KR101651304B1 - Ｈｍｇｂ1 의존적인 ｈｉｖ-1 복제 및 지속감염 촉발의 조절에 의한 인간 면역결핍 바이러스 감염의 모니터링 및 억제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고 운동성 박스 1(HMGB1) 단백질이 자연 살해(NK) 세포와 상호작용하는 능력을 억제하는 물질을 포함하는, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 치료 조성물은 HMGB1에 결합하는 항체 및 약물, 예컨대 글리시리진을 포함한다. HIV 감염을 검출 또는 모니터링하는 방법은 생물학적 샘플 중 HMGB1 또는 HMGB1 특이적 항체의 검출 또는 정량을 포함한다.

Description

ＨＭＧＢ1 의존적인 ＨＩＶ-1 복제 및 지속감염 촉발의 조절에 의한 인간 면역결핍 바이러스 감염의 모니터링 및 억제{MONITORING AND INHIBITING HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION BY MODULATING HMGB1 DEPENDENT TRIGGERING OF HIV-1 REPLICATION AND PERSISTENCE}
HMGB1 수준 및/또는 HMGB1에 대해 특이적으로 생성된 항체를 측정하는 것을 포함하는 진단 및 예후 방법에 관한 것이다. HMGB1의 활성을 조절하여 인간 면역결핍 감염의 중증을 치료 또는 경감시키는 항체계 및 약물계 방법에 관한 것이다.
HIV-1 감염의 초기 단계는 선천 면역의 중요한 이펙터, NK 세포 및 DC의 국부 동원 및 활성화와 관련되어 있다. 점막 감염의 처음 몇시간 및 몇일 동안에는, HIV-1이 상피세포 장벽을 통과하여 점막 조직에서 CCR5-발현 DC, 대식세포 및 T 세포를 발현하여 감염을 개시한다1,2. DC는 CD4, CCR5, DC-SIGN3 및 HIV-1의 포집 및 확산을 용이하게 하는 다른 C-유형 렉틴 수용체(CLR)를 발현한다4,5. 미숙 DC(iDC)는 CLR을 통해서 HIV-1를 포집하고6 포집된 바이러스는 내면화되어 감염성 시냅스 형태로 인근 CD4 T 세포로 신속하게 전달된다7,8. DC-T 세포 접합체는 CD4 T 세포에서 증식성 감염을 촉진하고9, 배액 림프절 및 후속되는 다른 림프구 조직 구획으로의 감염 확산은 감염된 대식세포 및 CD4 T 세포와 함께 바이러스 보유 DC에 의해 보장된다10.
바이러스 흡수 후에 2차 림프구 조직의 T 세포 영역으로의 iDC의 이동은 생성되는 성숙 DC(mDC)가 항원 특이적 반응을 감작시키는 성숙 과정과 관련이 있다11. 최근, DC의 운명은 자가 NK 세포에 대단히 의존적인 것으로 밝혀졌다12. NK-iDC 상호작용 결과 NK 세포가 활성화되어, 각각의 그 밀도에 따라서 DC 성숙 또는 사멸을 유도한다13, 14, 15. 성숙화를 진행한 DC는 몇몇 사이토킨, 예컨대 IL-12 및 IL-18을 분비하며, 이는 NK 세포 활성화 및 세포독성의 유효 유발인자로서 작용한다16,17,18,19,20. 또한, 일단 활성화되면, NK 세포는 DC 성숙화를 유도할 수 있는 IFN-γ 및 TNF-α를 생성한다. 이 현상은 iDC에서 발현되는 리간드에 의한 NKp30의 지속접촉(engagement)17,21과, CD94/NKG2A 억제성 수용체에 대한 리간드인 HAL-E의 iDC에서의 하향 조절에 의존한다22. 시냅스 간극에서 iDC에 의해 방출되는 IL-18에 의해 활성화되는 NK 세포는 HMGB1을 분비하며, 이는 DC 성숙화를 유도하고 세포용해로부터 DC를 보호함을 제시하는, 또 다른 메카니즘이 제안되었다20. HMGB1은 거의 모든 진핵 세포에 존재하는 핵 단백질이며, 뉴클레오솜 형성을 안정화시키는 기능을 하고, 몇몇 유전자 발현을 조절하는 전사 인자 유사 단백질로서 작용한다23,24. HMGB1은 괴사성 세포로부터 방출되지만, 염증 자극에 반응하여 활성화된 대식세포25 및 활성화된 NK 세포20에 의해 분비될 수 있으며, 손상 관련 분자 패턴 분자(DAMP)의 주요 프로토타입의 하나이다26. 이것은 면역계의 중요한 사이토킨으로서, 염증성 백혈구의 트래픽킹을 촉진하며, DC가 성숙하고, 림프절에 도달하여 항원 특이적 T 세포의 증식을 지원하고, T-헬퍼 1 표현형으로의 편향을 촉진하는데 중요한 것으로 최근 밝혀졌다27,28.
바이러스 감염 도중 NK-DC 상호작용에 관련된 메카니즘은 잘 알려지지 않았다. MCMV-감염된 DC가 시험관내에서 동계 NK 세포를 활성화시킬 수 있으며, 또한 생체 내에서 NK 세포 의존적 제거율을 향상시킬 수 있다는 것이 쥐과 CMV(MCMV) 감염에서 최근 보고되었는데29, 이는 바이러스 복제 조절에 있어서 NK-DC 크로스 토크의 중요한 역할을 입증하는 것이다. HIV 감염에 있어서, iDC의 NK 세포 제거 결함뿐 아니라, 상호 NK-DC 활성화 및 성숙화 과정에서의 비정상을 특징으로 하는, NK-DC 상호작용도 HIV-1-감염된 바이러스혈증 환자에서는 결함이 있지만, 비바이러스혈증 환자에서는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다30. HIV-1 감염된 iDC의 바이러스 복제에 대한 민감성, 작용, 및 성숙화에 대한 NK-DC 크로스 토크의 역할을 평가하였다. HIV-1 감염된 DC의 성숙화는 활성화된 NK 세포에 의해 촉발될 수 있지만, 이것은 NK 세포와의 크로스 토크 후에 Th1 편향을 유도하는 감염된 성숙 DC의 강력한 손상과 관련이 있었다. 또한, NK 세포와 HIV-1 감염된 iDC 사이의 크로스 토크는 DC에서의 프로바이러스 DNA 발현과 바이러스 복제를 급격히 증가시켰다. 이 과정은 NK-DC 크로스 토크의 결과로서 NK 세포 및 DC 둘다에 의해 방출되는, HMGB1에 의해 주로 촉발된다.
HIV-1은 DC를 이용하는 진화된 방식을 보유하여, 바이러스 확산을 촉진하고 항바이러스 면역 회피가 가능하다. DC의 운명은 NK 세포에 따라 달라진다. 이하, 본 발명자들은 HIV-1 감염된 DC의 운명에 대한 NK-DC 크로스토크의 영향을 상세히 설명한다. 활성화된 NK 세포는 감염된 DC의 성숙화를 효과적으로 촉발시키지만, 이것은 Th1 편향을 유도하는 성숙 DC의 강력한 손상과 관련이 있었다. 또한, NK 세포와 감염된 DC 사이의 크로스토크는 DC에서 HIV-DNA와 바이러스 복제를 급격히 증가시켰다. HMGB1은 이 과정에서 중요하며, 글리시리진(glycyrrhizin) 또는 특이적 항체에 의한 HMGB1 활성 억제가 DC에서 HIV-1 복제를 방해하였다. 본 발명자들은, HIV가 DC를 '장악(hijack)하여' 바이러스 확산을 효과적으로 촉진하는 방식에 관한 새로운 이해가, HIV 감염을 억제하는 새로운 방법, HIV 감염을 진단 및 모니터링하는 새로운 방법, HIV 감염, 바이러스 양(viral load) 및 HIV 감염에 대한 치료 효능을 모니터링하는 새로운 방법, 및 AIDS 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태의 예후를 전망하는 새로운 방법을 어떻게 제공할 수 있는지를 개시한다.
발명의 설명
본 발명의 측면들은 하기 치료, 예후 및 진단 분야를 포함한다.
환자에서 HMGB1을 차단하면 HIV 복제 억제, DC에서의 HIV 저장소 감소 및 질병 진행 지연에 도움이 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 측면은 HIV에 의해 감염된 피험체를 HMGB1에 결합하는 제제, 특히, 고 운동성 군 상자 1 단백질(HMGB1; High Mobility Group Box 1)에 결합하는 항체 또는 HMGB1 결합 항체 단편, 글리시리진 또는 단리된 RAGE 또는 HMGB1에 결합할 수 있는 RAGE 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 조절 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 HIV에 의해 감염된 개체에서 HIV 감염을 치료하기 위한 의약으로서 사용하기 위한, HMGB1에 결합하는 제제, 특히 고 운동성 군 상자 1 단백질(HMGB1)에 결합하는 항체 또는 HMGB1 결합 항체 단편, 글리시리진 또는 단리된 RAGE 또는 HMGB1에 결합할 수 있는 RAGE 단편에 관한 것이다. 치료에 사용할 수 있는 특정 제제는 HMGB1을 특이적으로 차단하는 항체, 또는 그러한 항체의 단편, 특히 HMGB1을 특이적으로 차단할 수 있는 능력을 보유한 항체 단편이다. 단편의 예는 단쇄 항체, 또는 Fab, Fv 및 Fab2 단편이다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이고, 상기 단편은 모노클로날 항체의 일부이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 항체 또는 단편은 인간 또는 인간화된 것이 바람직하다. "특이적으로 차단하는"이란, 항체 또는 이의 단편이 HMGB1 단백질에 결합하여, 이의 활성을 방지하거나 감소시키는, 구체적으로 그 수용체, 특히 RAGE 수용체 하나 이상에서의 결합을 방지하는 능력을 가지는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 차단 작용의 발생 여부는, HMGB1의 하나 이상의 이의 수용체에의 결합을 분석하고/하거나, 수지상 세포(DC) 성숙화(HIV 감염 여부와 무관하게), DC에서의 HIV 복제 및/또는 DC에서의 HIV DNA 발현에 대한 HMGB1의 활성을 분석하여 시험할 수 있다. HMGB1의 그 수용체들 중 하나(특히, RAGE)에서의 결합 감소 또는 상기 정의한 바와 같은 HMGB1의 활성 감소가 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상인 경우, 항체 또는 이의 단편이 HMGB1 단백질을 특이적으로 차단하는 것으로 본다.
본 명세서에 있어서, "특이적으로" 또는 "특이적"이란 용어는 항체 또는 이의 단편이 HMGB1 단백질을, 바람직하게는 다른 세포 단백질들에 대하여, 인식하여 결합할 수 있고, 특히 면역계에 관련된 다른 세포 단백질들을, 특히 NK-DC 크로스 토크 상황에서 유의적으로 인식하여 결합하지 않거나, 또는 다른 세포 단백질들을 유의적으로 인식하여 결합하지 않는 것을 의미한다. 본 출원에 있어서, 달리 언급된 바 없다면, 항체에 관한 설명은 상기 개시된 다른 단편들에게도 적용된다.
특정 작용 기전에 구애받지 않으면서, 수지상 세포에서 바이러스 저장소의 보충 및 바이러스 복제를 감소시켜 이 방법을 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 HIV 감염 피험체에서 HIV 저장소 세포를 감소시키는 약물로서 사용하기 위한 상기 언급한 HMGB1에 결합하는 제제에 관한 것이다. HIV 저장소 세포는 HIV에 민감하고/하거나, HIV로 감염될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 특정 구체예에서, HIV 저장소 세포는 프로바이러스 DNA를 보유한다. HIV 저장소 세포는 혈액, 고형 조직 또는 점막과 같은 생물학적 조직, 특히 뇌, 간, 비장, 편도선, 결절 또는 장연관 림프구 조직(GALT)으로부터 유래한다. 특정 구체예에서, 이들 세포는 말초혈 세포, 림프구계 세포, 예컨대 T 세포, 특히 T CD4 세포이거나, 또는 단핵구 유도 세포, 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포이다.
인간 면역결핍 바이러스는 HIV-1 및 HIV-2 균주뿐 아니라, 유인원 및 다른 포유류에 적응시킨 HIV 균주를 포함하여, 이 바이러스의 다른 변종을 포함한다.
본 발명은 또한 HIV-2 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하는, 다른 레트로바이러스에 의해 유발되는 감염의 치료, 진단 및 모니터링에 적용된다. HIV와 같은 레트로바이러스에 의해 감염된 피험체 또는 환자는 인간, 원숭이 및 다른 유인원과, HIV 감염 모델에 사용되는 다른 포유류를 포함한다. 특이적 HIV-1 균주는 R5 HIV-1 균주 및 X4 HIV-1 균주를 포함한다.
HMGB1은 핵에 나타나는 잘 알려진 단백질로서, 사이토킨으로도 알려져 있다. HMGB1의 물리적 및 기능적 특성은 참고로 포함된 문헌[Lotze, et al., Nature Reviews, Immunology 5:351 (2005)]에 개시되어 있다.
HMGB1에 결합하는 항체가 알려져 있으며, 당업계에 잘 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 시판되는 항-HMGB1 항체의 예는 인간 HMGB1의 150번 잔기 내지 C-말단으로부터 유도된 KLH 접합된 합성 펩티드에 대해 유도되는, 인간 HMGB1에 대한 토끼 1차 폴리클로날 항체(Abcam ref. 18256)이다. 이들 방법은 HMGB1에 대한 폴리클로날 항체 및 HMGB1에 대한 모노클로날 항체 또는 HMGB1의 특이적 단편을 생성하는 방법들을 포함한다. 치료 용도에 사용되는 항체는 차단성을 가지며, 예컨대 특히 감염된 수지상 세포에서 HMGB1 유도된 HIV 복제를 저해한다. 이들 항체는 바람직하게는 이들이 투여되어 인식되는 피험체와 동일한 종으로부터 유도되거나, 또는 이들이 투여되는 동일한 종의 HMGB1로 유도된다. 이들 항체는 상이한 이소타입, 예컨대 IgA, IgG 또는 IgM 이소타입을 가질 수 있다. Fab, Fab2, 및 단쇄 항체 또는 이의 단편을 포함하는, HMGB1에 결합하는 항체 단편을 또한 사용할 수 있다.
인간화된 항-HMGB1 모노클로날 항체를 또한 인간에서 치료적으로 사용할 수 있다. 이들은 당업계에 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 높은 바이러스 양 및 높은 수준의 HMGB1을 가지는 HIV 감염 환자에게 이들 항체 주사를 이용하여 바이러스 복제를 줄이고 저장소 세포의 수를 제한할 수 있다. 그러한 인간화 항체는 구제 요법 또는 대안 요법으로 사용되거나, 다른 항레트로바이러스와 병용될 수 있다.
HMGB1에 결합하는 본원에 정의된 항체 또는 이의 단편을 피험체에게 투여하여 피험체에서 HMGB1에 결합시켜 HIV 복제 또는 감염을 조절할 수 있다. 투여 방식은 정맥내(i.v.), 피내, 피하(s.c.), 대뇌내, 경점막, 경피, 흡입(예컨대, 기관내, 폐내, 또는 기관지내), 비강내, 경구, 협측, 경피 및 직장 투여를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
HMGB1 생성 또는 방출의 표적화, 또는 DC에서의 이의 수용체(들), 특히 RAGE와의 상호작용 방지를 이용하여 만성 바이러스 감염을 치료할 수 있는데, 이는 감염된 DC의 생존 및 성숙화와 염증 반응에 대한 영향을 고려한 것이다. 따라서, HMGB1과 DC 상에서의 HMGB1 수용체(예, RAGE)의 기능적 상호작용을 억제하는 가용성 HMGB1 수용체 단백질(예, 가용성 RAGE 단백질 또는 HMGB1에 결합할 수 있는 단편) 또는 HMGB1 수용체(예, RAGE)에 결합하여 이의 HMGB1과의 상호작용을 억제하는 항체 또는 항체 단편과 같은 제제를 이용할 수 있다. DC 상에서 RAGE에 결합하여 HMGB1과 DC의 기능적 상호작용을 억제하는 HMGB1 부분도 고려된다.
본 발명자들은 글리시리진이 DC에서 HMGB1 의존적 HIV 복제를 억제할 수 있다는 것을 확인하였다. 글리시리진 요법은 부작용이 거의 없고, 최근에 IFN 저항성인 만성 활성 C형 간염을 가진 환자에서 간세포 암발생을 예방하기 위해 생체내에서 성공적으로 사용되었다. 이 요법은, 다약물 내성 바이러스로 인한 구제 요법으로서, HIV 특이적 항-레트로바이러스의 사용에 대한 대체 요법으로서(바이러스 자체에서보다 염증성 미소환경에서 작용하며 독성이 적음), 또는 이들 약물이 완전하게 성공하지 못한 경우 항-레트로바이러스를 이용한 병용 요법으로서, HMGB1의 수준이 증가되고 바이러스 양이 검출가능한 만성 HIV 감염 환자에서 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면은 HIV-1 감염을 포함하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 조절 방법으로서, HIV에 의해 감염된 세포 또는 피험체를 고 운동성 군 상자 1 단백질(HMGB1)에 결합하는 제제, 특히 수지상 세포(DC)에서 자연 살해(NK) 세포 의존적인 HIV 복제 촉발을 억제하는 제제 소정량과 접촉시키는 것을 포함하는 방법이다. 또한, 본 발명은 HIV 감염된 세포 또는 환자에서 (HIV-1 감염을 포함하는) 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 조절에 사용하기 위한, 고 운동성 군 상자 1 단백질(HMGB1)에 결합하는 제제, 특히 수지상 세포(DC)에서 자연 살해(NK) 세포 의존적인 HIV 복제 촉발을 억제하는 제제에 관한 것이다.
