본 발명은 또한 용적 및/또는 대사 변화의 측정을 경우에 따라 조합하여, (1) 환자에서 신경 질환 존재, 또는 HIV 감염 환자에서 AIDS 관련 신경 질환의 존재를 통상적인 임상 기준에 의해 평가하는 단계; 및 (2) 면역학적 매개변수의 측정, 특히 HMGB1에 특이적인 항체의 정량(및 경우에 따라 케모카인, 예컨대 IP-10 및/또는 MCP-1의 정량)을 통한 이들 신경 질환 출현의 확증 또는 상관성을 조합하는 진단 방법에 관한 것이다. 특이적 HMGB1 항체의 정량은 예후 방법에 대해 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 따라서, HMGB1에 특이적인 항체의 수치는 임상 진단을 확인하기 위한 통상적인 임상 기준의 관찰과 상관있을 수 있다. 용어 "진단(diagnostic 및 diagnosis)"은 환자에 대해, HMGB1에 특이적인 항체의 정량이 그 환자로부터 얻은 샘플에서 수행될 때, 신경 질환의 존재 또는 부재, 또는 HIV 감염 환자에서, AIDS 관련 신경 질환의 존재 또는 부재를, 통상적인 임상 기준 및 면역학적 매개변수에 의존적으로, 결정하기 위한 가능성을 의미한다. 진단 방법 동안 HMGB1 특이적 항체의 정량은 특히 통상적인 임상 기준이 신경 질환의 출현에 대한 확실성을 결론내릴 수 없는 환자에 특히 적절하다. 예를 들면, 2기(신경심리학적 결핍)로 분류된 HIV 감염 환자에서, HMGB1 특이적 항체의 정량은 통상적인 임상 기준으로 얻은 신경 질환의 진단을 확증, 무효 또는 정량하기 위한 효과적인 상보적 지시자일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 시험관내 예후 방법 및/또는 진단 방법은 대체로 HMGB1이 관여하고 병리학적 위험 또는 상태와 관련된 것으로 보이는 질환 또는 질병에 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 다음에서 구현할 수 있다:
(1) 그 기원에 무관하게, 신경 질환이 존재하는 질환 또는 질병. 이 카테고리는 제한없이, 감염성 기원, 예를 들면, 박테리아 감염, 병원체 감염, 바이러스 감염 또는 프리온에 의한 감염 기원의 질환 또는 질병을 포함한다. 신경 질환을 갖는 감염성 질환의 특정예로는 HIV 감염이 있다. 이 카테고리는 또한 제한없이, 비감염성 기원(예를 들면, 외상성 기원) 또는 원인 불명 질환 또는 질병, 예를 들면, 급성 신경세포 손상, 외상성 뇌손상, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 허혈후 뇌손상, 파킨슨병, 말초 신경계 및/또는 척수에 영향을 미치는 임의의 질병, 예컨대 척수 손상, 근위축성 측색 경화증, 및 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증(MS)을 포함한다.
"신경 질환"이란, 예를 들면 치매 증후군(ADC), 뇌병증, 중추 신경계 림프종, 크립토코커스 뇌수막염, 사이토메갈로바이러스(CMV) 뇌염, 헤르페스 조스터 바이러스에 의한 척수염, 신경병증(주변 신경병증 및 원위 감각 다발신경병증), 신경매독, 진행성 다소성 백질뇌병증(PML), 톡소플라즈마 뇌염 또는 뇌 톡소플라즈마충증 및 공포성 척수병증을 의미한다.
(2) HMGB1 단백질이 관여하는 것으로 보이고, 감염성(박테리아, 병원체 또는 바이러스) 기원이거나 또는 자가면역 기원인, 신경 질환이 없는 질환 또는 질병. 이러한 제2 카테고리 질환의 예로는 제한없이 제1형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 류마티스성 관절염, HSV-2 감염, 만성 B형 간염, 레지오넬라(Legionella) 감염, 패혈증 또는 천식을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 HIV 감염 환자의, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 HIV 감염 또는 AIDS와 관련된 신경 질환으로의 진행 상태에 대한 시험관내 예후 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 감염 후, 바람직하게는 일차 감염 또는 급성 감염 동안, 또는 만성 감염 동안 상기 환자로부터 얻은 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플에서, 상기 개시된 HIV 감염을 모니터링하기 위한 방법 또는 정량 방법을 수행하는 단계를 포함하고, HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록, AIDS와 관련된 신경 질환을 발전시킬 위험 또는 AIDS와 관련된 진행된 단계의 신경 질환 또는 진행된 단계의 AIDS의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높다.
"AIDS 또는 AIDS로의 진행 상태"라는 표현은 AIDS 또는 AIDS로의 진행에 충족되는 다양한 병기를 의미하고, 특히 이하에 요약된, 세계 보건 기구에서 제작하고 갱신하는 HIV 감염 및 질환에 대한 WHO 질환 병기 체계를 의미한다. I기: HIV 질환이 무증상이고 AIDS로 분류되지 않는다; II기: 경증의 점액피부 증상 및 재발성 상기도 감염을 포함한다; III기는 1개월 이상동안 원인불명 만성 설사, 중증 박테리아 감염 및 폐결핵을 포함한다; IV기는 뇌의 톡소플라즈마충증, 식도, 기도, 기관지 또는 폐의 캔디다증 및 카포시 육종을 포함한다.
HIV 감염 환자에 적용시, "신경 질환으로의 진행 상태"는 상기 기술된 바와 같은 신경 질환 병기(1 내지 4) 범주를 의미한다. 다르게, [Antinori et al.]에서 제안되고 무 HAND(HIV 관련 신경 질환) 및 HNAD 환자에 대해 언급되는 분류를 고려할 수도 있다.
표현 "후천성 면역 결핍 증후군과 관련된 신경 질환" 또는 "AIDS와 관련된 신경 질환" 또는 "HIV 감염과 관련된 신경 질환"은 HIV 바이러스에 의해, 일부 암 및/또는 기회 감염에 의해 직접적으로 야기된 신경계의 신경 질환, 및 바이러스에 의해 영향을 받지만 직접적으로 야기되는 것으로 알려지지 않은 원인 불명의 질병을 포함한다. AIDS와 관련된 이들 신경 질환 중 일부는 상기 정의된 바와 같이, 질환 진행 상태의 특징일 수 있다. AIDS와 관련된 신경 질환의 예에는 AIDS 치매 증후군(ADC) 또는 HIV 관련 뇌병증, 중추 신경계 림프종, 크립토코커스 뇌수막염, 사이토메갈로바이러스(CMV) 뇌염, 뇌염 및 헤르페스 조스터 바이러스에 의한 척수염, 신경병증(말초 신경병증 및 원위 감각 다발신경병증), 신경매독, 진행성 다소성 백질뇌병증(PML), 톡소플라즈마 뇌염 또는 뇌 톡소플라즈마충증 및 공포성 척수병증이 있다. 예를 들면 강력한 항레트로바이러스 요법(HAART) 중인 환자처럼, AIDS 병기가 아닌 제어된 바이러스 존재량(VL)을 갖는 일부 환자는 신경 질환이 발병될 수 있다. 이들 신경 질환에 대한 임상 분류는 상기 개시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, HIV 감염 또는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 HIV 감염 또는 AIDS와 관련된 신경 질환으로의 진행 상태에 대한 시험관내 예후 방법은 예를 들면 강력한 항레트로바이러스 요법(HAART) 중인 환자처럼, AIDS 병기가 아닌 제어된 바이러스 존재량(VL)을 갖는 환자로부터 얻은 생물학적 샘플(들)에 대해 수행된다.
본 발명은 또한 환자, 특히 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체의 면역 결핍(또는 면역부전)을 평가하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이고, 이 방법은, 상기 피험체로부터 얻은, 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플에서, 상기 개시된 HIV 감염을 모니터링하는 방법 또는 정량 방법을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체가 많을수록, 면역 결핍이 더 높다. HIV 감염 환자에 대해, 감염 이후 관찰된 면역결핍은 CD4 T 세포의 감소 결과이며, 이는 본 발명에서 특이적 항-HMGB1 항체의 수치와 음성적으로 상호관련되는 것으로 확인되었다.
