JP6889160B2 - 3段階酸解離酵素結合免疫吸着(tadelis)アッセイ法 - Google Patents
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Description
Moxness, M. et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 1005 (2003) 265-268)(非特許文献1)は、全インスリン抗体(IAB)およびIgクラスのインスリン抗体(IAB)に対する放射性リガンド結合アッセイ法を報告した。最初に、試験血清および対照血清を酸性にして、結合されたインスリンを解離させ、木炭を添加して血清インスリンを吸着させた。中和後、結合されたインスリンを含む木炭を遠心分離によって血清から除去した。各アッセイ法において、インスリンを抜き取った血清試料を、高レベルの非標識インスリンの存在下および非存在下で、放射性標識インスリンと共にインキュベーションして、それぞれ非特異的結合および全結合を決定した。
酸解離段階および溶液中での複合体形成段階を含むイムノアッセイ法(3段階酸解離酵素結合免疫吸着アッセイ法(TADELISアッセイ法))を用いて、タンパク質治療物質の(可溶型として分泌されるか、または流し出された)循環リガンド/標的を決定するための方法が、本明細書において報告される。TADELISアッセイ法において、初めて、酸解離/組換え段階が、循環リガンドの量を決定するためのイムノアッセイ法で使用された。
- 試料を酸処理に供する段階、
- 抗リガンド抗体および標識リガンド結合タンパク質を試料に添加することによって、
(i)抗リガンド抗体、
(ii)リガンド、および
(iii)標識リガンド結合タンパク質
を含む非共有結合複合体を溶液中で形成させる段階、ならびに
-複合体の量を決定し、それによって、リガンド結合タンパク質のリガンドの量を決定する段階。
- 試料を酸処理に供する段階、
- 最初に標識リガンド結合タンパク質を試料に添加(およびインキュベーション)して、標識リガンド結合タンパク質-リガンド二元複合体を形成させ、かつ二元複合体の形成後に抗リガンド抗体を試料に添加(およびインキュベーション)して、標識リガンド結合タンパク質-リガンド-抗リガンド抗体三元複合体を形成させることによって、
(i)抗リガンド抗体、
(ii)リガンド、および
(iii)標識リガンド結合タンパク質
を含む(非共有結合)三元複合体を溶液中で形成させる段階、ならびに
-(非共有結合)三元複合体の量を決定し、それによって、リガンド結合タンパク質のリガンドの量を決定する段階。
-試料を酸処理に供する段階、
-(検出可能な標識にコンジュゲートされている)標識リガンド結合タンパク質と共に試料をインキュベーションする段階、
-結合対の第1のメンバーにコンジュゲートされている(ポリクローナル)抗リガンド抗体と共に試料をインキュベーションする段階、
-(非共有結合複合体が、固体支持体の結合対の第1のメンバーを介してコンジュゲート/固定化されるように)結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている固体支持体に、試料を添加する段階、および
-固相に固定化された標識リガンド結合タンパク質の量を決定することによって、リガンド結合タンパク質のリガンドの量を決定する段階。
[本発明1001]
以下の順序で以下の段階を含む、試料中のリガンド結合タンパク質(治療物質)のリガンドの(総)量を決定するための方法:
- 該試料を酸処理に供する段階;
- 最初に標識リガンド結合タンパク質を該試料に添加して、標識リガンド結合タンパク質-リガンド二元複合体を形成させ、かつ該二元複合体の形成後に抗リガンド抗体を該試料に添加して、標識リガンド結合タンパク質-リガンド-抗リガンド抗体三元複合体を形成させることによって、
(i)抗リガンド抗体、
(ii)リガンド、および
(iii)標識リガンド結合タンパク質
を含む該三元複合体を溶液中で形成させる段階;ならびに
- 該三元複合体の量を決定し、それによって、該リガンド結合タンパク質のリガンドの量を決定する段階。
[本発明1002]
リガンド結合タンパク質に(特異的に)結合することができるリガンドの量を決定するためのものである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
試料が、血漿試料または血清試料である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
試料が、酸処理の前に希釈されない、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
複合体を形成させる段階が、酸処理した試料を、過剰量の標識リガンド結合タンパク質と共にインキュベーションすることによる、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
複合体を形成させる段階が、酸処理した試料を、最初に過剰量の標識リガンド結合タンパク質と共に、次に抗リガンド抗体と共にインキュベーションすることによる、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
複合体を形成させる段階において、標識リガンド結合タンパク質が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
抗リガンド抗体が、結合対の第1のメンバーにコンジュゲートされている、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