글리시리진은 그러한 제제 중 하나로서, HMGB1에의 결합을 제공하는데 유용한 글리시리진의 방식 및 농도는 참고로 포함되는 문헌[Mollica, et al., Chem. Biol. 14:431 (2007)]에 개시되어 있다. 글리시리진 외에, HMGB1에 결합하는 다른 제제 또는 화합물을 또한 사용할 수 있다. HMGB1이 결합하는 자연 리간드의 분절 또는 가용성 리간드를 사용할 수 있다. 그러한 리간드는 HMGB1이 결합하는 항원 제시 세포 또는 백혈구로부터 얻을 수 있다.
HIV 감염되거나, 또는 감염 위험에 있는 인간 환자를 본원에 개시된 항체, 항체 단편 및 다른 HMGB1 결합 제제로 치료하여, HMGB1을 특이적으로 차단하는 항체 또는 HMGB1을 특이적으로 차단하는 능력을 보유한 단편을 이용하여 환자의 면역계를 유지할 수 있다. 글리시리진은 비독성인 반면 다수의 항레트로바이러스 약물은 상당한 독성을 유발하기 때문에, 본 발명의 치료는 통상적인 항-HIV 요법의 유해 부작용을 감소시킬 수 있다. HMGB1을 인식하는 항체계 생성물에는 또한 다수의 항-HIV 약물의 독성이 결여되어 있으며, HIV 치료 부작용을 줄이기 위해서 사용될 수 있다. 유사하게, 통상적인 레트로바이러스 약물 치료에 대한 내성 인간 환자 또는 복합 내성을 형성하는 인간 환자의 진행 치료는, HMGB1에 결합하는 항체 생성물 및 다른 제제를 포함하는, 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있다. 글리시리진(또는 인간화된 차단성 항-HMGB1 항체) 및 항-레트로바이러스 약물을 단독으로 사용했을 때보다 더 낮은 용량으로 이용하는 병용 요법도 고려된다.
이들 HMGB1 결합 제제 또는 화합물을 단독으로, 또는 HIV 감염에 대한 하나 이상의 추가의 활성 화합물과 함께 사용하거나, 또는 HIV 감염을 치료하는데 사용되는 다른 제제, 예컨대 약물 또는 약학 제제와 함께 투여할 수 있다. 그러한 약물 및 약학 제제의 예는 2종의 뉴클레오시드 유사체 역전사 효소 억제제((NARTI 또는 NRTI), 프로테아제 억제제 및 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTI), 예컨대 AZT 및 인디나비르를 포함한다.
또한, 본 발명은 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 항체 단편, 다른 HMGB1 결합 제제 및/또는 글리시리진과; 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 인간 피험체에게 투여하기 적절한 무균성 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 상기 언급한 것들과 같이, 인간 면역결핍 바이러스 감염을 치료하는데 사용되는, 상기 항체, 항체 단편 및/또는 글리시리진 이외의 다른 약물 또는 약학 제제를 포함할 수 있다. 일반적으로, HIV 감염된 인간 환자에 대한 치료 도구로서 사용되는 항체는 HMGB1의 활성을 차단하는 인간 또는 인간화 항체여야 한다.
본 발명의 다른 측면은 인간에서 HIV 감염 치료용 약물로서 사용하기 위한 글리시리진, HIV 감염의 치료 분야에서 의약의 제조를 위한 글리시리진의 용도, 및 HIV 감염의 치료 분야에서 의약의 제조를 위한 단리된 인간화 차단성 HMGB1 특이적 항체 또는 항체 단편의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플에 포함된 HMGB1에 대해 특이적인 총 항체를 정량하는 시험관내 정량 방법으로서, (a) 낮은 pH에서, 바람직하게는 글리신 1.5M을 이용하여, 샘플을 산 처리하여 샘플 중에서 발견되는 HMGB1을 포함하는 면역 복합체를 해리시키는 단계; b) 상기 처리된 생물학적 샘플을 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및 c) HMGB1에 특이적인 총 항체를 정량하는 단계를 포함하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 산 처리는 항체의 결합능을 변경시키지 않고, 샘플 내에서 면역학적으로 결합된 항체로부터 HMGB1 단백질을 분리하기 위해 선택된 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3의 산성 해리액과 샘플을 접촉시키는 것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 산성 해리액은 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3(예, 1.85)의 글리신(예, 1.5M)이다. 그 다음 중화 완충액(예, 트리스, 예컨대 1.5M 트리스, pH9)로 산 처리를 중단한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기한 것과 병용하거나 또는 병용하지 않고, 산성 해리액과의 항온처리를 20∼37℃, 바람직하게는 25℃에서 실시하고/하거나, 중화 단계를 얼음에서 실시한다.
본 출원에서, 용어 "정량(quantitating)"은 HMGB1 단백질 또는 특이적 항체의 임의의 적절한 유익 측정값과 용어 "정량화(quantifying)"를 포함한다.
또한, 본 발명은 HIV 감염된 것으로 알려진 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 HIV 감염을 모니터링하는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 상기 환자로부터 얻은 생물학적 샘플 중에 포함되는 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 특이적 항체를 정량하는 단계를 포함하고, 상기 정량화를 위해 표적화되는 항체는 HMGB1 특이적인 총 항체 또는 이의 순환 부분(순환 항체) 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분인 시험관내 방법에 관한 것이다.
HIV 감염, 바이러스 양 또는 치료 효능을 모니터링하는 방법과 본원에 개시된 예후 방법을, HMGB1에 특이적인 순환(잔류) 항체의 정량, 또는 HMGB1 특이적인 총 항체의 정량, 또는 면역학적 HMGB1/특이적 항체 복합체 부분의 정량을 기초로 실시할 수 있다.
특정 구체예에서, 이들 모든 방법은 순환하는 특이적 항체 또는 총 특이적 항체의 정량를 기초로 한다.
HMGB1 특이적인 순환 항체의 농도가 낮은 경우에는 HMGB1 특이적인 총 항체를 정량하는 것이 바람직하다.
HMGB1 특이적 총 항체를 기준으로 정량한 경우에는, 본 발명의 방법은 또한 HMGB1 특이적 항체와 함께 형성된 면역학적 복합체의 해리에 적합한 단계를 포함하며, 예를 들어, 본 발명의 방법은 상기 개시하고 실시예에 예시한 산 처리를 기초로 하는 정량 방법을 사용 또는 포함한다.
특정 구체예에서, 상기한 HMGB1 특이적 항체의 정량은 (피험체로부터 얻은) 생물학적 샘플을 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시켜 실시한다. 샘플과 상기 항체의 접촉뿐 아니라, 형성된 복합체의 정량도 시험관내에서 실시한다.
본 발명은 또한 HIV 감염된 것으로 알려진 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 중의 HIV 바이러스 양을 모니터링하는 방법으로서, HMGB1 특이적인 총 항체의 정량 방법 또는 함께 언급된 HMGB1 특이적 항체를 기반으로 하는 모니터링 방법을 실시하는 것을 포함하며, HMGB1 특이적 항체가 많을 수록 바이러스 양이 적어지는 모니터링 방법에 관한 것이다.
"바이러스 양(virus load)"은 HIV RNA(혈장 중에 존재하고 바이러스 입자로부터 유도됨) 또는 HIV DNA(세포 중에 존재하고 세포 게놈으로 통합됨)를 의미한다. 특정 구체예에서, HMGB1 특이적 항체의 정량을 기반으로 하는 본 발명의 방법은 HIV RNA 바이러스 양을 모니터링하는데 적절하다.
본 발명의 정량 방법과 HIV 감염, 바이러스 양 또는 치료 효능을 모니터링하는 방법 및 예후 방법에 대해서, 전길이 HMGB1 단백질(포유류 기원, 바람직하게는 인간 기원) 또는 HMGB1로부터 유도된 임의의 펩티드(10∼30 아미노산 잔기) 또는 폴리펩티드(30∼215 아미노산 잔기, 바람직하게는 30∼50 잔기, 또는 30∼100 잔기, 또는 30∼150 잔기)(HMGB1 단백질 유도체) 서열을, 이들 유도체가 HMGB1 특이적 항체에 결합하고/하거나 항-HGB1 항체를 정량할 수 있는 한, 사용할 수 있다. 그러한 유도체는 재조합 HMGB1(예, HMG 바이오테크, HM-115), HMGB1의 면역학적 반응성 부분, 서열이 각종 기원의 HMGB1 단백질에 공통인 HMGB1의 면역학적 반응성 부분으로 이루어진 군에서 선택된다. 그러한 예는 인간 및 마우스 HMGB1(HMG 바이오테크 HM-051)에 공통인 서열에 해당하는 HMGB1로부터 유래한 재조합 BOXB이다.
이들 방법을, HIV 감염 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 또는 이의의 체액 또는 조직에서 실시한다.
"HIV 감염의 모니터링"이란, 이전 분석과 비교하여, HIV 감염의 진행 비교, 즉 감소, 증가 또는 안정성을 나타내는 것이다. HIV 감염 진행은 표적 세포의 게놈내로의 HIV 게놈의 통합 및/또는 HIV 복제를 반영한다.
또한, 본 발명은 HIV 감염 피험체에서 HIV 감염에 대한 치료 효능을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, HMGB1 특이적 총 항체의 정량 방법 또는 이와 함께 언급된 HMGB1 특이적 항체를 기반으로 하는 모니터링 방법을, 치료 도중 상이한 시점에서 상기 피험체로부터 얻은 샘플에서 실시하는 단계, 및 상기 피험체에게 제공된 치료 효능을 결정하는 단계를 포함하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이 방법에서, HIV 감염 환자에서 HMGB1 특이적 항체의 양을 비감염(즉, 비-HIV 감염) 환자에서 HMGB1 특이적 항체의 양과 비교할 수 있다.
또한, HMGB1 특이적 항체의 양은 상이한 시점에서, 예컨대 감염 전, 1차, 급성 또는 만성 감염 도중, 또는 치료 개시 전, 예를 들어 치료 전 및 치료 도중 매월, 동일한 피험체로부터 얻은 양과 비교할 수 있다.
물질(들) 투여는, 치료 전의 동일한 환자에서 HMGB1 특이적 총 항체의 양과 비교하여 HMGB1 특이적 총 항체의 양이, 바람직하게는 M6(치료 개시 6개월 후)에서 1.5배 이상, 또는 M12에서 2배 이상 또는 3배 이상 감소되는 경우, 본 발명에 따른 "치료"를 제공한다. 더욱 일반적으로, 용어 "치료"는 HIV 감염, 즉 HIV RNA 및/또는 HIV DNA를 감소시키는데 이용되는 임의의 수단을 의미한다. 본 발명에 따른 치료는, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 역전사 효소 억제제(NRTI), 비-뉴클레오시드 역전사 효소 억제제(NNRTI), 프로테아제 억제제(PI), 융합 또는 침입 억제제, 인테그라제 억제제 또는 이의 임의의 조합과 같은 항레트로바이러스 약물을 사용한 통상의 치료에 대한 방책을 포함한다.
본 발명은 또한 HIV 감염 환자에서 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태의 시험관내 예후 방법으로서, 감염 후에, 바람직하게는 1차 또는 급성 감염 동안, 또는 만성 감염 동안 환자로부터 얻은 샘플 중에 상기 개시한 HIV 감염을 모니터링하는 방법 또는 정량 방법을 실시하는 것을 포함하며, HMGB1 특이적 항체의 수준이 높을 수록 AIDS 또는 진행 상태의 AIDS를 발병할 위험이 높아지는 시험관내 예후 방법에 관한 것이다.
용어 "예후"는 환자로부터 얻은 샘플로부터 HMGB1 특이적 총 항체의 정량을 실시할 때, 환자의 AIDS 발병 또는 AIDS로의 진행 위험을 평가할 수 있는 것을 의미한다. 표현 "진행 상태"는 AIDS 진행 또는 AIDS로의 진행 중에 직면하는 각종 단계를 의미하며, 특히, 이하 요약되어 있는, 세계 보건 기구가 생성하고 업데이트한 HIV 감염 및 질병에 대한 WHO 질병 단계 체계를 의미한다. I기: HIV 질병이 무증상이고 AIDS로 분류되지 않고; II기는 약간의 점막피부 징후와 재발성 상부 호흡기 감염증을 포함하며; III기는 1개월 이상 동안 불명의 만성 설사, 중증의 박테리아 감염 및 폐 결핵을 포함하며; IV기는 뇌의 톡소플라스마증, 식도, 기관, 기관지 또는 폐의 칸디다증, 및 카포시육종을 포함한다.
HMGB1 특이적 항체의 정량을 포함하는 상기 개시된 시험관내 방법들 중 임의의 방법은, 고체 지지체 상에 코팅된 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질 또는 이의 유도체를 사용하고, 경우에 따라서 HMGB1 특이적 항체를 검출할 수 있는 2차 항체를 이용하여 ELISA, 또는 다른 면역학적 검출 방법을 실행하여 실시할 수 있다.
하기 제시된 결과를 기초로, 본 발명자들은 HMGB1이 HIV-1 감염 환자에서 생체내 HIV 복제를 촉발한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 HIV 감염 피험체로부터 유래한 생물학적 샘플, 예컨대 혈청 중의 HMGB1 농도 증가 검출을 포함한다. 바이러스 양과 HMGB1 농도 간의 양의 상관관계를 또한 이용하여 HIV 감염을 모니터링할 수 있다. HMGB1 증가 수준은 질병 진행과 상관관계가 있거나, 또는 좋지 않은 예후와 관련이 있을 수 있다. 생물학적 샘플 중의 HMGB1 농도는, ELISA 시험과 같은 잘 알려진 진단 시험으로 정량할 수 있다. 재조합 hHMGB1, 항-hHMGB1 mAbs 및 토끼 항-hHMGB1 혈청이 시판되며, 그러한 진단 시험에 사용될 수 있다. 그러한 테스트를 이용하여 환자 샘플 중의 HMGB1 농도를 정량하고, HIV 감염 전개의 예후 마커로서 HMGB1을 동정하고, 인간화된 항-HMGB1 항체의 생체내 효과를 모니터링한다.
또한, 본 발명은 HIV 감염 피험체에서 HIV 감염을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 특히 상기 HIV 감염 피험체로부터의 생물학적 샘플을 고 운동성 군 상자 1(HMGB1)에 면역학적으로 결합하는 항체와 접촉시켜, 상기 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 중에 포함되는 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질을 정량하는 단계를 포함하며, 정량을 위해 표적화되는 HMGB1 단백질은 총 HMGB1 단백질 또는 이의 순환 부분(순환 HMGB1) 또는 이의 면역학적 복합 부분인 시험관내 방법에 관한 것이다.
본원에 개시된 HIV 감염, 바이러스 양 또는 치료 효능을 모니터링하는 방법 및 예후 방법은, 순환(잔여) HMGB1의 정량을 기초로 하거나, 총 HMGB1의 정량을 기초로 하거나, 또는 면역학적 HMGB1/특이적 항체 복합체 부분의 정량을 기초로 하여 실시할 수 있다.
특정 구체예에서, 이들 모든 방법은 순환 HMGB1 또는 총 HMGB1의 정량을 기초로 한다. 총 HMGB1의 정량은, 순환 HMGB1의 수준이 낮은 경우 바람직할 수 있다. 정량이 총 HMGB1을 기초로 하는 경우, 본 발명의 방법은 또한 HMGB1 특이적 항체와 함께 형성된 면역학적 복합체의 해리에 적당한 단계를 포함하고, 예를 들어 본 발명의 방법은 샘플의 산 처리를 이용하거나 또는 포함한다.
적절한 산 처리는 HMGB1 단백질과 특이적 항체에 의한 이의 인식능을 변경시키지 않고, 특이적 항체로부터 HMGB1 단백질을 분리하기 위해 선택된 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3의 산성 해리액과 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 산성 해리액은 낮은 pH, 바람직하게는 pH 1 내지 3(예, 1.85)의 글리신(예, 1.5M)이다. 그 다음 중화 완충액(예, 트리스, 예컨대 1.5M 트리스, pH9)으로 산 처리를 중단한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기한 것과 병용하거나, 또는 병용하지 않고, 산성 해리액과의 항온처리를 20∼37℃, 바람직하게는 25℃에서 실시하고/하거나, 중화 단계를 얼음에서 실시한다.
HMGB1 단백질의 정량값을 HIV로 감염되지 않은 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터의 HMGB1의 양, 또는 상이한 시점에서 동일한 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플로부터의 HMGB1의 양과 비교할 수 있다.
또한, 본 발명은 HMGB1 단백질의 정량을 실시하는 것을 포함하는 HIV로 감염된 것으로 알려진 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플의 HIV 바이러스 양을 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, HMGB1 단백질이 많을 수록 바이러스 양도 많다. "바이러스 양"이란, HIV RNA(혈장 중에 존재하고 바이러스 입자로부터 유도됨) 또는 HIV DNA(세포 중에 존재하고 세포 게놈으로 통합됨)를 의미한다. 특정 구체예에서, HMGB1의 정량을 기반으로 하는 본 발명의 방법은 HIV RNA 바이러스 양을 모니터링하는데 적절하다.