본 발명의 일부는 또한 환자, 특히 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체에서 면역 활성화도 특히 지속적인 면역 활성화도 또는 특히 지속적인 염증 상태를 유도하는, 일부 신체 구획(들) 내에서의 지속적인 면역 활성화도를 측정하는 시험관내 방법에 관한 것이고, 이 방법은 상기 피험체로부터 얻은, 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플에서, 상기 개시된 정량 방법을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체가 많을수록, 면역 활성화도가 보다 더 지속적이다. 지속적(또는 만성) 면역 활성은 CD8 T 세포 상의 활성 마커, 특히 CD38 및/또는 HLA-DR 마커의 고발현과 관련된다. 따라서, 본 발명은 특이적 HMGB1 항체의 높은 수치는 CD8+ CD38+ T 세포 및 CD8+ HLA-DR+ T 세포 둘 모두의 높은 수치와 상호관련이 있다.
특히 면역 활성은 급성기 HIV 감염 환자에서 관찰되는 면역 활성이거나, 또는 만성 HIV 감염을 갖는 환자에서 관찰되는, 특히 상기 환자가 항레트로바이러스 치료(ART) 중이 아니거나 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환이 존재할 경우에 관찰되는 면역 활성화를 의미한다.
시험관내 예후 및/또는 진단 방법, 면역 결핍 평가 방법 또는 면역 활성화도 측정 방법에서, 정량 방법은 예를 들면, 하기 a) 및 b)를 포함하는 방법이다:
a) 바람직하게 일차 감염 또는 급성 감염 동안 또는 만성 감염 동안, 상기 환자로부터 얻은 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계.
항-HMGB1 항체의 정량을 기초로 하는, 시험관내 예후 방법, 면역 결핍 평가 방법 또는 면역 활성화도 측정 방법의 특정 구체예에서, 건강한 개체군 또는 HAND가 없는 HIV 감염 환자 개체군 내 항-HMGB1 항체 수치와 비교하여 20% 이상의 항-HMGB1 항체 수치 증가는 지속적인 면역 활성화, 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 높은 위험 및/또는 높은 면역 결핍과 상호관련된다.
본 발명의 방법은 또한, 단계 a) 이전에, 전체 특이적 항-HMGB1 항체를 정량하도록, HMGB1 특이적 항체와 형성된 면역학적 복합체의 해리에 적합한 단계를 포함한다. 예를 들면, 이러한 추가 단계는 산 처리, 예컨대 실시예에 개시된 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 산 처리는 항체의 결합능을 변화시키지 않으면서, 샘플내에서 면역학적으로 결합된 항체로부터 HMGB1 단백질을 분리시키도록 선택된, 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3의 산성 해리 용액과 샘플(들)(뇌척수액, 혈청 또는 둘 모두)을 접촉시키는 것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 산성 해리 용액은 저 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3(예를 들면, 1.85)인 글리신(예를 들면, 1.5 M)이다. 이어서 산 처리는 중화 완충액(예컨대 Tris, 예를 들면 1.5 M Tris, pH 9)을 사용해 중지시킨다. 산 처리는 생물학적 샘플(CSF, 혈청...)을 희석시키게 된다. 다른 바람직한 구체예에서, 이전 것과 조합하거나 또는 조합하지 않고, 산성 해리 용액과의 항온반응은 20 내지 37℃의 온도, 바람직하게는 25℃의 온도에서 수행되고/되거나, 중화 단계는 얼음에서 수행된다.
바람직한 구체예에서, HMGB1에 특이적인 항체의 상기 정량은 샘플을 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1) 단백질 또는 이의 유도체와 시험관내에서 접촉시키는 것에 의해 수행된다. 따라서, 상기 정량은 전체 길이 HMGB1 단백질 서열(포유동물 기원, 바람직하게는 인간 기원, 예컨대 기탁 번호 NP_002119로 지정된 것) 또는 그 유도체가 HMGB1에 특이적인 항체에 결합하고/하거나 항-HMGB1 항체를 정량할 수 있는 한 HMGB1에서 유도된 임의의 펩티드(10 내지 30개 아미노산 잔기) 또는 폴리펩티드(30 내지 215개 아미노산 잔기, 바람직하게는 30 내지 50개, 또는 30 내지 100개, 또는 30 내지 150개 잔기)(HMGB1 단백질 유도체)의 서열을 사용해 수행된다. 이러한 유도체는 재조합 HMGB1(예를 들면, HMG biotech HM-115로 시판되는 단백질), HMGB1의 면역학적 반응성 부분, 그 서열이 다양한 기원의 HMGB1 단백질과 공통인 HMGB1의 면역학적 반응성 부분으로 이루어진 군에서 선택된다. 이러한 예로는 인간 및 마우스의 HMGB1과의 공통 서열에 상응하는 HMGB1 유래의 재조합 BOXB이다(HMGbiotech HM-051).
본원에 개시된 각각의 시험관내 방법 및 모든 시험관내 방법은 경우에 따라 샘플(예컨대 혈청 또는 뇌척수액 샘플)에 존재하는 다른 분자, 특히 케모카인의 정량 단계를 더 포함한다. 독립적으로 어세이 및 정량할 수 있는 케모카인의 예로는 케모카인 IP-10 및 케모카인 MCP-1이 있다. 인간 케모카인 IP-10(10 kDa 인터페론 감마 유도된 단백질)은 또한 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 10 또는 CXCL10이라고도 하며, NCBI 기탁 번호 NP_001556를 참조한다); 인간 케모카인 MCP-1(단핵구 화학주성 단백질-1)은 또한 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2(CCL2)이고 NCBI 기탁 번호 NP_002973을 참조한다).
분자 특히 케모카인, 예컨대 케모카인 IP-10 및 케모카인 MCP-1에 적용될 경우, 용어 "정량하는" 또는 "정량"은 용어 "수량화하는" 및 케모카인 IP-10 및 케모카인 MCP-1의 수치에 대한 임의의 적절한 유용한 측정을 포함한다.
구체적으로, 본 발명은 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체의 상태를 모니터링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이고, 이 방법은 본원에 개시된 정량 방법(HMGB1에 특이적인 항체의 정량)을 수행하는 단계 및 상기 피험체로부터 얻은, 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플 내 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1을 정량하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 또한 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태를 예후하는 시험관내 방법 또는 진단 방법에 관한 것이고, 이 방법은 환자로부터 얻은, 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플 또는 둘 모두에서, 본원에 개시된 정량 방법을 수행하는 단계 및 케모카인 IP-10 및//또는 케모카인 MCP-1을 정량하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록 그리고 케모카인 IP-10이 높을수록 및/또는 케모카인 MCP-1이 높을수록, 신경 질환을 발전시킬 위험 또는 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높다.
또한, 본 발명은 HIV 감염 환자의, 대체로 HIV 감염 또는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)와 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 대체로 HIV 감염 또는 AIDS와 관련된 신경 질환으로의 진행 상태를 예후하는 시험관내 방법에 관한 것이고, 이 방법은 감염 후 환자로부터 얻은 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플에서, 본원에 개시된 정량 방법(HMGB1에 특이적인 항체의 정량)을 수행하는 단계, 및 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1을 정량하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록 그리고 케모카인 IP-10이 높을수록 및/또는 케모카인 MCP-1이 높을수록, 대체로 HIV 감염 또는 AIDS와 관련된 신경 질환을 발전시킬 위험 또는 대체로 HIV 감염 또는 AIDS와 관련된 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높다.
본원에 기술된 바와 같이 모든 예후 방법에서, 케모카인(들)을 정량하는 단계들은 특히 HMGB1에 특이적인 항체를 정량하는 단계와 동시에 수행된다.
본 발명은 또한 HIV 감염 개체의 뇌척수액 샘플 및 혈청 샘플에서, HMGB1에 특이적인 항체의 정량 단계(예를 들면, 상기 기술된 바와 같음)를 포함하는 방법에 관한 것이고, 양쪽 정량은 동일 개체 및 동시에 채취된 샘플에 대해 수행되며, 경우에 따라, 동일 개체의 뇌척수액 샘플 및 혈청 샘플 둘 모두에서, 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1의 정량을 포함하고, 상기 샘플은 동시에 채취된다.