三元複合体を形成させる段階の後に、形成された該三元複合体を固体支持体上に固定化する段階を含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
固体支持体が、(抗リガンド抗体にコンジュゲートされた結合対の第1のメンバーと複合体を形成することができる)結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている、本発明1009の方法。
[本発明1011]
抗リガンド抗体がポリクローナル抗体である、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
以下の順序で以下の段階を含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法:
- 試料を酸処理に供する段階;
- 検出可能な標識にコンジュゲートされている標識リガンド結合タンパク質と共に該試料をインキュベーションする段階;
- 結合対の第1のメンバーにコンジュゲートされているポリクローナル抗リガンド抗体と共に該試料をインキュベーションする段階;
- 該結合対の第1のメンバーと共に非共有結合複合体を形成する結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている固体支持体に、該試料を添加する段階;および
- 固相に固定化された標識リガンド結合タンパク質の量を決定することによって、リガンド結合タンパク質のリガンドの量を決定する段階。
[本発明1013]
リガンド結合タンパク質が抗体である、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
結合対の第1のメンバーがビオチンであり、結合対の第2のメンバーがストレプトアビジンである、本発明1010〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
添加される標識リガンド結合タンパク質と添加される抗リガンド抗体の比が、分子量に基づいて、約8〜9:1である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
三元複合体が非共有結合複合体である、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
インビトロまたはインビボ起源の試料中の治療的抗体(tmAb)ならびに治療的mAbの各リガンド(tmAbのリガンドまたは短いリガンド)を解析するために、各アッセイ法が、特にtmAb開発の初期段階で必要である。しかし、初期の開発段階では、多くの場合、必要とされる特異的結合試薬、例えば、tmAbを決定するための抗イディオタイプ抗体またはtmAbリガンドを決定するためのリガンドの様々なエピトープに結合する抗体が入手可能であることはめったにない。
本明細書において報告される方法を用いると、「薬物特異的」標的濃度を検出することが可能である。「バイオマーカー」アッセイ法(市販されているか、または様々な抗体/クローンに基づく)が同じ標的を検出するかどうかを明らかにするためのさらなる努力は、必要ではない。さらに、必要とされる試薬は、プロジェクトの早期に入手可能であり、これにより、プロジェクトを早期に支援することが可能になる(薬物は入手可能であり、ポリクローナル抗体は、適度なスケジュールの範囲内で入手可能である)。したがって、本明細書において報告される方法(=TADELISアッセイ法)は、広く応用できる。
リガンド結合タンパク質:シュードモナス菌外毒素にコンジュゲートされた抗メソテリン抗体
抗リガンド抗体:ポリクローナル抗メソテリン抗体
-酸解離(試料10μL、0.1mol/Lグリシン溶液50μL、pH2、30分)、
-ジゴキシゲニンにコンジュゲートされたモノクローナル抗メソテリン抗体を含むTris/LowCross緩衝液(登録商標)50μLの添加および1時間のインキュベーション
-マルチウェルプレートのウェルへの添加および1時間のインキュベーション、
-ビオチンにコンジュゲートされたポリクローナル抗メソテリン抗体調製物を含むLowCross緩衝液(登録商標)200μLの添加および20分間のインキュベーション、
-ストレプトアビジンでコーティングされたマルチウェルプレートのウェルへの溶液の添加および30分間のインキュベーション、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-HRPにコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を含む溶液(50mU)を添加する段階、
-プレートを40分間インキュベーションする段階、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-読み取り値を生じさせるために基質溶液を添加する段階、
-プレートをインキュベーションする段階、
-吸光度の値の決定、
-検量線を用いて、分析物濃度を決定する段階。
(a)
- 試料を酸処理に供する段階、
- 抗リガンド抗体および標識リガンド結合タンパク質を試料に添加することによって、
(i)抗リガンド抗体、
(ii)リガンド、および
(iii)標識リガンド結合タンパク質
を含む非共有結合複合体を溶液中で形成させる段階、ならびに
- 複合体の量を決定する段階、
(b)
-リガンドを含まない試料(すなわち、段階(a)の検出限界より少ない量のリガンドを含む)に、定められているが異なる量のリガンドを添加することによって得られる少なくとも2種の試料を用いて段階(a)を実施することによって、検量線を定める段階、
