CN102209897B - 通过调节hiv-1复制和顽固存在的hmgb1依赖性触发来监测和抑制人免疫缺陷病毒感染 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)与天然杀伤(NK)细胞的相互作用的能力的物质的用于调节人免疫缺陷病毒感染的组合物和方法。本发明包含如甘草甜素等与HMGB1结合的抗体和药物的治疗组合物。本发明涉及对生物样品中的HMGB1或对于HMGB1具有特异性的抗体进行检测或定量的HIV感染检测或监测方法。

Description

通过调节HIV-1复制和顽固存在的HMGB1依赖性触发来监测和抑制人免疫缺陷病毒感染
技术领域
本发明涉及对HMGB1水平和/或针对HMGB1而特异性出现的抗体进行测定的诊断和预后方法。用于通过调节HMGB1活性来治疗或降低人免疫缺陷感染的严重性的基于抗体和基于药物的方法。
背景技术
早期HIV-1感染与天然免疫的重要效应子(NK细胞和DC)的局部募集和激活相关联。在粘膜感染的最初的数小时和数日中，HIV-1穿越上皮屏障并感染粘膜组织中的CCR5表达性DC、巨噬细胞和T细胞以引发感染1,2。DC表达促进捕获和散播HIV-1的CD4、CCR5、DC-SIGN3和其它C型凝集素受体(CLR)4,5。未成熟DC(iDC)通过CLR捕获HIV-16，且捕获的病毒可以被内化并以感染性突触的形式快速传递至附近的CD4T细胞7,8。DC-T细胞缀合物促进CD4T细胞中的生产性感染9，且携带病毒的DC以及受感染的巨噬细胞和CD4T细胞保证了对排出淋巴结和随后的其它淋巴样组织区室的感染的散播10。
摄取病毒后iDC向次级淋巴样组织的T细胞区域的迁移与使得所产生的成熟DC(mDC)能够刺激抗原特异性响应的成熟过程相关11。近来，据发现DC的归趋极度依赖于自体NK细胞12。NK-iDC相互作用导致NK细胞的激活，这反过来根据对应的DC密度而诱导DC成熟或杀伤13,14,15。经历成熟的DC分泌数种充当NK细胞激活和细胞毒性的有力诱导物的细胞因子，诸如IL-12和IL-1816,17,18,19,20。反过来，一旦NK细胞被激活，其产生能够诱导DC成熟的IFN-γ和TNF-α。该现象依赖于由表达于iDC上的配体的NKp30衔接17,21、和iDC上的HLA-E的下调，HLA-E是CD94/NKG2A抑制性受体的配体。所提出的另一种机理表明，由突触间隙处的iDC所释放的IL-18激活的NK细胞分泌 HMGB1，这诱导DC成熟并保护DC免受裂解20。HMGB1是存在于几乎所有真核细胞中的核蛋白，且其起着稳定核小体形成的功能，并且充当调节数种基因的表达的转录因子样蛋白23,24。HMGB1从坏死细胞释放，但其也能由激活的巨噬细胞25和激活的NK细胞20在响应于炎性刺激时释放，且其为损伤相关分子模式分子(DAMP)的主要原型26。近来发现，HMGB1是免疫系统中的关键细胞因子，其促进炎性白血球的转运，且对于DC的成熟、到达淋巴节和维持抗原特异性T细胞的增殖以及促进其向T辅助1表型的极化都至关重要27,28。
对于涉及病毒感染期间NK-DC相互作用的机理的认识甚少。近来据报道，在小鼠CMV(MCMV)感染中，MCMV感染的DC能体外激活同基因NK细胞，并且还能在体内增强NK细胞依赖性清除29，从而表明NK-DC的遗传交谈(cross-talk)在控制病毒复制中的关键作用。在HIV感染中，据发现NK-DC相互作用在HIV-1感染的病毒血症患者而不是非病毒血症患者中有缺陷，所述病毒血症患者的特征在于互利性NK-DC激活和成熟的过程中的异常以及iDC的NK细胞消除中的缺陷30。对NK-DC遗传交谈在受HIV-1感染的iDC的病毒复制物的成熟、功能和易感性上的作用进行评估。据发现，HIV-1感染的DC的成熟可以由激活的NK细胞所引发，但其与成熟的受感染DC的较强受损有关，所述受感染DC的受损在其与NK细胞的遗传交谈后诱导Th1极化。另外，NK细胞和HIV-1感染的iDC之间的遗传交谈导致DC中的病毒复制物和前病毒DNA表达物的显著增加。该过程主要由NK细胞和DC两者释放的HMGB1作为NK-DC遗传交谈的结果而引发。
HIV-1已进化出利用DC的方法，由此促进病毒散播和允许侵入抗病毒免疫。DC的归趋依赖于NK细胞。下文中，本发明人详细描述的NK-DC的遗传交谈对HIV-1感染的DC的归趋的影响。激活的NK细胞有效激发受感染DC的成熟，但这与诱导Th1极化的成熟DC的较强损伤有关。此外，NK细胞与受感染DC之间的遗传交谈导致DC中病毒复制物和HIV-DNA的显著增加。HMGB1在该过程中至关重要，且由甘草甜素或特异性抗体对HMGB1活性的抑制废止了DC中的HIV-1复制。本发明人描述了其对于HIV如何“劫持”DC以有效促进病毒散播的新认识如何能够提供抑制HIV感染的新方法、诊断和监测HIV感染的新方法、监测HIV感染、病毒载量和针对HIV感染的治疗 的效率的新方法、以及执行对AIDS或近AIDS的进展状态的预后的新方法。
发明内容
本发明的各个方面包括以下治疗性、预后性和诊断性应用。
在患者中阻断HMGB1能有助于抑制HIV复制、减少DC中的HIV贮存和减缓疾病进展。因此，本发明的一方面涉及调节人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，所述方法包括使受HIV感染的受试对象与结合HMGB1的试剂相接触，特别是结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)的抗体或HMGB1结合抗体片段、甘草甜素或能结合HMGB1的分离的RAGE或RAGE片段。本发明还与用作治疗受HIV感染的受试对象中的HIV感染的药物的结合HMGB1的试剂有关，特别是结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)的抗体或HMGB1结合抗体片段、甘草甜素或能结合HMGB1的分离的RAGE或RAGE片段。可以用于治疗中的特定试剂是特异性阻断HMGB1的抗体或此类抗体的片段，特别是保持所述特异性阻断HMGB1的能力的抗体片段。片段的实例是单链抗体或Fab、Fv和Fab2片段。在一个具体实施方式中，所述抗体是单克隆抗体，或所述抗体是单克隆抗体的一部分。在另一个具体实施方式中，所述抗体或片段优选是人类的或人源化的。“特异性阻断”是指抗体或其片段具有结合HMGB1蛋白并阻止或减少其活性的能力，特别是阻止其在其至少一个受体、特别是RAGE受体上的结合。在一个具体实施方式中，通过测试HMGB1在其至少一个受体上的结合和/或通过测试HMGB1在树突状细胞(DC)成熟(不管是否受HIV感染)方面、在DC中的HIV复制方面和/或在DC中的HIV DNA的表达方面的活性，可以测试本发明的抗体或其片段的阻断行为的出现。据认为，当如上定义的HMGB1在其受体之一(特别是RAGE)上的结合的减少或HMGB1的活性的减少为大于50%、大于60%、大于70%、大于80%或大于90%时，抗体或其片段被特异性阻断HMGB1蛋白。
在本发明的背景下，术语“特异性地”或“特异性”是指抗体或其片段相比其他细胞蛋白能更优选识别并结合HMGB1蛋白，并且特别地不会显著识别和结合参与免疫系统的其它细胞蛋白(特别是在 NK-DC遗传交谈的背景下)或不会显著识别和结合其它细胞蛋白。在本申请中，除非另外声明，涉及抗体的描述应用于如上公开的它们的片段。
虽然不受特定作用机理的限制，本方法可以通过减少树突状细胞中的病毒复制和病毒贮存的补充而起作用。因此，本发明也涉及如上所述与HMGB1结合的试剂，其用作减少受HIV感染的受试对象中的HIV贮存细胞的药物。HIV贮存细胞可以是对于HIV敏感和/或能被HIV感染的任何细胞。在一个具体实施方式中，HIV贮存细胞蕴藏着前病毒DNA。HIV贮存细胞源自如血液、实体组织或粘膜等生物组织，且具体而言来自脑、肝、脾、扁桃体、节点或肠相关淋巴样组织(GALT)。在一个具体实施方式中，这些细胞是外周血细胞、如T细胞(尤其是TCD4细胞)等淋巴样细胞系，或为如巨噬细胞或树突状细胞等单核细胞衍生细胞。
人免疫缺陷病毒包含HIV-1和HIV-2毒株以及该病毒的其他变体，包括类人猿和其他哺乳动物所适应的HIV毒株。
本发明也应用于对于由包括HIV-2和类人猿免疫缺陷病毒(SIV)的其他逆转录病毒造成的感染的治疗、诊断和监测。受如HIV等逆转录病毒感染的受试对象或患者包括人、猴和其他类人猿以及其他哺乳动物所用HIV感染模型。
具体的HIV-1毒株包括R5HIV-1毒株和X4HIV-1毒株。
HMGB1是公知的出现在细胞核中的蛋白并且已知其为细胞因子。HMGB1的物理和功能特征由Lotze等，Nature Reviews,Immunology5:351(2005)所公开，且通过参考将其并入。
结合HMGB1的抗体是已知的且可通过本领域公知方法来制备。商购抗HMGB1抗体的一个实例是兔抗人HMGB1多克隆一抗(Abeam ref.18256)，其针对源自人HMGB1的第150号残基至C端的KLH缀合的合成肽。这些方法包括产生抗HMGB1多克隆抗体和抗HMGB1单克隆抗体或抗特定HMGB1片段的单克隆抗体的那些方法。用于治疗性应用的抗体的特征在于阻断、尤其是其干扰受感染树突状细胞中的HMGB1所诱导的HIV复制。这些抗体优选源自与其所施用至的受试对象相同的物种并且进行识别，或其被针对其将被施用至的相同物种 的HMGB1而诱导。这些抗体可以具有不同的同种型，例如IgA、IgG或IgM同种型。也可采用结合HMGB1的抗体片段，包括Fab、Fab2和单链抗体或其片段。
也可采用在人类中具有治疗性的人源化抗HMGB1单克隆抗体。这些抗体可通过本领域公知方法制备。将这些抗体向具有高病毒载量和升高的HMGB1水平的HIV感染患者注射能用于减少病毒复制和限制贮存细胞的数目。此类人源化抗体可以用作挽救治疗或替代治疗，或者可与抗逆转录病毒剂组合。
结合HMGB1的如本文所定义的抗体或其片段可以施用于受试对象以结合HMGB1和调节患者中的HIV复制或感染。施用模式包括但不限于静脉内(i.v.)、皮内、皮下(s.c.)、脑内、透粘膜、透皮、通过吸入(例如，气管内、肺内或支气管内)、鼻内、口服、颊内、透皮和直肠施用。
考虑到其对于炎性响应以及受感染DC的成熟和存活的影响，可以采用靶向HMGB1生成或释放或者阻止其与其受体(特别是DC上的RAGE)的相互作用来治疗慢性病毒感染。因此，可以采用诸如结合HMGB1受体(例如，RAGE)并且抑制其与HMGB1或可溶性HMGB1受体蛋白(例如，能结合HMGB1的可溶性RAGE蛋白或片段)的相互作用的抗体或抗体片段等试剂，所述可溶性HMGB1受体蛋白抑制DC上的HMGB1受体(例如，RAGE)与HMGB1的功能性相互作用。也考虑结合DC上RAGE并且抑制HMGB1与DC的功能性相互作用的HMGB1部分。
本发明人已展示出，甘草甜素能够抑制DC中的HMGB1依赖性HIV复制。甘草甜素疗法几乎没有副作用并且近来其被成功在体内用于预防患有IFN抵抗性活性慢性丙型肝炎的患者中的肝细胞癌发生。该疗法可以用于具有可检测的病毒载量和增加的HMGB1水平的慢性HIV感染患者中，既可因多药物抗性病毒的存在而作为挽救性疗法，也可作为对于使用HIV特异性抗逆转录病毒剂的替代性疗法(毒性更低且作用于炎性微环境而不是病毒本身)，或可在抗逆转录病毒剂不完全成功的情形中用作与这些康逆转录病毒剂的组合疗法。
因此，本发明的再一个方面是用于调节人免疫缺陷病毒(HIV)感染(包括HIV-1感染)的方法，该方法包括使受HIV感染的细胞或受试对象与一定量的试剂接触，所述试剂结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)、 特别是抑制树突状细胞(DC)中的HIV复制的天然杀伤(NK)细胞依赖性触发。本发明还涉及结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)、特别是抑制树突状细胞(DC)中的HIV复制的天然杀伤(NK)细胞依赖性触发的试剂，该试剂用于调节受HIV感染的细胞或患者中的人免疫缺陷病毒(HIV)感染(包括HIV-1感染)。
甘草甜素是一种此类试剂并且在Mollica等，Chem.Biol.14:431(2007)中公开了可用于提供与HMGB1的结合的甘草甜素的模式和浓度，本文通过参考并入其内容。也可采用除甘草甜素以外的其他结合HMGB1的试剂或化合物。可以采用与HMGB1结合的可溶性配体或天然配体的片段。此类配体可以获自与HMGB1结合的白细胞或抗原呈递细胞。
