KR20130029166A

KR20130029166A - 어류 껍질 유래의 펩타이드를 함유하는 항알츠하이머 활성의 약학 조성물 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR20130029166A
Application number: KR1020110092393A
Authority: KR
Inventors: 변희국; 전중균; 이정권
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단; 재단법인 강릉과학산업진흥원
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2013-03-22
Also published as: KR101297339B1

Abstract

본 발명에서는 어류의 껍질을 이루는 단백질의 가수분해산물 및 그 일부분인 올리고펩타이드(oligo-peptide)를 유효 성분으로 함유하는 항알츠하이머 약학 조성물 및 건강기능식품을 개시한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 알츠하이머 질병을 야기하는 베타-세크레타아제의 활성을 억제하는데, 작게는 디-펩타이드로 구성되어 있기 때문에, 경구 투여시에도 생체내의 가수분해효소에 의한 분해가 일어나지 않을 뿐만 아니라 생체내에서의 쉽게 흡수, 소화되기 때문에 생리적 활성 효과가 양호할 것으로 기대된다. 특히, 생체에서 유래한 성분이기 때문에 부작용의 우려가 없어 안전성도 양호할 뿐만 아니라, 대부분 폐기되었던 어류의 껍질로부터 얻어진 것이므로 수산부산물을 적극적으로 활용할 수 있다.

Description

어류 껍질 유래의 펩타이드를 함유하는 항알츠하이머 활성의 약학 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical Composition and Functional Food Having Anti-Alzheimer Activity Containing Peptides from Fish Skins}

본 발명은 항알츠하이머 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 어류 껍질 유래의 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항알츠하이머 조성물에 관한 것이다.

삼면이 바다로 둘러싸인 대한민국의 경우, 바다에서 서식하고 있는 생물들에 함유되어 있는 물질을 활용하여 의약품, 건강기능식품 또는 화장품과 같은 기능성 제품의 활성 성분으로의 가능성에 대하여 연구와 개발을 집중할 필요성이 있다. 특히, 종래의 화학합성법에 따른 새로운 의약품 개발의 지연이나 이들 의약품이 지닌 부작용을 고려해 볼 때, 바다에 널리 서식하고 있는 해양 생물에 포함되어 있는 각종 생리 활성 성분을 활용하여 새로운 항생물질은 물론이고 항암제, 당뇨병 치료제와 같은 난치병의 치료 및 예방을 위한 유효 성분으로의 가능성에 대해서 현재보다 훨씬 많은 연구와 개발이 수행되어야 한다.

그런데 수산물 가공 공장을 비롯하여 수산물을 가공 처리한 후에 필요가 없는 부산물이 많이 발생하고 있지만, 이에 대한 활용 대책이 거의 없는 관계로 현재는 대부분의 수산부산물이 폐기 처리되고 있는 실정이다. 이러한 부산물은 주로 수산물의 껍질, 어두, 내피, 내장, 어골(魚骨) 등인데, 대부분 사료로 사용되거나 폐기되는 관계로 자원의 효율적인 활용이 이루어지지 못하여 환경오염을 유발하고 있는 실정이었다. 하지만, 이와 같은 수산가공 부산물 중에는 단백질, 탄수화물 및 지방과 같은 유용한 생리활성 물질이 다량 함유되어 있어 이들 물질을 활용하기 위한 방안이 모색되고 있다.

이에 따라, 최근에는 해양 생물에서 유래된 단백질 가수분해산물을 이용하여, 다양한 산업분야에 응용하고자 하는 연구도 많이 이루어지고 있다. 특히, 해양 생물에서 유래한 단백질 가수분해산물의 경우, 항산화성, 항고혈압성, 항암성 및 항염증 등 다양한 약리학적 효과가 있다는 연구 결과가 보고되고 있어서 이러한 가수분해산물은 유용한 생리활성물질 자원으로서의 가치가 새롭게 부각되고 있다.