2가지 다른 샘플에서 HMGB1에 특이적인 항체의 동시 정량을 기초로 하는, 이러한 방법은 다음의 분야에서 사용될 수 있다:
- HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체에서 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염을 모니터링하기 위한 시험관내 방법;
- 바람직하게 일차 감염 또는 급성 감염 동안 또는 만성 감염 동안, HIV에 감염된 환자의 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태에 대한 시험관내 예후 방법;
- 환자의 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태에 대한 시험관내 예후 방법;
- 일차 감염 또는 급성 감염 동안, 또는 만성 감염 동안, HIV에 감염된 환자의, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS) 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 AIDS 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환으로의 진행 상태에 대한 시험관내 예후 방법; 및
- 다른 수단과 관련될 경우, 환자에서 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태, 특히 HIV 감염 환자에서, AIDS 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 AIDS 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환으로의 진행 상태에 대한 진단 방법.
"동시에"란, 임상 증상, 특히 신경 질환, 예컨대 AIDS 또는 HIV와 관련된 신경 질환, AIDS의 병기 및/또는 상기 HIV 감염 환자의 혈청 또는 CSF 바이러스 존재량이 유사(통계적으로 유의하지 않음) 또는 동일한 시간 내에, 측정 환자로부터 샘플을 얻는 것을 의미한다. 특히 이러한 기간은 6개월, 3개월, 1개월 또는 2주를 초과하지 않는다(미만이다).
모든 및 각각의 시험관내 예후 및/또는 진단 방법, 면역 결핍을 평가하기 위한 시험관내 방법, 환자의 병태를 모니터링하는 시험관내 방법, 면역 활성화도를 측정하는 시험관내 방법 및 상기 개시된 바와 같이 뇌척수액 샘플 및 혈청 샘플에서 HMGB1에 특이적인 항체를 정량하는 방법과 동시에, HIV 바이러스 존재량은 통상의 방법(예를 들면, PCR에 의함)을 사용해 측정된다. 표현 "동시에"는 방법들이 동일 시점에 동일 환자에서 얻어진 샘플에서 수행됨을 의미한다.
흥미롭게도, 환자의 혈청 및/또는 CSF 바이러스 존재량이 검출불가할 수 있고 혈액 및/또는 CNS 중 HIV 바이러스의 복제가 없는 것으로 밝혀지더라도, 가능하게는 대량의 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1과 함께, 대량의 HMGB1에 특이적인 항체의 정량은, HIV 바이러스가 다른 구획 또는 장기, 예컨대 간, 뇌 또는 장에서 복제한다는 것을 밝혀준다. 이는 공지 표준에 따라 낮거나 또는 검출불가한 HIV 바이러스 존재량을 갖는 치료된 HIV 감염 환자는 AIDS로 진행하지 않지만 신경 질환이 존재한다고 설명할 수 있다. 이러한 관찰은 혈청 바이러스 존재량의 측정과 동시에, HIV 바이러스가 감염되어 다양한 장기 및 구획에서 유지된다는 사실을 고려하여 다른 어세이, 예컨대 HMGB1에 특이적인 항체의 정량을 실시할 수 있다는 것을 정당화한다.
시험관내 예상 및/또는 진단 방법은 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태, 특히 AIDS 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환을 확증 또는 입증하기 위해 디자인된 상보적인 어세이를 더 포함할 수 있다. 이러한 어세이는 다음의 단계뜰을 포함한다:
(a) 상기 환자의 기저핵에서 용적 변화를 자기 공명 영상 측정법에 의해 확인하는 단계; 및/또는
(b) 상기 환자의 기저핵에서 대사 변화를, 바람직하게 혈청 콜린/N-아세틸 아스파테이트 비율(Cho/NAA)을 계산함으로써 확인하는 단계.
본원에 기술된 모든 방법은 시험관내에서 실시된다.
본 발명은 또한 환자, 특히 HIV 감염 환자의 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태의 시험관내 예후를 위한 키트, 마커 또는 수단의 제작을 위한 상기 정의된 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이고, 상기 진단 및 예후는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 달성된다:
a) 바람직하게 일차 감염 또는 급성 감염 동안 또는 만성 감염 동안, 상기 환자로부터 얻은 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된, 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계를 포함하고,
여기서 HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록, 신경 질환을 발전시킬 위험 또는 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높고, 특히 HIV 감염과 관련된 신경 질환을 발전시킬 위험 또는 HIV 감염과 관련된 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높다.
본 발명은 또한 환자, 특히 HIV 감염된 것으로 알려진 피험체의 면역 결핍을 평가하기 위한 키트, 마커 또는 수단을 제조하기 위한 상기 정의된 바와 갖는 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이고, 상기 평가는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 달성된다:
a) 상기 환자로부터 얻은 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 HMGB1(High Mobility Group Box 1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체가 많을수록, 면역 결핍이 더 높다.
본 발명은 또한 환자, 특히 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체의 면역 활성화도를 측정하기 위한 키트, 마커 또는 수단을 제조하기 위한 상기 정의된 바와 같은, 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이고, 상기 측정은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 달성된다:
a) 상기 피험체로부터 얻은, 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1에 특이적인 항체가 많을수록, 면역 활성화가 더 지속된다.
본 발명은 또한 환자, 특히 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체에서의, 본 발명의 진단 방법을 위한 키트, 마커 또는 수단을 제조하기 위한 상기 정의된 바와 같은 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.
상기 기술된 키트, 마커 또는 수단의 제조는 또한, 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체 이외에도, 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리하는데 적합한 산성 해리 용액의 용도 및/또는 케모카인, 예컨대 IP-10 및/또는 MCP-1을 정량하기 위한 수단의 용도를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 기술된 키트, 마커 또는 수단의 제조는 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리하는데 적합한 산성 해리 용액 또는 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체의 용도를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 기술된 키트, 마커 또는 수단의 제조는 케모카인을 정량하기 위한 수단, 및 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체의 용도를 포함한다.
HMGB1에 특이적인 항체의 정량을 포함하는 상기 개시된 임의의 시험관내 방법은 고상 지지체 상에 코팅된 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체를 이용하고, 경우에 따라 HMGB1 특이적 항체를 검출할 수 있는 2차 항체를 사용하여, ELISA, 또는 다른 면역학적 검출 방법을 실시해 수행될 수 있다.
케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1의 정량이 고려되는 경우, ELIS 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 방법을 사용할 수 있다.
본 발명자들은 또한 단백질 HMGB1 단백질 자체가 뇌척수액 샘플에서 어세이될 수 있다는 증거를 제공한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 HIV 감염 환자 유래의 뇌척수액 샘플 내 높은 수치의 HMGB1의 검출을 포함한다. 뇌척수액 샘플 내 바이러스 존재량 및 HMGB1 수치 간 양성적 상관성은 또한 HIV 감염을 모니터링하는데 사용될 수도 있다. HMGB1 수치는 공지의 진단법, 예컨대 ELISA 검사법을 사용해 정량화될 수 있다. 재조합 hHMGBI, 항-hHMGB1 모노클론 항체 및 토끼 항-hHMGBI 혈청은 시판되며 그러한 진단 검사법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 HIV에 감염된 피험체에서 HIV 감염을 모니터링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서 이 방법은 특히 HIV 감염된 상기 피험체 유래의 생물학적 샘플을 HMGB1에 면역학적으로 결합하는 항체와 접촉시킴으로서, 상기 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플에 함유된 HMGB1 단백질을 정량하는 단계를 포함하고, 여기서 정량 표적인 HMGB1 단백질은 전체 HMGB1 단백질 또는 그의 순환 분획(잔류 순환 HMGB1) 또는 그의 면역학적 복합체 분획이다.
본 발명은 또한 HIV 감염된 것으로 알려진 피험체의 HIV 바이러스 존재량을 모니터링하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이고, 이 방법은 상기 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플 내 HMGB1 단백질의 정량을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 HMGB1 단백질이 많을수록, 바이러스 존재량은 높다. "바이러스 존재량(바이러스 존재량)"이란, HIV RNA(바이러스 입자로부터 유래되고 혈장에 존재) 또는 HIV DNA(세포 게놈에 통합되고 세포에 존재)를 의미한다. 특정 구체예에서, HMGB1의 정량을 기초로 하는 본 발명의 방법은 HIV RNA 바이러스 존재량을 모니터링하는데 적합하다.
HIV 감염 또는 바이러스 존재량을 모니터링하기 위한 방법은 순환(잔류) HMGB1의 정량, 전체 HMGB1의 정량 또는 면역학적 HMGB1/특이적 항체 복합체 분획의 정량을 기초로 실시될 수 있다.