본 발명은 또한 HIV 감염 피험체에서 HIV 감염에 대한 치료 효능을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 치료 도중 상이한 시점에서 피험체로부터 얻은 샘플 상에서 상기 개시된 HMGB1 단백질에 기초하여 HIV 감염을 모니터링하는 방법을 실시하는 단계, 및 상기 피험체에게 제공된 치료 효능을 결정하는 단계, 그리고 경우에 따라서 치료 개시 전에 동일한 피험체의 샘플에서 얻은 결과들을 비교하는 단계를 포함하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 물질(들) 투여는, 치료 전의 동일한 환자에서 HMGB1의 양과 비교하였을 때, 세포 HMGB1 단백질의 양이, 바람직하게는 M1(치료 개시 1개월 후)에서 1.5배 이상, 또는 M3에서 2배 이상 감소되거나, 또는 건강한 공여자의 샘플에서 얻은 값(500 pg/ml 미만)에 도달하는 경우 본 발명에 따른 "치료"를 제공한다. 또한, 총 HMGB1 단백질의 양이 건강한 공여자의 샘플에서 얻은 값에 도달하는 경우 치료는 효과적인 것으로 생각할 수 있다. 더욱 일반적으로, 용어 "치료"는 HIV 감염, 즉 HIV RNA 및/또는 HIV DNA를 감소시키는데 이용되는 임의의 수단을 의미한다.
본 발명은 또한 HIV 감염 환자에서 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태의 시험관내 예후 방법으로서, 감염 후에, 바람직하게는 1차 또는 급성 감염 도중, 또는 만성 감염 도중 환자로부터 얻은 샘플에서, 상기 개시된 임의의 방법으로 HMGB1을 정량하는 것을 포함하며, 총 HMGB1 수준이 높을 수록 AIDS 또는 진행된 AIDS 발병 위험이 높아지는 시험관내 예후 방법에 관한 것이다. HMGB1 단백질 특이적 항체를 기초로하는 예후 방법에 관한 상기 제시된 정의가, 여기서도 적용된다.
본 발명의 또 다른 측면은 샘플 중 고 운동성 군 상자 1 단백질(HMGB1)에 대해 특이적인 총 항체를 정량하기 위한 키트로서, a) 상기 정의한 바와 같은 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체, 및 b) 상기 정의된 바와 같이, 환자로부터 채취한 경우 샘플에서 발견되는 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리시키기에 적당한 산성 해리액을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 샘플 중 고 운동성 군 상자 1 단백질(HMGB1)의 총량을 정량하기 위한 키트로서, a) 상기 정의된 바와 같이, HMGB1 단백질 특이적 항체, 또는 HMGB1 단백질에 결합할 수 있는 이의 단편, 및 b) 상기 정의한 바와 같이, 환자로부터 채취한 샘플에서 발견되는 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리시키기에 적합한 산성 해리액을 포함하는 키트에 관한 것이다. 경우에 따라서, 이들 키트는, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 중화 완충액 및/또는 HMGB1/특이적 항체 복합체에 결합하고/하거나 이의 형성을 나타내는 2차 항체를 또한 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은, 피험체의 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 감별 진단을 포함하는 진단, 또는 HIV 감염 위험 평가이다. 이 진단 방법은 고 운동성 군 상자 1 단백질(HMGB1)에 면역학적으로 결합하는 항체와 HIV 감염 의심 개체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 타액 또는 다른 체액을 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플 중의 임의의 HMGB1과 HMGB1에 결합하는 항체 또는 항체 단편 간의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 형성된 복합체 검출 뿐 아니라 상기 항체와 샘플의 접촉도 시험관내에서 실시한다. HIV에 의한 감염 위험 진단 또는 증후는, HIV 감염되지 않은 대조군 피험체에서의 복합체 형성과 비교하거나, 또는 HIV-1 감염과 같은 HIV 감염 이전에 상기 피험체에서의 복합체 형성과 비교하여, 항-HMGB1 복합체의 형성 증가를 기초로 결정할 수 있다. 그러한 진단 방법의 일례는 고체 지지체 상에 코팅된 모노클로날 항체 및 코팅된 mAb에 결합된 HMGB1을 검출하기 위한 폴리클로날 항체를 사용하여 HMGB1 단백질을 검출하는 ELISA를 이용하는 것이다.
상기 피험체에서 급성 및/또는 만성 염증을 배제 또는 제어하거나, 또는 시험 피험체에서 HIV의 존재 또는 역가를 나타내기 위한 다른 진단 시험을, 인간 또는 인간 이외의 피험체의 전체적인 진단 과정의 일부로서 실시할 수도 있다.
유사하게, HIV에 감염되거나, 또는 이전에 HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체는, 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 상기 피험체로부터의 생물학적 샘플과 접촉시키고, 상기 샘플 내의 HMGB1과 상기 항체 사이의 복합체 형성을 정량하여 모니터링할 수 있다. 형성된 복합체 정량 뿐 아니라 상기 항체와 샘플의 접촉도 시험관내에서 실시한다. 여기서, 복합체의 양은 상기 피험체에서 NK 의존적인 HIV 복제 촉발 정도를 나타내며, 따라서, HIV 감염의 경중 또는 진행의 척도가 된다. 복합체 형성은 복합체 형성량을 HIV 감염되지 않은 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 중의 복합체 형성, 또는 감염 전 또는 이전의 급성 또는 만성 감염 도중과 같은 상이한 시점에서 동일한 피험체로부터 얻은 복합체 형성과 비교할 수 있다. 이 방법은 또한 피험체에서 HIV 감염과 관련되지 않은 HMGB1의 원인이 되는 급성 및/또는 만성 염증을 제외 또는 제어하기 위한 다른 진단 시험을 포함할 수 있으며, 피험체에서 HIV의 존재 또는 HIV 바이러스 양에 대한 다른 진단 시험을 수반할 수 있다.
본 발명에 따른 진단 분석을 실시하기 전에, 생물학적 샘플, 예컨대 혈청 또는 혈장을 산으로 처리하여 HMGB1에 결합한 다른 단백질로부터 HMGB1을 분리할 수 있으며, 이에 대해서는, 산 처리를 포함하는, HMGB1 단백질의 검출 및 측정을 위한 고 감도 방법이 교시되어 있는, 인용에 의해 구체적으로 포함되는 문헌[Gaillard, et al., PLOS One 3(8) e2855, pages 1-9 (2008)] 참조. 상기 처리는 항체가 인식에 이용가능한 HMGB1 에피토프의 수를 증가시킨다. HMGB1에 대한 일부 항체는 다른 단백질의 결합에 의해 차단되지 않는 단백질의 영역에 결합하기 때문에, 산 처리는 선택사항이다.
진단 분야에 사용되는 항체는 HMGB1의 활성을 차단할 필요가 없으며, HMGB1에 결합하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 상기 항체는 마우스, 래트 및 토끼와 같은 동물로부터 공지된 방법으로 유도하거나, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 방법으로 생성할 수 있다. HMGB1 수준의 모니터링 또는 진단에 사용되는 항체 또는 다른 HMGB1 결합제를, 분석 시행 방법에 관한 서면 또는 전자 설명서, 완충액, 보존제, 음성 및/또는 양성 대조군 샘플, 고체 지지체 및 용기 또는 팩키징 재료를 포함하는 키트로 제조할 수 있다.
도 1. aNK 세포는 1차 미숙 HIV-1 감염 DC의 성숙화를 유도한다. (a) IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 정제된 CD14+ 단핵구로부터 형성된 iDC를, 상이한 비율에서 aNK 세포와 함께 24 시간 동안 함께 공배양하였다. 7-AAD 분석을 이용한 유세포 분석에 의해 DC 생존을 측정하였다. 생존 DC는 7AAD-CD56- 세포로서 확인되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험 결과를 나타내며, 값은 평균 ± sd이다. (b) aNK 세포는 iDC의 성숙화를 유도한다. 유세포 분석의 iDC를 3 시간 동안 R5-HIV-1BaL(1 ng/ml p24)로 감염시키거나 또는 감염시키지 않았는데, 이를 1:5의 비율로 rNK 세포 또는 aNK 세포와 함께 항온처리하였다. HLA-DR 및 CD86 특이적 항체의 공동염색으로 성숙 DC(CD86brightHLA-DRbright)를 확인할 수 있다. 3회 독립적인 실험으로부터 나온 대표 실험 데이터가 도시되어 있다. (c) 이 연구에 사용된 감염 상태는 감염된 iDC의 배양 상청액에서의 유의적인 p24 검출과 CD40 발현에 의해 표적화된 DC에서의 p24의 유세포 분석에 의한 세포내 검출에 의해 3일째에 나타나는 바와 같이, iDC의 증식성 감염의 상태였다. 3개의 독립적 공여자로부터 얻은 DC에서 실험을 실시하였으며, 값은 평균 ± sd이다. (d) HIV-1 감염은, 0.001∼10 ng/ml p24 HIV-1로 감염된 iDC의 CD86/HLA-DR 이중 염색에 의해 나타나는 바와 같이, 그 자체가 iDC의 성숙화를 유도하지 않는다. LPS(DC0)에 의해 유도되는 mDC의 비율(78.1% CD86brightHLA-DRbright)이 양성 대조군으로서 제시되어 있다. (e) rNK 또는 aNK 세포와 감염 또는 비감염 iDC의 제시된 공배양에서 유도된 성숙 CD86brightHLA-DRbright DC의 비율이 제시되어 있다. 이들 실험은 여러 공여자로부터 유래한 1차 세포에서 실시하였으며, 이들 3회 실험으로부터의 대표적인 데이터가 제시되어 있다. 제시된 경우, 비모수 Mann-Whitney 테스트로 통계 분석을 실시하였다. * p<0.05, ** p = 0.02
도 2. aNK-DC 크로스 토크는 aNK 세포와 DC 둘다에서 HMGB1 발현을 촉발한다. (a) iDC, rNK 세포, aNK 세포(106/ml)의 24 시간 무세포 배양 상청액 또는 aNK 세포 및 iDC(비율 1:5)의 공배양물을 사이토킨 함량에 대해 시험하였다. MAP 기법을 이용하여 IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α IL-12 및 IFN-γ를 정량하고, HMGB1은 ELISA로 정량하였다. * p<0.05(비모수 Mann-Whitney 테스트). (b) HMGB1 발현은, 새로 분류한 혈액 NK 세포에서 면역형광(적색)으로 검출하였다. DAPI를 이용한 대비염색(청색)은 HMGB1의 핵 위치를 보여주었다. (c) HIV-1과 aNK 세포를 함께 배양하면 HMGB1 분비가 억제된다. 좌측 패널: aNK 세포(106 세포/ml)를 3 시간 동안 배지에서 또는 R5-HIV-1Ba-L(1 ng/ml p24)과 함께 항온처리하고, 21 시간 이후에 HMGB1 생성에 대해 시험하였다. 데이터는 3회 독립 실험을 나타내며, 값은 평균 ± sd이다. 우측 패널: aNK 세포의 동일한 조제물에서의 HMGB1 발현의 면역형광 분석. (d) aNK-iDC 크로스 토크 동안의 HMGB1 생성은 iDC의 HIV-1 감염에 의해 억제되지 않는다. iDC를 3 시간 동안 배지에서 또는 HIV-1BaL(1 ng/ml p24)과 함께 항온처리하고 21 시간 동안 aNK 세포(aNK:iDC 비율 1:5)와 함께 추가로 공배양하였다. 이어서, HMGB1 농도를 배양 상청액에서 측정하였다. 데이터는 3회 독립 실험의 평균 ± sd를 나타낸다. (e) 비감염 또는 HIV-1 감염된 iDC에서의 HMGB1 발현의 면역형광 공초점 분석. 상부 패널: 비감염된 iDC; 중간 패널: 세포내 p24 염색에 의해 나타나는 바와 같이 HIV-1 감염되고 복제하는 iDC; 하부 패널: HIV-1과 함께 항온배양되지만, 세포내 p24 발현에 대해 음성인 iDC. (f) LPS (DC0), 가용성 CD40L(DC1) 또는 LPS + PGE2(DC2)로 iDC를 48 시간 자극하여 성숙 DC를 형성하였다. DC0, DC1 및 DC2를 3 시간 동안 배지에서 항온처리하거나, 또는 R5-HIV-1BaL(1 ng/ml p24)로 감염시키고, 21 시간 동안 배지에서 추가로 항온처리하였다. 배양 상청액에서의 HMGB1 정량을 실시하였다. 3회 독립 실험의 평균 ± sd가 제시되어 있다. (g) 24 시간 공배양물에서 aNK 세포와 비감염된 DC(상부 패널) 또는 HIV-1 감염된 DC(하부 패널)의 접합체에서의 HMGB1 발현의 면역형광 분석. DC는 DC-SIGN+이고 aNK 세포 및 DC는 모두 이들 접합체에서 HMGB1을 발현한다. 상이한 1차 세포 조제물로 실시된 3회 실험 중 대표적인 실험으로부터 얻은 사진이 도시되어 있다.
도 3. HIV-1 감염된 iDC의 aNK-의존적 성숙화는 HMGB1에 의해 매개되며 RAGE를 포함한다. (a) 좌측 패널: iDC를 24 시간 동안 단독으로 또는 aNK 세포와 함께, 차단성 항-HMGB1 항체(10 ㎍/ml) 또는 글리시리진(10 ㎍/ml)의 존재 하에 배양하였다. DC의 성숙화 상태는 CD86 및 HLA-DR - 특이적 항체와 함께 유세포 분석으로 측정하였다. 우측 패널: 동일 실험이지만, HIV-1 감염된 iDC와 함께 실시하였다. 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험의 평균 ± sd를 나타내며, 비모수 Mann-Whitney 테스트를 이용하여 통계학적 비교를 실시하였다. * p<0.05. (b) iDC(106 세포/ml)를 rh-HMGB1의 농도를 증가시키면서(1∼10 ㎍/ml) 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 항-CD86, -HLA-DR, -CD80, -CD83, DC-LAMP 및 -CD40 항체로 염색하고, 유세포 분석으로 분석하였다. (c) DC에 의한 (MAP로 결정되는) 사이토킨 및 케모카인 생성에 대한 rh-HMGB1의 영향. iDC(106 세포/ml)를 48 시간 동안 배지에서 또는 rh-HMGB1(1 또는 10 ㎍/ml)의 존재 하에 항온처리하였다. 양성 대조군으로서, iDC를 LPS(DC0)로 자극하였다. (d) iDC, DC0, 또는 rh-HMGB1(1 ㎍/ml)과 함께 항온처리된 iDC에 의한 RAGE의 표면 발현의 유세포 분석 검출. iDC는 감염되지 않거나, 또는 HIV-1(3 시간 동안 1 ng/ml p24)로 감염되었다. (e) aNK 세포와 함께 24 시간 동안 공배양된 iDC, DC0, 비감염 또는 HIV-1 감염된 iDC를 rh-HMGB1(1 ㎍/ml)과 함께 항온처리한 후, 항-RAGE 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. CD3- 및 CD56-특이적 항체(CD3-CD56+)와의 공동염색을 통해 분석으로부터 NK 세포를 배제하였다.
도 4. HIV-1 감염 후에 DC에 의해 NK-촉발된 Th1 편향화의 손상은 변경된 IL-12 및 IL-18 생성과 관련이 있다. (a) NK 세포에 의해 촉발되는 DC에 의한 Th1 편향은, rNK 또는 aNK 세포(2 x 105/ml)의 존재 하에 30분 동안 iDC(106/ml)를 항온처리하여 시험하였다. 미접촉 CD4 T 세포(106/ml)를 공배양물에 첨가하고 IFN-γ 또는 IL-4를 생성하는 T 세포의 빈도수를 8일 후에 유세포 분석으로 측정하였다. 이 실험은 비감염된 iDC (b) 또는 HIV-1 감염된 iDC (c), 또는 AZT(1 mM)의 존재 하의 HIV-1 감염된 iDC로 실시하였다. 제시된 배양물의 배양 상청액을 IL-12 (e), IL-18 (f), 및 IFN-g (g) 함량에 대해 시험하였다. 데이터는 5회 독립 실험의 평균 ± sd를 나타낸다. 비모수 Mann-Whitney 테스트로 통계학적 비교를 실시하였다. * p<0.05, **p=0.03.
도 5 (a)-(g). NKDC 크로스 토크의 결과 DC에서의 HMGB1 의존적 HIV 복제 촉발. (a) 단독으로, 또는 rNK 또는 aNK 세포(2 x 105/ml)의 존재 하에 3일 항온처리한 후에, HIV-1-감염된(하부 패널) 또는 비감염된(상부 패널) iDC(CD40+)(106/ml)에서의 p24 세포내 발현의 유세포 분석. (b) 동일 배양물의 배양 상청액에서의 p24 농도. 3회 독립 실험의 평균 ± sd. * p < 0.05, 비모수 Mann-Whitney 테스트. (c) 단독으로 또는 aNK 세포의 존재 하에 3일 동안 배양된 HIV-1 감염된 iDC에서의 세포내 p24 발현의 면역형광 분석. 핵은 DAPI로 염색한다. (d) 단독으로 또는 aNK 세포의 존재 하에 6일 동안 배양된 HIV-1 감염된 DC0(106/ml)에서의 세포내 p24 발현의 유세포 분석. (f 및 g) 단독으로 또는 rNK 또는 aNK 세포의 존재 하에 6일 동안 배양된 HIV-1 감염된 성숙 DC의 배양 상청액에서의 p24 농도. 3회 독립 실험의 평균 ± sd. 비모수 Mann-Whitney 테스트로 통계학적 비교를 하였다. * p<0.05. (e) 제시된 배양물로부터의 세포에 대한 명주기 분석으로 결정되는 HIV-1 프로바이러스 DNA 수준. 상이한 1차 세포 조제물로 실시한 3회 실험 중 1회의 대표적인 실험이 제시되어 있다.