可以使用本文公开的抗体、抗体片段和其他HMGB1结合试剂来治疗受HIV感染或具有HIV感染风险的人类患者，以便维持患者的免疫系统，所述治疗包括采用特异性阻断HMGB1的抗体或保留所述特异性阻断HMGB1的能力的片段。由于甘草甜素无毒而许多抗逆转录病毒药会造成显著毒性，因此本发明的治疗可以减少传统抗HIV疗法的恶性副作用。识别HMGB1的抗体类产品也缺乏许多抗HIV药的毒性，且也能被用于减少HIV治疗的副作用。类似地，可以采用本发明的方法、包括结合HMGB1的抗体产品和其他试剂来对对于常规逆转录病毒药物治疗具有抗性或已发展出多重抗性的人类患者进行高级治疗。也考虑到甘草甜素(或人源化阻断性抗HMGB1抗体)与较低剂量的抗逆转录病毒药(剂量低于单独使用时的剂量)的组合疗法。
这些HMGB1结合试剂或化合物可以单独使用，或与至少一种其他抗HIV感染的活性化合物组合使用，或者与用于治疗HIV感染的其他试剂(如药物和药物制剂)组合施用。此类药物和药物制剂的实例包括两种核苷类似物逆转录酶抑制剂(NARTI或NRTI)、蛋白酶抑制剂和包括AZT和印地那韦(Indinavir)的非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。
本发明还包括适于施用于人类受试对象的无菌组合物，所述无菌组合物包含分离的结合高迁移率族蛋白I(HMGB1)的抗体或抗体片段、其他HMGB1结合试剂和/或甘草甜素，其还包含药物可接受载剂、赋形剂或稀释剂。这些组合物可以含有除所述抗体、抗体片段和/或甘草甜素以外的用于治疗人免疫缺乏病毒感染的其他药物或药物制剂，如上文所述 的那些。一般而言，用作HIV感染的人类患者的治疗工具的抗体应该是阻断HMGB1活性的人类抗体或人源化抗体。
本发明的其他方面包括用作治疗人类中HIV感染的甘草甜素、甘草甜素在用于HIV感染的治疗性应用的药物的制造中的应用、以及分离的人源化HMGB1阻断特异性抗体在HIV感染中的治疗性应用的药物的制备中的应用。
本发明还涉及对获自受试对象的生物样品中所含的HMGB1特异性总抗体进行定量的体外方法，所述方法包括(a)优选采用1.5M甘氨酸在较低pH下，通过酸处理来处理所述样品以使发现于所述样品中的HMGB1相关性免疫复合物解离；(b)使所述经处理的生物样品与天然HMGB1蛋白或其衍生物接触；和(c)对高迁移率族蛋白I(HMGB1)特异性总抗体进行定量。
在一个优选实施方式中，所述酸处理由以下过程组成：在不改变与HMGB1蛋白免疫学结合的抗体的结合能力的情况下，将样品与具有较低pH值(优选在pH1～3)的选定用以将样品中的HMGB1蛋白与上述抗体分离的酸性解离溶液接触。在一个具体实施方式中，所述酸性解离溶液是处于较低pH、优选在pH1～3(例如，1.85)的甘氨酸(例如，1.5M)。然后用中和缓冲液(如Tris，例如，pH9的1.5M Tris)终止酸处理。在另一个优选实施方式中，不管是否与前述实施方式组合，在20℃～37℃(优选25℃)进行与酸性解离溶液的温育，和/或所述中和步骤在冰中进行。
在本申请中，术语“定量(quantitating)”涵盖了术语“定量(quantifying)”和任何合适的对HMGB1蛋白或特异性抗体的信息确定。
本发明还涉及用于监测获自已知被HIV感染的受试对象的生物样品中的HIV感染的体外方法，所述方法包括对获自该患者的生物样品中所含的对于高迁移率族蛋白I(HMGB1)具有特异性的抗体进行定量，其中定量所针对的所述抗体是对于HMGB1具有特异性的总抗体或其循环组分(循环抗体)或其免疫学复合组分。
用于监测HIV感染、病毒载量或本文公开的治疗和预后方法的效力的方法可以基于以下进行实施：对具有HMGB1特异性的循环(残留) 抗体的定量，或对具有HMGB1特异性的总抗体的定量，或对免疫学HMGB1/特异性抗体复合物的组分的定量。
在一个具体实施方式中，所有这些方法都基于对循环的特异性抗体或总特异性抗体的定量。
当HMGB1特异性循环抗体的水平较低时，可以优选对具有HMGB1特异性的总抗体的定量。
当定量基于具有HMGB1特异性的总抗体时，本发明的方法还包括适于使与HMGB1特异性抗体形成的免疫学复合物解离的步骤，例如，本发明的方法使用或包含基于上文所公开且如实施例中所述的酸性处理的定量方法。
在一个具体实施方式中，所述对具有HMGB1特异性抗体的定量通过使生物样品(获自受试对象)与高迁移率族蛋白I(HMGB1)或其衍生物接触而进行。样品与所述抗体的接触以及对所形成的复合物的定量在体外进行。
本发明还涉及用于监测获自已知被HIV感染的受试对象的生物样品中的HIV病毒载量的方法，所述方法包括执行本文所述的对具有HMGB1特异性的总抗体的定量方法或基于具有HMGB1特异性的抗体的监测方法，其中具有HMGB1特异性的抗体越多，病毒载量越少。
“病毒载量”是指HIV RNA(源自病毒颗粒且存在于血浆中)或HIV DNA(其整合于细胞基因组中且存在于细胞中)。在一个具体实施方式中，本发明的基于对具有HMGB1特异性的抗体的定量的方法适于监测HIV RNA病毒载量。
可以理解，对于定量方法以及对HIV感染、病毒载量或本发明的治疗和预后方法的效力的监测的方法而言，可以使用全长HMGB1蛋白(源自哺乳动物、优选源自人类)或源自HMGB1的任何肽(10～30个氨基酸残基)或多肽(30～215个氨基酸残基，优选30～50、30～100或30～150个氨基酸残基)(HMGB1蛋白衍生物)的序列，条件是这些衍生物与具有HMGB1特异性的抗体结合和/或使得能够对抗HMGB1抗体进行定量。此类衍生物选自重组HMGB1(例如，HMG biotech,HM-115)、HMGB1的免疫学反应性部分、其序列是不同来源的HMGB1蛋白所共有的HMGB1的免疫学反应性部分。此类衍生物的一个实例是对应于人类和 小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB(HMGbiotech HM-051)。
这些方法在获自受HIV感染的受试对象的生物样品上进行，例如，血液、血浆、血清、唾液或者任何体液或身体组织。
“监测HIV感染”是指将HIV感染的进展(即减少、增加或稳定)与此前测试进行比较。HIV感染的进展反映了HIV复制和/或HIV基因组向靶细胞基因组内的整合。
本发明还涉及用于监测受HIV感染的受试对象中针对HIV感染的治疗的效力的体外方法，所述方法包括在所述治疗期间的不同时间在获自所述受试对象的样品上执行本文所述的对具有HMGB1特异性的总抗体的定量方法或基于具有HMGB1特异性的抗体的监测方法，和确定给予所述受试对象的所述治疗的效力。
在本发明的该方法中，可以将HIV感染的患者中的HMGB1特异性抗体的量与未受感染(即未受HIV感染)的患者中的HMGB1特异性抗体的量进行比较。
此外，可以将HMGB1特异性抗体的量与在不同时间(例如在感染之前、在原发性、急性或慢性感染期间，或者在开始治疗前，例如，在治疗前或治疗期间的每个月)获自相同受试对象的量进行比较。
根据本发明，在具有HMGB1特异性的总抗体的量相比于治疗前相同患者中HMGB1特异性的总抗体的量减少(优选在M6(治疗开始后6个月)减少至少1.5倍，或在M12减少至少2倍或至少3倍)时，物质的施用提供“治疗”。更一般而言，术语“治疗”是指用于减少HIV感染(即HIV RNA和/或HIV DNA)的任何方式。本发明的治疗涵盖使用如核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、融合或侵入抑制剂、整合酶抑制剂等抗逆转录病毒药或其任意组合的常规治疗的资源。
本发明还针对受HIV感染的患者中的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的进展状态或朝AIDS进展的状态的体外预后方法，所述方法包括在感染后、优选在原发性或急性感染期间或者在慢性感染期间在获自所述患者的样品中执行上文所公开的HIV感染监测方法，且其中 具有HMGB1特异性的抗体的水平越高，则发展AIDS或晚期AIDS状态的风险越高。
术语“预后”是指在对来自获自患者的样品的具有HMGB1特异性的总抗体进行定量时，对患者发展AIDS或朝AIDS进展的风险进行评估的可能性。表达“进展状态”是指在AIDS进展或朝向AIDS进展中的不同阶段，且特别是指由世界卫生组织制定和更新的HIV感染和疾病的WHO疾病分期系统，对其总结如下。I期：HIV疾病无症状且不归类为AIDS；II期包括轻微的皮肤和粘膜表现形式以及复发性上呼吸道感染；III期包括超过一个月的不明原因的慢性腹泻、严重细菌感染和肺结核；而IV期包括大脑弓形体病、食道、器官、支气管或肺念珠菌病以及卡波西肉瘤。
上文公开的涉及对HMGB1特异性抗体的定量的体外方法中的任何一种可以通过使用涂布于固体基体上的高迁移率族蛋白I(HMGB1)或其衍生物、且可选地使用能检测HMGB1特异性抗体的二抗来实施ELISA或其它免疫学监测方法而进行。
基于下文所示结果，本发明人已发现HMGB1触发HIV-1感染的患者中的HIV复制。结果，本发明的另一方面涉及对来自HIV感染的受试对象的生物样品(如血清)中的HMGB1浓度的增加的检测。也可以使用病毒载量与HMGB1浓度的正相关来监测HIV感染。HMGB1水平的增加可能与疾病进展相关联或者与更差的预后有关。生物样品中的HMGB1浓度可以采用公知的诊断测试(如ELISA测试)进行定量。重组hHMGB1、抗hHMGB1 mAb和兔抗hHMGB1血清可商购并且可用在此类诊断测试中。此类测试用于对患者样品中的HMGB1浓度进行定量，以鉴定作为HIV感染进展的预后标记物的HMGB1，并且监测人源化抗HMGB1抗体的体外效应。
本发明还涉及监测受HIV感染的受试对象中的HIV感染的体外方法，所述方法包括对获自所述受试对象的生物样品中所含的高迁移率族蛋白I(HMGB1)进行定量，特别是通过使来自所述受HIV感染的受试对象的生物样品与免疫结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)的抗体相接触，其中定量所针对的HMGB1蛋白是总HMGB1蛋白或其循环组分(循环HMGB1)或其免疫学复合组分。
监测HIV感染、病毒载量或本文所公开的治疗和预后方法的效力的方法可以基于如下实施：基于对循环(残留)HMGB1的定量、基于对总HMGB1的定量或基于对免疫学HMGB1/特异性抗体复合物的组分的定量。
在一个具体实施方式中，所有这些方法都基于对循环HMGB1或总HMGB1的定量。当循环HMGB1的水平较低时，优选对总HMGB1进行定量。当定量基于总HMGB1时，本发明的方法还包括适于使与HMGB1特异性抗体形成的免疫学复合物解离的步骤，例如，本发明的方法使用或包括对样品的酸性处理。
合适的酸处理包括：在不改变HMGB1蛋白及其由特异性抗体的识别能力的情况下，将样品与具有较低pH值(优选在pH1～3)的选定用以将HMGB1蛋白与所述特异性抗体分离的酸性解离溶液接触。在一个具体实施方式中，所述酸性解离溶液是处于较低pH、优选在pH1～3(例如，1.85)的甘氨酸(例如，1.5M)。然后用中和缓冲液(如Tris，例如，pH9的1.5M Tris)终止酸处理。在另一个优选实施方式中，不管是否与前述实施方式组合，在20℃～37℃(优选25℃)进行与酸性解离溶液的温育，和/或所述中和步骤在冰中进行。
可以将HMGB1蛋白的定量与来自获自未受HIV感染的受试对象的生物样品的HMGB1量进行比较，或与来自在不同时间获自相同受试对象的生物样品的HMGB1的量进行比较。
本发明也涉及用于检测获自已知受HIV感染的受试对象的生物样品中的HIV病毒载量的方法，所述方法包括进行HMGB1蛋白的定量，其中HMGB1蛋白越多，病毒载量越多。“病毒载量”是指HIV RNA(源自病毒颗粒且存在于血浆中)或HIV DNA(其整合于细胞基因组中且存在于细胞中)。在一个具体实施方式中，本发明的基于对HMGB1的定量的方法适于监测HIV RNA病毒载量。
本发明也涉及用于监测受HIV感染的受试对象中针对HIV感染的治疗的效力的体外方法，所述方法包括在所述治疗期间的不同时间在获自所述受试对象的样品上执行上文公开的对基于HMGB1蛋白的HIV感染的监测方法，和确定给予所述受试对象的所述治疗的效力，且可选地将其与在治疗开始前获自相同受试对象的样品中的结果相比较。 根据本发明，在细胞HMGB1蛋白的量相比于治疗前相同患者中HMGB1的量减少(优选在M1(治疗开始后1个月)减少至少1.5倍，或在M3减少至少2倍)或达到获自健康供体的样品中的值(小于500pg/ml)时，物质的施用提供“治疗”。当总HMGB1蛋白的量达到获自健康供体的样品中的值时，也认为治疗是有效的。更一般而言，术语“治疗”是指用于减少HIV感染(即HIV RNA和/或HIV DNA)的任何方式。