특정 구체예에서, 이들 방법은 순환 HMGB1 또는 전체 HMGB1의 정량을 기초로한다. 정량이 전체 HMGB1을 기초로 하는 경우, 본 발명의 방법은 또한, HMGB1 특이적 항체와 형성된 면역학적 복합체의 해리에 적합한 단계를 포함하고 예를 들면 본 발명의 방법은 뇌척수액의 산 처리를 이용 또는 포함한다.
적절한 산 처리는 특정 항체에 의한 HMGB1 단백질 및 그 인지능을 변화시키지 않으면서 HMGB1 단백질을 특이적 항체와 분리하도록 선택된, 저 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3인 산성 해리 용액과 뇌척수액 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 산성 해리 용액은 저 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3(예를 들면, 1.85)의 글리신(예를 들면, 1.5 M)이다. 산 처리는 이어 중화 완충액(예컨대 Tris, 예를 들면 1.5 M Tris, pH 9)를 사용해 중지시킨다. 다른 바람직한 구체예에서, 이전 것과 조합하거나 또는 조합하지 않고, 산성 해리 용액과의 항온반응은 20 내지 37℃의 온도, 바람직하게는 25℃의 온도에서 수행되고/되거나, 중화 단계는 얼음에서 수행된다.
HMGB1 단백질의 정량은 HIV에 감염되지 않은 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플 내 HMGB1의 양, 또는 다른 시점에 동일 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플 유래의 HMGB1의 양과 비교할 수 있다.
본 발명은 또한, 동일한 분야를 위해, HIV 감염된 개체의 뇌척수액 샘플 및 혈청 샘플에서 HMGB1을 정량(예를 들면, 상기 기술된 바와 같음)하는 단계를 포함하며, 두 정량 모두는 동일 개체 및 동일 시점에 수행되고, 경우에 따라, 동일 개체 및 동일 시점의 뇌척수액 샘플 및 혈청 샘플 둘 모두에서의 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1의 정량을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 다음의 용도 중 하나를 실시하는데 사용하기 위한 키트에 관한 것이다: HIV 감염된 피험체의 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염을 모니터링, HIV 감염 치료중이 아닌 HIV 감염 피험체의 HIV 바이러스 존재량을 모니터링, HIV 감염 환자의 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태의 예후를 수행, 환자의 신경 질환, 특히 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS) 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 환자의 신경 질환, 특히 HIV에 감염된 환자의 AIDS 또는 HIV 감염과 관련된 신경 질환으로의 진행 상태의 예후를 수행, 환자, 특히 HIV 감염 피험체의 면역 결핍을 평가, 면역 활성화도 특히 환자, 특히 HIF 감염 피험체에서 지속적인 면역 활성화도를 측정, HIV 피험체의 상태를 모니터링 및 본 발명의 진단 방법.
키트는 상기 정의된 바와 같은 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체, 및 경우에 따라 예컨대 상기 정의된, 환자에서 채취시, 생물학적 샘플에 존재하는 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리하는데 적합한 산성 해리 용액, 및 경우에 따라 케모카인 IP-10을 정량하는 수단 및/또는 케모카인 MCP-1을 정량하는 수단을 포함한다. 경우에 따라, 이러한 키트는 또한 예를 들면 상기 정의된 바와 같은 중화 완충액 및/또는 HMGB1/특이적 항체 복합체 형성의 노출 및/또는 그에 결합하는 2차 항체를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 이러한 키트는 또한 사용 설명서(전단)을 포함할 수도 있다. 특정 구체예에서, 키트는 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체 및 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리하는데 적합한 산성 용액을 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체 및 케모카인 IP-10 정량 수단을 포함한다.
키트는 임의의 샘플, 특히 HIV 감염 환자의 뇌척수액 샘플 또는 HIV 감염 환자의 혈청 샘플, 또는 동시 정량이 필요한 경우 상기 HIV 감염 환자의 뇌척수액 샘플과 혈청 샘플 둘 모두에서 유래된 임의의 생물학적 샘플로부터 항-HMGB1 항체를 정량하도록 제공된다.
실시예
I. 샘플(혈청 및/또는 인간 뇌척수액) 내 HMGB1 단백질 및 항-HMGB1 항체의 검출
HIV 감염 환자 유래의 샘플 내 HMGB1 단백질 농도(즉, 잔류 순환 HMGB1 단백질)를 ELISA 키트 Shino 검사법(IBL)에 따라 정량하였다.
또한, 전체 항-HMGB1 특이적 항체의 검출을 위해 특이적 ELISA 어세이를 개발하였다. 다음의 시약들을 사용하였다:
- 인간 HMGB1의 잔기 150 내지 C-말단에서 유래된 KLH-접합 합성 펩티드에 대해 유도시킨 인간 HMGB1에 대한 토끼 1차 폴리클론 항체(Adcam ab18256).
- 인간 및 마우스와 전체적으로 동일한, 포유동물 서열을 코딩하는 발현 플라스미드로부터 이.콜라이(E.coli)에서 생산한 HMGB1 유래의 재조합 BOXB(HMGBiotech HM-051).
- 대조군 토끼 혈청(Sigma;Ref: R9133)
- 알칼리 포스파타아제(PAL)에 접합된 항-토끼 IgG 또는 IgM, 기질 p-니트로페닐 포스페이트 정제(pNPP)
- 캘리브레이터: 혈청 유래 인간 IgG(Sigma; ref 12511) 및 혈청 유래 인간 IgM(Sigma; ref I8260)
- 염소에서 생산된 항-인간 IgG(Fc 특이적)-알칼리 포스파타아제 항체(Sigma; Ref A9544), 염소에서 생산된 항-인간 IgM(μ-쇄 특이적)-알칼리 포스파타아제 항체(Sigma; ref A3437)
전체 항-HMGB1 특이적 항체를 정량하기 위한 ELISA 어세이는 다음과 같이 수행하였다:
96웰 플레이트의 코팅은 DPBS 중 0.5 pg/㎖의 BOXB를 사용해 밤새 4℃에서 수행하였다. 동시에, 캘리브레이터의 코팅은 상응하는 이소타입의 DPBS에서 연속 희석으로 수행하였다(오직 인간 샘플로 수행되는 ELISA 어세이의 경우). 플레이트는 마이크로플레이트 세척기((Atlantis;Oasys)를 사용해, DPBS/0.05%(v/v) Tween?20으로 4회 세척하엿다. 유사한 세척을 ELISA 어세이의 각 단계 이후에 수행하였다. 미결합 부위를 4℃에서 2시간 동안 PBS/2%(w/v) BSA로 차폐시켰다. DPBS/0.05% (v/v) Tween?/1 %(W/V) BSA에 희석된 샘플의 100 ㎕ 분취액을 코팅 및 미코팅 웰에 부가하였고 1시간 동안 37℃에서 항온반응시켰다. 모든 샘플들은 수조 내 25℃에서 30 mn 동안 1.5 M 글리신(v/v, pH 1.85)으로 처리하였고, 얼음에 더욱 유지시키고, 1.5M Tris, v/v, pH 9.0으로 희석하였다. 이어서 샘플을 즉시 희석(1/10 내지 1/1000)하고 코팅 플레이트에 분배하였다. DPBS/0.05%(v/v) Tween?/1 %(W/V) BSA에 희석된, 항-토끼 IgG 알칼리 포스파타아제-접합된 항체(비율 1/10000), 또는 염소 항-인간 IgG(비율 1/2000), 또는 IgM(비율 1/2000) 알칼리 포스파타아제-접합 항체를 1시간 동안 37℃에서 부가하였다. 항원 특이적 항체의 검출을 100 ㎕ pNPP 기질을 사용해 37℃에서 30 mn 항온반응 이후 수행하였고 반응은 100 ㎕ 3 M NaOH를 부가해 중지하였다. BOXB 특이적 항체의 농도는 시겔라(Shigella) LPS에 특이적인 ELISA에서 이전에 보고한 바와 같이(Launay et al. Vaccine 2009, 27:1184-1191), Ascent 소프트웨어, ThermoElectrocorp에 의한 표준 면역글로불린 용액 흡광도로 얻은 표준 곡선에 따라 계산하였다. 이 데이타는 검출된 항체의 ng/㎖로 표시하였다.