도 6 (a), (b) 및 (c). 외인성 rh-HMGB1은 iDC에서 HIV-1 및 HIV-2 복제를 촉발한다. (a) HIV-1 감염된 iDC를 단독으로 또는 aNK 세포의 존재 하에 3 일 동안 배양하였다. Rh-HMGB1(1 ㎍/ml)을 일부 배양물 중에 첨가하였다. 배양 상청액 중의 p24 정량으로 HIV 복제를 측정하였다. (b) HIV1 감염된 iDC를 단독으로 또는 aNK 세포의 존재 하에 3일 동안 배양하였다. 차단성 항-HMGB1 항체(10 ㎍/ml) 또는 글리시리진(10 ㎍/ml)을 배양 초기에 첨가하였다. 배양 상청액에서 p24 정량으로 HIV 복제를 측정하였다. 3회 독립 실험의 평균 ± sd가 제시되어 있다. 비모수 Mann-Whitney 테스트로 통계학적 비교를 실시하였다. *p < 0.05; (c) HIV-2 감염된 iDC를 단독으로 또는 aNK 세포의 존재 하에 3일 동안 배양하였다. Rh-HMGB1(1 ㎍/ml)을 일부 배양물에 첨가하였다. 배양 상청액에서 p24 정량에 의해 HIV 복제를 측정하였다.
도 7 (a)-(c). 활성화된 NK 세포(aNK)는 5:1 비율의 NK:DC에서의 미숙 수지상 세포(iDC)의 아폽토시스를 빠르게 유도한다. (a) IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 건강한 공여자의 정제된 CD14+ 단핵구로부터 형성된 iDC를 휴지기 NK 세포(rNK) 또는 aNK 세포와 함께 2종의 상이한 NK:DC 비율(1:5 및 5:1)로 24 시간 동안 공배양하였다. 7-AAD 분석을 이용한 유세포 분석으로 DC 생존을 결정하였다. CD56- 개체군을 게이팅하여 분석으로부터 NK 세포를 배제하였다. 생존 DC는 7-AAD- FSChigh 세포이다. 데이터는 3회 독립 실험을 나타낸다. (b) aNK 세포에 의해 유도된 iDC의 아폽토시스의 라이브 비디오 현미경. 상이한 1차 세포 조제물로 실시한 3회 실험 중 하나의 대표적인 실험으로부터 얻은 사진이 제시되어 있다. (c) 공배양물에서 생존 DC의 비율에 의해 평가되는, aNK 세포에 의한 iDC 사멸의 동력학. 여러 건강한 공여자로부터 얻은 1차 세포에서 이들 실험을 실시하였으며, 이들 중 3회 실험으로부터 얻은 대표적인 데이터가 제시되어 있다.
도 8(a)-(b). aNK 세포에 의한 사멸에 대해 내성이 있는 DC는 성숙 표현형을 나타낸다. (a) IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 정제된 CD14+ 단핵구로부터 형성된 iDC를 aNK 세포와 함께 5:1의 NK:DC 비율에서 24 시간 동안 공배양하였다. 7-AAD 분석을 이용한 유세포 분석으로 DC 생존을 결정하였다. CD56- 개체군을 게이팅하여 분석으로부터 NK 세포를 배제하였다. 생존 DC는 7-AAD- FSChigh 세포이다. 아폽토시스 외에, aNK 세포는 iDC의 성숙을 유도하였다. HLA-DR 및 CD86 특이적 항체를 이용한 공동염색으로 성숙 DC(CD86bright HLA-DRbright)를 확인하였다. 양성 대조군으로서, LPS(DC0)로 iDC를 48 시간 자극하여 성숙 DC를 생성하였다. 3회 독립 실험 중 대표적인 실험 데이터가 제시되어 있다. (b) 단독 배양한 또는 5:1 비율의 NK:DC에서 NK 세포와 공배양한 iDC를 항-CD83 및 -DC-SIGN 항체로 염색하고, 유세포 분석으로 분석하였다. 양 마커의 양성 발현은 iDC의 성숙 표현형을 입증한다. 데이터는 3회 독립 실험 중 하나를 나타낸다.
도 9(a)-(g). iDC의 aNK 의존적 아폽토시스는 TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL) 의존적이며 DR4 수용체를 포함한다. (a) 건강한 공여자의 혈액으로부터 CD56+ NK 세포를 정제하였다. 배양물에 PHA(10 ㎍/ml) 및 IL-2(10 ㎍/ml)를 첨가하여 최적 이하 농도의 인터류킨-2(IL-2)(100 ng/ml)(rNK 세포) 또는 활성화된 세포(aNK 세포)와 함께 NK 세포를 유지하였다. 항-CD56 항체를 이용한 염색 강도로 고도로 (CD56bright 세포) 및 약하게(CD56dim 세포) CD56을 발현하는 2종의 NK 세포군을 구별할 수 있다. 데이터는 3회 독립 실험의 평균 ± sd를 나타낸다. (b) NK 세포에 의한 막 TRAIL(mTRAIL) 발현은 항-CD56 및 -mTRAIL 특이적 항체를 이용한 유세포 분석으로 측정하였다. 데이터는 3회 독립 실험 중 하나를 나타낸다. (c) aNK 세포를 항-CD56 및 -mTRAIL 항체로 공동염색하였다. CD56bright 및 CD56dim 군 중에서 mTRAIL을 발현하는 aNK 세포의 비율을 측정하였다. 데이터는 3회 독립 실험의 평균 ± sd를 나타낸다. (d) 유세포 분석에 의한 표면 iDC에서의 TRAIL 수용체 DR4 발현의 검출. 일부 경우에, iDC를 5:1의 NK:DC 비율로 aNK 세포와 공배양하였다. DC 표면에서의 DR4 발현을 NK-DC 공배양 1, 2, 3.5, 6 및 24 시간 후에 분석한다. 3명의 공여자에서 이들 실험을 실시하였으며, 이들 중 하나로부터의 대표적인 데이터가 제시되어 있다. (e) iDC(106 세포/ml)를 24 시간 동안 재조합 인간 가용성 TRAIL(rhs-TRAIL) 농도를 증가시키면서 배양하였다. 그 다음 7-AAD 분석으로 세포사를 정량하였다. 데이터는 3회 독립 실험의 평균 ± sd를 나타낸다. (f) iDC, rNK 세포, aNK 세포 (106/ml), 또는 aNK 세포와 iDC(비율 5:1)의 공배양물의 24 시간 무세포 배양 상청액을 가용성 TRAIL(sTRAIL) 함량에 대해 시험하였다. sTRAIL을 EILSA로 정량하였다. 데이터는 3회 독립 실험의 평균 ± sd를 나타낸다. (g) iDC는 차단성 항-DR4 항체(250 ng/ml)의 부재 또는 존재 하에, 24 시간 동안 단독으로 또는 aNK 세포(NK:DC 비율 5:1)와 함께 배양하였다. DC의 생존 상태는 7-AAD 분석을 이용하여 유세포 분석으로 측정하였다. 데이터는 3회 독립 실험 중 하나를 나타낸다.
도 10(a)-(d). R5-HIV 감염된 DC는 aNK 세포에 의한 사멸에 대해 내성이 있지만, HIV-1의 존재 하에 TRAIL 분비가 지속되었다. (a) iDC는 24 시간 동안 R5-HIV-1BaL(1 ng/ml p24)로 감염되거나, 또는 비감염되고, 몇회의 세척 후에, 1:5 및 5:1의 비율에서 aNK 세포와 함께 항온처리하였다. iDC 생존력은 유세포 분석으로 7-AAD 테스트를 이용하여 분석하였다. 생세포는 7-AAA-이고, 아폽토시스 세포 7-AAD+이고, 아폽토시스 잔해는 7-AAD- FSClow이다. 도트 플롯은 3회 이상의 독립적인 실험 중 하나를 나타낸다. (b) R5-HIV는 iDC 성숙화를 유도하지 않는다. DC는 비감염되거나(iDC), 1 ng/ml의 p24에서 R5-HIV-1로 감염되거나(HIV-DC), 또는 48 시간 동안 LPS로 자극되었다. 그 다음 세포를 CD86 및 HLA-DR로 염색하였다. 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험 중 하나를 나타낸다. (c) TRAIL 분비는 iDC의 HIV 감염에 의해 영향을 받지 않는다. iDC, HIV 감염된 DC(106/ml), aNK 세포-iDC 공배양물(비율 5:1) 및 aNK 세포-HIV 감염된 DC 공배양물(비율 5:1)의 24 시간 무세포 배양 상청액을 ELISA에 의한 가용성 TRAIL(sTRAIL) 함량에 대해 시험하였다. 데이터는 3회 독립 실험의 평균 ± sd를 나타낸다. (d) HIV-1 감염된 DC는 TRAIL 유도된 아폽토시스에 여전히 민감하였다. iDC 및 HIV 감염된 DC(106 세포/ml)를 rhs-TRAIL의 농도를 증가시키면서(1-1000 ng/ml) 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음 7-AAD 분석으로 세포사를 정량하였다. 3회 독립 실험의 평균 ± sd를 제시하였다.
도 11(a)-(b). 고 운동성 군 상자 1(HMGB1)은 HIV-1 감염된 iDC의 NK 유도성 DC 아폽토시스에 대한 내성과 관련이 있다. (a) iDC 또는 HIV-1 감염된 iDC를 단독으로 또는 aNK 세포(NK:DC 비율 5:1)의 존재 하에 배양하였다. 일부 실험에서, HIV 감염시에 아지도티미딘(AZT)을 첨가하였고; 다른 실험에서는 공배양 초기에 글리시리진(10 ng/ml)을 첨가하였다. 그 다음 7-AAD 분석으로 세포사를 정량하였다. (b) 일부 실험은 차단성 항-HMGB1 항체(10 및 15 ㎍/ml)의 존재 하에 실시하였다. 3회 실시한 실험 중 하나의 대표적인 실험이 제시되어 있다.
도 12(a)-(b): (a) aNK 세포는 iDC 표면에서 TRAIL 수용체(DR4) 발현을 상향조절하여 비감염된 iDC의 아폽토시스를 유도하여, TRAIL 의존성 아폽토시스에 대한 DC 민감성을 증가시킨다. (b) HIV-1 감염된 DC는 HMGB1 의존성 메카니즘에 의해 aNK-유도 아폽토시스에 대해 내성이 있다. 따라서, aNK 세포는 감염된 DC의 지속성, CD4 T 세포로의 DC 의존성 HIV 전파 및 HIV 저장소의 확립에 참여한다.
도 13. 항-HMGB1 항체에 대한 ELISA 분석을 위한 상태 측정. (A): HMGB1로 코팅한 벽을 포화시키기 위한 BSA 농도의 측정. (B): 결합된 항-HMGB1 항체를 나타내기 위한 항-IgG-PAL 항체 농도(2차 항체)의 측정. (C): 벽을 코팅하기 위한 HMGB1 농도의 측정. (D): 표준 곡선의 작성을 위한 정제된 항-HMGB1 항체 농도의 측정. (E): 분석 특이성
도 14. HMGB1 단백질 또는 BOXB 코팅을 이용한 항-HBG1 적정.
도 15. 글리신 1.5M로 처리한 또는 미처리한 인간 혈청을 항-HMGB1 IgG 항체의 존재에 대해 적정하였다. 순환(유리) 항-HMGB1 항체는 선영을 넣어서 나타내었고, 복합 항-HMGB1 항체는 회색으로 나타내었다.
도 16. HIV+ 환자로부터의 혈청 중에서 HMGB1 농도의 적정. 각 히스토그램은 단일 환자를 나타낸다. 평선은 EILSA 테스트에 의한 최소 검출 수준을 나타내고, 점선은 건강한 공여자에서의 HMGB1의 평균 수준을 나타낸다.
도 17. HAART 후의 상이한 시점(개월수)에서 측정한 T 세포 서브세트에서의 영향(A) 및 HIV 바이러스 양(B). ***: p<0.001 및 **: p<0.05.
도 18. M0에서 HAART를 수용한 HIV 감염 환자로부터 얻은 HMGB1의 적정. 건강한 공여자에서의 HMGB1의 평균 농도가 점선으로 제시되어 있다.
도 19. HIV 감염 환자로부터 얻은 혈청에서의 항-HMGB1 항체 적정과 항레트로바이러스 요법의 영향. M-1은 임상 시험 등록 전 15∼30일 동안 시험한 환자로부터 얻은 혈청 샘플을 의미한다. M1, M3, M6 및 M12는 HAART 후 상이한 시점에 나타난다. "Fin"은 M9와 M12 사이에 HAART가 정지된 환자를 의미한다.
도 20. 혈청 HMGB1과 항-HMGB1 항체 농도 사이의 상관관계 (A), 및 항-HMGB1 항체와 HIV-RNA 바이러스 양 사이의 상관관계 (B) 연구. Spearman 상관관계 테스트. 상관 계수 r, 상관 확률(p) 및 분석된 샘플 수(n)가 제시되어 있다.
HMGB1은 거의 모든 진핵 세포에 존재하는 핵 단백질이며, 뉴클레오솜 형성을 안정화시키는 기능을 하고 몇몇 유전자 발현을 조절하는 전사 인자 유사 단백질로서 작용한다. 이것은 또한, 손상, 감염 또는 다른 염증 자극에 반응하여 활성화된 대식세포, 성숙 수지상 세포(DC) 및 천연 살해(NK) 세포에 의해 분비되는 사이토킨이다.
바이러스 감염의 조기 단계는 선천 면역 이펙터, 즉 NK 세포 및 DC의 국부 동원 및 활성화와 관련이 있다. DC는 미접촉 CD4+ T 세포의 항원 제시 및 활성화 둘다와, 추가의 Th1 편향에 필요하다. DC는 또한 HIV에 대한 초기 표적을 구성하며, 프로바이러스 DNA를 통합시켜 HIV 지속감염에 기여한다. DC 성숙화 및 항상성은 DC와 NK 세포 사이의 크로스토크에 의해 조절된다. HIV 복제에 대한 DC의 민감성에 미치는 크로스 토크의 영향은 이전에는 알려져 있지 않았다.
활성화된 NK 세포(aNK)는, NK 세포와 미숙 DC(iDC) 사이의 접촉 과정에서 방출되고 iDC의 성숙화 및 IL-12 의존적 T-헬퍼-1 반응의 유도를 촉진하는 HMGB1의 공급원을 제공한다. HIV-1로 iDC가 감염된 후에, DC는 더 이상 NK 의존적 IL-12 편향에 감수성이 아니며, 따라서 Th1 반응을 유도할 수 없다. 또한, NK 의존적 DC 성숙화 및 생존은 HIV-1 p24의 생성 증가 및 DC에 의한 프로바이러스의 발현 증가와 관련이 있었다. DC에서 HIV-1의 NK 의존적 복제 증가는 HMGB1 특이적 항체와, HMGB1과 특이적으로 상호작용하는 것으로 알려진 글리시리진에 의해 억제되었는데, 이는 이 과정에서 이 사이토킨에 대한 중요한 역할을 한다는 것을 제시하는 것이다. 필연적인 결과로서, rh-HMGB1은 감염된 DC에 대한 직접적인 효과를 나타내어, 배양 상청액에서 p24의 생성을 급격히 증가시켰다. DC에서 HIV 복제에 대한 HMGB1의 강력한 자극 효과가 aNK:iDC 공배양물에서 또한 관찰되었다. HMGB1 특이적 중화 항체 또는 글리시리진을 첨가하면, aNK 세포의 존재 하에 또는 단독으로 배양된 감염된 DC에 의한 HIV-1 생성이 저해된다. 이와 함께, 이들 결과는 감염된 DC 상의 재조합 인간 단백질로서 첨가되든 또는 NK:DC 크로스 토크 도중 aNK 세포에 의해 생성되든, HMGB1은 감염된 DC에서 HIV-1 복제를 촉발하고 HIV-DNA를 증가시킴을 나타낸다.
DC의 직접 감염이 CD4+ T 세포의 감염보다는 덜 효과적이지만40,41, 증가량의 증거는 DC에 의해 매개되는 장기간의 HIV 전파가 DC에 의한 바이러스 생성에 따라 달라지며42, 43, 44, 생체내에서 HIV-감염된 DC는 림프구 조직으로의 이동 과정에서 바이러스 저장소로서 작용하여, 바이러스 감염 확산을 보조한다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 처음으로 활성화된 NK 세포가 HIV-1 감염된 DC에서 바이러스 저장소 확립에 기여한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 본원에서 DC에서의 프로바이러스 DNA 발현 및 HIV-1 복제 자극에 있어서, aNK-iDC 크로스 토크 동안 생성되는 HMGB1의 결정적 연관성 및 HIV-1 감염된 iDC의 NK-세포 활성화 능력을 보여주었다. NK 세포와의 크로스 토크 후에 Th1 편향을 유도하는 감염된 성숙 DC의 강한 손상이 입증되었다. 이들 관찰 결과로 HIV의 확산을 효과적으로 촉진하여 숙주 면역계를 회피하는 HIV의 능력을 억제하는 신규한 치료법이 도출된다.