本发明还涉及受HIV感染的患者中的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的进展状态或朝AIDS进展的状态的体外预后方法，所述方法包括在感染后、优选在原发性或急性感染期间或者在慢性感染期间在获自所述患者的样品中通过上文所公开的任何方法对HMGB1进行定量，且其中总HMGB1的水平越高，则发展AIDS或晚期AIDS状态的风险越高。上文给出的关于基于具有HMGB1蛋白特异性的抗体的预后方法的定义在此处也适用。
本发明的另一方面涉及用于对样品中的对于高迁移率族蛋白1(HMGB1)具有特异性的总抗体进行定量的试剂盒，所述试剂盒包含：a)如上定义的天然HMGB1蛋白或其衍生物；和b)适于将在取自患者时发现于所述样品中的免疫学HMGB1/抗HMGB1抗体复合物解离的酸性解离溶液。
本发明还涉及用于对样品中高迁移率族蛋白1(HMGB1)进行定量的试剂盒，所述试剂盒包含：a)如上定义的具有HMGB1蛋白特异性的抗体，或其能结合所述HMGB1蛋白的片段；和b)适于将在取自患者时发现于所述样品中的免疫学HMGB1/抗HMGB1抗体复合物解离的酸性解离溶液，如上文所限定。必要时，这些试剂盒还可包含中和缓冲液(例如如上文定义的中和缓冲液)和/或与HMGB1/特异性抗体复合物结合和/或揭示其形成的二抗。
因此，本发明的再一个方面是对免疫缺陷病毒(HIV)感染的诊断(包括不同诊断)或对受试对象中的HIV感染的风险的评估。该诊断方法涉及使获自疑似正受HIV感染的受试对象的生物样品(如血液、血浆、血清、唾液或其它体液)与免疫学结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)的抗体接触，和检测所述样品中的任何HMGB1与结合HMGB1的抗体或抗体片段之间的复合物形成。所述样品与所述抗体的接触以及对所形成 的复合物的检测在体外进行。相比于未受HIV感染的对照受试对象中的复合物形成、或相比于在HIV感染(如HIV-1感染)前的所述受试对象中的复合物形成，基于抗体-HMGB1复合物的形成的增加可以确定对经受HIV感染的诊断或表明其风险。此类诊断方法的一个实例是使用涂布于固体基体上的单克隆抗体和多克隆抗体的检测HMGB1的ELISA的应用，其用于检测结合于经涂布的mAb的HMGB1。
作为人类或非人类受试对象的整体诊断过程的一部分，还可以进行排除或控制所述受试对象中的急性和/或慢性炎症或者指示测试受试对象中的HIV的存在或滴度的其他诊断测试。
相似地，通过使来自受试对象的生物样品与结合高迁移率族蛋白1(HMGB1)的抗体或抗体片段接触并对在所述样品中的HMGB1与所述抗体之间的复合物形成进行定量，可以监测已知受HIV感染或此前受HIV感染的受试对象。样品与所述抗体的接触以及对形成的复合物的定量在体外进行。此处，复合物的量指示着所述受试对象中的HIV复制的NK依赖性触发的程度，且因此是HIV感染的严重性或进展的量度。可以将复合物形成与获自未受HIV感染的受试对象的生物样品中的复合物形成的量相比较，或与在不同时间(如感染前或者在前的急性或慢性感染期间)获自相同受试对象的复合物形成的量相比较。该方法还可涉及排除或控制受试对象中不与HIV感染相关的可归因于HMGB1的急性和/或慢性炎症的其他诊断测试，且可伴随针对受试对象中的HIV存在或病毒载量的其它诊断测试。
在进行本发明的诊断测试之前，可以用酸对生物样品(如血清或血浆)进行处理以使HMGB1与结合HMGB1的其它蛋白分离，参见Gaillard等，PLOS One3(8)e2855,第1-9页(2008)，本文通过参考将其作为包含酸处理的HMGB1蛋白检测和测定用高灵敏度方法的教导而特别并入。此类处理增加可由抗体识别所利用的HMGB1表位的数目。酸处理是可选的，因为某些HMGB1抗体与未受其它蛋白的结合所阻断的蛋白区域相结合。
用于诊断性应用的抗体不必阻断HMGB1的活性，且可以为结合HMGB1的多克隆或单克隆抗体或抗体片段。此类抗体可以通过已知方法从如小鼠、大鼠和兔等动物衍生，或可以通过本领域公知的其它方 法产生。可以将用于诊断或检测HMGB1水平的抗体或其它HMGB1结合剂配制到试剂盒中，所述试剂盒包含有关如何进行测试的书面或电子说明书、缓冲液、防腐剂、阴性和/或阳性对照样品、固体基体以及容器或包装材料。
附图说明
图1.aNK细胞诱导原代未成熟HIV-1感染的DC的成熟。(a)将在存在IL-4和GM-CSF时产生自纯化的CD14+单核细胞的iDC在24小时期间与aNK细胞以不同比例共培养。DC存活率采用7-AAD测试通过流式细胞术确定。存活的DC被将定为7AAD-CD56-细胞。数据表示三次独立实验，且值为平均值±标准偏差。(b)aNK细胞诱导iDC的成熟。对iDC进行流式细胞术分析，所述iDC由R5-HIV-1BaL(1ng/ml的p24)感染3小时或未受感染，其与rNK细胞或aNK细胞以1:5的比例温育。用HLA-DR和CD86特异性抗体共染色使得可以鉴定成熟DC(CD86明亮HLA-DR明亮)。所示为来自3次独立实验的代表性实验。(c)用于本研究的感染条件是iDC的生产性感染的条件，如在第3天由受感染的iDC的培养上清液中显著的p24检测以及通过流式细胞术对CD40表达所靶向的DC中的p24的细胞内检测所显示。实验在来自三个独立供体的DC上进行，且值为平均值±标准偏差。(d)HIV-1感染自身不会诱导iDC的成熟，如受0.001ng/ml～10ng/ml p24HIV-1感染的iDC的CD86/HLA-DR双重染色所示。由LPS(DC0)诱导的mDC的部分(78.1%CD86明亮HLA-DR 明亮)作为阳性对照显示。(e)显示了所指定的受感染或未受感染的iDC与rNK或aNK细胞的共培养物中所诱导的成熟CD86明亮HLA-DR明亮DC的比例。这些实验已在来自多个供体的原代细胞上进行，且所示为来自这些实验中的三个的代表性数据。当指出时，采用非参数性Mann-Whitney测试进行了统计分析。*p<0.05，**p=0.02
图2.aNK-DC遗传交谈在aNK细胞和DC中均触发HMGB1表达。(a)测试了iDC、rNK细胞、aNK细胞(106/ml)或者aNK细胞与iDC的共培养物(比例1:5)的24小时无细胞培养上清液中的细胞因子含量。使用MAP技术来定量IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12和IFN-γ，而HMGB1由ELISA进行定量。*p<0.05(非参数性Mann-Whitney测试)。(b)通过免疫荧光检测新分选出的血液NK细胞中的HMGB1表达(红色)。采用DAPI 的复染色(蓝色)显示出HMGB1的核定位。(c)aNK细胞与HIV-1的温育抑制HMGB1分泌。左图：aNK细胞(106细胞/ml)在培养基中或与R5-HIV-1Ba-L(1ng/ml的p24)一同温育3小时，并在21小时后测试其HMGB1产生。数据代表三次独立实验，且值为平均值±标准偏差。右图：相同的aNK细胞制备物中的HMGB1表达的免疫荧光分析。(d)aNK-iDC遗传交谈期间的HMGB1产生未受iDC的HIV-1感染的抑制。iDC在培养基中或与HIV-1BaL(1ng/ml的p24)一同温育3小时，并与aNK细胞再共培养21小时(aNK:iDC比为1:5)。然后测定培养上清液中的HMGB1浓度。数据代表三次独立实验的平均值±标准偏差。(e)未受感染或受HIV-1感染的iDC中的HMGB1表达的免疫荧光共聚焦分析。上图：未受感染的iDC；中图：受HIV感染和复制性的iDC，由细胞内p24染色所示；下图：与HIV-1温育但对于细胞内p24表达为阴性的iDC。(f)通过用LPS(DC0)、可溶性CD40L(DC1)或LPS+PGE2(DC2)对iDC刺激48小时而产生成熟DC。将DC0、DC1和DC2在培养基中温育3小时或用R5-HIV-1BaL(1ng/ml的p24)感染并再在培养基中温育21小时。在培养上清液中进行HMGB1定量。所示为三次独立实验的平均值±标准偏差。(g)在24小时共培养物中的aNK细胞与未受感染(上图)或受HIV-1感染的DC(下图)的缀合物中的HMGB1表达的免疫荧光分析。DC是DC-SIGN+，且在这些缀合物中aNK细胞和DC均表达HMGB1。所示为来自采用不同原代细胞所进行的三次实验中的一次代表性实验的图片。
图3.受HIV-1感染的iDC的aNK依赖性成熟由HMGB1介导且涉及RAGE。(a)左图：在存在阻断性抗HMGB1抗体(10μg/ml)或甘草甜素(10μg/ml)时，将iDC单独或与aNK细胞培养24小时。DC的成熟状态通过采用CD86和HLA-DR特异性抗体的流式细胞术确定。右图：相同实验，但采用受HIV-1感染的iDC进行。数据表示至少三次独立实验的平均值±标准偏差，且采用非参数性Mann-Whitney测试进行统计比较。 *p<0.05。(b)将iDC(106细胞/ml)与浓度递增(1μg/ml～10μg/ml)的rh-HMGB1培养48小时。然后将细胞用抗CD86、抗HLA-DR、抗CD80、抗CD83、抗DC-LAMP和抗CD40抗体进行染色，并通过流式细胞术分析。(c)rh-HMGB1对DC的细胞因子和趋化因子生产(由MAP确定)的影响。将iDC(106细胞/ml)在培养基中或在rh-HMGB1(1μg/ml或10μg/ml)的存在下温育48小时。作为阳性对照，将iDC用LPS(DC0)刺激。(d)对 由iDC、DC0或与rh-HMGB1(1μg/ml)温育的iDC对RAGE的表面表达的流式细胞术检测。iDC未受感染或受HIV-1感染(1ng/ml p24感染3小时)。(e)将与aNK细胞共培养24小时的iDC、DC0、未受感染或受HIV-1感染的iDC与rh-HMGB1(1μg/ml)温育，并随后用抗RAGE抗体进行染色并通过流式细胞术进行肥西。通过与CD3和CD56特异性抗体的共染色(CD3-CD56+)将NK细胞从分析中排除。
图4.HIV-1感染后的DC对NK触发的Th1极化的损害与经改变的IL-12和IL-18生产相关。(a)通过将iDC(106/ml)在存在rNK或aNK细胞(2×105/ml)时温育30分钟来测试由NK细胞触发的DC的Th1极化。将天然CD4T细胞(106/ml)添加至所述共培养物中，并在8天后通过流式细胞术确定产生IFN-γ或IL-4的T细胞的频率。实验采用未受感染的iDC(b)受HIV-1感染的iDC(c)或在AZT(1mM)存在下的受HIV-1感染的iDC(d)进行。对所指定的培养物的培养上清液测试IL-12(e)、IL-18(f)和IFN-g(g)含量。数据代表5次独立实验的平均值±标准偏差。统计比较采用非参数性Mann-Whitney测试进行。*p<0.05，**p=0.03。
图5(a)～(f).作为NKDC遗传交谈的结果的DC中HIV复制的HMGB1依赖性触发。(a)在单独温育3天或在存在rNK或aNK细胞(2×105/ml)时温育3天之后的HIV-1感染的iDC(下图)或未受感染的iDC(上图)中的p24胞内表达的流式细胞术分析。(b)相同培养物的培养上清液中的p24浓度。三次独立实验的平均值±标准偏差。*p<0.05，非参数性Mann-Whitney测试。(c)单独培养3天或在存在aNK细胞时培养3天的HIV-1感染的iDC中的胞内p24表达的免疫荧光分析。细胞核用DAPI染色。(d)单独培养6天或在存在aNK细胞时培养6天的HIV-1感染的DC0(106/ml)中的胞内p24表达的流式细胞术分析。(f)和(g)单独培养6天或在存在rNK或aNK细胞时培养6天的HIV-1感染的成熟DC的培养上清液中的p24浓度。三次独立实验的平均值±标准偏差。统计比较采用非参数性Mann-Whitney测试进行。*p<0.05。(e)由来自指定的培养物的细胞上的光周期分析所确定的HIV-1前病毒DNA水平。所示为采用不同原代细胞制备物进行的三次实验中的一次代表性实验。