II. HIV 감염 환자 유래의 CSF 중 HMGB1 및 특이적 항-HMGB1 항체, 및 케모카인 시그내처의 분석
HIV 감염 환자
HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 CSF 함량을 분석하려는 환자군은 AIDS 관련 신경 질환(상기 설명한 바와 같음)에 따라 분류된, 105명의 만성 HIV 감염 환자 코호트의 일부이다. 1그룹은 신경 질환이 없는 HIV-1 감염 환자를 포함하는 반면, 2그룹, 3그룹 및 4그룹은 높은 신경인지 질환이 있는 환자를 포함한다.
IIa. HMGB1 및 특이적 항-HMGB1 항체와 바이러스 존재량, 질환 진화 및 케모카인 시그내처의 상관관계
건강한 기증자와 비교하여 HIV 감염(HIV + ) 환자 유래 CSF 샘플의 높은 수치의 HMGB1 및 항-HMGB1 Ab
HMGB1 검출을 위해 Shinotest Elisa(IBL) 어세이(검출 한계 0.25 ng/㎖) 및 항-HMGB1 항체 검출을 위해 본 발명자의 홈메이드 Elisa 어세이(검출 한계 90 ng/㎖)를 사용한 경우, 건강한 기증자(HD)와 비교하여 HIV 감염 환자(P) 유래의 CSF에서 HMGB1(도 1A) 및 항-HMGB1 항체(도 1B) 둘 모두 높은 수치로 존재하였다. 환자의 CSF 내 높은 수치의 HMGB1는 HD와 통계적으로 차이가 있지 않았지만(도 1a) 항-HMGB1 항체의 수치는 HD와 비교해 유의하게 높았다(도 1b). 신경 병기에 따른 환자의 계층화는 CSF에서 HMGB1 및 항-HMGB1 항체 둘 모두의 높은 수치는 3기 및 4기 환자에서 관찰되었다. 오직 항-HMGB1 항체 수치만 HD와 통계적으로 차이가 있었다(도 1).
CSF 샘플 유래의 HMGB1 및 항-HMGB1는 바이러스 존재량과 상관관계가 있다.
HIV-1은 아마도 CSF 내 HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 생산을 유도한다. 이는 미검출 VL(<40 cp/㎖ CSF)을 갖는 환자와 비교하여 비제어적인 바이러스 존재량(VL)을 갖는 환자에서 두 분자 모두 높은 수치라는 것에 의해 시사된다(도 2A). 또한, HMGB1 및 항-HMGB1 항체 수치는 CSF 내 HIV-1 VL과 양성적으로 상관있다(도 2B). 당연한 귀결로서(CSF VL이 혈장 VL과 뚜렷하게 상관관계가 있다는 판단, 도 2C), CSF HMGB1 수치는 혈장 VL과 양성적으로 상관관계가 있다(도 2C).
CSF 항-HMGB1 수치는 질환 진화와 상관관계가 있다.
HIV 감염의 특징은 혈액 내 CD4 T 세포의 점진적 소멸이고, CD4 T 세포의 주변 수치는 HIV 질환 진행의 마커이다. 도 3 A(우측 패널)는 CSF 내 항-HMGB1 항체 수치가 CD4 T 세포수가 감소될 때 증가하는 것을 보여주고, 이는 높은(>600) CD4 T 세포 대비 낮은(<300) CD4 T 세포수를 갖는 환자에서 유의하게 높았다. 또한, CSF 내 항-HMGB1 항체의 수치는 항-HMGB1 항체가 CD4 T 세포수와 음성적으로 상관되는 것처럼, 질환 진화와 상관있는 것으로 나타났다(도 3B 우측 패널). CSF 내 HMGB1 수치와 관련하여, 이들은 CD4 T 세포수에 따라 가변적이지 않았다(도3A, 3B 좌측 패널s). HMGB1 정량에 사용된 어세이(Shinotest, IBL)가 오직 잔류 자유 HMGB1(즉, 항체와 복합체 형성하지 않은 HMGB1)만을 검출하는 반면, 항-HMGB1 항체 정량을 위해 본 발명자의 실험실에서 개발한 어세이는, HMGB1과 복합체를 이루는 것을 포함해, 전체 항체를 검출한다는 것을 주목한다. 따라서, 항-HMGB1 항체의 수치(HMGB1보다 1000배)는 잔류 HMGB1보다 질환 진화에 대한 보다 정확한 측정치를 나타낸다.
CSF HMGB1 및 항-HMGB1 항체 수치는 지속적인 면역 활성화와 관련된다.
수많은 연구들이 만성 HIV 감염이 질환 진행의 강력한 마커인 면역 활성화 상태를 유도한다는 것을 검증하였다((Giorgi JV, et al. Shorter survival in advanced HIV-1 infection is more closely associated with T lymphocyte activation than with plasma virus burden 또는 virus chemokine coreceptor usage. J Infect Dis 1999). 면역 활성화는 그 조합이 AIDS로의 진행과 연관있는, 혈액 CD8 T 세포 상의 활성 마커, 특히 CD38 및 HLA-DR의 발현을 통해 분석될 수 있다(Liu Z, et al. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the MACS Study than CD4+ cell count, soluble immuno activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 1997; 16:83-92). 도 4는 CD8+CD38+ T 세포 비율이 높은 수(>600/㎕)를 갖는 환자와 비교해 CD4 T 세포수가 낮은(CD4 <300/㎕) 환자에서 유의하게 높고, T 세포의 활성화 상태(즉, CD8+CD38+ T 세포 및 CD8+HLA-DR+ T 세포의 비율)은 CSF 및 혈장 바이러스 존재량 둘 모두와 양성적으로 상관관계가 있다(도 4B). 본문에서, HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 발현은 T 세포의 활성 상태와 양성적으로 상관관계가 있다(도 4C).
따라서, 신경 질환이 있는 환자의 CSF 내 HMGB1 및 항-HMGB1 검출은 HIV에 의해 유도된 지속적인 면역 활성화의 결과이다.
CSF 샘플 내 높은 수치의 HMGB1 및 항-HMGB1 항체는 높은 수치의 염증성 케모카인 및 IP-10 및 MCP-1와 연관있다.
3기 또는 4기의 신경 질환을 갖는 HIV+ 환자 및 HD 유래의 CSF를 24 사이토카인/케모카인의 동시 검출을 위한 MAP(MultiAnalyte Profiling) 방법으로 검사하였다. 도 5는 HD 및 HIV+ 환자에서의 케모카인 프로파일 비교결과를 보여준다. HD 유래 CSF에서, 사이토카인/케모카인 시그내처(signature)는 2종 케모카인, IP-10 및 MCP-1의 검출로 특징된다. HIV+ 환자 유래 CSF에서, 이들 2종 케모카인이 역시 검출되지만, 보다 높은 수치이다. 환자 CSF 내 높은 수치의 IP-10은 CSF VL과 상관관계가 있고(이전 보고와 일치(Paola Cinquea et al. Cerebrosopinal fluid interferon-Y-inducible protein 10(IP-10, CXCL10) in HIV-1 infection. J Neuroimmunology 2005) CD8 T 세포의 활성화 상태와 상관관계가 있다(도 6A). 유사하게, CSF MCP1 수치 및 CD4 T 세포수간 역상관관계에 의해 알수 있는 바와 같이, 높은 수치의 MCP-1은 T 세포의 활성화 상태와 상관관계가 있고, MCP-1 수치는 질환 진화와 관련되는 것으로 보인다(도 6B). 도 6C는 IP-10 및 MCP-1의 수치가 환자의 CSF와 양성적으로 상관관계가 있음을 보여준다.
신경 질환이 있는 환자 유래의 CSF에서 검출된 매개인자의 성질을 특징규명하기 위해, IP-10 및 MCP-1 수치를 HD 및 3기 및 4기 환자 간에 비교하였다. 도 7A는 3기가 IP-10 및 MCP-1 둘 모두의 유의한 증가와 연관됨을 보여준다. 흥미롭게도, CSF IP-10 및 MCP-1 수치는 항-HMGB1 항체의 농도와 양성적으로 연관있다(도 7B).