홍어류(Skate, Raja kenojei)는 홍어목, 가오리과에 속하는 편평한 체형의 연골어류를 지칭하는데, 열대에서 북극 근해의 수역에 걸쳐 얕은 곳에서 2,700 미터 이상의 수심까지 세계 전역에서 발견된다. 우리나라에서는 예로부터 목포 등지에서는 홍어회와 같은 전통 발효식품으로 애용되고 있어서 홍어 발효식품에 대한 영양학적 분석에 대한 연구가 주로 이루어지고 있었으며, 홍어 발효식품으로 사용되지 않는 내부 장기나 껍질 등은 전량 폐기되고 있는 실정이었다. 하지만, 홍어 및 홍어 발효식품에는 안세린(anserine), 타우린(taurine) 및 알라닌/리신 등의 아미노산과 같이 생리활성 성분이 다량 함유되어 있다는 점이 알려지면서 홍어로부터 생리활성 성분을 얻고자 하는 연구나 특허가 보고되고 있다.

예를 들어, 대한민국등록특허 제607371호(특허문헌 1)에서는 홍어의 가식부, 내장, 연골 및 뇌 부위의 열수추출물이 항암 효과가 있다고 개시하고 있고, 홍어의 내장 및 가식부의 열수추출물이 ACE(angiotensin Converting Enzyme)의 활성을 저해하는 등 항고혈압 활성이 있다는 연구도 보고된 바 있다(Lim, H.S. 2003. ACE Inhibitory Materials from Raja kenojei. Korean J. Life Sci., 13, 668-674, 비특허문헌 1; 대한민국공개특허 제2005-93477호, 특허문헌 2)). 아울러, 숙성된 홍어 껍질에서 분리된 항균성 펩타이드인 kenojeinin Ⅰ은 Bacillus subtilis, E. coli 등과 같은 미생물의 생육을 제어하는 효과가 있다는 연구(Cho, S. H. et al. 2005. Kenojeinin Ⅰ, antimicrobial peptide isolated from the skin of the fermented skate, Raja kenojei. Food Hydrocolloids, 26, 581-587, 비특허문헌 2), 홍어에서 추출한 간유에는 LDL-cholesterol을 감소시키고 HDL-cholesterol을 증가시키며 중성지방을 저하사여 관상동맥질환을 예방하는데 효과가 있는 EPA와 DHA와 같은 n-3 지방산이 상당량 함유되어 있다(NAM, H.K., Lee, M.K. 1995. Studies on the fatty acids and cholesterol level of Raja Skate. J. Korean Oil Chem. Soc., 12, 55-58, 비특허문헌 3).

한편, 연어(salmon, Oncorhynchus keta)는 연어목 연어과의 바닷물고기로서 가을에 산란을 위해 강으로 거슬러 올라가는 소하어류이다. 어린 연어는 봄에 부화된 지 몇 주 후에 바다로 돌아간 뒤 3~4년이 지나면 성숙하여 원래 하천으로 회귀한다. 우리나라의 경우에는 동해와 남해로 흐르는 일부 하천에서 발견되며, 일본, 러시아, 북아메리카 등지에 분포한다. 일본에서는 연어를 염장품, 젓갈, 훈제품, 건제품과 같은 식용으로 활용되고 있으나 우리나라에서는 식용으로서의 활용도가 크지 않다.

하지만 최근에 연어가 가지는 생리적 활성에 대한 연구 결과가 특허가 일부 발표되고 있다. 연어 정자에 함유되어 있는 nucleoprotein인 프로타민(protamine)이 Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes와 같은 그람 양성균, Pseudomonas aeruginosa, E. coli와 같은 그람 음성균, Candia utilis와 같은 효모에 대하여 항균 활성을 보이며 항산화 활성을 보인다는 연구 결과가 보고되었다(Joo. D.S. et al. 2000. Antimicrobial and Antioxidant Activity of Protamine Prepared from Salmon Sperm, Korean J. Food Sci. Technol. 32, 902-907, 비특허문헌 4). 또한 대한민국등록특허 제1048265호(특허문헌 3) 및 제1048271호(특허문헌 4)에서는 대한민국 인근 해역에서 포획되는 연어의 살 건조 분말이 고지혈증이나 동맥경화증의 예방이나 치료에 효과가 있다고 설명하고 있다. 하지만, 국내에서도 식용으로도 널리 활용되지 못하고 있는 연어를 의약이나 식품 등에 활용할 필요성이 크게 있다.