图6(a)、(b)和(c).外源性rh-HMGB1触发iDC中HIV-1和HIV-2的复制。(a)将HIV-1感染的iDC单独或在存在aNK细胞时培养3天。在某些培养物中添加rh-HMGB1(1μg/ml)。通过在培养物上清液中的p24 定量来测定HIV复制。(b)将HIV-1感染的iDC单独或在存在aNK细胞时培养3天。在培养开始时添加阻断性抗HMGB1抗体(10μg/ml)或甘草甜素(10μg/ml)。通过在培养物上清液中的p24定量来测定HIV复制。所示为三次独立实验的平均值±标准偏差。采用非参数性Mann-Whitney测试进行统计比较。*p<0.05。(c)将HIV-2感染的iDC单独或在存在aNK细胞时培养3天。在某些培养物中添加rh-HMGB1(1μg/ml)。通过在培养物上清液中的p24定量来测定HIV复制。
图7(a)～(c).在NK:DC比为5:1时，激活的NK细胞(aNK)快速诱导未成熟树突状细胞(iDC)的凋亡。(a)由来自健康供体的纯化CD14+单核细胞在IL-4和GM-CSF的存在下产生的iDC与静息NK细胞(rNK)或aNK细胞在两种不同的NK:DC比(1:5和5:1)共培养24小时。使用7-AAD测试通过流式细胞术确定DC存活率。通过门控CD56-群来从分析中排除NK细胞。存活的DC是7-AAD-FSC高细胞。数据表示三次独立实验。(b)由aNK细胞诱导的iDC的凋亡的实时显微视频照片。所示为来自用不同原代细胞制备物进行的3次实验中的一次代表性实验的图片。(c)aNK细胞对iDC的杀伤的动力学，其由共培养物中存活的DC的比例来评估。在来自多个健康供体的原代细胞上进行了三次实验，且所示为来自这三次实验的代表性数据。
图8(a)～(b).对于aNK细胞的杀伤具有抵抗性的DC展示出成熟的表型。(a)由纯化CD14+单核细胞在IL-4和GM-CSF的存在下产生的iDC与aNK细胞在两种不同的NK:DC比为5:1时共培养24小时。使用7-AAD测试通过流式细胞术确定DC存活率。通过门控CD56-群来从分析中排除NK细胞。存活的DC是7-AAD-FSC高细胞。除凋亡以外，aNK细胞还诱导iDC的成熟。采用HLA-DR和CD86特异性抗体的共染色使得能够鉴定成熟的DC(CD86明亮HLA-DR明亮)。作为正对照，成熟的DC通过用LPS(DC0)刺激iDC48小时而产生。所示为来自三次独立实验的一次代表性实验的数据。(b)在NK:DC比为5:1时单独培养iDC或将其与aNK细胞共培养，将培养的iDC用抗Cd83和抗DC-SIGN抗体染色并通过流式细胞术进行分析。两种标记物的阳性表达均表明iDC的成熟表型。数据展示三次独立实验中的一次。
图9(a)～(g).iDC的aNK依赖性凋亡具有TNF相关凋亡诱导性配体(TRAIL)依赖性，并且与DR4受体有关。(a)从健康供体的血液中纯化 CD56+NK细胞。将NK细胞维持在具有次优浓度的白细胞介素-2(IL-2)(100ng/ml)的培养物中(rNK细胞)，或通过将PHA(10μg/ml)和IL-2(10μg/ml)添加至培养物来将NK细胞激活(aNK细胞)。采用抗CD56抗体的染色的强度使得可以区分强表达CD56(CD56明亮细胞)和弱表达CD56(CD56暗细胞)的两种NK细胞群。数据表示三次独立实验的平均值±标准偏差。(b)采用抗CD56和抗mTRAIL特异性抗体通过流式细胞术来确定NK细胞的膜TRAIL(mTRAIL)表达。数据代表三次独立实验中的一次。(c)将aNK细胞与抗CD56和抗mTRAIL抗体共染色。确定了表达mTRAIL的aNK细胞在CD56明亮细胞群和CD56暗细胞群中的比例。数据表示三次独立实验的平均值±标准偏差。(d)通过流式细胞术鉴定表面iDC上的TRAIL受体DR4表达。在某些情形中，在NK:DC比为5:1时将iDC与aNK细胞共培养。在NK-DC共培养1小时、2小时、3.5小时和24小时后分析DC表面的DR4表达。在三个供体上进行三次实验，且所示来来自这些实验中的一次的代表性数据。(e)将iDC(106细胞/ml)与浓度递增(1ng/ml～1000ng/ml)的重组人可溶TRAIL(rhs-TRAIL)一起培养24小时。然后用7-AAD测试对细胞死亡进行定量。数据显示三次独立实验的平均值±标准偏差。(f)对iDC、rNK细胞、aNK细胞(106/ml)或者aNK和iDC的共培养物(比例为5:1)的24小时无细胞培养物上清液测试可溶性TRAIL(sTRAIL)含量。通过ELISA对sTRAIL定量。数据显示三次独立实验的平均值±标准偏差。(g)在存在或不存在阻断性抗DR4抗体(250ng/ml)时，将iDC单独培养或与aNK细胞一起培养(NK:DC比为5:1)24小时。使用7-AAD测试通过流式细胞术确定DC的活力状态。数据显示三次独立实验中的一次。
图10(a)～(d).R5-HIV感染的DC对于aNK细胞的杀伤具有抗性，但TRAIL分泌在HIV-1存在时仍然持续。(a)将iDC用R5-HIV-1BaL(1ng/ml的p24)感染24小时或未进行感染，并在洗涤数次后，将其与aNK细胞以1:5和5:1的比例温育。通过流式细胞术采用7-AAD测试对iDC活力进行测试。活细胞为7-AAA-，凋亡细胞为7-AAD+，而凋亡碎片为7-AAD-FSC低。点状图显示至少三次独立实验中的一次。(b)R5-HIV不诱导iDC成熟。DC未经感染(iDC)、用R5-HIV-1以1ng/ml的p24 感染(HIV-DC)或用LPS刺激48小时。然后将细胞用CD86和HLA-DR染色。数据表示至少三次独立实验中的一次。(c)TRAIL分泌不受iDC的HIV感染影响。通过ELISA对iDC、HIV感染的DC(106/ml)、aNK细胞-iDC共培养物(比例为5:1)以及aNK细胞-HIV感染的DC共培养物(比例为5:1)的24小时无细胞培养物上清液测试可溶性TRAIL(sTRAIL)含量。数据显示三次独立实验的平均值±标准偏差。(d)HIV-1感染的DC仍然易受到TRAIL诱导的细胞凋亡的影响。将iDC和HIV感染的DC(106cells/ml)与浓度递增(1ng/ml～1000ng/ml)的rhs-TRAIL一起培养24小时。然后用7-AAD测试对细胞死亡进行定量。所示为三次独立实验的平均值±标准偏差。
图11(a)～(b).高迁移率族蛋白1(HMGB1)与HIV-1感染的iDC对于NK诱导的DC凋亡的抗性有关。(a)将iDC或HIV-1感染的iDC单独培养或在存在aNK细胞(NK:DC比为5:1)时进行培养。在某些实验中，在HIV感染时添加叠氮胸苷(AZT)；在其它实验中，在共培养开始时添加甘草甜素(10ng/ml)。用7-AAD测试对细胞死亡进行定量。(b)在存在阻断性抗HMGB1抗体(10μg/ml和15μg/ml)时进行相同的实验。所示为所进行的三次实验中的一次代表性实验。
图12(a)～(b).(a)aNK细胞通过上调iDC表面的TRAIL受体(DR4)表达而诱导细胞凋亡，由此增加DC对于TRAIL依赖性细胞凋亡的敏感性。(b)HIV-1感染的DC通过HMGB1依赖性机制对aNK诱导的细胞凋亡具有抗性。因此，aNK细胞参与感染的DC的维系、向CD4T细胞的DC依赖性HIV传递以及HIV贮存细胞的建立。
图13.用于抗HMGB1抗体的ELISA测试的条件的确定。(A)：确定使得以HMGB1涂布的板孔饱和的BSA浓度。(B)：确定展现出结合的抗HMGB1抗体的抗IgG-PAL抗体的浓度(二抗)。(C)：确定用于涂布板孔的HMGB1的浓度。(D)：确定用于制作标准曲线的纯化抗HMGB1抗体的浓度。(E)：该测试的特异性。
图14.采用HMGB1蛋白涂层或BOXB涂层进行的抗HBG1滴定。
图15.针对抗HMGB1IgG抗体的存在，对未经处理或用1.5M甘氨酸处理的人类血清的滴定。循环(游离)抗HMGB1抗体以晕线显示，而复合的抗HMGB1抗体以灰色显示。
图16.对来自HIV+患者的血清中的HMGB1浓度的滴定。每个直方图表示一个患者。普通线表示ELISA测试的最低检测水平，虚线表示健康供体中的HMGB1平均水平。
图17.在HAART后的不同时间(以月计)测定的HAART对T细胞亚组(A)和HIV病毒载量(B)的影响。***:p<0.001且**:p<0.05。
图18.对来自在M0接受HAART的HIV感染患者的血清中的HMGB1的滴定。健康供体中的HMGB1平均浓度以虚线表示。
图19.对来自HIV感染患者的血清中的抗HMGB1抗体的滴定，以及抗逆转录病毒疗法的影响。M-1是指来自进入临床测试前15～30天受测的患者的血清样品。M1、M3、M6和M12分别表示HAART后的不同时间点。“Fin”是指在M9和M12之间停止HAART的患者。
图20.血清HMGB1与抗HMGB1抗体浓度之间的相关性研究(A)，以及抗HMGB1抗体与HIV-RNA病毒载量之间的相关性研究(B)。Spearman相关性测试。示出相关系数r、相关性概率(p)和所分析样品数(n)。
实施例
HMGB1是存在于几乎所有真核细胞中的核蛋白，且其起着稳定核小体形成的作用并充当调节数种基因的表达的转录因子样蛋白。它也是由激活的巨噬细胞、成熟树突状细胞(DC)和天然杀伤(NK)细胞在响应于损伤、感染或其他炎性刺激时分泌的细胞因子。
病毒感染的早期与天然免疫效应子(即NK细胞和DC)的局部募集和激活有关。DC对于天然CD4+T细胞的抗原呈递和激活、以及进一步的Th1极化都至关重要。DC还构成HIV的早期靶标，并且通过整合前病毒DNA促进HIV维系。DC成熟和体内平衡受到DC与NK细胞的遗传交谈控制。此前对于这种遗传交谈对于DC对HIV复制的易感性的贡献是未知的。
激活的NK细胞(aNK)提供了HMGB1源，其在NK细胞和未成熟DC(iDC)的接触期间释放并且促进iDC的成熟和对IL-12依赖性T辅助细胞1响应的诱导。在用HIV-1感染iDC后，DC不再对NK依赖性IL-12极化易感，并因而不再能诱导Th1响应。另外，NK依赖性 DK成熟和存活与HIV-1p24生成的增加和DC的前病毒DNA表达的增加相关。DC中HIV-1复制的NK依赖性增加受HMGB1特异性抗体的抑制，也受已知会与HMGB1特异性相互作用的甘草甜素的抑制，这表明该细胞因子在该过程中的重要作用。作为推论，rh-HMGB1对受感染的DC具有直接效果，从而极大提高p24在培养物上清液中的生成。在aNK:iDC共培养物中也观察到HMGB1对DC中的HIV复制的强刺激效应。HMGB1特异性中和抗体或甘草甜素的添加废止了受感染的DC(单独培养或在aNK细胞存在时培养)的HIV-1生成。综上，这些结果表明，不管是作为重组人蛋白在受感染的DC上添加还是在NK:DC遗传交谈期间由aNK细胞产生，HMGB1都会触发HIV-1复制并增加受感染的DC中的HIV-DNA。
虽然DC的直接感染不如CD4+T细胞感染有效40,41，但越来越多的证据表明，由DC介导的长期HIV传递依赖于DC的病毒生成42,43,44，而受HIV感染的DC在体内可能起到在迁移至淋巴样组织期间的病毒贮存细胞的作用，由此有助于扩散病毒感染。
本发明人已首次显示，激活的NK细胞促进受HIV-1感染的DC中的病毒贮存细胞的建立。本发明人在本文中显示出HIV-1感染的DC的NK细胞激活能力，以及在aNK-iDC遗传交谈期间产生的HMGB1在刺激HIV-1复制和DC中的前病毒DNA表达中的关键性参与。此外还展示出，在成熟的受感染DC与NK细胞的遗传交谈后，所述DC对Th1极化的诱导严重受损。这些观察结果促成抑制HIV有效促进其散播和逃避宿主免疫系统的能力的新型疗法。
NK细胞与自体iDC的相互作用导致互惠性激活，且该相互作用似乎在T细胞产生之前的免疫响应早期的起始/扩增中显得至关重要 11。NK细胞触发iDC的成熟，且这通过HMGB1依赖性机制发生20。据报道，iDC的NK依赖性成熟与DC的功能性极化有关，并且增加细胞内游离Ca2浓度、细胞骨架重排、NK/DC突触处的分泌性溶酶体的积聚以及经调节的IL-18向相互作用的NK细胞的表达。反过来，NK细胞分泌大量HMGB1，这诱导DC的成熟20。本发明人已证实，HMGB1参与NK-DC接触期间的NK依赖性DC成熟，如抗HMGB1抗体或已知可与HMGB1特异性相互作用的甘草甜素的抑制效应所示31。共聚 焦显微分析和对无细胞培养物上清液中的HMGB1检测表明，HMGB1不仅如报道那样由原代NK细胞表达和分泌20，也由孤立的DC产生，HMGB1释放水平与其成熟阶段相关联。当将iDC与aNK细胞接触时，检测到极高水平的HMGB1，与成熟DC所释放的HMGB1水平类似。有趣的是，NK-DC缀合物的共聚焦显微分析显示，两种细胞均表达该细胞因子。据发现，在DC与aNK细胞相互作用后，HMGB1受体RAGE被快速诱导并被进一步下调，这与HMGB1在NK依赖性DC成熟中的参与相一致。除了促进DC成熟外，已据显示HMGB1可充当iDC上的化学吸引剂45，此外也是成熟DC响应于CCR7和CCR4的迁移所必需46，这两种活性均由RAGE介导45,46。因此，HMGB1充当警报蛋白(alarmin)，其具有对DC的激活和趋化效应，然后刺激DC从发炎组织迁移至排出淋巴节45。在未受控制的病毒感染(如HIV诱导的病毒感染)的背景下，已考虑到HMGB1的这些性质。