IIb. 신경 질환이 있는 HIV + 환자 유래 혈청 내 HMGB1, 항-HMGB1 항체 케모카인 시그내처
혈청 항-HMGB1 항체 수치는 2기에서 증가되고 HIV 바이러스 존재량에 의해 유도된다.
도 8A는 2기부터, 환자가 혈청 항-HMGB1 항체 수치에 유의한 증가를 보이는 한편, HMGB1 수치는 덜 식별된다는 것을 보여준다. 다른 그룹 간 VL에 유의한 차이는 없었다(결과는 도시하지 않음). 혈청 바이러스 존재량(미검출 <40 cp/㎖ vs 양성 >40 cp/㎖)을 기초로한 환자의 계층화는 항-HMGB1 항체가 검출가능한 바이러스 존재량을 갖는 환자에서 유의하게 증가함을 보여주었다(도 8B). 예상되는 바와 같이, 검출가능한 VL은 CD4 T 세포수 감소와 관련된다(도 8B). 혈청 VL의 보다 정제된 계층화는 항-HMGB1 항체가 유의하게 VL>1000 cp/㎖로부터 상승하고, HMGB1 Ab 수치는 VL과 양성적으로 상관관계가 있음을 보여주었다(도 8C). CSF에서 관찰되는 바와 같이, HMGB1 수치는 덜 식별되었다.
혈청 항-HMGB1 Ab 수치는 IP-10 수치와 상관관계가 있다.
환자의 CSF에서 관찰되는 바와 같이, 양성 상관관계가 항-HMGB1 항체 및 IP-10 수치 간에 존재하였다(도 9A). IP-10은 질환 진화와 관련있는 것으로 보이는데, CD4 손실에 따라 증가하고, 그 생성이 T 세포 상의 활성화 마커의 발현에 의해 평가시, 면역계의 지속적인 활성화와 연관되어 있었기 때문이다(도 9B). 흥미롭게도, HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 수치는 역으로 관련되어(도 9A) 항-HMGB1 항체의 생성이 HMGb1의 생성에 의해 유도되고, 항-HMGB1 항체가 중성화 활성을 가짐을 시사한다.
IIc. 바이러스 존재량이 억제된 환자의 신경 질환은 CSF 및 혈청 내 항-HMGB1 및 케모카인 IP-10 및 MCP-1의 지속성과 관련된다.
HAART에서의 바이러스 존재량(VL) 억제는 CSF 항-HMGB1, HMGB1, IP-10, MCP-1 및 면역 활성화의 감소와 연관있다.
성공적인 항-레트로바이러스 요법은 신경 질환이 있는 대부분의 환자에서 CSF 바이러스 존재량 억제와 연관되어 있다(도10A). 수반적으로, CSF HMGB1, 항-HMGB1(도 10A), IP-10 및 MCP1(도 10C)의 수치가 감소되고, CD8 T 세포 상의 CD38 및 HLA-DR의 발현 역시 감소되었다(도 10B).
건강한 기증자와 비교시 바이러스 존재량이 억제된 환자 유래 CSF 중 HMGB1, 항-HMGB1, IP-10 및 MCP1의 지속성
VL<40 cp/㎖인 HIV+ 환자 유래 CSF 및 건강한 기증자 유래 CSF 내 사이토카인/케모카인 수치 비교는 HMGB1, 항-HMGB1, IP-10 및 MCP-1의 지속성을 밝혀주었다(도 11). 따라서, 이들 데이타는 VL 억제에도 불구하고 지속되는 신경 질환은 CSF 내 항-HMGB1, IP-10 및 MCP1의 높은 수치와 관련됨을 보여준다.
혈청 항-HMGB1 Ab는 바이러스 복제 억제에도 불구하고, 2기 내지 4기 환자와 1기 환자를 구별한다.
항-HMGB1 Ab는 1기(신경 문제없음) HIV+ 환자와 비교하여 2기 내지 4기 HIV+ 환자에서 여전히 유의하게 존재하나, 이들 모든 환자는 미검출 수치의 VL(<40 cp/㎖)을 보인다(도 12A). 도 12B 및 12C는 HMGB1, IP-10 또는 MCP-1 수치나, nCD4 T 세포, nCD8 T 세포, 최저 CD4, 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포의 비율이 1기 환자 대비 2기, 3기 및 4기 환자에서 다르게 존재하지 않는 것을 보여준다. 따라서, 항-HMGB1 수치가 1기 환자와 2기, 3기 및 4기 환자를 구별하는 유일한 인자임을 의미한다.
바이러스 존재량이 억제된, 2기, 3기 및 4기 환자에서 항-HMGB1, MCP1, IP-10 및 면역 활성화 간의 상관관계
제어된 바이러스 존재량에도 불구하고 지속적인 항-HMGB1 수치의 원인을 이해하기 위해, 임상 진화와 관련된 다양한 매개변수간에 스페어만(Spearman) 상관성을 분석하였다. 도 13A는 항-HMGB1 수치가 IP-10 및 MCP-1 수치와 양성적으로 상관관계가 있고, 그들 자체는 CD4 및 CD8 T 세포 상의 HLA-DR 및 CD38의 발현으로 측정시, 면역 활성화 상태와 관련되었다(도 13B). 전체 코호트에서 이미 관찰된 바와 같이(앞서 기술함), 면역 활성화 상태는 CD4 T 세포수 측정된 질환 진화와 관련된다(도 13C). 종합적으로, 이들 데이타는 항-HMGB1 Ab의 생성을 유도하는, 지속적인 면역 활성이 바이러스 존재량이 억제된, 2기, 3기 및 4기 환자에서 검출됨을 보여준다. 전체 환자 코호트(바이러스 존재량이 가변적인 1기 내지 4기)(도 9A) 및 바이러스 존재량이 억제된 2기, 3기 및 4기 환자(도 13A) 둘 모두에서 발견된 혈청 항-HMGB1 및 HMGB1 간 음성적 상관성은 항체 활성의 생체내 중성화를 시사한다.
환자 코호트를 특징규명하는 면역학적 매개변수의 연구는 다음의 2가지 목적을 추구한다:
(1) 3기 및 4기 분류된 CSF에서 보고된 분자 시그내처가 역시환자 혈청에 존재하고 HAND/무 HAND 분류되는지를 결정하기 위해 전체 코호트(n=106 환자)의 혈청으로 분석을 확대; 및
(2) 기저핵 용적 변화, 및 CNS 변화와 관련된 대사 변화를 확인하는 자기 공명 영상(MRI) 측정법이 이러한 분자 시그내처와 상관성이 있는지 평가.
III. 순환 HMGB1 단백질 수치 및 전체 항-HMGB1 항체 수치는 HAND 환자와 무 HAND 환자를 구별하는 유일한 매개변수이다.
HAND를 정의하게 위해, [Antinori et al. (Neurology. 2007 Oct 30;69(18):1789-99)]에 따른 기준을 사용하였다. 상기 기술된 1기 내지 4기 분류와의 이하 상응성을 고려한다: 무 HAND(1기 및 2기); HAND(3기 및 4기).
도 14는 연구한 환자 코호트를 특징화하는 임상 및 면역학적 매개변수를 도시한다. 이들 환자의 대부분(81%)은 강력한 항레트로바이러스 용법을 받았고, 67%는 바이러스 존재량이 억제되었다. CD4 계측으로 측정시, 면역 결핍은 중간이었고, 최저 CD4 계측치(즉, 감염 시작 이래로 최하 CD4 값에 도달)이 낮지 않았다. 면역활성화도는 중간이었고, AIDS 병기시 미처리 환자에서, CD8+ T 세포의 60 내지 100%는 활성화 마커 CD38 및 HLA-DR를 공동발현하였다.
이들 환자 중 1/3은 HAND를 가졌고(이하 상세 정보 참조), 무 HAND 그룹과의 비교는 바이러스 존재량, CD4 및 최저 CD4 계측수, 바이러스혈증 환자의 비율 및 면역 활성화도와 관련해 차이가 보이지 않았다.
두드러지게, 이들 2 그룹 간 유일한 유의차는 HMGB1 및 항-HMGB1 항체 간에 검출되었다(각각 p=0.006, 및 p=0.05, 비모수 만-위트니 검정법). IP-10 및 MCP-1 혈청 수치는 HAND 및 무 HAND 환자 간에 식별할 수 없었다(도 14). HAND 및 무 HAND 환자에서, 면역학적 및 바이러스학적 매개변수의 유사성은 도 15에 히스토그램으로서 도시하였다.