NK 세포와 자가 iDC의 상호작용 결과로 서로 활성화되며, 이러한 상호작용은 T 세포가 형성되기 전에, 초기 단계의 면역 반응의 개시/증폭에 중요한 것으로 보인다11. NK 세포는 iDC의 성숙을 촉발하며, 이는 HMGB1 의존적 메카니즘으로 일어난다20. iDC의 NK 의존적 성숙은 DC의 기능적 편향과 함께, 세포내 유리 Ca2+ 농도 증가, 세포골격 재배열, NK/DC 시냅스에서의 분비 리소솜의 축적, 및 상호작용성 NK 세포로의 IL-18의 발현 조절을 포함하는 것으로 알려져 있다. 또한, NK 세포는 다량의 HMGB1을 분비하는데, 이는 DC의 성숙을 유도한다20. 본 발명자들은, HMGB1과 특이적으로 상호작용하는 것으로 알려진, 글리시리진 또는 항-HMGB1 항체의 억제 효과에 의해 제시되는 바와 같이, NK-DC 접촉 도중 NK 의존적 DC 성숙화에서의 HMGB1의 관련성을 실증하였다31. 무세포 배양 상청액에서의 HMGB1 검출과 고초점 현미경 분석은, 보고된 바와 같이20, HMGB1이 1차 NK 세포에 의해 발현 및 분비될 뿐 아니라, 단리된 DC에 의해 생성된다는 것을 입증하는데, HMGB1 방출 수준은 성숙화 단계와 관련이 있다. 예시적인 고 수준의 HMGB1은, iDC가 aNK 세포와 접촉할 때, iDC가 성숙 DC에 의해 방출되는 것과 유사하게, 검출되었다. 흥미롭게도, NK-DC 접합체의 공초점 현미경 분석 결과, 이들 세포 둘다는 사이토킨을 발현한다는 것을 확인하였다. HMGB1 수용체인 RAGE는 aNK 세포와의 DC 상호작용 후에 빠르게 유도된 다음, 이후에 하향조절되는 것으로 밝혀졌는데, 이는 NK 의존적 DC 성숙화에서 HMGB1의 연관성과 양립하는 것이다. DC 성숙화에 대한 기여 이외에, HMGB1은 iDC에서의 주화성인자로서 작용하고45, CCR7 및 CCR4 리간드에 반응하여 성숙 DC의 이동에 필요한 것으로46 확인되었으며, 둘다의 활성은 RAGE에 의해 매개된다45,46. 따라서, HMGB1은 DC에 대한 활성화 및 주화성 효과를 가지며, 염증 조직으로부터 배액 림프절로의 DC의 이동을 자극하는, 알라르민(alarmin)으로 작용한다45. HMGB1의 이들 성질을, HIV에 의해 유도된 것과 같은, 비조절 바이러스 감염시 고려해야 한다.
CD86brightHLA-DRbright DC의 빈도수에 의해 확인되는 바와 같이, HIV-1에 의한 iDC의 증식성 감염은 NK 의존적 표현형 DC 성숙화를 보존하는 반면, HIV 자체는 사용된 p24 농도(0.001∼10 ng/ml)에서 DC 성숙화를 유도하지 못하였다. 그러나, aNK-DC 상호작용의 결과 iDC에서 HIV-1 감염이 유의적으로 증가하였다. 이는 NK-DC 배양 상청액에서 p24 방출의 유의적인 증가와 관련된, p24+ DC의 빈도수 증가를 나타내는, 몇가지 수단에 의해 확인하였으며, 단세포 수준에서 면역형광으로 확인하였다. 또한, NK-DC 크로스 토크는 DC에서의 프로바이러스 HIV-1 DNA 발현의 급격한 증가를 초래하였다. DC와 NK 세포의 상호 활성화 과정에서 HMGB1의 중요한 역할을 고려하여, 차단성 항-HMGB1 항체 또는 글리시리진을 이용하여 iDC에서의 HIV-1 복제 촉발에 대한 기여를 평가하였다. p24 방출에 대한 이들 억제제의 강력한 차단 효과는 프로세스에서의 HMGB1 연관성을 나타낸다. 이들 억제제들이, NK 세포의 부재 하에, 감염된 iDC의 24 시간 배양물에서 HIV-1 복제를 유의적으로 감소시켰다는 것은 주목할만하다. 이것은 iDC에 의한 HMGB1의 자발적 방출에 기인하는 것으로 생각되는데, 이는 여기서 제시되고 앞서 보고된 바 있으며46, HIV-1로 감염 후에도 보존된다. 이들 관찰 결과는 DC에서 HIV-1 복제를 제어하는데 있어서 HMGB1의 중추적 역할을 밝혀준다. 결과적으로, rh-HMGB1은 감염된 DC 및 aNK-감염된 DC 공배양물의 배양 상청액에서의 p24 방출을 유의적으로 증가시키는 것으로 입증되었다. 혈장 HMGB1 수준은 만성적으로 HIV-1 감염된 환자에서 상승되고, 임상적 합병증을 가지는 환자에서 최대 농도이기 때문에, 이들 데이터는 HIV 병인에 대한 이해에 있어서 중요한 의미를 가질 수 있다47. 또한, 외인성 HMGB1은 항레트로바이러스 요법 하에 HIV-1 감염된 환자로부터 유래한 PBMC에서 HIV-1의 재활성화를 시험관내에서 유도하는 것으로 보고되었다39.
분비된 HMGB1은 동종이계 DC에 의한 활성화 후에 미접촉 CD4 T 세포의 증식, 생존 및 편향에 필수적이며, 이들 효과는 DC에 의해 발현되는 RAGE를 포함한다48. 여기서, 동계 조건에서 HMGB1은 그 자체로 Th1 편향을 유도할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 정상 수준의 HMGB1이 계속 생성되어도 HIV-1 감염된 DC의 존재 하에 Th1 반응이 유도되지 않지만, IL-12 및 IL-18 방출은 억제되었다. 최근 연구는 Th1 편향 조절에 있어서 NK 세포의 필수적인 역할을 강조하는데, 이것은 이들 세포가 DC에 의한 IL-12 및 IL-18 방출을 촉발하여, NK 세포에 의한 IFN-γ의 생성을 촉진하며, 이는 Th1 세포로의 T 세포의 분화를 촉발한다는 것을 제시한다49,50. NK 세포 활성화에 대한 반응으로 IL-12 및 IL-18을 증가량으로 생성하는 HIV-1 감염된 DC의 결함은 결함성 Th1 편향과 관련이 있기 때문에, Th1 분화에 대한 IL-12 및 IL-18의 필수적인 역할이 여기서 확인된다. 이러한 결함은, HIV 억제제 AZT의 긍정적인 효과에 의해 확인되는 바와 같이, DC에서 HIV-1 복제와 직접적으로 연관되어 있다. 이들 관찰결과는, 최근 제안된 바와 같이30, HIV 감염 환자로부터 유래한 DC에서 보고된 일부 기능 변화51,52, 예컨대 IL-12를 포함하는 몇몇 사이토킨의 분비 감소와 자가 CD4 T 세포를 프라이밍하는 능력 손상이 NK-DC 크로스 토크 결함과 연관될 수 있음을 시사한다.
본 발명자들은 HIV-1 감염된 DC에서 바이러스 저장소의 확립 및 HIV-1 복제 활성화가 aNK 세포와 자가 DC 사이의 크로스 토크에 따라 달라지며, 이들의 크로스 토크 동안 NK 세포 및 DC 둘다에 의해 생성되는, HMGB1의 이 프로세스에서의 중추적 역할을 확인하였으며, DC에서 HIV 복제의 NK 의존성 촉발이 HMGB1에 특이적으로 결합하는 글리시리진에 의해, 또는 항-HMGB1 항체를 이용한 차단에 의해 완전히 없어진다는 것을 확인하였다. 또한, NK 세포와의 크로스 토크 후에 Th1 편향을 유도하는 HIV-1 감염된 DC의 능력의 강한 손상이 입증되었다. 바이러스 확산을 촉진하는데 있어서 NK-DC 크로스 토크의 역할, 및 바이러스 저장소의 보충 및 바이러스 복제의 촉발에 있어서 HMGB1의 생체내 연관성에 기초한 HIV 감염의 치료 및 모니터링 방법이 개시되어 있다.
실시예 1: 활성화된 NK 세포는 HIV-1로 감염된 자가 1차 미숙 수지상 세포의 성숙을 유도한다.
DC 성숙에 대한 NK 세포의 역할은, 단리된 단핵구로부터 단핵구 유도 DC를 형성하고, 동일한 공여자로부터 얻은 정제된 NK 세포와 함께 공배양하여 조사하였다. NK 세포는 휴지기(rNK)이거나, PHA 및 IL-2(aNK)의 조합에 의해 활성화된다. aNK 세포와 자가 미숙 DC(iDC)의 24시간 공배양은, NK-DC 비율에 따라서, iDC의 생존 또는 아폽토시스를 유도하며, 이는 이전의 보고와 일치하는 것이다14. 실제로, 5:1의 aNK-DC 비율은 DC 아폽토시스를 유도하는 반면에, 1:5 비율은 DC 생존을 유도하였다. (도 1a). 성숙 DC의 특징인, 성숙 마커 CD86 및 HLA-DR의 동시발현 증가에 의해 확인되는 바와 같이(기준선에서 15.3%와 비교하여, NK 세포에 의해 72.1%의 CD86brightHLA-DRbright DC가 유도되었다), 1:5의 NK:DC 비율에서의 iDC 생존은 그 성숙과 관련이 있었다(도 1b). 동일한 실험 조건 하에서, CD86brightHLA-DRbright DC의 비율에 의해 판정되는 바와 같이, rNK 세포는 DC 성숙에 대한 영향이 더 약하였다(도 1b,e). HIV-1로 iDC를 감염시킨 후에, iDC 증식성 감염 조건 하에서, p24에 대한 iDC의 세포내 염색 및 배양 상청액에서의 p24 방출에 의해 제3일에 측정되는, iDC의 NK 의존적 성숙이 변하지 않았다(도 1c).
DC 성숙에 대한 HIV의 직접적 효과는 0.001∼10 ng/ml 농도에서 발견되며, 여기서 HIV는 DC 성숙의 강력한 유발자로서 양성 대조군으로서 사용되는 LPS와 대조적으로 성숙 마커 CD86 및 HLA-DR 발현을 증가시킬 수 없다(도 1b,d). 도 1 e에 도시된 3명의 대표적인 공여자들로부터 얻은 데이터는, iDC의 감염 상태 또는 비감염 상태와 무관하게, 24 시간 공배양 후에 iDC의 성숙화에 대한 aNK 세포의 영향이 크다는 것을 확인한다. 이들 데이터는 HIV-1 증식성 감염된 iDC가 NK-DC 크로스 토크 과정에서 NK 세포에 의해 유도되는 성숙화에 대한 정상적인 감수성을 유지함을 보여준다.
실시예 2: aNK-DC 크로스 토크는 NK 세포 및 DC에서 HMGB1 발현을 촉발한다.
iDC의 aNK 의존적 성숙에 관련된 분자를 확인하기 위해서, 다분석물 프로파일링(MAP)을 사용하여 iDC, NK 세포 및 aNK:iDC의 24 시간 배양물에서 생성되는 주요 사이토킨을 맵핑하였다. iDC는 소량의 IL-1β IL-6 및 IL-12을 방출하며, IL-10 또는 TNF-α를 생성하지 않는다. aNK 세포와의 공배양 후에, 염증촉진 사이토킨 프로파일이 유도되었으며, IL-12 분비가 크게 증가하고, NK 세포로부터 유도되는 TNF-α 및 IFN-γ수준이 유의적이며, IL-10은 생성되지 않았다(도 2a). 흥미롭게도, iDC 및 NK 세포 둘다로부터 유래한, 높은 수준의 HMGB1이 이들 배양 상청액 중에서 검출되었으며, aNK:iDC 공배양물은 배양 상청액에서 HMGB1 농도를 크게 증강시켰다(도 2a). 공초점 현미경에 의해, NK 세포가 새로 단리된 NK 세포의 핵에서 검출되고(도 2b), aNK 세포의 세포질로 추가로 전위되는(도 2c), HMGB1을 생성할 수 있다는 것을 단세포 수준에서 확인하였다. HIV-1과 항온처리한지 3 시간 후에, aNK 세포는 배양 상청액과 공초점 현미경에 의해 검출되는, 강한 HMGB1 발현 감소를 나타내었다(도 2c). 이 후, HMGB1 수준은 rNK 세포와 유사한 수준에 도달하였다(도 2a). 본 발명자들은, 배양 상청액에서의 p24 검출 부재와 NK 세포에서 (FACS에 의해 검출되는) 세포내 p24 염색 부재(데이터는 도시되지 않음)에 의해 확인되는 바와 같이, NK 세포가 HIV-1을 복제할 수 없다는 것을 입증하였다. HMGB1은 또한 iDC에 의해 분비되며, 일단 감염되면 배양 상청액에서 유사한 양의 사이토킨을 생성하였다(도 2d). HMGB1은 HIV-1에 의해 감염되었는지 여부와 무관하게, 대개 iDC의 세포질에서 검출되었으며(도 2e), 감염된 DC에서의 p24 발현은 p24 및 HMGB1에 대한 이중 세포내 염색에 의해 확인되는 바와 같이, HMGB1 발현을 변경하지 못하였다(도 2e). iDC를 aNK 세포와 공배양한 경우, 배양 상청액 중 HMGB1 분비의 강력한 유도가 관찰되었으며(도 2d), 성숙 DC, 즉 DC0, DC1 및 DC2에 의해 생성되는 것과 유사한 수준에 도달되었다(도 2f). 두드러지는 점은, iDC의 HIV-1 감염이 NK-DC 공배양물(도 2d) 및 성숙 DC의 배양물(도 2f)에서 생성되는 HMGB1의 양에 영향을 주지 않는다는 것이다. 공초점 현미경 분석으로 aNK 세포와 iDC 사이에 접합체가 형성되는 것을 확인하였는데, 이는 aNK 세포를 HIV-1 감염된 DC와 공배양할 때도 관찰되었으며, 양 세포는 모두 DC의 감염 상태와 무관하게 HMGB1을 발현하였다(도 2g). 이들 결과는 HMGB1이 NK-DC 크로스 토크 동안 NK 세포와 iDC 둘다에 의해 발현되며, 이 프로세스는 iDC의 HIV-1 감염에 의해 변하지 않는다는 것을 입증한다.
실시예 3: HIV-1 감염된 iDC의 aNK-의존적 성숙은 HMGB1에 의해 매개되며 RAGE를 포함한다.
NK 의존적 DC 성숙에서 HMGB1의 가능한 연관성을 결정하기 위해서, 가용성 HMGB1 분자와 상호작용하는 것으로 알려진31 글리시리진을 항-HMGB1 항체와 함께 사용하였다(도 3a). 24 시간 aNK-iDC 공배양물의 개시시 첨가되는 이들 억제제는 aNK 세포의 부재 하에 관찰되는 기준 수준에 대한 성숙 DC(CD86brightHLA-DRbright로 확인됨)의 비율을 감소시켰다(도 3a). 감염된 DC를 이용하여 유사한 효과를 얻었다(도 3a). rh-HMGB1 자체는 1∼10 ㎍/ml rh-HMGB1로 24 시간 동안 처리한 경우 iDC의 표현형 성숙을 유도하지 않았으며, 48 시간 배양시 유사한 데이터가 얻어졌다(도 3b). 실제로, iDC의 자발적 성숙은 배지에서 배양 48 시간 후에 관찰되었지만, 고 비율의 CD86bright HLA-DRbright DC에 의해 확인되는 바와 같이, 10 ㎍/ml rh-HMGB1은 이들 세포의 비율을 65%에서 71%로 약하게만 증가하였다. 흥미롭게도, mDC(DC0)에서 모두 충분히 발현되는, CD80, CD83의 발현 결여 및 DC-lamp의 약한 발현에 의해 평가되는 바와 같이, rh-HMGB1 처리된 DC는 완전히 성숙되지 않았다(도 3b). 그러나, 이들 부분적으로 성숙한 DC는, hr-HMGB1 처리된 DC에 의한 케모카인, MCP1, MIP-1α, MIP-1β 및 IL-8의 방출 증가에 의해 확인되는 바와 같이, rh-HMGB1에 대해 기능적으로 감수성이었다(도 3c). HMGB1 수용체는 RAGE32,33 TLR-2 및 TLR-434를 포함한다. RAGE는 HMGB1에 대해 처음 확인된 수용체이며, T 세포, 단핵구, 대식세포 및 DC를 포함하는 각종 면역 세포에 의해 발현되고35, 림프절로의 생체내 귀소를 위해 성숙 DC에 의해 사용된다. TLR-2 및 TRL-4는 iDC에서는 거의 검출되지 않지만(도시되지 않음), RAGE는 유세포 분석에 의해 확인되는 바와 같이 DC에서는 충분히 발현되며, 이의 발현은 성숙 DC0에서 더욱 높았다(도 3d). 1 ㎍/ml의 HMGB1과 iDC의 항온처리 후에, RAGE의 하향 조절이 관찰되었는데, 이것은 이 수용체가 이들 세포에 의해 사용된다는 것을 강력하게 시사하는 것이다(도 3d). HIV-1에 의한 DC의 감염 후에, RAGE 수준 변화가 iDC 및 DC0에서는 검출되지 않았다. HMGB1과 감염된 DC의 항온처리는 RAGE의 유사한 하향 조절을 유도하였다(도 3d). NK-DC 크로스 토크 과정에서 RAGE의 가능한 연관성은, aNK 세포와 함께 공배양된 DC 및 단독 배양된 DC에서의 RAGE 발현을 비교하는, 동일한 방법을 이용하여 평가하였다. aNK 세포와 2 시간 공배양한 후에, DC는 RAGE 발현의 상향 조절을 나타낸 후에, 24 시간에 하향조절되었다(도 3e). HIV-1 감염된 DC를 이용하여 유사한 관찰결과가 얻어졌다(도 3e). 따라서, HMGB1은 NK-DC 크로스 토크 동안 비감염된 및 HIV-1 감염된 iDC 모두의 성숙에 중요한 인자이며, 증식성 감염 후에 iDC에서의 발현이 영향을 받지 않는 RAGE를 포함한다.