한편, 연체동물문, 두족강, 이새아강, 십각목(Teuthoidea)에 속하는 오징어(squid, cuttlefish, Todarodes pacificus)는 해양 연체동물의 총칭으로서 우리나라에서는 식용으로 섭취하는 대표적인 해양 생물의 하나이다. 오징어는 인간 질병에 대한 모델 동물로도 활용되고 있을 뿐만 아니라, 오징어가 내뿜는 먹물을 활용하여 화장품으로서, 예를 들면 염모제나 파머 조성물의 구성 성분으로도 응용되고 있다. 특히 최근에는 오징어를 활용하여 약품 등의 활성 성분으로 가능성에 대한 시도가 이루어지고 있다.

대한민국공개특허 제2008-94983호(특허문헌 5)에서는 오징어의 뼈 분말이 위궤양, 십이지장궤양, 위염, 위경련과 같은 위장 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물이나 건강기능식품의 활성 성분으로 사용될 수 있다고 보고하고 있고, 대한민국등록특허 제1017734호(특허문헌 6) 및 대한민국공개특허 제2010-0056140호(특허문헌 7)에서는 오징어의 육이나 지느러미 분말을 알코올 등의 유기용매를 사용하여 분리한 분획물이 고지혈증이나 동맥경화증의 치료 및 예방에 효과가 있다고 개시하고 있다. 최근의 보고에 따르면 오징어의 껍질로부터 분리된 펩타이드가 안지오텐신 Ⅰ(angiotensin Ⅰ)으로부터 혈관수축작용 등의 생리적 효과를 가지는 안지오텐신 Ⅱ(angiotensin Ⅱ)로 전환시키는 안지오텐신 Ⅰ 전환 효소(angiotensin Ⅰ- converting enzyme, ACE)의 활성을 저해한다(Lee. J.K. et al. 2011. Purification of Angiotensin Ⅰ-Converting Enzyme Inhibitory Peptide from Squid Todarodes pacificus Skin, Kor J. Fish Aquat. Sci. 32, 118-125, 비특허문헌 5)

하지만, 아직까지도 홍어, 오징어나 연어는 발효 제품이나 건조 제품과 같은 식용으로 주로 애용되고 있는 실정이다. 따라서 식용으로 사용되지 못하는 홍어 껍질, 오징어 껍질이나 연어 껍질에는 다량의 단백질을 함유하고 있는 등, 활용 가치가 있음에도 불구하고, 수산가공 부산물로서 대부분 폐기되고 있는 실정이다. 이에 따라, 홍어 껍질, 오징어 껍질 및 연어 껍질과 같은 수산가공 부산물 중에 포함되는 생리활성 물질의 기능을 연구하여, 여타 산업 분야로 활용될 수 있는 방안을 모색할 필요가 있다.

1. 대한민국등록특허 제607371호 2. 대한민국공개특허 제2005-93477호 3. 대한민국등록특허 제1048265호 4. 대한민국등록특허 제1048271호 5. 대한민국공개특허 제2008-94983호 6. 대한민국등록특허 제1017734호 7. 대한민국공개특허 제2010-0056140호