상기 언급한 바와 같이, HMGB1 및 항-HMGB1는 2개 환자 그룹을 구별하는 유일한 2가지 매개변수였다(도 16). 이러한 구별은 RNA 바이러스 존재량과는 독립적인데, 이는 무바이러스혈증 환자에서도 관찰되기 때문이다(VL<40 복제수/㎖).
IP-10 및 MCP1 케모카인의 수치는 HAND 및 무 HAND 환자 간에 통계적으로 다르지 않았지만(도 14), 감염 동안 이들의 생성은 지속적인 면역 활성화, 항-HMGB1 및 MCP-1의 수치 및 질환 진화와 양성적으로 상관있었고, 만성 염증이 케모카인 방출을 담당함을 시사한다(도 17 및 18). 이러한 관찰은 HIV 감염 환자의 CSF에 대해 이전에 보고한 결과를 확증시켜 주었다(실시예 IIA 및 도 5, 6 및 7).
IV. 면역학적 시그내처는 HAND를 갖는 HIV 감염 환자에서 기저핵의 용적 및 대사 변화와 상관된다.
각 환자는 광범위한 인지 도메인을 조사하는 신경학적 검사를 수행하였다. NP 검사 결과에 따라, 환자는 HAND 또는 무 HAND의 2개 그룹으로 나뉘었다(Antinori et al. above). MRI 분석을 일부 환자에 대해 수행하였다. 평균 3D 영상을 만들고, 디지탈 뇌 아트라스와 추가로 융합시켰으며(Montreal Neurological Institute), 여기서 좌우 기저핵(BG)가 확인되었다. 이는 각 영상에 대해 야코비값으로 측정된 팽창 또는 수축 부피 및 양을 계산할 수 있게 한다. 1보다 낮은 값은 주형에 대해 피험체 영상의 팽창을 의미하고, 1보다 높은 값은 부피 감소를 의미한다. BG의 대사 변화를 계산하였다. 콜린/N-아세틸 아스파테이트(Cho/NAA)는 신경세포 염증 마커이며 이전 문헌에 기술된 바와 같이 측정하였다(Ratai EM et al. PLoS One. 2010 May 7;5(5):e10523; Yiannoutsos CT et al. Neuroimage. 2008 Mar 1;40(1):248-55. Paul RH et al.J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 2007 Summer;19(3):283-92 Greco JB et al. Magn Reson Med. 2004 Jun;51 (6):1 108-14. Meyerhoff DJ et al. AJNR Am J Neuroradiol. 1996 May;17(5):973-8). 인지 손상 HIV 감염 환자의 BG에서, Cho/NAA 비율이 대체로 증가하였다.
도 19A는 HAND가 잇는 환자의 피각이 보다 크다는 것을 보여준다(1보다 낮은 야코비값; p=0.008). HAND가 있는 환자는 BG의 MRI-분광계 상에서 Cho/NAA 비율이 높았다(도 19B). 용적 및 대사 매개변수간 관계는 도 19C에 도시하였는데, 보다 큰 피각 용적이 0.575보다 높은 Cho/NAA 값과 관련되었다(p=0.02).
신경학적 및 면역학적 매개변수간 가능한 관련성을 조사하기 위해, 환자를, Cho/NAA 비율에 따라 계층화시키고 면역 마커를 비교하였다. 도 20은 높은 면역 활성화(CD8+CD38+HLA-DR+ T 세포의 %) 및 높은 수치의 항-HMGB1 및 IP10이 높은 Cho/NAA 값과 상관됨을 보여주었다.
결론
일부가 AIDS 연관 신경 질환을 앓고 있는, HIV 감염 환자 유래의 혈청 및 CSF에서 검출되는 가용성 매개인자의 상세 분석은 케모카인 IP-10의 고발현과 관련된 중요 수치의 항-HMGB1 항체(방출된 HMGB1과의 반응에서)를 특징으로 하는, CSF 염증 프로파일을 보여주었다. 케모카인은 신경 질환, 예컨대 다발성 경화증(MS)의 면역병인론에 연루되어 있으며, 특히 IP-10는 염증이 우세한 경우 MS 환자 유래의 CSF에서 높다고 보고된 바 있다(Scarpini E et al. J Neurological Sciences 195:41, 2002). HIV 감염 환자에서, IP-10 수치는 일차 및 무증상 HIV 감염 및 AIDS 치매 증후군을 갖는 피험체에서 증가되었고, CSF 바이러스 존재량과 양성적으로 상관된다는 연구가 보고되었다(Paola Cinquea et al. Cerebrospinal fluid interferon-Y-inducible protein 10(IP-10, CXCL10) in HIV-1 infection. J Neuroimmunology 2005). IP-10는 강력한 화학주성 인자이고 레트로바이러스 감염을 증가시키고 신경세포 손상을 매개한다고 시사된 바 있다. MCP1의 향염증성 및 그의 HIV-1 복제 상향조절 능력이 또한 높은 치매 위험성의 발생 원인이 된다는 것이 시사되었다. MCP-1은 HIV 복제용 숙주 세포가 되는 장소인 뇌로 감염 및/또는 활성화 단핵구가 이동하는 것을 촉진하고, 대식세포, 미세아교세포 및 성상세포를 활성화에 의해 수많은 강력한 신경 독수의 방출이 일어난다(Dhillon et al. Roles of MCP-1 in development of HIV-dementia. Front Biosci. 2008, 13: 3913-3918). 본 발명자의 관찰은 알라민 HMGB1 및 가장 중요하게 이러한 알라민에 특이적인 항체가 2기 내지 4기의 HIV 감염 환자 유래의 CSF에서 검출되고(IP-10 및 MCP-1에 부가적으로), 이들이 바이러스 복제 및 질환 진화와 관련됨을 보여주는 새로운 발견을 제시한다. 또한, 바이러스 복제가 억제된 환자에서 항-HMGb1 항체의 지속성이 2기 내지 4의 결정인자이다.
무 HAND/HAND 코호트에 대한 결과는 HAND가 염증 매개인자 및/또는 주변 T 세포상의 활성화 마커(CD38 및 HLA-DR 발현)를 포함하는, 면역 마커를 통해서 및/또는 MRI를 사용해(보다 큰 피각, 높은 Cho/NAA) 밝힐 수 있는 염증 패턴과 연관됨을 보여준다. 이러한 연구는 전체 항-HMGB1 항체 및 IP-10 수치가 HAND 환자에서의 BG 변화와 상관성이 있음을 처음으로 부여주어, HAND가 발병한 환자의 혈액에서 이들 2종 분자의 특정 중요성을 입증시켜 주었다. 중요하게, 이러한 관찰들은 처음으로 HAND와 관련된 MRI 및 분광계 매개변수, 예컨대 거대 피각 및 높은 Cho/NAA 수치를 면역학적 매개변수(항-HMGB1 항체 및 IP-10) 및 면역 활성화/염증 마커와 연결시켰다.
이러한 결과는 HMGB1/항-HMGB1 항체, IP-10, MCP-1의 조합이 CNS 내 국소 감염의 결정에 기여하고 반응임을 시사한다. 본원은 분자 시그내처 항-HMGB1 항체 및 IP-10 및/또는 MCP-1이, 신경 질환, 예컨대 AIDS을 갖거나 또는 갖지 않는, HMGB1이 관여하는 것으로 보이는, 질환의 진단 및 예후에 유용할 수 있음을 보여주었다.
변형 및 다른 구체예
본 발명의 개념과 본 발명에 개시된 생성물, 조성물 및 방법에 다양한 변형 및 별법이 본 발명의 범주 및 정신을 벗어나지 않고 이루어질 수 있음은 당분야의 숙련가에게 자명하다. 본 발명이 특정의 바람직한 구체예와 관련지어 기술되어 있으나, 청구된 발명을 그러한 특정 구체예에 국한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 의학, 면역학, 생물학, 화학 또는 약학 분야 또는 관련 분야의 숙련가에게 명백한 본 발명의 수행을 위해 기술한 방식의 다양한 변형들을 이하 첨부된 청구항의 범주에 포함시키고자 한다.