실시예 4. 결함성 NK-DC 크로스 토크 결과 HIV 감염된 DC에 의한 Th1 편향 손상
NK 세포와 iDC의 상호작용은 Th1 반응의 유도를 위해 NK 세포 유도 보조 캐리어로서 작용하는 1형 편향된 DC를 유도한다37. 감염 또는 비감염된 DC가 aNK 세포와의 크로스 토크 후에 Th1 반응을 편향하는 능력을 평가하기 위해서, 미접촉 CD4+CD45RO- T 세포를 DC 및 aNK 세포의 존재 하에 8일 동안 공배양하고, FACS에 의해 측정되는 바와 같이, T 세포에서의 IFN-γ 및 IL-4의 세포내 생성의 검출로 Th1 편향을 측정하였다(도 4a). 미접촉 T 세포와 iDC의 공배양은 IFN-γ 양성 T 세포의 비율을 증가시키지 않았으며, iDC 및 rNK 세포와 미접촉 T 세포의 공배양시에도 유사한 데이터가 얻어졌다. 대조적으로, aNK 세포의 존재 하에 미접촉 T 세포와 iDC의 공배양은 IFN-γ T 세포 반응의 유의적 증가를 유도하였는데(도 4b), 이는 aNK:iDC 크로스 토크가 Th1 편향에 필수적임을 제시하는 것이다. 동일한 실험을 HIV-1 감염된 DC로 수행한 결과 Th1 편향이 관찰되지 않았다(도 4c). Th1 편향 억제에 대한 HIV-1 복제의 기여는, aNK 세포와 공배양된 감염된 DC에 의해 유도된 IFN-γ T 세포 반응 증가를 회복시키는, AZT 첨가에 의해 확인되었다(도 4d). AZT는 상청액에서 p24 항원 용량에 의해 평가되는 바와 같이, 이들 조건 하에 바이러스 복제를 억제하는 농도로 사용되었다(데이터는 도시되지 않음). IL-12 및 IL-18은 DC에 의해 생성되고 Th1 편향에 관련된 중요한 사이토킨이다. 이것은 DC에 의한 이들 사이토킨의 방출에 대한 aNK-DC 크로스 토크의 영향과 관련된 문제를 제기하였다. aNK-DC 크로스 토크는 감염되지 않은 DC에 의한 IL-12 및 IL-18 둘다의 분비를 촉발하는 것으로 밝혀졌다. 중요한 것은, 이들 사이토킨 둘다의 생성이 aNK 세포와 감염된 DC의 공배양물에서는 더 이상 검출되지 않는다는 것이다(도 4e, f). 또한, aNK-DC 크로스 토크 동안 NK 세포에 의한 IFN-γ 생성의 촉발은, 공배양이 HIV-1 감염된 DC와 함께 실시되는 경우에는 더 이상 검출되지 않았다(도 4g). 따라서, Th1 편향을 위한 DC 프라이밍은, NK 세포에 의해 방출되는 IFN-γ 및 DC에 의해 방출되는 IL-12 및 IL-18과 같은 사이토킨의 유도를 통해서, aNK-iDC 크로스 토크 동안 일어난다. HIV-1 감염 후에, 결함 NK-DC 크로스 토크로 인해, aNK 세포에 의해 iDC는 더 이상 편향될 수 없다. 따라서, HIV-1 감염된 DC는 Th1 편향을 유도하는 능력이 손상되어 있다.
실시예 5: iDC에서 HIV-1 복제 및 지속감염의 NK-DC 의존적 촉발에서의 HMGB1의 중추적 역할
NK-감작된 HIV-1 감염 DC에 의한 Th1 편향 손상은 HIV-1 복제에 따라 달라진다는 것이 확인되었기 때문에(도 4d), 본 발명자들은 aNK-iDC 상호작용이 iDC에서 HIV-1 복제를 촉발할 수 있는지 여부를 시험하였다. iDC를 HIV-1(1 ng/ml p24)로 3 시간 동안 감염시키고, 단독으로 또는 rNK 또는 aNK의 존재 하에 18 시간 동안 추가 배양하였으며, p24의 세포내 발현을 포함하는 DC의 빈도를 유세포 분석으로 측정하였다. p24+ DC의 비율은 감염된 iDC를 단독으로 배양한 경우 매우 낮지만, aNK 세포와의 상호작용 후에 p24+ DC가 유의적으로 증가하여, NK 세포의 부재 하에 단 4%인 것과 비교하여 전체 DC의 거의 1/3을 나타내었다(도 5a). 동일한 조건 하에, rNK 세포는 iDC에서의 HIV 복제에 대한 영향이 없었다(도 5a). 감염된 DC에서 aNK 의존적 HIV 복제 증가는 배양 상청액에서의 p24 항원 검출에 의해 확인되었으며, 통계학적으로 유의적인 p24 생성 증가가 단독으로 또는 rNK 세포와 함께 배양된 감염 iDC와 비교하여 HIV-1-iDC와 aNK의 공배양물에서 검출되었다(도 5b). p24 발현 DC의 빈도에 대한 NK-DC 상호작용의 극적인 효과는, p24 특이적 항체와 공초점 현미경에 의해 확인하였다. 감염 다음날 세포내 p24에 대해 매우 소수의 DC가 염색된 반면, aNK 세포와 배양 후에 매우 많은 수의 p24+ DC가 관찰되었다(도 5c). 흥미롭게도, iDC에서 HIV 복제에 대한 aNK 세포의 긍정적 영향이 성숙 DC에서 유사하게 관찰되었다. FACS에 의해 검출되는 p24+ DC의 빈도수 증가가 단독으로 배양된 DC0와 비교하여 aNK 세포와 함께 24 시간 동안 공배양한 HIV-1 감염된 DC0에서 발견되었으며(도 5d), aNK 세포와 함께 공배양된, HIV-1 감염된 성숙 DC0, DC1 및 DC2로부터의 배양 상청액에서 p24 검출로 성숙 DC에서 HIV-1 복제에 대한 aNK 세포의 유의적인 자극 효과를 확인하였다(도 5f 및 g). 중요한 것은, rNK 세포가 성숙 감염된 DC에서 HIV-1 복제에 대한 유의적인 영향을 미치지 않는다는 것이다(도 5f 및 g). 그 다음 본 발명자들은 aNK 세포가 iDC에서 프로바이러스 DNA의 발현에 영향을 미치는지를 시험하였다. 도 5(e)의 데이터는 rNK 세포와 감염된 iDC의 배양물 또는 단독의 감염된 iDC의 배양물과 비교하여, aNK 세포와 감염된 iDC의 배양물에서 HIV-1 프로바이러스 DNA 카피의 수의 매우 큰 증가가 감지되었다는 것을 보여준다.
외인성 HMGB1은 감염된 단핵세포주에서 HIV-1 복제를 증가시키고38, 항레트로바이러스 요법 하의 HIV-1 감염된 환자로부터 얻은 PBMC에서 HIV-1의 시험관내 재활성화를 유도하는 것으로39 최근 보고되었다. 따라서, DC에서 HIV 복제의 NK 의존적 촉발에서의 HMGB1 역할 문제가 제기되었다. 외인성 rh-HMGB1은 HIV-1 감염된 iDC에 대한 직접적 효과를 가져서, 배양 상청액에서 p24의 생성을 급격히 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 6a). rh-HMGB1은 또한, NK 세포와 공배양된 HIV-1 감염된 iDC에 의한 p24 생성에 대한 유의적인 자극 효과를 나타낸다(도 6a). 감염된 iDC-aNK 공배양물에서의 HIV-1 복제 촉발에 있어서 HMGB1의 영향을 조사하기 위해서, HMGB1 특이적 중화 항체 또는 글리시리진을 이들 공배양물에 첨가하여, 상청액에서 p24 생성을 측정하였다. 이들 HMGB1 억제제는 둘다는 aNK 세포와 공배양된 또는 단독 배양된 감염된 DC에 의한 HIV-1 생성을 저지하였다(도 6b). 이들 결과는 외인성 HMGB1이 감염된 iDC에 의한 HIV-1 복제를 촉발시킬 수 있음을 나타낸다. 이들은 또한 iDC에서 HIV-1 복제의 aNK 세포 의존적 자극이 HMGB1에 의해 매개됨을 나타낸다.
실시예 6: 1차 세포의 단리 및 분리
Ficoll-Hypaque 밀도 구배에서 건강한 공여자의 혈액(EFS Cabanel, Paris, France)으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하였다. CD14 특이적 면역자기 비드(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 사용한 양성 선별로 PBMC로부터 CD14+ 단핵구를 단리하였다. iDC를 생성하기 위해서, 정제된 CD14+ 단핵구를, 개시된 바와 같이53, 10 ng/ml의 재조합 인간(rhu) GM-CSF 및 10 ng/ml rhIL-4(Peprotech INC, Rockyhill, USA)의 존재 하에, 2mM 글루타민, 10% FCS, 페니실린(100 U/ml) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/ml)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 6일 동안 배양하였다(1 × 106 세포/ml). 2일마다 배양 배지를 교체하였다. CD3, CD4, CD14, CD19, CD20, CD36, CD123, CD66b, 글리코포린(Glycophorin) A(StemCell Technologies)에 대한 항체의 고갈(depletion) 칵테일을 이용하여 단핵구가 없는 PBMC로부터 음성 선별로 NK 세포를 분리하였다. CD3-CD56+ 세포로서 FITC-접합된 항-CD3 및 APC-접합된 항-CD56 항체를 이용한 유세포 분석(FACScalibur, Becton Dickinson)으로 측정되는 농축 분획의 NK 세포 함량은 상이한 실험에서 85∼95% 범위였다. FITC-접합된 항-CD14 항체로 평가한, 골수양 세포로 인한 오염은 일관되게 1% 미만이었다. 미접촉 CD4 T 세포(CD4+CD45RA+)는, CD4- 및 CD45RA-특이적 면역자기 비드(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 사용하여, 양성 선별로 PBMC로부터 단리하였다. 단리된 미접촉 CD4 T 세포의 세포 순도는 일반적으로 90% 이상이다.
실시예 7: NK 세포의 활성화 및 감염
정제된 NK 세포를 최적 이하 농도의 IL-2(100 ng/ml)(Peprotech)의 존재 하에 106 세포/ml에서 배양하여 살아있도록 유지하거나(rNK라고 함), 또는 PHA(10 ㎍/ml) (Sigma) 및 IL-2(10 ㎍/ml)의 조합에 의해 활성화시켰다(aNK 세포라고 함). 일부 실험에서, aNK 세포(106 세포/ml)를 HIV-1(1 ng/ml p24)의 존재 하에 3 시간 동안 배양하고 21 시간 동안 추가로 배양하였다. 이들 조건 하에서, 증식성 감염은 관찰되지 않았다. 그 다음 배양 상청액을 사이토킨 및 케모카인 검출에 대해 시험하였다(하기 참조).
실시예 8: 수지상 세포의 성숙 및 표현형 분석
IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 배양 6일 후에, iDC(106 세포/ml)를 자극하지 않거나, 또는 48 시간 동안 10 ㎍/ml LPS(E. 콜라이 혈청형 026-B6, Sigma-Aldrich)로 자극하여 DC0 세포를 얻거나, 또는 500 ng/ml의 삼량체 CD40L(Sigma-Aldrich)로 자극하여 DC1 세포를 얻거나, 또는 10 ㎍/ml의 LPS 및 1 ㎍/ml PGE2(Sigma-Aldrich)로 자극하여 DC2 세포를 얻었다. DC의 표현형 분석 및 이의 성숙 단계의 특성화를 유세포 분석으로 실시하였다. 100 ㎍의 PBS/10% FCS/0.1% NaN3 중에 희석시킨 CD80, CD83, CD86, HLA-DR, CD40, DC-LAMP 또는 DC-SIGN(모든 항체는 캘리포니아주 산 호세의 BD Biosciences에서 입수) 특이적 항체와 함께 4℃에서 20분 동안 DC를 염색하였다. 일부 실험에서, HMGB1-수용체인 RAGE(Abcam) 특이적 항체를 이용하여 DC를 염색하였다. 2회 세척 후에, 1% PFA로 세포를 고정하고, FACScalibur(Becton Dickinson)에서 즉시 얻고, Flow Jo 소프트웨어로 분석하였다.
실시예 9: HIV-1에 의한 수지상 세포의 감염
건강한 공여자로부터의 MDM에서의 R5-HIV-1Ba-L의 증폭으로 바이러스 스톡 제제를 제조하였다. 그 다음 HIV1 p24 농도의 결정 전에 원심분리로 바이러스 스톡을 청징화하였다. iDC를 200,000 세포/웰로 96웰 배양판에서 평판배양하고, 37℃에서 5% CO2 대기 하에 3 시간 동안 각종 농도(0.001∼10 ng p24/ml)의 R5-HIV-1BAL과 함께 항온처리하였다. 세포를 수거하고, 10% FCS를 포함하는 배지를 이용하여 4회 세척하고, 제시된 경우, 달리 언급된 바 없다면 1:5의 NK:DC 비율로 rNK 또는 aNK 세포를 첨가하였다. 바이러스 생성의 정량 및/또는 DC의 성숙화 단계 분석 이전에 NK-DC 공배양을 24 시간 동안 지속하였다. 일부 실험에서(도 6), HIV-1 감염된 iDC를 단독으로 또는 aNK 세포와 함께 3일 동안, rh-HMGB1(1 ㎍/ml)(R & D Systems)의 존재 하에 항온처리하고, 일부 배양시에는 토끼 항-HMGB1 Abs(10 ㎍/ml)(Abcam, Cambridge, UK) 또는 글리시리진(10 ㎍/ml)의 존재 하에 배양하였다.
실시예 10: HIV-1 바이러스 생성, 프로바이러스 양 및 감염된 DC 빈도수의 정량
감염된 세포 배양물 상청액 중 HIV-1의 농도는 ELISA(Ingen, Belgium)에 의한 p24 단백질의 양을 측정하여 결정하였다. 세포로부터 DNA를, GIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen, Basel, Switzerland)를 사용하여 추출하고, 이전에 개시된 바와 같이54, RT-PCR로 HIV-1 프로바이러스 양을 정량하였다. 유세포 분석으로 HIV-1 감염된 세포의 빈도를 측정하여 세포내 p24 분자를 검출하였다. 세포를, DC를 표적으로 하는 CD40(BD Biosciences, San Jose, CA) 특이적 항체로 표면 염색하고, p24 특이적 항체로 세포내 염색하였다(Coulter). 염색된 세포를 1% PFA로 고정하고, FACScalibur(Becton Dickinson) 상에서 즉시 얻었으며, FlowJo 소프트웨어로 분석하였다. 일부 실험에서 감염된 DC를, 면역형광 후에 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 영상화하였다.
실시예 11: NK 세포와 iDC의 공배양
rNK 또는 aNK를, 달리 제시된 바 없다면, 1:5(2 x 105 NK + 10 x 105 DC/1 ml)로 iDC 또는 mDC와 함께 24 시간 동안 공배양하였다. 전술한 바와 같이55, 7-AAD 분석으로 DC 생존을 결정하였다. 간단히 설명하면, 배양된 세포를 20 ㎍/mL 핵 염료 7-아미노-액티노마이신 D(7-AAD; St. Quentin-Fallavier, Sigma-Aldrich)로 4℃에서 30분 동안 염색하고, CD56 특이적 항체(BD Biosciences, San Jose, CA)로 공동 염색하였다. 생존 DC는 CD56-7-AAD- 세포로 확인되었다. DC의 표현형 특성규명을 NK-DC 공배양물에서 실시하는 경우, CD56 특이적 항체를 이용한 염색을 통해 FACS 분석으로부터 NK 세포를 항상 배제하였다.