如CD86明亮HLA-DR明亮DC的频率所示，iDC受HIV-1的生产性感染维持NK依赖性表型DC成熟，但HIV自身在所用的p24浓度范围(0.001ng/ml～10ng/ml)内不会诱导DC成熟。然而，aNK-DC相互作用的结果是对iDC中的HIV-1感染的极大提高。这由数种方法显示，表明p24+DC频率的增加，其与NK-DC培养物上清液中的p24释放的显著提高有关，且这通过在单细胞水平的免疫荧光分析得到确认。而且，NK-DC遗传交谈导致DC中的前病毒HIV-1DNA表达的显著增加。考虑到DC和NK细胞的互惠性激活期间HMGB1的关键作用，对其对于具有阻断性抗HMGB1抗体的iDC中的HIV-1复制的触发的贡献进行评估。这些抑制剂对于p24释放的强阻断效应表明HMGB1参与了所述过程。值得注意的是，这两种抑制剂也显著减少了在不存在NK细胞时的受感染iDC的24小时培养物中的HIV-1复制。这可能是由于iDC对HMGB1的自发释放(如此处所示和此前所报道46)，这在iDC受HIV-1感染后得到维持。这些观察揭示了HMGB1在控制DC中的HIV-1复制中的关键作用。作为推论，据证实rh-HMGB1显著增加了受感染的DC的培养物上清液和aNK感染的DC共培养物中的p24释放。这些数据对于对HIV发病机理的理解可能具有重要意义，这是因为据发现血浆HMGB1水平在慢性HIV-1感染患者中升高，而在患有 临床并发症的患者中浓度最高47。此外，据报道外源性HMGB1可在体外诱导来自接受抗逆转录病毒治疗的HIV-1感染患者的PBMC中的HIV-1的再激活39。
分泌的HMGB1对于天然CD4T细胞在受同种异基因DC的激活后的增殖、存活和极化是必需的，而这些效应与DC所表达的RAGE有关48。此处显示，在同种同基因情况下，HMGB1自身无法诱导Th1极化。事实上，在受HIV-1感染的DC存在时，没有诱导Th1响应，但所述DC在释放IL-12和IL-18时受抑制的同时持续产生正常水平的HMGB1。近期研究突出了NK细胞在调节Th1极化中的关键作用，表明其触发DC的IL-12和IL-18释放，从而促进NK细胞的IFN-γ生成，其反过来触发T细胞朝Th1细胞的分化49,50。此处证实了IL-12和IL-18对于Th1分化的关键作用，这是因为受HIV-1感染的DC响应于NK细胞激活而产生增量的IL-12和IL-18的缺陷与有缺陷的Th1极化相关。该缺陷直接与DC中的HIV-1复制关联，如HIV抑制剂AZT的阳性效应所示。这些观察结果表明，所报道的在来自HIV感染患者的DC中的某些功能性改变51,52(如包括IL-12在内的数种细胞因子的减少)以及原始自体CD4T细胞的能力受损可能与近期所表明的缺陷性NK-DC遗传交谈相关联30。
本发明人显示，HIV-1感染的DC中的HIV-1复制的激活和病毒贮存细胞的确立依赖于aNK细胞和自体DC之间的遗传交谈，且已鉴定出由Nk细胞和DC在其遗传交谈期间产生的HMGB1在该过程中的关键作用，且已显示出DC中HIV复制的NK依赖性触发完全受特异性结合HMGB1的甘草甜素或抗HMGB1抗体的阻断的废止。另外，已表明受HIV-1感染的DC在其与NK细胞遗传交谈之后诱导Th1极化的能力的强烈受损。基于NK-DC遗传交谈在促进病毒传播和HMGB1在触发病毒复制和更新病毒贮存细胞中的体内参与中的作用，描述了治疗和监测HIV感染的方法。
实施例1：激活的NK细胞诱导自体受HIV-1感染的原代未成熟树突状细胞的成熟
通过从分离的单核细胞产生源自单核细胞的DC并将其与从相同供体纯化的NK细胞共培养来研究NK细胞对于DC成熟的作用。NK 细胞为静息(rNK)细胞或受PHA和IL-2的组合激活(aNK)。根据NK-DC比，aNK细胞与自体未成熟DC的24小时共培养诱导iDC的存活或凋亡，这与此前的报道相一致14。事实上，5:1的aNK-DC比诱导DC凋亡，而1:5的比例诱导DC存活(图1a)。NK-DC比为1:5时的iDC存活与其成熟相关，如成熟标记物的共表达的增加(成熟DC的特征)所示(与基线的15.3%相比，72.1%的CD86明亮HLA-DR明亮DC被aNK细胞诱导)(图1b)。在相同实验条件下，rNK细胞具有较弱的对DC成熟的效果，这可由CD86明亮HLA-DR明亮DC的比例判断(图1b、1e)。在iDC受HIV-1感染后，在iDC的生产性感染的情况下，iDC的NK依赖性成熟未改变(图1b)，iDC的生产性感染由在第3天时培养上清液中的p24释放和针对p24的iDC细胞内染色所测定(图1c)。
据发现HIV对DC成熟的直接效应见于浓度范围为0.001ng/ml～10ng/ml时，在该浓度范围内HIV无法增加成熟标记物CD86和HLA-DR的表达，这与用作作为DC成熟的强诱导剂的阳性对照LPS相反(图1b、1d)。如图1e所示，来自3个代表性供体的数据证实，不论iDC的感染或未感染状态如何，24小时共培养后aNK细胞对iDC成熟均有较强影响。这些数据显示，受生产性HIV-1感染的iDC在NK-DC遗传交谈期间保持了正常的对由NK细胞诱导的成熟的易感性。
实施例2：aNK-DC遗传交谈触发NK细胞和DK中的HMGB1表达
为了鉴定参与iDC的aNK依赖性成熟的分子，采用多分析物概况分析(MAP)来对iDC、NK细胞和aNK:iDC的24小时培养物中产生的关键细胞因子作图。iDC释放较少量的IL-1β、IL-6和IL-12，且其不会产生IL-10或TNF-α。在其与aNK细胞共培养后，诱导了促炎性细胞因子谱，并且具有高度增加的IL-12分泌、显著的TNF-α和IFN-γ(均源自NK细胞)水平，且不产生IL-10(图2a)。有趣的是，在源自iDC和NK细胞的那些培养物上清液中检测到高水平的HMGB1，且aNK:iDC共培养物导致培养物上清液中HMGB1浓度的较大提高(图2a)。经共聚焦显微镜证实，在单细胞水平，NK细胞能产生HMGB1(在新分离的NK细胞中检测到)(图2b)，并进而转位至aNK细胞中的细 胞质中(图2c)。在与HIV-1培养3小时后，aNK细胞显示出HMGB1表达的较大减少，这在培养物上清液中和由共聚焦显微镜检测到(图2c)。然后HMGB1达到与rNK细胞的HMGB1水平相当的水平(图2a)。本发明人确证，NK细胞无法复制HIV-1，这由培养物上清液中p24检测的缺失和NK细胞中细胞内p24染色(由FACS检测)的缺失所示出(数据未显示)。HMGB1也由iDC分泌，且一旦iDC受到感染，其仍然在培养物上清液中产生相似量的细胞因子(图2d)。不论受HIV-1感染与否，HMGB1大多在iDC的细胞质中被检测到(图2e)，且受感染的DC中的p24表达不会改变HMGB1表达，如对p24和HMGB1的双重细胞内染色所示(图2e)。当iDC与aNK细胞共培养时，观察到培养物上清液中的HMGB1分泌的强诱导(图2d)，其达到与成熟DC(即DC0、DC1和DC2)所产生的HMGB1分泌相当的水平(图2f)。令人惊奇的是，iDC的HIV-1感染不影响NK-DC共培养物中(图2d)和成熟DC培养物中(图2f)产生的HMGB1量。共聚焦显微分析显示出aNK细胞和iDC的缀合物形成，这在aNK细胞与受HIV-1感染的DC共培养时也观测到，且不论DC的感染状态如何两种细胞均表达HMGB1(图2g)。这些结果表明，HMGB1在NK-DC遗传交谈期间由NK细胞和iDC表达，且该过程未受iDC的HIV-1感染的改变。
实施例3：HIV-1感染的iDC的NK依赖性成熟由HMGB1介导且与RAGE有关
为了确定HMGB1在NK依赖性DC成熟中的可能参与，使用已知与可溶性HMGB1分子特异性相互作用的甘草甜素31以及抗HMGB1抗体(图3a)。这些抑制剂在24小时的aNK iDC共培养起始时加入，并将成熟DC的比例(鉴定为CD86明亮HLA-DR明亮)减少至没有aNK细胞时所观察到的基线水平(图3a)。用感染的DC获得了相似的效果(图3a)。当将iDC用1μg/ml～10μg/ml的rh-HMGB1处理24小时后，rh-HMGB1自身不会诱导iDC的表型成熟，且在培养48小时后获得相似的数据(图3b)。事实上，虽然在培养基中培养48小时候观察到iDC的自发成熟，如高百分比的CD86明亮HLA-DR明亮DC所示，但10μg/ml rh-HMGB1仅使这些细胞的百分比从65%微弱地增加至71%。有趣的是，如通过CD80、CD83的表达缺失以及DC-lamp的弱表达(其在mDC(DC0)中均 完全表达)所评估，经rh-HMGB1处理的DC未完全成熟(图3b)。然而，这些部分成熟DC在功能上对rh-HMGB1易感，如rh-HMGB1处理的DC所释放的趋化因子MCP1、MIP-1α、MIP-1β和IL-8的增加所示(图3c)。HMGB1受体包括RAGE32,33、TLR-2和TLR-434。RAGE是首个鉴定出的HMGB1受体，其由包括T细胞、单核细胞、巨噬细胞和DC的多种免疫细胞所表达35，且其被成熟DC用于在体内朝淋巴节的归巢 36。虽然在iDC上几乎没有检测到TLR-2和TLR-4(未示出)，RAGE在DC上完全表达，如流式细胞术所示，且其表达甚至高于成熟DC0上的表达(图3d)。在将iDC与1μg/ml的HMGB1温育后，观察到RAGE的下调，这强烈表明该受体为这些细胞所用(图3d)。在用HIV-1感染DC后，在iDC和DC0上没有检测到RAGE水平的变化。受感染的DC与HMGB1的温育诱导了相似的RAGE下调(图3d)。采用相同的方法对NK-DC遗传交谈期间RAGE的可能参与进行评估，将与aNK细胞供培养的DC上的RAGE表达与单独培养的DC上的RAGE表达相比较。在与aNK细胞共温育2小时后，DC显示出RAGE表达的上调，继以24小时时的下调(图3e)。用HIV-1感染的DC得到了极为相似的观察(图3e)。因此，HMGB1是未受感染和受HIV-1感染的DC在NK-DC遗传交谈期间的成熟的重要因子，且其与RAGE相关，RAGE在iDC上的表达在其生产性感染后未被改变。
实施例4.由于缺陷性NK-DC遗传交谈(cross-talk)导致的受HIV感染的DC对Th1极化的损害
NK细胞与iDC的相互作用导致对1型极化DC的诱导，所述1型极化DC充当源自NK细胞的对Th1响应诱导的辅助物的载体37。为评估不论受感染或未受感染的DC在其与aNK细胞遗传交谈后极化Th1响应的能力，将天然CD4+CD45RO–T细胞在DC和aNK细胞存在时共培养8天，并通过检测由FACS测定的T细胞中IFN-γ和IL-4的细胞内生产来确定Th1极化(图4a)。天然T细胞与iDC的共培养不会增加IFN-γ阳性T细胞的比例，且在天然T细胞与iDC和rNK细胞的共培养物种获得相似的数据。相反，天然T细胞与iDC在aNK细胞存在时的共培养诱导了IFN-γT细胞响应的显著增加(图4b)，从而表明aNK:iDC遗传交谈对于Th1极化至关重要。当用HIV-1感染的DC进 行相同实验时，没有观察到Th1极化(图4c)。HIV-1复制对于对Th1极化的抑制的贡献由AZT的添加所显示，AZT恢复由与aNK细胞共培养的受感染DC所诱导的增加的IFN-γT细胞响应(图4d)。AZT以在这些情况下可抑制病毒复制的浓度而使用，这由上清液中的p24抗原的剂量来评估(数据未示出)。IL-12和IL-18时由DC产生的关键细胞因子，且参与Th1极化。这解决了aNK-DC遗传交谈对这些细胞因子由DC所释放的影响的问题。据发现，aNK-DC遗传交谈触发了未受感染的DC的IL-12和IL-18分泌。重要的是，在aNK细胞与受感染DC的共培养物中不再检测到这两种细胞因子的产生(图4e、4f)。另外，当采用受HIV-1感染的DC进行共培养时，不再检测到在aNK-DC遗传交谈期间由NK细胞对IFN-γ生产的触发(图4g)。因此，尽管DC所释放的如IL-12和IL-18等细胞因子的诱导和由NK细胞所释放的IFN-γ的诱导，在aNK-DC遗传交谈期间发生DC针对Th1极化的启动。在iDC受HIV-1感染后，其不再能被aNK细胞所极化，这是出于缺陷性NK-DC遗传交谈的缘故。因此，受HIV-1感染的DC在其诱导Th1极化方面的能力受到损害。