(c)
- 段階(a)および段階(b)の結果を用いて、リガンド結合タンパク質のリガンドの量を決定する段階。
- 捕捉抗体に対する検出抗体の重量比が約1.7であり、薬物濃度が5μg/mLもしくはそれ以下、1つの態様においては5μg/mL〜0.01μg/mLの範囲、別の態様においては3μg/mL〜0.6μg/mLの範囲である、および/または
- 捕捉抗体に対する検出抗体の重量比が約8.85であり、薬物濃度が18μg/mLもしくはそれ以下、1つの態様においては18μg/mL〜0.01μg/mLの範囲、別の態様においては15μg/mL〜0.6μg/mLの範囲である、および/または
- 捕捉抗体に対する検出抗体の重量比が約44であり、薬物濃度が80μg/mLもしくはそれ以下、1つの態様においては80μg/mL〜0.01μg/mLの範囲、別の態様においては75μg/mL〜0.6μg/mLの範囲である。
- 捕捉抗体に対する検出抗体の重量比が約1.7であり、検出抗体濃度が約14nMであり、薬物濃度が5μg/mLもしくはそれ以下、1つの態様においては5μg/mL〜0.01μg/mLの範囲、別の態様においては3μg/mL〜0.6μg/mLの範囲である、および/または
- 捕捉抗体に対する検出抗体の重量比が約8.85であり、薬物濃度が18μg/mLもしくはそれ以下、1つの態様においては18μg/mL〜0.01μg/mLの範囲、別の態様においては15μg/mL〜0.6μg/mLの範囲である、および/または
- 捕捉抗体に対する検出抗体の重量比が約44であり、検出抗体濃度が約338nMであり、薬物濃度が80μg/mLもしくはそれ以下、1つの態様においては80μg/mL〜0.01μg/mLの範囲、別の態様においては75μg/mL〜0.6μg/mLの範囲である。
以下で、一般に公知である3種の異なるアッセイ形式を、できる限りTADELISアッセイ法に合わせた。特に、今までに報告されていない、リガンド検出アッセイ法における酸解離段階の使用を、これらのアッセイ法に含めた。
Fujirebio Diagnostics, Inc.(Malvern, PA, USA)社製の市販のメソテリンアッセイ法Mesomark(登録商標)を、製造業者の取扱い説明書に従って実施した。
-血清試料の希釈(1:101、試料10μLおよび緩衝液1mL)、
-捕捉モノクローナル抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルに希釈試料(100μL)を添加する段階、
-振盪しながら(700rpm)プレートを室温で約60分間インキュベーションする段階、
-上清を除去し、ウェルを入念に洗浄する段階、
-HRPにコンジュゲートされた第2のモノクローナル抗体を含む溶液100μLを添加する段階、
-振盪しながら(700rpm)プレートを室温で約60分間インキュベーションする段階、
-上清を除去し、ウェルを入念に洗浄する段階、
-読み取り値を生じさせるために基質溶液100μLを添加する段階、
-振盪しながら(700rpm)プレートを室温で約15分間インキュベーションする段階、
-塩酸(100μL、1%(w/v))の添加によって反応を停止させる段階、
-吸光度の値の決定、
-検量線を用いて、分析物濃度を決定する段階。
この比較例では、TADELISアッセイ法の場合と同じ試薬を使用した。
-酸解離(試料10μL、0.1mol/Lグリシン溶液50μL、pH2、30分)、
-1つはビオチンにコンジュゲートされ、1つはジゴキシゲニンにコンジュゲートされている、標的の異なるエピトープに結合する2種の抗体溶液(mAbおよびpAb)を含むTris/LowCross緩衝液(登録商標)50μL(LowCross緩衝液(登録商標)2100μL+0.5M Tris-HCl(pH8.5)900μL)およびLowCross緩衝液(登録商標)200μLの、酸解離物への添加、ならびに1時間のインキュベーション、
-ストレプトアビジンでコーティングされたマルチウェルプレートのウェルへの添加および1時間のインキュベーション、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-HRPにコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を含む溶液(50mU)を添加する段階、
-プレートを約1時間インキュベーションする段階、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-読み取り値を生じさせるために基質溶液を添加する段階、
-プレートをインキュベーションする段階、
-吸光度の値または蛍光単位の決定、
-検量線を用いて、分析物濃度を決定する段階。
この比較例では、TADELISアッセイ法の場合と同じ試薬を使用した。
-ストレプトアビジンでコーティングされたマルチウェルプレートのウェルを、ビオチン標識ポリクローナル抗メソテリン抗体と共にインキュベーションした(500ng/mL;1.25時間)、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-酸解離(試料10μL、0.1mol/Lグリシン溶液50μL、pH2、30分)、