1. Lim, H.S. 2003. ACE Inhibitory Materials from Raja kenojei. Korean J. Life Sci., 13, 668-674 2. Cho, S. H. et al. 2005. Kenojeinin Ⅰ, antimicrobial peptide isolated from the skin of the fermented skate, Raja kenojei. Food Hydrocolloids, 26, 581-587 3. NAM, H.K., Lee, M.K. 1995. Studies on the fatty acids and cholesterol level of Raja Skate. J. Korean Oil Chem. Soc., 12, 55-58 4. Joo. D.S. et al. 2000. Antimicrobial and Antioxidant Activity of Protamine Prepared from Salmon Sperm, Korean J. Food Sci. Technol. 32, 902-907 5. Lee. J.K. et al. 2011. Purification of Angiotensin Ⅰ-Converting Enzyme Inhibitory Peptide from Squid Todarodes pacificus Skin, Kor J. Fish Aquat. Sci. 32, 118-125

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 어류의 껍질에 함유되어 있는 단백질로부터 유래한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항알츠하이머 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대부분 폐기 처분되고 있는 어류 껍질에 함유되어 있는 단백질 유래의 펩타이드를 식품공학적인 조성물, 예를 들어 건강기능식품 등에 활용하기 위한 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 이점 및 목적은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 첨부하는 도면을 통해서 더욱 분명해질 것이다.

본 발명은 현재 대부분 폐기 처리되고 있는 어류 껍질에서 유래한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 항알츠하이머 효과를 갖는 약리적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 2에서 서열번호 21의 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 예방 또는 치료 효과를 가지는 약학 조성물을 제공한다.

상기 서열번호 12 내지 서열번호 16의 펩타이드들은 연어 껍질을 구성하는 단백질을 파파인으로 처리한 가수분해산물이거나 이 가수분해산물의 일부이며, 상기 서열번호 17 내지 서열번호 21의 펩타이드들은 오징어 껍질을 구성하는 단백질을 펩신으로 처리한 가수분해산물이거나 이 가수분해산물의 일부일 수 있다.

전술한 펩타이드는 베타-세크레타아제(β-secretase) 활성 억제 효과를 통하여 항알츠하이머 활성을 가지면, 바람직하게는 상기 펩타이드는 상기 약학 조성물 중에 0.001 ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

전술한 펩타이드 중에서 C-말단에 로이신이 결합된 펩타이드를 유효성분으로 함유할 수 있는데, 특히 바람직하게는 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 15 내지 서열번호 17, 서열번호 19 또는 서열번호 21의 펩타이드를 유효 성분으로 함유하며, 특히, 서열번호 7, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 19 및 서열번호 21의 펩타이드 중에서 선택된다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면 서열번호 2에서 서열번호 21의 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에서는 현재 대부분 폐기 처분되고 있는 연어 껍질, 오징어 껍질 및 홍어 껍질의 체성분 중에서 가장 많은 함량을 가지는 단백질의 가수분해 산물인 펩타이드 성분이 대표적인 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질병과 밀접하게 관련된 베타-세크레타아제의 활성을 크게 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

이에 따라, 이들 어류의 껍질로부터 추출된 베타-세크레타아제의 활성을 억제하는 활성 성분인 펩타이드를 유효성분으로 사용하는 경우, 해당 활성 물질의 순도에 따라 약리학적 조성물과 같은 의약품은 물론이고, 건강 보조 식품 등으로 활용할 수 있어서, 건강 기능성 식품을 포함한 식품 산업 및 의약 산업에 응용될 경우 그 가치가 매우 높을 것으로 기대된다.

특히, 본 발명에 따라 생리적 활성이 확인된 펩타이드는 구성 아미노산이 10개 안팎의 올리고펩타이드 또는 그보다 적은 디펩타이드/트리펩타이드/테트라펩타이드와 같은 저분자 펩타이드로서, 경구 투여시에 체내 가수분해효소에 의하여 분해되지 않고, 안전성이 뛰어나며 체내 흡수율이나 소화율이 높을 것이기 때문에 의약품이나 건강기능식품 중의 유효 성분으로 응용이 용이할 것으로 예측된다.