实施例5：HMGB1在HIV-1复制的NK-DC依赖性触发中的关键作用和在iDC中的维系
由于据显示NK敏化的受HIV-1感染的DC对Th1的计划的损害依赖于HIV-1复制(图4d)，本发明人测试了是否aNK-iDC相互作用能触发iDC中的HIV-1复制。将iDC用HIV-1(1ng/ml的p24)感染3小时，并进而单独培养或或在rNK或aNK存在下培养18小时，且通过流式细胞术确定具有细胞内p24表达的DC的频率。虽然当将受感染的DC单独培养时p24+DC的百分比非常低，其在与aNK细胞相互作用后显著增加，p24+DC代表几乎所有DC中的三分之一(与之相比在不存在NK细胞时仅为4%)(图5a)。在相同条件下，rNK细胞对于iDC中的HIV复制几乎没有效果(图5a)。受感染DC中的HIV复制的aNK依赖性增加由培养物上清液中的p24抗原检测所证实，且与单独培养或与rNK细胞培养的受感染iDC相比，aNK与HIV-1-iDC的共培养物中检测到p24生产的统计性显著的增加(图5b)。NK-DC相互作用对表达p24的DC的频率的显著效果由采用p24特异性抗体的共聚焦显微 分析所证实。虽然在RC感染后的当天极少的DC被针对细胞内p24而染色，在其与aNK细胞一起培养后观察到较高数目的p24+DC(图5c)。有趣的是，aNK细胞对于iDC中的HIV复制的正面影响与在成熟DC上所观察到的相似。与单独培养的DC0相比，在24小时期间与aNK细胞共培养的HIV-1感染的DC0中发现p24+DC的频率增加(由FACS检测)(图5d)，且在来自HIV-1感染的成熟DC0、DC1和DC2的培养物上清液中的p24检测证实了aNK细胞对于成熟DC中的HIV-1复制的显著刺激性效果(图5f和5g)。值得注意的是，rNK细胞对于成熟的受感染DC中的HIV-1复制没有显著影响(图5f和5g)。然后，本发明人测试了aNK细胞是否对iDC中的前病毒DNA的表达有影响。图5(e)中的数据显示，与受感染的iDC与rNK细胞的培养物或单独的受感染iDC的HIV-1前病毒DNA拷贝数相比，在受感染的IDC与aNK细胞的培养物中检测到HIV-1前病毒DNA拷贝数的极大增加。
近来，据报道外源性HMGB1可增加受感染的单核细胞系中的HIV-1复制38，并可体外诱导来自进行抗逆转录病毒治疗的HIV-1感染患者的PBMC中的HIV-1的再激活39。因此，关于HMGB1在DC中的HIV复制的NK依赖性触发中的作用的问题得到解决。据发现，外源性rh-HMGB1对于HIV-1感染的iDC具有直接影响，极大地提高了培养物上清液中的p24生产(图6a)。rh-HMGB1也对与aNK细胞共培养的HIV-1感染iDC的p24生产具有显著刺激性效果(图6a)。为了研究HMGB1对受感染iDC-aNK共培养物中的HIV-1复制的触发的影响，将HMGB1特异性中和抗体或甘草甜素添加至这些共培养物中，并测定上清液中的p24生产。两种HMGB1抑制剂均废止了与aNK细胞共培养或单独培养的受感染DC的HIV-1生产(图6b)。这些结果表明，外源性HMGB1能够触发受感染iDC的HIV-1复制。其还表明，iDC中的HIV-1复制的aNK细胞依赖性刺激受HMGB1所介导。
实施例6：原代细胞的隔离和分离
将外周血单核细胞(PBMC)从健康供体(EFS Cabanel,Paris,法国)的血液中以Ficoll-Hypaque密度梯度分离。使用CD14特异性免疫磁珠(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)通过阳性选择从PBMC隔离出CD14+单核细胞。为产生iDC，如文献所述53，在10ng/ml重组人(rhu)GM-CSF 和10ng/ml rhIL-4(Peprotech INC,Rockyhill,美国)存在下，将纯化的CD14+单核细胞在补充有2mM谷氨酰胺、10%FCS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI1640培养基中培养6天(1×106细胞/ml)。每2天更换培养基。通过阴性筛选将NK细胞从PBMC中隔离出，已使用针对CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD123、CD66b、血型糖蛋白A的抗体耗竭混合物(StemCell Technologies)将所述PBMC中的单核细胞耗竭。通过流式细胞术确定的富集级分中的NK细胞(作为具有FITC缀合的抗CD3抗体和APC缀合的抗CD56抗体的CD3-CD56+细胞)的含量在不同实验中的范围是85%～95%。以FITC缀合的抗CD14抗体评估的骨髓细胞的污染恒定地小于1%。使用CD4特异性和CD45RA特异性免疫磁珠(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)通过阳性选择从PBMC隔离出天然CD4T细胞(CD4+CD45RA+)。隔离出的天然CD4T细胞的细胞纯度常规地高于90%。
实施例7：NK细胞的激活和感染
在次优浓度的IL-2(100ng/ml)(Peprotech)存在下以106细胞/ml培养纯化的NK细胞以维持其存活(称为rNK)，或通过PHA(10μg/ml)(Sigma)和IL-2(10μg/ml)的组合来将其激活(称为aNK细胞)。在某些实施方式中，将aNK细胞(106细胞/ml)在存在HIV-1(1ng/ml p24)时在3小时期间温育并进而培养21小时。在这些条件下，无法观察到生产性感染。然后对培养物上清液的细胞因子和趋化因子检测进行测试(见下)。
实施例8：树突状细胞的成熟和表型分析
在IL-4和GM-CSF的存在下培养6天后，iDC(106细胞/ml)未经刺激，或在48小时期间用10μg/ml LPS(大肠杆菌血清型026-B6,Sigma-Aldrich)进行刺激以获得DC0细胞，或用500ng/ml的三聚体CD40L(Sigma-Aldrich)进行刺激以获得DC1细胞，或用10μg/ml的LPS和1μg/ml PGE2(Sigma-Aldrich)进行刺激以获得DC2细胞。通过流式细胞术进行对DC的表型分析和对其成熟期的表征。在4℃，用在100μl of PBS/10%FCS/0.1%NaN3中稀释的CD80、CD83、CD86、HLA-DR、CD40、DC-LAMP或DC-SIGN(所有抗体均来自BD Biosciences,San Jose,CA)对DC染色20分钟。在某些实验中，使用HMGB1受体特异 性抗体RAGE(Abcam)来对DC染色。在洗涤两次后，将细胞在1%PFA中固定，立刻在FACScalibur(Becton Dickinson)进行数据采集并用FlowJo软件进行分析。
实施例9：用HIV-1感染树突状细胞
通过扩增来自健康供体的MDM上R5-HIV-1Ba-L来制备病毒储备制剂。然后在确定HIV1p24浓度之前，通过离心使病毒储备液澄清。将iDC以200,000细胞/孔平板接种至96孔培养板中，并在37℃在5%CO2气氛中与不同浓度的R5-HIV-1BAL(0.001ng p24/ml～10ng p24/ml)培养3小时。收集细胞，用含10%FCS的培养基洗涤4次，并在指示时以1:5的NK:DC比添加rNK或aNK细胞(除非另外指明)。在对DC的成熟期进行分析和/或对病毒生产定量前，NK-DC共培养持续24小时。在某些实验中(图6)，在存在rh-HMGB1(1μg/ml)(R&DSystems)时，且在某些培养物中在存在兔抗HMGB1Abs(10μg/ml)(Abcam,Cambridge,UK)或甘草甜素(10μg/ml)时，将HIV-1感染的iDC单独培养或与aNK细胞培养3天。
实施例10：对HIV-1病毒生产、前病毒载量和受感染DC频率的定量
通过由ELISA(Ingen,比利时)测定p24蛋白量来确定受感染细胞培养物的上清液中的HIV-1浓度。使用GIAamp DNA血液小型试剂盒(Qiagen,Basel,瑞士)提取出来自细胞的DNA，并如前所述通过RT-PCR对HIV-1前病毒载量进行定量54。通过流式细胞术确定受HIV-1感染的细胞的频率，以检测细胞内p24分子。用CD40特异性抗体(BD Biosciences,San Jose,CA)对细胞进行表面染色以靶向DC，并用p24特异性抗体(Coulter)进行细胞内染色。将经染色的细胞在1%PFA中固定，立刻在FACScalibur(Becton Dickinson)进行数据采集并用Flow Jo软件进行分析。在某些实验中，在免疫荧光后通过激光扫描共聚焦显微镜对感染的DC进行成像。
实施例11：iDC与NK细胞的共培养
除非另外指出，在24小时期间将rNK或aNK与iDC或mDC以1:5的比例(2×105NK+10×105DC/1ml)。如前所述55，用7-AAD测试确定DC存活率。简言之，将培养的细胞在4℃用20μg/mL核染料 7-氨基放射菌素D(7-AAD;St.Quentin-Fallavier,Sigma-Aldrich)染色30分钟，并用CD56特异性抗体(BD Biosciences,San Jose,CA)共染色。存活的DC被鉴定为CD56-7-AAD-细胞。当在NK-DC共培养物中进行DC的表型表征时，总是通过用CD56特异性抗体对NK细胞进行染色来将其从FACS分析中排除。
实施例12：细胞因子和趋化因子生产的测定
通过将iDC以106细胞/ml、rNK或aNK细胞以2×105细胞/ml或者比例为1:5的aNK和iDC细胞培养24小时来制备无细胞培养物上清液。根据制造商说明，通过Luminex(24plex试剂盒;Biosource)测定趋化因子和细胞因子。简言之，将50μl上清液或标准物与抗体连接珠一起温育2小时，用洗涤溶液洗涤两次，并与生物素化二抗温育1小时。最后与抗生物素链霉亲和素-PE温育30分钟再开始在Luminex100IS上的数据采集。对于每个分析物采集至少100次事件。将高于或低于标准曲线的值用所测定的最低或最高浓度代替。采用ELISA试剂盒(IBL,Hamburg)进行对无细胞培养物上清液中的HMGB1的定量。在测试NK触发的DC对天然CD4T细胞的Th1极化的实验中(图4)，对培养物上清液中的IL-12、IFN-γ和IL-18的定量用ELISA试剂盒(IL-12和IFN-γ试剂盒来自R&D Systems,IL-18试剂盒来自MBL)进行。
实施例13：Th1极化测试
如前所报道56，将天然CD4T细胞(106/ml)在未经感染或受HIV-1感染的iDC(106/ml)以及静息或激活的NK细胞(2×105/ml)的存在下共培养8天，并通过流式细胞术对Th1极化进行测试。简言之，将brefeldine A(10μg/ml)(Sigma Aldrich)在培养的最后16小时期间添加至培养物中以抑制蛋白分泌。用PerCP缀合CD8抗体和FITC缀合CD3抗体(BD Biosciences,San Jose,CA)进行表面染色，随后在4℃用1%PFA进行15分钟的细胞固定并用皂角苷缓冲液(PBS-BSA0.2%-NaN30.01%-皂角苷0.5%)进行透化，并用APC-缀合IFNγ特异性或IL-4特异性抗体(BD Biosciences,San Jose,CA)进行细胞内染色。将经染色的细胞在FACScalibur(Becton Dickinson)上立刻进行数据采集，并用Flow Jo软件进行分析。为了分析HIV-1复制对Th1极化的影响，在单独培养或者在HIV-1感染iDC+/-rNK或aNK细胞存在时培养的天然CD4T细 胞的培养开始时，添加1mM AZT。在共培养结束时除去AZT。如上所述，在不存在AZT时进行iDC的HIV-1感染。
实施例14：统计分析
采用非参数性Mann-Whitney测试进行统计分析。所报告为显著性差异的P值。作图数据表示平均值±标准偏差(s.d.)。
实施例15：HIV-1感染的树突状细胞可通过hmgb1依赖性机理抵抗NK诱导的凋亡
树突状细胞(DC)和天然杀伤(NK)细胞是在针对感染的早期防御中起着关键作用的关键天然效应子。近来，出现了NK-DC遗传交谈的证据。该遗传交谈是双向的，且其可能根据这两种细胞类型的激活状态而导致NK细胞激活和分化为杀伤细胞、DC成熟或凋亡。DC是启动辅助CD4+T细胞成为Th1效应子所必需的，且如HIV等不受控病毒的慢性表达可能诱导DC的受损成熟和破坏。在本研究中，本发明人解决了NK-DC相互作用对于DC破坏的影响，以及HIV对该遗传交谈的影响。