실시예 12: 사이토킨과 케모카인 생성 측정
24 시간 동안 106 세포/ml로 iDC를, 2.105 세포/ml로 rNK 또는 aNK 세포를 또는 1:5 비율로 aNK 및 iDC 세포를 항온처리하여 무세포 배양 상청액을 제조하였다. 제조자의 지시에 따라서 Luminex(24 plex kits; Biosource)로 케모카인 및 사이토킨을 측정하였다. 간단히 설명하면, 50 ㎕의 상청액 또는 표준물을 항체 결합된 비드와 함께 2 시간 동안 항온처리하고, 세척액으로 2회 세척하고, 비오티닐화 2차 항체로 1 시간 동안 항온처리하였다. 스트렙타비딘-PE와 함께 30분 동안 최종 항온처리한 후에 Luminex 100IS에서 얻었다. 100 이상의 사건을 각 피분석물에 대해 획득하였다. 표준 곡선 이상 또는 이하의 값을 측정된 최소 또는 최대 농도로 치환하였다. 무세포 배양 상청액에서의 HMGB1 정량을 ELISA 키트(IBL, Hamburg)에서 실시하였다. NK 촉발된 DC에 의한 미접촉 CD4 T 세포의 Th1 편향을 시험하는 실험에서(도 4), 배양 상청액 중 IL-12, IFN-γ 및 IL-18의 정량을 EILSA 키트(R&D Systems의 IL-12 및 IFN-γ 키트, MBL의 IL-18 키트)로 실시하였다.
실시예 13: Th1 편향 분석
이전에 보고된 바와 같이56, 미접촉 CD4 T 세포(106/ml)를 비감염된 또는 HIV-1 감염된 iDC(106/ml)와 휴지기 또는 활성화된 NK 세포(2 x 105/ml)의 존재 하에 8일 동안 공배양하고, 유세포 분석으로 Th1 편향을 시험하였다. 간단히 설명하면, 브레펠딘 A(10 ㎍/ml)(Sigma Aldrich)를 배양 마지막 16 시간 동안 첨가하여 단백질 분비를 억제하였다. PerCP 접합 CD8 항체 및 FITC 접합 CD3 항체(BD Biosciences, San Jose, CA)로 표면 염색을 실시한 후에, 1% PFA로 4℃에서 15 분 동안 세포 고정하고 사포닌 완충액(PBS-BSA 0.2%-NaN3 0.01%-사포닌 0.5%)으로 투과시키며, APC 접합된 IFN-γ 또는 IL-4 특이적 항체(BD Biosciences, San Jose, CA)로 세포내 염색을 실시하였다. 염색된 세포를 즉시 FACScalibur(Becton Dickinson)에서 얻고 Flow Jo 소프트웨어로 분석하였다. Th1 편향에 대한 HIV-1 복제의 영향을 분석하기 위해서, AZT 1 mM을 단독으로 또는 HIV-1 감염된 iDC +/- rNK 또는 aNK 세포의 존재 하에 배양된 미접촉 CD4 T 세포 배양 개시시에 첨가하였다. 공배양이 끝날 때까지 AZT가 남았다. iDC의 HIV-1 감염을 상기한 바와 같이 AZT의 부재 하에 실시하였다.
실시예 14: 통계학적 분석
비모수 Mann-Whitney 시험으로 통계학적 분석을 실시하였다. 유의차 P 값을 보고한다. 플롯된 데이터는 평균 ± 표준 편차(s.d.)를 나타낸다.
실시예 15: HIV-1 감염된 수지상 세포는 hmgb1 의존적 메카니즘을 통한 NK 유도 아폽토시스에 대해 내성이 있다.
수지상 세포(DC) 및 자연 살해(NK) 세포는 감염에 대한 초기 방어에 있어서 중요한 역할을 하는 주요 선천면역 이펙터이다. NK-DC 크로스토크의 증거가 현재 나타나고 있다. 이 크로스토크는 양방향성이며, 양 세포 유형의 활성화 상태에 따라서, NK 세포 활성화와 살해 세포로의 분화, DC 성숙 또는 아폽토시스를 초래할 수 있다. DC는 헬퍼 CD4+ T 세포의 Th1 이펙터로의 프라이밍에 필요하며, HIV와 같은 비조절된 바이러스의 만성 발현은 DC의 성숙화 손상 및 파괴를 유도할 수 있다. 이 연구에서, 본 발명자들은 DC의 파괴에 대한 NK-DC 상호작용의 영향, 및 크로스토크에 대한 HIV의 영향력에 대한 문제를 검토하였다.
IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 6일 동안 배양된, 건강한 공여자로부터 얻은 분류된 단핵구로부터 미숙 DC(iDC)를 제조하였다. 일부 실험에서, iDC를 R5-HIV-1(1 ng/ml의 p24)로 감염시켰다. 정제된 자가 aNK 세포(PHA+IL-2에 의해 활성화됨)를 이용한 공배양 실험을 각종 NK:DC 비율로 실시하였다. DC 성숙화 및 아폽토시스에 대한 NK-DC 상호작용의 영향은, 막을 이용한 7-AAD 염색을 HLA-DR, DC-SIGN, CD83, CD86, DR4, mTRAIL 등에 대해 특이적인 mAb를 이용한 세포내 염색과 조합한, 다변수 유세포 분석을 이용하여 분석하였다.
aNK 세포는 5:1 비율의 NK:DC에서 비감염된 iDC의 아폽토시스를 빠르게(1∼2 시간 내에) 유도하는 것을 발견하였다. NK-DC 공배양물의 라이브 비디오 현미경으로 NK-DC 접촉 직후에 DC가 전형적인 아폽토시스 표현형(세포 부피 및 버블링 증가)을 나타낸다는 것을 확인하였다(도 7). 생존 DC는 성숙 세포의 표현형을 나타내었다(도 8). iDC 아폽토시스는 aNK 세포에 의해 생성된 TFN-α 관련 아폽토시스 유도된 리간드(TRAIL)를 포함하고, 이는 막 수준에서 TRAIL을 발현하는 CD56bright NK 세포와 TRAIL 수용체 DR4를 발현하는 DC 사이의 상호작용에 의해 매개된다. NK 의존적 iDC 아폽토시스는 항-DR4 항체를 중화시켜 완전히 저지할 수 있는데, 이는 이 프로세스에서 TRAIL 의존적 경로의 중요한 역할을 강조하는 것이다(도 9). 그러나, 콘카나마이신 A(과립 의존적 세포독성의 억제제)의 NK-DC 공배양물로의 첨가는 NK 의존적 DC 아폽토시스에 대한 영향이 없으며, 이는 DC 아폽토시스에서 퍼포린(perforin) 경로의 연루를 배제하는 것이다.
aNK 유도된 iDC 아폽토시스에 대한 HIV의 영향을 조사하기 위해서, iDC를 R5-HIV-1(1ng의 p24/ml)로 감염시켰다. HIV 감염 후에, iDC는 aNK 의존적 아폽토시스에 대해 내성이 되었다. HIV-1은 감염된 iDC의 CD86/HLA-DR 공동염색으로 확인되는 바와 같이, 그 자체가 iDC의 성숙화를 유도하지 않았다(도 10). aNK 세포에 의한 TRAIL 분비는 iDC의 HIV 감염에 의해 영향을 받지 않았으며, HIV-1 감염된 DC는 TRAIL 유도된 아폽토시스에 민감하였다(도 10). aNK 유도 아폽토시스에 대한 HIV-1 감염된 iDC의 내성은 글리시리진 또는 차단성 항-HMGB1 항체의 존재 하의 억제 분석에 의해 확인되는 바와 같이, HMGB1에 의존적인 것으로 밝혀졌다(도 11). HIV-1 감염된 iDC의 aNK 유도된 아폽토시스에 대한 내성은, iDC 감염시 아지도티미딘(AZT)의 첨가에 의해 입증되는 바와 같이, DC에서 HIV-1 복제에 의존적인 것으로 밝혀졌다(도 11). 또한, 이들 결과는, iDC의 HIV-1 감염이 염증촉진성 사이토킨 HMGB1을 포함하며, aNK 유도 아폽토시스에 대한 감염된 iDC의 내성을 유도한다는 것을 보여준다.
본 발명자들은 aNK 세포와 HIV-1 감염된 iDC 사이의 크로스 토크가 DC에서의 프로바이러스 DNA 발현 및 바이러스 복제의 급격한 증가를 초래하며, 이 프로세스가 주로 HMGB1에 의해 촉발된다는 것을 앞서 인식하였다. 이 실시예의 결과는 HIV-1 감염된 DC의 생존에 있어서 주요 매개인자로서 HMGB1의 중요한 연관성을 보여주는 것으로서, HIV 저장소의 확립 및 바이러스 지속감염에 있어서 HMGB1의 역할을 강조하는 것이다. 이들 결과는 HIV가 DC를 "장악"하여 바이러스 확산을 효과적으로 촉진하는 방법과, HIV 감염을 치료하는데 이 성질을 이용할 수 있는 방법을 보여준다.
실시예 16: HIV-2의 존재 하에 aNK-DC 공배양 실험
HIV-1과 마찬가지로, 바이러스 복제의 NK 의존적 촉발에 대한 HIV-2 감염된 DC의 감수성 문제를 검토하였다. 이 프로세스에서의 HMGB1의 영향을 평가하였다.
1- HIV-2에 의한 DC의 감염: iDC를 500,000 세포/웰로 96웰 배양판에 평판배양하고 5% CO2 대기 하에서 3 시간 동안 37℃에서 HIV-2(20 ng p24/ml)와 함께 항온처리하였다.
2- NK-DC 공배양물: 세포를 수거하고, 10% FCS를 포함하는 RPMI로 3회 세척하고, 제시된 경우, aNK 세포를 1:5의 NK:DC 비율로 첨가하였다. 제시된 경우, 재조합 HMGB1을 10 ㎍/ml(R&D Systems)로 첨가하거나, 또는 토끼 항-HMGB1 Abs(1 ㎍/ml)(Abcam, Cambridge, UK)를 첨가하였다. 배양 상청액에서 바이러스 생성의 정량 전에 NK-DC 공배양을 3∼7일 동안 지속하였다.
3- HIV-2 바이러스 생성의 정량: 상청액 중 HIV-2 입자의 농도를 p24 ELISA 키트(Ingen, Belgium)를 사용하여 결정하였다.
도 6c에 도시된 바와 같이, 감염된 DC가 단독으로 또는 aNK 세포의 존재 하에 배양되는지 여부와 무관하게, 감염 3일 후에 매우 낮은 수준의 HIV-2 생성이 검출되었다. rh-HMGB1은 바이러스 복제를 약간 증가시켰다. HIV-1을 이용한 본 발명자들의 이전 연구에서 관찰되는 바와 같이, DC 감염 3일 후는 유의적인 바이러스 복제를 검출하기에는 너무 이르다. 이들 공배양 상청액을 7일에 다시 시험한다.
실시예 17: 인간 혈청에서 HMGB1 단백질 및 항-HMGB1 항체의 검출/HIV로 감염된 환자에서 질병 활성도와의 관련성
HIV 감염된 환자로부터의 혈청 중에서 HMGB1의 농도를 ELISA kit Shino 테스트(IBL)에 따라서 정량하였다.
또한, 항-HMGB1 특이적 항체의 검출에 대한 특정 ELISA 분석을 개발하였다. HMGB1 특이적 자가항체가 SLE(전신 홍반성 루프스)에서 발견될 수 있다는 것을 고려하면(Hayashi et al., 2009), 항-HMGB1 항체가 HIV 감염 환자에서 검출되었는지, 그리고 그 수준이 HIV 감염과 상관관계가 있는지를 확인하였다.
항-HMGB1 항체의 검출을 위한 ELISA 분석
이 분석은 2 단계로 개발되었다:
(1) 제1 단계에서, 인간 HMGB1 특이적 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 코팅된 HMGB1 또는 BOX B에서 항체의 적정을 위한 조건을 정한다. 항-HMGB1 항체는 혈청 중에서 면역 복합체로서 발견되는 것으로 추정되기 때문에(Urbonaviciute et al. Factors masking HMGB1 in human serum and plasma. j Leukoc Biol. 2007 81:67-74), 항체 적정 이전에 이들 복합체를 해리시키는 방법을 개발하였다.
(2) 제2 단계에서, 몇몇 공여자 그룹으로부터의 인간 샘플(건강한 공여자, 패혈성 쇼크 환자 또는 항레트로바이러스 치료 전 및 후의 HIV+ 환자)의 혈청을 이용하였다.
하기 시약을 사용하였다:
- 인간 HMGB1에 대한 토끼 1차 폴리클로날 항체(Adcam ab18256)는 인간 HMGB1의 150번 잔기 내지 C-말단으로부터 유도된 KLH 접합된 합성 펩티드에 대한 것이다.
- 인간 HMGB1과 99% 동일한, 래트 HMGB1을 코딩하는 발현 플라스미드로부터 E.콜라이에서 생성한 재조합 HMGB1(HMGBiotech, HM-115).
- 인간 및 마우스와 전체적으로 동일한, 포유류 서열을 코딩하는 발현 플라스미드로부터 E.콜라이 내에서 생성한 HMGB1(HMGBiotech HM-051) 유래의 재조합 BOXB.
- 대조군 토끼 혈청(Sigma; Ref: R9133)
- 기질 p-니트로페닐 포스페이트 정제(pNPP), 포스파타제 알칼리(PAL)에 접합된 항-토끼 IgG 또는 IgM,
- 캘리브레이터: 혈청 유래의 인간 IgG(Sigma; ref I2511) 및 혈청 유래의 인간 IgM(Sigma; ref I8260)
- 염소에서 생성된 항-인간 IgG(Fc 특이적)-알칼리 포스파타제 항체(Sigma; Ref A9544), 염소에서 생성된 항-인간 IgM(μ쇄 특이적)-알칼리 포스파타제 항체(Sigma; ref A3437)
하기 분석을 실시하였다:
96웰 평판 코팅을 DPBS 중 BOXB 0.5 ㎍/ml 또는 HMGB1 3 ㎍/ml로 4℃에서 밤새 실시하였다. 동시에, 캘리브레이터 코팅을 상응하는 이소타입의 DPBS 중에서의 연속 희석액으로 실시하였다(인간 샘플을 이용하여 실시한 ELISA 분석에 대해서만). 마이크로판 세척기(Atlantis; Oasys)를 이용하여, 평판을 DPBS/0.05%(v/v) Tween® 20으로 4회 세척하였다. 각 단계의 ELISA 분석 후에 유사한 세척을 실시하였다. 미결합 부위를 PBS/2% (w/v) BSA를 이용하여 2 시간 동안 4℃에서 차단시켰다. DPBS/0.05% (v/v) Tween®/1% (W/V) BSA로 희석된 혈청 샘플 분액 100 ㎕를 코팅 및 비코팅 웰에 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 모든 혈청 샘플을 수조 중 25℃에서 30분 동안 1.5 M 글리신(v/v, pH 1.85)으로 처리하거나 또는 미처리하고, 얼음 위에 더 유지하고, 1.5M Tris, v/v, pH 9.0으로 희석하였다. 그 다음 샘플을 바로 희석하고(1/10에서 1/1000로) 코팅판 위에 분배하였다. DPBS/0.05% (v/v) Tween®/1% (W/V) BSA로 희석된 항-토끼 IgG 알칼리 포스파타제 접합된 항체(비율 1/10000), 또는 염소 항-인간 IgG(비율 1/2000), 또는 IgM(비율 1/2000) 알칼리 포스파타제 접합된 항체를 37℃에서 1 시간 동안 첨가하였다. 100 ㎕ pNPP 기질과 37℃에서 30분 동안 항온처리한 후에 항원 특이적 항체를 검출하고, 100 ㎕의 NaOH 3M을 첨가하여 반응을 정지시켰다. HMGB1- 또는 BOXB-특이적 항체의 농도는, 쉬겔라(Shigella) LPS에 특이적인 ELISA에서 이전에 보고된 바와 같이, Ascent 소프트웨어, ThermoElectrocorp에 의해 표준 면역글로불린 용액 흡광도로부터 얻은 표준 곡선에 따라 계산하였다(Launay et al. Vaccine 2009, 27:1184-1191). 데이터는 검출된 항체 ㎍/ml로 표시한다.
이 분석법을 개발하기 위해서, 토끼 항-인간 항체를 적정하기 위한 HMGB1 또는 BOXB 코팅판을 사용하여 여러 매개변수를 시험하였다. 얻어진 결과는 다음과 같다:
- 2%∼5% BSA 농도는 동일하게 효과적이며(도 13a);
- 정제된 항-HMGB1 항체에 대한 적정 곡선의 직선부에 있는, 화살표로 표시된, 항-IgG-PAL 항체의 1/10,000 희석율이 선택되었으며(도 13b);
- 정제된 항-HMGB1 항체에 대한 적정 곡선의 직선성에 의해 제시되는 바와 같이 웰 코팅을 위한 HMGB1 2.5∼5 ㎍/ml 농도가 가장 적당하고(도 13c);
- 정제된 항-HMGB1 항체 0.5 ㎍/㎕ 농도가 선택되었으며(도 13d);
- 토끼 항-HMGB1 항체와 비교하여 비면역 토끼 항체의 반응성이 없기 때문에, 이 시험은 특이적이었고(도 13e);
- HMGB1 또는 박스 B-코팅된 평판에서 정제된 토끼 항-인간 항체를 시험한 경우 유사한 데이터가 얻어졌다. 박스 B(HMGB1의 주요 면역원성 부분)가 추가로 선택되었다(도 14).