-Tris/LowCross緩衝液(登録商標)50μL(LowCross緩衝液(登録商標)2100μL+0.5M Tris-HCl(pH8.5)900μL)およびLowCross緩衝液(登録商標)200μLの、酸解離物への添加ならびにマルチウェルプレートのウェルへの添加、ならびに1時間のインキュベーション、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-ジゴキシゲニン標識モノクローナル抗メソテリン抗体を含む溶液(500ng/mL)の添加および1時間のインキュベーション、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-HRPにコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を含む溶液(50mU)を添加する段階、
-プレートを約1時間インキュベーションする段階、
-上清を除去し、ウェルを洗浄する段階、
-読み取り値を生じさせるために基質溶液を添加する段階、
-プレートをインキュベーションする段階、
-吸光度の値の決定、
-検量線を用いて、分析物濃度を決定する段階。
下記の表から認めることができるように、本明細書において報告されるTADELISアッセイ法は、他のアッセイ形式と比較して、使用試薬の(プロジェクトの継続期間における)早期の入手しやすさ、薬物を含有する試料の平均回収率、扱われる種の範囲、および時間の点で、有利である。
本明細書において報告される方法
ヒトメソテリンを用いて100%のウサギプール血漿中で陽性対照標準物質を調製して、50nM〜0nMの濃度範囲(50.0nM、21.45nM、9.21nM、3.95nM、1.70nM、0.73nM、0.31nM、および0nM)の検量線を作成した。較正物質最終濃度は、ウサギプール血漿を用いる一対一の希釈によって実現した(希釈倍率=2)。次の濃度、すなわち25nM、17.5nM、12.5nM、0.469nM、および0.156nMの追加の品質管理試料を、100%ウサギプール血漿中で調製した(個別希釈)。
Claims (13)
- 以下の順序で以下の段階を含む、試料中の治療的抗体のリガンドの総量を決定するための方法:
- 該試料を酸処理に供する段階;
- 最初に試料中の予想されるリガンドの量に対して5〜700倍の過剰量の標識された治療的抗体を該試料に添加して、該酸処理された試料を該過剰量の標識された治療的抗体と共にインキュベーションして、標識治療的抗体-リガンド二元複合体を形成させ、かつ該二元複合体の形成後にポリクローナル抗リガンド抗体を該試料に添加して、標識治療的抗体-リガンド-抗リガンド抗体三元複合体を形成させることによって、
(i)抗リガンド抗体、
(ii)リガンド、および
(iii)標識された治療的抗体
を含む該三元複合体を溶液中で形成させる段階;ならびに
- 該三元複合体の量を決定し、それによって、該治療的抗体のリガンドの量を決定する段階。 - 治療的抗体に特異的に結合することができるリガンドの量を決定するためのものである、請求項1記載の方法。
- 試料が、血漿試料または血清試料である、請求項1または2記載の方法。
- 試料が、酸処理の前に希釈されない、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 複合体を形成させる段階が、酸処理した試料を、最初に試料中の予想されるリガンドの量に対して過剰量の標識された治療的抗体と共に、次に抗リガンド抗体と共にインキュベーションすることによる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 複合体を形成させる段階において、標識された治療的抗体が、検出可能な標識にコンジュゲートされている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 抗リガンド抗体が、結合対の第1のメンバーにコンジュゲートされている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 三元複合体を形成させる段階の後に、形成された該三元複合体を固体支持体上に固定化する段階を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 固体支持体が、抗リガンド抗体にコンジュゲートされた結合対の第1のメンバーと複合体を形成することができる、結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている、請求項8記載の方法。
- 以下の順序で以下の段階を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法:
- 試料を酸処理に供する段階;
- 検出可能な標識にコンジュゲートされている標識された治療的抗体と共に該試料をインキュベーションする段階;
- 結合対の第1のメンバーにコンジュゲートされているポリクローナル抗リガンド抗体と共に該試料をインキュベーションする段階;
- 該結合対の第1のメンバーと共に非共有結合複合体を形成する結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている固体支持体に、該試料を添加する段階;および
- 固相に固定化された標識された治療的抗体の量を決定することによって、治療的抗体のリガンドの量を決定する段階。 - 結合対の第1のメンバーがビオチンであり、結合対の第2のメンバーがストレプトアビジンである、請求項9または10記載の方法。
- 添加される標識された治療的抗体と添加される抗リガンド抗体の比が、分子量に基づいて、8〜9:1である、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 三元複合体が非共有結合複合体である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
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