从来自健康供体的分选单核细胞制备未成熟DC(iDC)，并在IL-4和GM-CSF存在下培养6天。在某些实验中，用R5-HIV-1(1ng/ml的p24)感染iDC。在不同的NK:DC比进行与自体纯化aNK细胞(由PHA+IL-2激活)的共培养实验。将7-AAD染色与采用对HLA-DR、DC-SIGN、CD83、CD86、DR4、mTRAIL等具有特异性的mAb的膜染色和细胞内染色结合，使用多参数流式细胞分析对NK-DC相互作用对DC成熟和凋亡的影响进行了分析。
据发现，在NK:DC比为5:1时，aNK细胞快速(在1至2小时内)诱导未受感染的iDC的凋亡。NK-DC共培养物的实时视频显微分析证实，在NK-DC接触后即刻，DC显示出典型的凋亡性表型(细胞体积和出芽增加)(图7)。存活DC表现出成熟细胞的表型(图8)。iDC凋亡涉及由aNK细胞所产生的TNF相关凋亡诱导的配体(TRAIL)，且其由在其膜水平表达TRAIL的CD56明亮NK细胞与表达TRAIL受体DR4的DC之间的相互作用所介导。NK依赖性iDC凋亡完全被中和性抗DR4抗体所废止，从而突出了TRAIL依赖性途径在该过程中的重要作用(图9)。然而，刀豆素A(Concanamycin A)(颗粒体依赖性细胞毒性的抑制 剂)在NK-DC共培养物中的添加对于NK依赖性DC凋亡没有影响，从而排除了DC凋亡中穿孔素途径的参与。
为了研究HIV对aNK诱导的iDC凋亡的影响，用R5-HIV-1(1ng的p24/ml)感染iDC。在HIV感染后，iDC变得对aNK依赖性凋亡具有抗性。HIV-1自身并未诱导iDC的成熟，如受感染iDC的CD86/HLA-DR共染色所示(图10)。aNK细胞的TRAIL分泌未受iDC的HIV感染的影响，且HIV-1感染的DC仍然对于TRAIL诱导的凋亡易感(图10)。据发现，HIV-1感染的iDC对aNK诱导的凋亡的抗性依赖于HMGB1，如在甘草甜素或阻断性抗HMGB1抗体的存在下的抑制测试所示(图11)。此外还发现，HIV-1感染的iDC对aNK诱导的凋亡的抗性依赖于DC中的HIV-1复制，如在iDC感染时添加叠氮胸苷所示(图11)。综上，这些结果表明，iDC的HIV-1感染诱导受感染iDC对aNK诱导的凋亡的抗性，这涉及促炎性细胞因子HMGB1。
本发明人此前认识到，aNK细胞与HIV-1感染的iDC之间的遗传交谈导致DC中病毒复制和前病毒DNA表达的极大增加，且该过程主要由HMGB1触发。本实施例中的结果显示出HMGB1作为关键介导物在-1感染的DC的存活中的关键性参与，然后突出了HMGB1在病毒维系和HIV贮存细胞建立中的作用。这些结果表明，HIV如何“劫持”DC以有效诱导病毒散播和该性质如何可以用于治疗HIV感染。
实施例16：HIV-2存在下的aNK-DC共培养实验
与HIV-1类似，解决了HIV-2感染的DC对于病毒复制的NK依赖性触发的易感性的问题。对HMGB1在该过程中的影响进行评估。
1.用HIV-2感染DC：将iDC以500,000细胞/孔平板接种至96孔培养板中，并在37℃的5%CO2气氛中与HIV-2(20ng p24/ml)培养3小时。
2.NK-DC共培养：收集细胞，用含10%FCS的RPMI洗涤3次，并在指示时以1:5的NK:DC比添加aNK细胞。在指示时，添加10μg/ml的重组HMGB1(R&D Systems)，或添加兔抗HMGB1Abs(1μg/ml)(Abcam,Cambridge,英国)。NK-DC共培养持续3至7日，然后对培养物上清液中的病毒生产进行定量。
3.HIV-2病毒生产的定量：用p24ELISA试剂盒(Ingen,比利时)确定上清液中的HIV-2颗粒的浓度。
如图6C所示，不论感染的DC是单独培养还是在aNK细胞存在下培养，在感染3天后都检测到极低水平的HIV-2生产。rh-HMGB1诱导了轻微的病毒复制的增加。如此前采用HIV-1的研究中所观察到，DC感染第3日对于检测显著病毒复制而言过早。这些共培养物上清液将在第7日时再次测试。
实施例17：人血清中HMGB1蛋白和抗HMGB1抗体的检测/与受HIV感染的患者中的疾病活性的关联
根据ELISA试剂盒Shino测试(IBL)，对来自HIV感染患者的血清中的HMGB1蛋白的浓度进行定量。
此外，开发了用于检测总的抗HMGB1特异性抗体的特殊ELISA测试。考虑到对于HMGB1特异的自身抗体可见于SLE(系统性红斑狼疮)(Hayashi等，2009)，所要探求的是在HIV感染患者中是否检测到抗HMGB1抗体且其水平是否与HIV感染相关联。
抗HMGB1抗体检测用ELISA测试
该测试以两步进行开发：
(1)在第一步中，使用具有人HMGB1特异性的兔多克隆抗体，来限定用于对涂布的HMGB1或BOX B上的抗体的滴定的条件。由于据怀疑抗HMGB1抗体可能作为免疫复合物见于血清中(Urbonaviciute等，Factors masking HMGB1in human serum and plasma.J Leukoc Biol.200781:67-74)，因而开发了一种在对抗体进行滴定之前将这些复合物解离的方法。
(2)在第二步中，使用来自数组供体的人类样品(来自健康供体、脓毒性休克患者或者在进行抗逆转录病毒治疗之前或之后的HIV+患者)。
使用以下试剂：
——兔抗人HMGB1多克隆一抗(Adcam ab18256)针对源自人HMGB1的150位残基至C端的KLH缀合的合成肽；
——在大肠杆菌中生产的来自编码大鼠HMGB1的表达质粒的重组HMGB1(HMGBiotech,HM-115)，所述大鼠HMGB1与人HMGB1具有99%同一性；
——来自在大肠杆菌中生产的来自编码哺乳动物序列的表达质粒的重组HMGB1(HMGBiotech,HM-115)的重组BOXB，所述哺乳动物序列在人和小鼠中完全相同；
——对照兔血清(Sigma;Ref:R9133)；
——与碱性磷酸酶(PAL)、底物磷酸对硝基苯酯片剂(pNPP)缀合的抗兔IgG或IgM；
——校正物：来自血清的人IgG(Sigma;ref I2511)和来自血清的人IgM(Sigma;ref I8260)；
——产自山羊的抗人IgG(Fc特异性)碱性磷酸酶抗体(Sigma;RefA9544)，产自山羊的抗人IgM(μ链特异性)碱性磷酸酶抗体(Sigma;refA3437)。
进行如下测试：
使用DPBS中的3μg/ml的HMGB1或0.5μg/ml的BOXB于4℃过夜进行96孔板的涂布。同时，采用对应的同种型的DPBS系列稀释液进行校正物的涂布(仅对于用人类样品进行的ELISA测试)。使用微孔板洗涤器(Atlantis;Oasys)用DPBS/0.05%(体积/体积)20洗涤板四次。在ELISA测试的每一步之后进行类似洗涤。于4℃用PBS/2%(重量/体积)BSA将未结合位点封闭。将在DPBS/0.05%(体积/体积) /1%(重量/体积)BSA中稀释的血清样品的100μl等分试样添加至经涂布和未经涂布的板孔中，并在37℃温育1小时。将所有血清样品在未经处理或经处理后用1.5M甘氨酸(体积/体积,pH1.85)在25℃的水浴中测试30分钟，并进而保持在冰上并用1.5M Tris(体积/体积,pH9,0)稀释。然后将样品立即稀释(1/10～1/1000)并配分至涂布板上。在37℃的1小时中添加在DPBS/0.05%(体积/体积)/1%(重量/体积)BSA中稀释的抗兔IgG碱性磷酸酶缀合抗体(比例为1/10000)、山羊抗人IgG(比例为1/2000)或IgM(比例为1/2000)碱性磷酸酶缀合抗体。在37℃温育30分钟后用100μl pNPP进行抗原特异性抗体的检测，然后通过添加100μl的3M NaOH使反应停止。如此前在志贺氏菌属 LPS特异性ELISA中所报道(Launay等，Vaccine2009,27:1184-1191)，根据通过Ascent软件(ThermoElectrocorp)从标准免疫球蛋白溶液吸光度获得的标准曲线来计算HMGB1特异性或BOXB特异性抗体的浓度。数据以μg/ml所检测抗体表达。
为开发该测试，已使用HMGB1或BOXB涂布板对许多参数进行测试，以滴定兔抗人抗体。所获结果如下：
——2%～5%的BSA浓度是等效的(图13A)；
——选择1/10000稀释的抗IgG-PAL抗体作为纯化抗HMGB1抗体滴定曲线的线性部分，如箭头所示(图13B)；
——浓度为2.5μg/ml～5μg/ml的板孔涂布用HMGB1是最适合的，如纯化抗HMGB1抗体滴定曲线的线性所示(图13C)；
——选择浓度为0.5μg/ml的纯化抗HMGB1抗体(图13D)；
——由于与兔抗HMGB1抗体相比没有非免疫兔抗体的反应性存在，因而该测试是特异性的(图13E)；且
——当在HMGB1或Box B涂布板上对兔抗人抗体进行测试时获得比较数据，进而选择Box B(HMGB1的主要免疫原性部分)(图14)。
用于检测人类样品中的复合的抗HMGB1抗体的酸处理
为确定测试人类生物样品所需的测试条件，测试了一系列人血清中HMGB1特异性抗体的存在，且假定[HMGB1抗HMGB1Ab]存在于生物样品中，对采用甘氨酸(1.5M,pH1.85)对这些免疫复合物进行预处理以使其解离的影响进行了分析。对所有未经处理的或在25℃的水浴中用1.5M甘氨酸(体积/体积，pH1.85)处理30分钟的血清样品进行测试，并进而保持在冰上，并用1.5M Tris(体积/体积，pH9,0)稀释。然后如上所述将样品立即稀释，并配分至涂布板上进行测试。
图15中所示数据显示，抗HMGB1抗体很难在人血清中被检测到，除非对其用1.5M甘氨酸处理以使免疫复合物解离。因此，大多数HMGB1特异性抗体形成与HMGB1的复合物，从而表明促炎性分子的中和机制。
对来自HIV+患者的血清中的HMGB1和抗HMGB1抗体的定量
在不同疾病期在未经治疗的HIV感染(HIV+)患者中对循环HMGB1和抗HMGB1抗体进行测试。
1.来自HIV感染患者的血清中的HMGB1滴定
图16显示，与健康供体相比(虚线)，在HIV+患者中检测到循环水平升高的HMGB1。
2.强效抗逆转录病毒疗法对CD4细胞、CD8细胞、前病毒DNA和HIV RNA VL的影响
在对7位HIV+患者(具有可检测的病毒载量;VL)的一年期临床跟踪过程中，在高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)开始时和HAART的第1月(M1)、第3月(M3)、第6月(M6)和第12月(M12)，对HAART对于CD4细胞、CD8细胞、前病毒DNA和HIV RNA VL的免疫学效果进行测定。结果在下表和图17中呈现。
该患者特征表显示，HAART在所有患者中均诱导了对HIV-RNAVL的显著和快速抑制(Δ病毒载量是指在给定时间点的VL与在基线M0的VL之间的差异)，从而达到不可检查的水平(50拷贝/ml血液)。此外，HAART诱导了血液CD4T细胞数目的显著增加，而在CD8T细胞水平没有检测到变化(图17A)。HAART还诱导了血浆HIV-RNA病毒载量的显著减少(相比M0，在M1和M3时p<0.001，在M6和M12时p<0.05)。在与HIV-DNA相关的细胞上没有观察到显著影响(图17B)。
3.强效抗逆转录病毒疗法对这些血清样品中的HMGB1和抗HMGB1抗体的影响 
在HAART开始时和HAART的第1月(M1)、第3月(M3)、第6 月(M6)和第12月(M12)后，对HMGB1和抗HMGB1抗体的血浆水平进行滴定。通过上述测试确定抗体滴度，即在滴定前用甘氨酸处理患者血清并对抗HMGB1抗体进行定量。结果如图18和19中所示。
对来自这些患者的血清样品中的HMGB1的滴定表明，在HAART下的HIV-RNA VL的抑制与降低的HMGB1水平相关(图18)。到M6时，HMGB1达到健康个体(虚线)的水平。因此，证明HAART的影响对于HIV对HMGB1生产具有驱动作用。
图19中的数据显示，在M0时在患者血清中发现可检测的抗HMGB1抗体浓度，且到M6时抗逆转录病毒疗法诱导了抗HMGB1抗体浓度的下降，在M12时达到不可检测的值。在M6(p=0.05)和更晚的时间点(M12)也检测到与基线相比统计性显著的抗HMGB1抗体水平的下降。
因此，对HMGB1和抗HMGB1水平的组合测定表明，慢性HIV感染触发HMGB1的生产，后者反过来触发中和抗体的生产。这是一个动态过程，指示着在HMGB1水平的下降(M3)和抗HMGB1水平下降(M6)之间的延迟，两种分子的水平在强效抗逆转录病毒治疗后均被归一化。