이에 따라, 현재 수산가공 부산물로서 대부분 폐기 처분되고 있는 어류 껍질을 산업적으로 응용할 수 있고, 생체에서 유래한 성분으로서 인체에 대해서도 부작용이 없이 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 연어 껍질을 마쇄한 뒤에 다양한 단백질 가수분해효소로 처리한 산물의 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정한 그래프로서, 파파인(Papain) 가수분해산물의 활성이 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따라 연어 껍질의 파파인 가수분해산물에 대하여 칼럼 크로마토그래피로 분리한 결과를 도시한 것이다. (A)는 3개의 분획 성분(1차 분획 성분)을 보여주는 그래프이고, (B)는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 분리된 각 분획성분의 베타-세크레타아제의 저해 활성을 측정한 그래프로서, F1 분획 성분이 저해 활성 효과가 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따라 연어 껍질의 파파인 가수분해산물의 1차 분획성분 중 베타-세크레타아제의 저해 활성이 가장 뛰어난 분획 성분을 다시 HPLC로 분리한 결과를 도시한 것이다. (A)는 HPLC에 의하여 8개의 분획성분(2차 분획성분)으로 분리된다는 것을 보여주는 그래프이고, (B)는 HPLC에 의하여 분리된 각 분획성분의 베타-세크레타아제의 저해 활성을 측정한 그래프로서, 3번째 분획성분이 저해 활성이 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 4는 HPLC 분석에서 가장 우수한 3번째 분획을 다시 재-분리 정제한 결과로서, (A)는 1개의 분획 성분이 얻어졌다는 것을 보여주는 그래프이고, (B)는 이 분획 성분의 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 5는 HPLC 분석에서 가장 우수한 베타-세크레타아제 저해 활성을 보인 연어 껍질 유래의 가수분해산물 분획성분을 대상으로 MS/MS 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 오징어 껍질을 마쇄한 뒤에 다양한 단백질 가수분해효소로 처리한 산물의 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정한 그래프로서, 펩신(Pepsin) 가수분해산물의 활성이 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따라 오징어 껍질의 펩신 가수분해산물에 대하여 칼럼 크로마토그래피로 분리한 결과를 도시한 것이다. (A)는 6개의 분획 성분(1차 분획 성분)을 보여주는 그래프이고, (B)는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 분리된 각 분획성분의 베타-세크레타아제의 저해 활성을 측정한 그래프로서, F3 분획 성분이 저해 활성 효과가 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따라 오징어 껍질의 펩신 가수분해산물의 1차 분획성분 중 베타-세크레타아제의 저해 활성이 가장 뛰어난 분획 성분을 다시 HPLC로 분리한 결과를 도시한 것이다. (A)는 HPLC에 의하여 7개의 분획성분(2차 분획성분)으로 분리된다는 것을 보여주는 그래프이고, (B)는 HPLC에 의하여 분리된 각 분획성분의 베타-세크레타아제의 저해 활성을 측정한 그래프로서, 5번째 분획성분(E)이 저해 활성이 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 9는 HPLC 분석에서 가장 우수한 5번째 분획을 다시 재-분리 정제한 결과로서, (A)는 1개의 분획 성분이 얻어졌다는 것을 보여주는 그래프이고, (B)는 이 분획 성분의 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 10은 HPLC 분석에서 가장 우수한 베타-세크레타아제 저해 활성을 보인 오징어 껍질 유래의 가수분해산물 분획성분을 대상으로 MS/MS 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 홍어 껍질을 마쇄한 뒤에 다양한 단백질 가수분해효소로 처리한 산물의 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정한 그래프로서, 뉴트라제(Neutrase) 가수분해산물의 활성이 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 12는 본 발명의 다른 실시예에 따라 홍어 껍질 유래 단백질로부터 뉴트라제 처리한 가수분해산물에 대하여 칼럼 크로마토그래피로 분리한 결과를 도시한 것이다. (A)는 4개의 분획 성분(1차 분획 성분)을 보여주는 그래프이고, (B)는 칼럼 크로마토그래피에 의하여 분리된 각 분획성분의 베타-세크레타아제의 저해 활성을 측정한 그래프로서, F4 분획 성분이 저해 활성 효과가 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 13은 본 발명의 다른 실시예에 따라 홍어 껍질의 뉴트라제 가수분해산물의 1차 분획성분 중 베타-세크레타아제의 저해 활성이 가장 뛰어난 분획 성분을 다시 HPLC로 분리한 결과를 도시한 것이다. (A)는 HPLC에 의하여 4개의 분획성분(2차 분획성분)으로 분리된다는 것을 보여주는 그래프이고, (B)는 HPLC에 의하여 분리된 각 분획성분의 베타-세크레타아제의 저해 활성을 측정한 그래프로서, 2번째 분획성분이 저해 활성이 가장 뛰어나다는 것을 보여준다.
도 14는 HPLC 분석에서 가장 우수한 2번째 분획을 다시 재-분리 정제한 결과로서, (A)는 1개의 분획 성분이 얻어졌다는 것을 보여주는 그래프이고, (B)는 이 분획 성분의 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 15는 HPLC 분석에서 가장 우수한 베타-세크레타아제 저해 활성을 보인 홍어 껍질 유래의 분획성분을 대상으로 MS/MS 분석 결과를 도시한 그래프이다.