참조문헌 편입
본원에 인용되거나 또는 참조된 각 문헌, 특허, 특허출원 또는 특허 공개를 특히 본문내 참조 인용 주변의 특정 주제에 대해, 전체로 참조하여 편입시킨다. 그러나, 임의의 그러한 참조문헌이 배경기술을 구성함을 인정하는 것이 아니고 인용 문헌의 정확성 및 적절성을 반박할 권리는 유지된다.

Claims (20)

  1. 환자의 신경 질환, 특히 HIV 감염 환자에서 HIV 감염과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 신경 질환으로의 진행 상태의 시험관내 예후 방법으로서,
    a) 상기 환자로부터, 바람직하게는 일차 또는 급성 감염 동안 또는 만성 감염 동안 얻은, 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(High Mobility Group Box I: HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계
    를 포함하고, HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록, 신경 질환을 발전시키거나 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높고, 특히 HIV 감염과 관련된 신경 질환을 발전시키거나 HIV 감염과 관련된 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 높은 것인 시험관내 예후 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환자로부터 얻은 상기 샘플, 특히 혈청 또는 뇌척수액 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에서 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1을 추가로 정량하는 단계를 포함하고, HMGB1에 특이적인 항체의 수치 및 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1이 높을수록, 신경 질환을 발전시키거나 진행된 단계의 신경 질환을 발전시킬 위험이 더 높은 것인 특히 HIV 감염과 관련된 신경 질환의 진행 상태 또는 특히 HIV 감염과 관련된 신경 질환으로의 진행 상태의 시험관내 예후 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경 질환은 (1) 감염성 기원, 예를 들면 박테리아 감염, 병원체 감염, 바이러스 감염 또는 프리온에 의한 감염, 예컨대 HIV 감염에 의한 질환 또는 질병; 및 (2) 비감염성 기원 또는 기원 불명의 질환 또는 질병, 예를 들면 급성 신경세포 손상, 외상성 뇌손상, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 허혈후 뇌손상, 파킨슨병, 말초 신경계 및/또는 척수에 영향을 주는 임의의 질환, 예컨대 척수 손상, 근위축성 측색 경화증, 및 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증(MS)으로 이루어진 군에서 선택되는 질환 또는 질병과 관련된 것인 시험관내 예후 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 환자의 기저핵 내 용적 변화를, 바람직하게 자기 공명 영상 측정법에 의해 확인하는 단계; 및/또는
    (b) 상기 환자의 기저 내 대사 변화를, 바람직하게 혈청 콜린/N-아세틸 아스파테이트 비율(Cho/NAA)을 계산함으로써 확인하는 단계
    를 더 포함하는 것인 시험관내 예후 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 HIV에 감염되고, 레트로바이러스 요법을 받고 있는 것인 시험관내 예후 방법.
  6. 환자, 특히 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체의 면역 결핍을 평가하는 시험관내 방법으로서,
    a) 상기 환자로부터 얻은 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계
    를 포함하고, HMGB1에 특이적인 항체가 많을수록, 면역 결핍이 더 높은 것인 시험관내 방법.
  7. 환자, 특히 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체에서 면역 활성화도를 측정하는 시험관내 방법으로서,
    a) 상기 환자로부터 얻은 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계
    를 포함하고, HMGB1에 특이적인 항체가 많을수록, 면역 활성화가 더 지속되는 것인 시험관내 방법.
  8. HMGB1이 관여하는 것으로 보이는 질환 또는 질병의 진행 상태의 시험관내 예후 방법으로서,
    a) 상기 환자로부터 얻은, 뇌척수액 샘플 또는 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 뇌척수액 샘플, 상기 혈청 샘플 또는 상기 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계
    를 포함하고, HMGB1에 특이적인 항체의 수치가 높을수록, 진행된 단계의 상기 질환 또는 상기 질병을 발전시킬 위험이 높은 것인 시험관내 예후 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 질환 또는 질병은
    (a) (1) 감염성 기원, 예를 들면 박테리아 감염, 병원체 감염, 바이러스 감염 또는 프리온에 의한 감염, 예컨대 HIV 감염에 의한 질환 또는 질병; 및 (2) 비감염성 기원 또는 기원 불명의 질환 또는 질병, 예를 들면 급성 신경세포 손상, 외상성 뇌손상, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 허혈후 뇌손상, 파킨슨병, 말초신경계 및/또는 척수에 영향을 주는 임의의 질병, 예컨대 척수 손상, 근위축성 측색 경화증, 및 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증(MS)으로 이루어진 군에서 선택되는, 신경 질환이 존재하는 질환 또는 질병,
    (b) 감염성 기원 또는 자가면역 기원의, 신경 질환이 없는 질환 또는 질병, 예컨대 제1형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 류마티스성 관절염, HSV-2 감염, 만성 B형 간염, 레지오넬라(Legionella) 감염, 패혈증 또는 천식
    인 시험관내 예후 방법.
  10. 환자에서 신경 질환, 특히 HIV 감염 환자에서 AIDS와 관련된 신경 질환의 존재의 시험관내 진단 방법으로서,
    (a) 통상적인 임상 기준에 의해 신경 질환의 존재 또는 부재를 평가하는 단계; 및
    (b) 상기 환자로부터 얻은 뇌척수액 샘플, 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를, 상기 샘플을 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시킨 후, 정량하는 단계
    를 포함하고, HMGB1에 특이적인 항체의 수치는 통상적인 임상 기준에 의한 신경 질환의 존재의 진단과 상관성이 있는 것인 시험관내 진단 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에 존재하는 케모카인과 같은 다른 분자의 정량 단계, 바람직하게는 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1의 정량 단계를 더 포함하는 것인 시험관내 방법.
  12. HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체의 병태를 모니터링하는 시험관내 방법으로서,
    a) 상기 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플, 혈청 샘플 또는 혈청 샘플과 뇌척수액 샘플 둘 모두를 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 것에 의해, 상기 샘플(들)에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계; 및
    b) 상기 피험체로부터 얻은 상기 동일 샘플(들)에서 케모카인 IP-10 및/또는 케모카인 MCP-1을 정량하는 단계
    를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 정량된 HMGB1, 및 상기 정량된 IP-10 및/또는 상기 정량된 MCP-1을 각각 HIV에 감염되지 않은 피험체로부터 얻은 샘플 유래, 또는 다른 시점 또는 다른 시점들에 동일 피험체로부터 얻은 샘플 유래의 정량된 HMGB1, 및 정량된 IP-10 및/또는 정량된 MCP-1의 양과 비교하는 것인 시험관내 방법.
  14. 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 시험관내 방법으로서,
    a) 상기 뇌척수액 샘플을 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
    b) HMGB1에 특이적인 항체를 정량하는 단계
    를 포함하는 시험관내 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계 전에, 샘플을 샘플에 존재하는 면역 복합체가 해리되도록 산 처리, 바람직하게는 낮은 pH에서 1.5 M 글리신으로 처리하는 단계를 포함하며, 상기 방법에서, 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 정량된 항체는 HMGB1에 특이적인 전체 항체인 시험관내 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1)에 특이적인 항체는 상기 항체의 순환 분획(순환 항체) 또는 이들의 면역학적 복합 분획인 시험관내 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 단백질 유도체는 재조합 HMGB1, HMGB1의 면역학적 반응성 부분, 다양한 기원의 HMGB1 단백질과 서열이 공통인 HMGB1의 면역학적 반응성 부분 및 인간 및 마우스의 HMGB1과의 공통 서열에 상응하는 HMGB1 유래의 재조합 BOXB로 이루어진 군에서 선택되는 것인 시험관내 방법.
  18. HIV에 감염된 피험체에서 HIV 감염을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 상기 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플에 함유된 하이 모빌리티 그룹 박스 I(HMGB1) 단백질을 정량하는 단계를 포함하고, 정량의 대상인 상기 HMGB1 단백질은 전체 HMGB1 또는 이의 순환 분획(순환 HMGB1) 또는 이의 면역학적 복합 분획인 시험관내 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 정량된 HMGB1을 HIV에 감염되지 않은 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플 유래의 HMGB1의 양, 또는 다른 시점에 동일 피험체로부터 얻은 뇌척수액 샘플 유래의 HMGB1의 양과 비교하는 것인 시험관내 방법.
  20. 제5항 내지 제7항 및 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HIV가 HIV-1 또는 HIV-2인 시험관내 방법.
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