인간 샘플에서 복합된 항-HMGB1 항체의 검출을 위한 산 처리
인간의 생물학적 샘플을 시험하기 위해 필요한 분석 조건을 결정하기 위해서, HMGB1 특이적 항체의 존재에 대해 일련의 인간 혈청을 적정하였으며, [HMGB1 항-HMGB1 Ab] 복합체가 생물학적 샘플 중에 존재한다는 가정하에, 이들 면역 복합체를 해리하기 위한 글리신 1.5M, pH1.85의 전처리 영향을 분석하였다. 수조에서 30분 동안 25℃에서 1.5 M 글리신(v/v, pH 1.85)으로 처리되거나 또는 비처리된 모든 혈청 샘플을 시험하고, 얼음 위에서 추가로 유지하고, 1.5M Tris, v/v, pH 9,0으로 희석하였다. 직후 샘플을 희석하고 코팅판 위에 분배하고, 상기 개시한 바와 같이 시험하였다.
도 15에 제시된 데이터는, 면역 복합체를 해리시키기 위해 항-HMGB1 항체를 글리신 1.5M로 처리하지 않은 경우, 항-HMGB1 항체는 인간 혈청에서 거의 검출되지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, HMGB1 특이적 항체 대부분은 HMGB1과의 복합체를 형성하였으며, 이는 염증촉진 분자에 대한 중화 메카니즘을 나타낸다.
HIV + 환자의 혈청 중 HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 정량
순환 HMGB1 및 항-HMGB1 항체를 상이한 질병 단계에서 HIV-감염된(HIV+) 환자에서 시험하였다.
1. HIV 감염된 환자의 혈청에서의 HMGB1 적정
도 16은 건강한 공여자(점선)와 비교하여 HIV+ 환자에서 HMGB1의 순환 수준 증가가 감지됨을 보여준다.
2. CD4 세포, CD8 세포, 프로바이러스 DNA 및 HIV RNA VL에 대한 유효 항레트로바이러스 요법의 영향
7명의 HIV+ 환자(검출가능한 바이러스 양을 가짐: VL)를 1년간 임상 추적조사하는 과정에서, 항-HIV 약물(숙주 세포로의 HIV 침입 및 복제 차단), CD4 세포, CD8 세포, 프로바이러스 DNA 및 HIV RNA VL의 조합을 포함하는 매우 활동성인 항레트로바이러스 요법(HAART)의 면역학적 효과를 HAART 개시시(M0)와 HAART 1개월후(M1), 3개월 후(M3), 6개월 후(M6) 및 12개월 후(M12)에 측정하였다. 결과는 하기 표와 도 17에 제시되어 있다.
Figure 112011021041330-pct00001
상기 환자의 특성표는 HAART가 모든 환자에서 HIV-RNA VL의 유의적이고 신속한 억제를 유도하여(△ 바이러스 양은 소정의 시점에서의 VL과 기준 M0에서의 VL 사이의 차이를 나타냄), 검출가능하지 않은 수준(50 카피/ml 혈액)에 이르게 한다는 것을 보여준다. 또한, HAART는 혈액 CD4 T 세포의 수의 유의적인 증가를 유도하는 반면, CD8 T 세포 수준에는 변화가 감지되지 않았다(도 17a). HAART는 또한 혈장 HIV-RNA 바이러스 양의 유의적인 감소를 유도하였다(M0에 비해서 M1, M3에서 p<0.001 및 M6 및 M12에서 p<0.05). 세포 회합 HIV-DNA에서의 유의적인 영향은 관찰되지 않았다(도 17b).
3. 이들 혈청 샘플 중 HMGB1 및 항-HMGB1 항체에 대한 유효 항레트로바이러스 요법의 영향
HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 혈장 수준을 HAART 개시시(M0)와 HAART 1개월후(M1), 3개월 후(M3), 6개월 후(M6) 및 12개월 후(M12)에 적정하였다. 상기 개시된 분석으로 항체 역가를 결정하였다. 즉, 환자 혈청을 적정 전에 글리신으로 처리하고 항-HMGB1 항체에 대해 정량하였다. 결과는 도 18 및 19에 제시되어 있다.
이들 환자로부터의 혈청 샘플 중 HMGB1 적정은, HAART 하의 HIV-RNA VL의 억제가 HMGB1 수준 감소와 관련이 있다는 것을 보여주었다(도 18). M6까지, HMGB1 수준이 건강한 개체의 수준에 도달하였다(점선). 따라서, HAART 영향은 HMGB1 생성시 HIV의 구동 역할을 증명한다.
도 19의 데이터는 항-HMGB1 항체의 검출가능한 농도가 M0에서의 환자 혈청에서 발견되고, 항레트로바이러스 요법이 M6까지 항-HMGB1 농도 강하를 유도하여, M12에서 검출가능하지 않은 값에 도달한다는 것을 보여준다. 기준값과 비교하여 항-HMGB1 항체 수준의 통계학적으로 유의적인 감소가 M6(p=0.05)과 더 이후 시점(M12)에서 또한 감지되었다.
따라서, HMGB1 및 항-HMGB1 수준의 병행 측정은 만성 HIV 감염이 HMGB1 생성을 촉발하며, 이는 다시 중화 항체 생성을 촉발함을 나타낸다. 이것은 HMGB1 수준(M3) 강하와 항-HMGB1 수준 감소(M6)를 포함하는 동적 프로세스이며, 양 분자의 수준은 유효 항레트로바이러스 요법 후에 정상화된다.
항-HMGB1 수준 및 HIV 바이러스 양 사이의 상관관계
상기 언급한 결과를 고려하여, HMGB1 및 항-HMGB1 항체의 순환 수준이 HIV-RNA 바이러스 양과 관련이 있는지에 관한 중요한 문제를 검토하였다.
따라서, 다양한 바이러스 양을 포함하는 HIV+ 환자의 혈청 샘플을, 상이한 질병 단계에서 시험하였다. 이들 결과는 하기 표((Spearman의 상관관계 시험), 및 도 20에 요약되어 있다.
Figure 112011021041330-pct00002
r= 상관 계수; p<0.05: 2개의 변수가 관련될 확률 >95%; n=연구에서의 환자 수
도 20a에 도시된 바와 같이, HMGB1과 항-HMGB1 항체 수준 사이의 역의 상관관계가 있는데, 이는 HMGB1의 낮은 수준은 항체의 높은 수준과 관련이 있기 때문에, HMGB1 생성이 HMGB1을 중화시키는 항-HMGB1 항체의 합성을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 20b는 항-HMGB1 항체와 VL 사이의 역의 상관관계가 있음을 입증하는데, 이는 항-HMGB1 항체의 중화 활성으로 인하여 바이러스 복제에 대한 HMGB1의 자극 활성이 항체에 의해 억제됨을 제시하는 것이다.
이들 데이터는 HMGB1 중화를 유도하여 바이러스 양을 감소시키는, HIV+ 환자에서의 항-HMGB1 기반 요법의 유리한 효과를 증명한다.
변형예 및 기타 구체예
본 발명의 구상뿐 아니라 개시된 제품, 조성물 및 방법의 각종 변형예 및 변화예가 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 당업자들에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 구체예들과 관련하여 설명되어 있지만, 청구되는 본 발명은 이들 특정 구체예에 한정되는 것은 아님을 이해해야 한다. 의학, 면역학, 생물학, 화학 또는 약학 분야 또는 관련 분야의 전문가들에게 명백한 본 발명을 수행하는 개시된 방식의 각종 변형예는 하기 특허청구범위 내에 포함시키고자 한다.
문헌 인용
본 개시내용에 인용되거나 언급된 각 문헌, 특허, 특허 출원 또는 특허 공개공보는, 특히 내용 중에 참고문헌의 인용을 포함하는 특정 청구 대상과 관련하여, 그 전문이 참고로 포함된다. 그러나, 그러한 임의의 참조문헌은 배경 기술을 구성하며 인용된 문헌의 정확성 및 적절성에 대한 문제제기 권한은 남아 있다는 승인서는 만들어지지는 않았다.
참조문헌
Figure 112011021041330-pct00003
Figure 112011021041330-pct00004
Figure 112011021041330-pct00005
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Figure 112011021041330-pct00007

Claims (36)

  1. 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 내에 포함되는 고 운동성 군 상자 1(HMGB1; High mobility group box 1)에 특이적인 총 항체를 정량하는 시험관내 방법으로서,
    a) 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시키는 단계;
    b) 상기 처리된 생물학적 샘플을 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체와 접촉시키는 단계; 및
    c) 고 운동성 군 상자 1(HMGB1)에 특이적인 총 항체를 정량하는 단계를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HMGB1 단백질 유도체는 재조합 HMGB1, HMGB1의 면역학적 반응성 부분, 각종 기원의 HMGB1 단백질에 공통인 서열을 갖는 HMGB1의 면역학적 반응성 부분, 및 인간과 마우스의 HMGB1에 공통인 서열에 상응하는 HMGB1으로부터 유래한 재조합 BOXB로 이루어진 군에서 선택되는 것인 시험관내 방법.
  3. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 감염된 것으로 알려진 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 중에서 HIV 감염을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 고 운동성 군 상자 1(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계를 포함하고, 정량을 위해 표적화되는 상기 항체는 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 HMGB1에 특이적인 총 항체이거나 또는 이의 순환 부분(순환 항체) 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분인 것인 시험관내 방법.
  4. HIV 감염 피험체에서 HIV 감염에 대한 치료 효능을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, (a) 치료 도중 상이한 시점에 상기 피험체로부터 얻은 샘플 중에 함유된 고 운동성 군 상자 1(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계로서, 정량을 위해 표적화되는 상기 항체는 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 HMGB1에 특이적인 총 항체이거나 또는 이의 순환 부분(순환 항체) 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분인 것인 단계, 및 (b) 상기 피험체에게 대한 치료 효능을 결정하는 단계를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  5. 제4항에 있어서, 치료 도중 상이한 시점에서 피험체로부터 얻은 샘플에 대해 얻어진 결과를 치료 개시 전에 동일한 피험체의 샘플에 대해 얻은 결과와 비교하는 것인 시험관내 방법.
  6. HIV 감염 피험체에서 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태의 시험관내 예후 방법으로서, 감염 후에 상기 피험체로부터 얻은 샘플에서 고 운동성 군 상자 1(HMGB1)에 특이적인 항체를 정량하는 단계를 포함하고, 정량을 위해 표적화되는 상기 항체는 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 HMGB1에 특이적인 총 항체이거나 또는 이의 순환 부분(순환 항체) 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분이며, HMGB1 특이적 항체의 수준이 높을수록 AIDS 또는 AIDS의 진행 상태로의 발병 위험이 높아지는 것인 시험관내 예후 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 샘플은 1차 또는 급성 감염 도중에 또는 만성 감염 도중에 얻은 것인 시험관내 예후 방법.
  8. 제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, HMGB1 특이적 항체의 양은, 고체 지지체 상에 코팅된 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질 또는 이의 유도체를 사용하여 EISA에 의해 측정하는 것인 시험관내 방법.
  9. 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 정량된 HMGB1 특이적 항체는 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 HMGB1에 특이적인 총 항체인 것인 시험관내 방법.
  10. HIV 감염 피험체에서 HIV 감염을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 상기 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 내에 포함되는 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질을 정량하는 단계를 포함하고, 정량을 위해 표적화되는 상기 HMGB1 단백질은 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 총 HMGB1이거나 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분인 것인 시험관내 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 HIV 감염 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플을 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 면역학적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  12. HIV에 감염된 것으로 알려진 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 HIV 바이러스 양(viral load)을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 상기 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 내에 포함되는 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질을 정량하는 단계를 포함하고, 정량을 위해 표적화되는 상기 HMGB1 단백질은 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 총 HMGB1이거나 또는 이의 순환 부분(순환 HMGB1) 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분이며, HMGB1 단백질이 많을수록 바이러스 양이 많은 것인 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 정량된 HMGB1을 HIV에 감염되지 않은 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 유래의 HMGB1의 양, 또는 상이한 시점에서 동일한 피험체로부터 얻은 생물학적 샘플 유래의 HMGB1의 양과 비교하는 것인 시험관내 방법.
  14. 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 피험체에서 급성 및/또는 만성 염증을 배제 또는 제어하기 위한 하나 이상의 진단 시험을 추가로 포함하는 것인 시험관내 방법.
  15. HIV 감염 피험체에서 HIV 감염에 대한 치료 효능을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, (a) 치료 도중 상이한 시점에서 상기 피험체로부터 얻은 샘플 내에 포함되는 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질을 정량하는 단계로서, 정량을 위해 표적화되는 상기 HMGB1 단백질은 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 총 HMGB1이거나 또는 이의 순환 부분(순환 HMGB1) 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분인 것인 단계, (b) 피험체에 대한 치료 효능을 결정하는 단계, 및 경우에 따라 (c) 치료 개시 전에 동일한 피험체의 샘플에 대해 얻어진 결과와 비교하는 단계를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  16. HIV 감염 피험체에서 AIDS의 진행 상태 또는 AIDS로의 진행 상태의 시험관내 예후 방법으로서, 감염 후에 상기 피험체로부터 얻은 샘플 내에 포함되는 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질을 정량하는 단계를 포함하고, 정량을 위해 표적화되는 상기 HMGB1 단백질은 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 총 HMGB1이거나 또는 이의 순환 부분(순환 HMGB1) 또는 이의 면역학적으로 복합된 부분이며, HMGB1 단백질 수준이 높을수록 AIDS 또는 AIDS의 진행 상태로의 발병 위험이 높아지는 것인 시험관내 예후 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 샘플은 1차 또는 급성 감염 도중에 또는 만성 감염 도중에 얻은 것인 시험관내 예후 방법.
  18. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제10항, 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, PBMC 또는 다른 체액인 것인 시험관내 방법.
  19. 제3항, 제4항, 제6항, 제10항, 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HIV는 HIV-1 또는 HIV-2인 것인 시험관내 방법.
  20. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제10항, 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험체는 인간인 것인 시험관내 방법.
  21. 제10항, 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 정량된 HMGB1 단백질은 산 처리로 샘플을 처리하여 샘플 중에서 발견되는 면역 복합체를 해리시킨 후에 얻어지는 총 HMGB1 단백질인 것인 시험관내 방법.
  22. 제1항, 제3항, 제4항, 제6항, 제10항, 제12항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산 처리는 샘플을 pH 1 내지 3의 산성 해리액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 시험관내 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 산성 해리액은 pH 1 내지 3의 글리신 용액인 것인 시험관내 방법.
  24. 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 조절에 사용하기 위한 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 결합하는 제제로서, 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 결합하는 제제와 HIV 감염 피험체를 접촉시키는 것인 제제.
  25. 제24항에 있어서, 상기 HMGB1에 결합하는 제제는 수지상 세포(DC)에서 자연 살해(NK) 세포 의존적인 HIV 복제 촉발을 억제하는 제제인 것인 제제.
  26. 경우에 따라 HIV 감염에 대한 추가의 활성 화합물과 함께, 인간에서 HIV 감염의 치료에 사용하기 위한 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 결합하는 제제.
  27. 경우에 따라 HIV 감염에 대한 추가의 활성 화합물과 함께, HIV 감염 피험체에서 HIV 저장소 세포를 감소시키는 약물로서 사용하기 위한 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 결합하는 제제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 HIV 저장소 세포는 HIV에 대해 감수성이고 이에 의해 감염될 수 있는, 혈액, 고형 조직 또는 점막과 같은 생물학적 조직으로부터 유래하는 세포인 것인 제제.
  29. 제28항에 있어서, 상기 세포는 뇌, 간, 비장, 편도선, 결절, 장연관 림프구 조직(GALT)으로부터 유래한 세포이고, 말초혈 세포, 림프구계 세포이거나, 또는 단핵구 유도 세포인 것인 제제.
  30. 제29항에 있어서, 상기 림프구계 세포는 T 세포 또는 CD4 T 세포인 것인 제제.
  31. 제29항에 있어서, 상기 단핵구 유도 세포는 대식세포 또는 수지상 세포인 것인 제제.
  32. 제24항, 제26항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 글리시리진;
    b) HMGB1을 특이적으로 차단하는 항체, 또는 HMGB1을 특이적으로 차단하는 능력을 보유한 항체의 단편, 또는 Fab, Fv, Fab2 단편; 및
    c) HMGB1에 결합할 수 있는 단리된 RAGE 또는 이의 단편
    으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제제.
  33. 제32항에 있어서, 상기 HMGB1을 특이적으로 차단하는 항체는 모노클로날 항체인 것인 제제.
  34. 제32항에 있어서, 상기 HMGB1을 특이적으로 차단하는 항체 또는 이러한 항체의 단편은 인간 또는 인간화된 항체 또는 단편인 것인 제제.
  35. 샘플에서 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질에 특이적인 총 항체를 정량하기 위한 키트로서,
    a) 천연 HMGB1 단백질 또는 이의 유도체;
    b) 피험체로부터 채취할 때 샘플 중에서 발견되는 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리시키기에 적합한 산성 해리액;
    c) 경우에 따라서, 중화 완충액; 및
    d) 경우에 따라서, HMGB1/특이적 항체 복합체에 결합하는 2차 항체를 포함하는 키트.
  36. 샘플에서 총 고 운동성 군 상자 1(HMGB1) 단백질을 정량하기 위한 키트로서,
    a) HMGB1 단백질 특이적 항체, 또는 HMGB1 단백질에 결합할 수 있는 이의 단편;
    b) 피험체로부터 채취할 때 샘플 중에서 발견되는 면역학적 HMGB1/항-HMGB1 항체 복합체를 해리시키기에 적합한 산성 해리액;
    c) 경우에 따라서, 중화 완충액; 및
    d) 경우에 따라서, HMGB1/특이적 항체 복합체에 결합하는 2차 항체를 포함하는 키트.
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