抗HMGB1水平和HIV病毒载量的相关性
考虑到上述结果，解决了有关HMGB1和抗HMGB1抗体的循环水平是否与HIV-RNA病毒载量相关的重要问题。
因此，在疾病的不同阶段，对具有不同病毒载量的来自HIV+患者的血清样品进行了测试。结果总结在下表和图20中(Spearman相关性测试)。
r=相关系数；p<0.05：两个变量相关的概率>95%；n=研究中的患者数
如图20A所示，在HMGB1和抗HMGB1抗体水平之间存在反相关性，表明HMGB1生产诱导了中和HMGB1的抗HMGB1抗体的合成，因为较低水平的HMGB1与较高水平的抗体相关联。
图20B证明，在抗HMGB1抗体和VL之间存在反相关性，这表 明由于抗HMGB1抗体的中和活性，HMGB1对于病毒复制的刺激性活性受抗体的抑制。
这些数据证明，基于抗HMGB1的疗法在HIV+患者中具有有益效果，这可导致HMGB1中和并因此减少病毒载量。
修改和其它实施方式
在不背离本发明的范围和精神的情况下，对本发明所公开的产品、组合物和方法以及概念的各种修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。虽然已结合具体优选实施方式对本发明进行了描述，但应该理解，所要求的发明并非只在限于这些具体实施方式。对于医学、免疫学、生物学、化学和药学领域或相关领域的技术人员显而易见的对所属具体实施方式的各种修改理应落入后附权利要求的范围内。
参考文献的并入
特别是对于围绕正文中文献引用的具体主题而言，通过参考将本公开所引用或提及的每篇文献、专利、专利申请或专利公报整体并入。然而，并并未承认任何此类参考文献构成背景技术，且保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。
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Claims (31)

1.一种体外方法，所述方法用于对获自受试对象的生物样品中所含有的对于高迁移率族蛋白I(HMGB1)具有特异性的总抗体进行定量，且所述方法包括：
a)通过用1.5M甘氨酸在pH 1-3之间来处理所述样品以使发现于所述样品中的免疫复合物解离；
b)使所述经处理的生物样品与天然HMGB1蛋白或重组HMGB1或对应于人类和小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB；和
c)对对于高迁移率族蛋白I(HMGB1)具有特异性的总抗体进行定量。
2.如权利要求1所述的方法，其中获自受HIV感染的受试对象的所述生物样品是血液、血浆、血清、唾液、外周血单核细胞(PBMC)或者其它体液或组织。
3.如权利要求1所述的方法，其中对于HMGB1具有特异性的抗体的量通过使用涂布于固体支持体上的高迁移率族蛋白I(HMGB1)或重组HMGB1或对应于人类和小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB的ELISA来确定。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述HIV是HIV-1或HIV-2。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述受试对象是人类。
6.天然HMGB1蛋白或重组HMGB1或对应于人类和小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB在制造试剂盒中的应用，且所述试剂盒用于体外监测获自已知被HIV感染的受试对象的生物样品中的人免疫缺陷病毒(HIV)感染，包括对对于高迁移率族蛋白I(HMGB1)具有特异性的抗体进行定量，其中定量所针对的所述抗体是对于HMGB1具有特异性的总抗体或其循环组分或其免疫学复合组分，其中抗-HMGB1抗体水平的降低指示了HIV感染的降低。
7.天然HMGB1蛋白或重组HMGB1或对应于人类和小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB在制造试剂盒中的应用，且所述试剂盒用于体外监测受HIV感染的受试对象中针对HIV感染的治疗的效力，包括
(a)在所述治疗期间的不同时间在获自所述受试对象的样品上执行权利要求1所述的方法，或者对对于高迁移率族蛋白I(HMGB1)具有特异性的抗体进行定量，其中定量所针对的所述抗体是对于HMGB1具有特异性的总抗体或其循环组分或其免疫学复合组分，
(b)确定给予所述受试对象的所述治疗的效力,
(c)任选地，将在所述治疗的不同时间对于获自所述受试对象的样品所获得的结果与采用在所述治疗开始前采用相同受试对象的样品获得的结果相比较。
8.如权利要求6或7所述的应用，其中获自受HIV感染的受试对象的所述生物样品是血液、唾液、外周血单核细胞(PBMC)或者其它体液或组织。
9.天然HMGB1蛋白或重组HMGB1或对应于人类和小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB在制造试剂盒中的应用，且所述试剂盒用于体外诊断/预后受HIV感染的患者中的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的进展状态或朝AIDS进展的状态，包括在感染后、在原发性或急性感染期间或者在慢性感染期间在获自所述患者的样品中执行权利要求1所述的方法，或者对对于高迁移率族蛋白I(HMGB1)具有特异性的抗体进行定量，其中定量所针对的所述抗体是对于HMGB1具有特异性的总抗体或其循环组分或其免疫学复合组分，且其中对于HMGB1具有特异性的抗体的水平越高，则发展AIDS或晚期AIDS的风险越高。
10.如权利要求6、7或9所述的应用，其中对于HMGB1具有特异性的抗体的量通过使用涂布于固体支持体上的高迁移率族蛋白I(HMGB1)或重组HMGB1或对应于人类和小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB的ELISA来确定。
11.如权利要求6、7或9所述的应用，其中所定量的对于HMGB1具有特异性的抗体是选自(a)在进行适于使与特异性抗HMGB1抗体形成的免疫复合物解离的步骤之后获得的对于HMGB1具有特异性的总抗体，或(b)循环抗体。
12.抗人HMGB1抗体在制造试剂盒中的应用，所述试剂盒用于体外监测受HIV感染的受试对象中的HIV感染，包括(a)对获自所述受试对象的由血液、唾液、PBMC或其它体液构成的生物样品中所含的高迁移率族蛋白I(HMGB1)进行定量，其中定量所针对的所述HMGB1蛋白是总HMGB1或其免疫学复合组分，(b)任选地与获自治疗开始前的受试对象的样品的结果进行比较。
13.如权利要求12所述的应用，其中对生物样品中所含的HMGB1蛋白进行定量是在使来自所述生物样品与免疫学结合高迁移率族蛋白I(HMGB1)的抗体相接触之后进行。
14.如权利要求12所述的应用，其中所述定量的HMGB1蛋白是在使得与所述HMGB1蛋白形成的免疫学复合物能够解离的条件下通过酸处理来处理得到的总HMGB1蛋白。
15.抗人HMGB1抗体在制造试剂盒中的应用，所述试剂盒用于体外在获自已知受HIV感染的受试对象的生物样品中监测HIV病毒载量，包括
(a)对获自所述受试对象的由血液、唾液、PBMC或其它体液构成的生物样品中所含的高迁移率族蛋白I(HMGB1)进行定量，其中定量所针对的所述HMGB1蛋白是总HMGB1或其循环组分或其免疫学复合组分，并且任选地与获自治疗开始前的受试对象的样品的结果进行比较，其中所述HMGB1蛋白越多，则病毒载量越多
(b)任选地，将步骤(a)中所定量的HMGB1与来自获自未受HIV感染的受试对象的生物样品的HMGB1的量进行比较，或与来自在不同时间获自相同受试对象的生物样品的HMGB1的量进行比较。
16.如权利要求15所述的应用，其中对生物样品中所含的HMGB1蛋白进行定量是在使来自所述生物样品与免疫学结合高迁移率族蛋白I(HMGB1)的抗体相接触之后进行。
17.如权利要求15所述的应用，还包括排除或控制所述受试对象中的急性和/或慢性感染的至少一种诊断测试。
18.抗人HMGB1抗体在制造试剂盒中的应用，所述试剂盒用于体外监测针对受HIV感染的受试对象中的HIV感染的治疗的效力，包括在所述治疗期间的不同时间在获自所述受试对象的样品上(a)对获自所述受试对象的由血液、唾液、PBMC或其它体液构成的生物样品中所含的高迁移率族蛋白I(HMGB1)进行定量，其中定量所针对的所述HMGB1蛋白是总HMGB1或其循环组分或其免疫学复合组分，(b)任选地与获自治疗开始前的受试对象的样品的结果进行比较，和确定给予所述受试对象的所述治疗的效力，以及任选地与用治疗开始前获自相同受试对象的样品所获得的结果进行比较。
19.如权利要求18所述的应用，其中对生物样品中所含的HMGB1蛋白进行定量是在使来自所述生物样品与免疫学结合高迁移率族蛋白I(HMGB1)的抗体相接触之后进行。
20.抗人HMGB1抗体在制造试剂盒中的应用，所述试剂盒用于体外诊断/预后对受HIV感染的患者中的AIDS的进展状态或朝AIDS进展的状态，包括在感染后、在原发性或急性感染期间或者在慢性感染期间在获自所述患者的样品中(a)对获自所述受试对象的由血液、唾液、PBMC或其它体液构成的生物样品中所含的高迁移率族蛋白I(HMGB1)进行定量，其中定量所针对的所述HMGB1蛋白是总HMGB1或其循环组分或其免疫学复合组分，(b)任选地与获自治疗开始前的受试对象的样品的结果进行比较，且其中HMGB1蛋白的水平越高，则发展AIDS的风险或晚期AIDS的风险越高。
21.如权利要求20所述的应用，其中对生物样品中所含的HMGB1蛋白进行定量是在使来自所述生物样品与免疫学结合高迁移率族蛋白I(HMGB1)的抗体相接触之后进行。
22.如权利要求6、7、9、12、15、18或20所述的应用，其中所述HIV是HIV-1或HIV-2。
23.如权利要求6、7、9、12、15、18或20所述的应用，其中所述受试对象是人类。
24.选自由a)甘草甜素，b)特异性阻断HMGB1的抗体或此类抗体的片段，所述抗体或抗体片段保持所述特异性阻断HMGB1的能力，和c)能结合HMGB1的分离的RAGE或其片段组成的组的试剂在制备用于治疗人类中HIV感染的药物中的应用，所述试剂任选地与针对HIV感染的其它活性化合物组合。
25.选自由a)甘草甜素，b)特异性阻断HMGB1的抗体或此类抗体的片段，所述抗体或抗体片段保持所述特异性阻断HMGB1的能力，和c)能结合HMGB1的分离的RAGE或其片段组成的组的试剂在制备用于减少HIV感染的受试对象中的HIV贮存细胞的药物中的应用，所述试剂任选地与针对HIV感染的其它活性化合物组合。
26.如权利要求24或25所述的应用，其中所述抗体是单克隆抗体、单链抗体，或所述抗体的片段是Fab、Fv、Fab2片段。
27.如权利要求24或25所述的应用，其中所述抗体或片段为人类的或人源化的。
28.如权利要求25所述的应用，其中所述HIV贮存细胞是对于HIV敏感且能被HIV感染的源自如血液、实体组织或粘膜等生物组织的细胞。
29.如权利要求25所述的应用，所述HIV贮存细胞为来自脑、肝、脾、扁桃体、节点、肠相关淋巴样组织(GALT)的细胞，或为外周血细胞、如T细胞特别是CD4T细胞等淋巴样细胞系，或为如巨噬细胞或树突状细胞等单核细胞衍生细胞。
30.一种试剂盒，所述试剂盒用于对样品中的对于高迁移率族蛋白1(HMGB1)具有特异性的总抗体进行定量，所述试剂盒包含：
a)天然HMGB1蛋白或重组HMGB1或对应于人类和小鼠所共有的HMGB1序列的来自HMGB1的重组BOXB；
b)适于将在取自患者时发现于所述样品中的免疫学HMGB1/抗HMGB1抗体复合物解离的在pH 1-3之间的1.5M甘氨酸溶液；
c)任选的中和缓冲液；和
d)任选的与HMGB1/特异性抗体复合物结合的二抗。
31.一种试剂盒，所述试剂盒用于对样品中的总高迁移率族蛋白1(HMGB1)进行定量，所述试剂盒包含：
a)对于所述HMGB1蛋白具有特异性的抗体，或其能结合所述HMGB1蛋白的片段；
b)适于将在取自患者时发现于所述样品中的免疫学HMGB1/抗HMGB1抗体复合物解离的在pH 1-3之间的1.5M甘氨酸溶液；
c)任选的中和缓冲液；和
d)任选的与HMGB1/特异性抗体复合物结合的二抗。
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