본 발명자들은 현재 대부분이 폐기 처분되고 있는 어류 유래의 껍질에 다량의 단백질 성분을 포함하고 있다는 점을 고려하여, 이들 성분의 생체 활성 효과를 연구하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명은 어류 껍질에서 유래된 펩타이드, 아미노산이 대략 10개인 올리고펩타이드, 특히 바람직하게는 2개 내지 6개 정도의 아미노산으로 구성되는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드 성분이 알츠하이머 질병과 밀접한 관련이 있는 베타-세크레타아제 활성을 억제한다는 점을 규명한 것에 있다.

파킨슨병, 알츠하이머 질병, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 등과 같은 퇴행성 뇌질환은 현대 의학에서도 해결하고 있지 못하는 난치병들이다. 그 중에서도 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)은 노인성 치매(senile dementia)의 주요 원인으로서, 주로 65세 이상의 노인들에게 발병하지만, 드물게는 그보다 훨씬 이른 연령에서도 조발성 알츠하이머 질병(early-onset Alzheimer) 역시 보고되고 있다.

알츠하이머 질병을 앓고 있는 환자는, 초기에는 단기간의 기억 상실에서부터 감정의 기복, 언어 능력의 상실 및 장기간 기억 손상을 거쳐 최종적으로는 사망에 이르게 된다. 현재까지 알츠하이머 질병을 치료하기 위한 효율적인 방법은 알려져 있지 않으며, 운동이나 균형 있는 식습관 등을 통하여 알츠하이머 질병을 어느 정도 예방할 수 있는 정도이다. 특히, 급속한 노령화가 진행되고 있는 국내의 추세를 고려해 볼 때, 노인성 치매의 주원인인 알츠하이머 질병을 비롯한 퇴행성 뇌질환을 효율적으로 예방, 치료할 수 있는 제제를 신속하게 개발할 필요성이 제기된다.

알츠하이머 질병의 원인과 관련해서는 크게 ⅰ) 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 합성이 저하되기 때에 야기된다는 가설(아세틸콜린 가설, cholinergic hypothesis), ⅱ) 뇌에서 아밀로이드 펩타이드가 축적되는 것이 원이이라는 가설(아밀로이드 가설, amyloid hypothesis), ⅲ) 과도하게 인산화된 타우 단백질(tau protein)의 이상으로 알츠하이머 질병이 개시된다는 가설(tau hypothesis)이 제기되고 있고, 그 중에서도 아밀로이드 가설이 폭넓게 지지를 받고 있다.

아밀로이드 가설에 따르면, 알츠하이머 질병의 가장 중요한 원인으로서 40~42개의 아미노산으로 구성되는 베타-아밀로이드(amyloid β peptide, Aβ)가 뇌세포에 축적되고 이로 인하여 신경 세포를 구성하는 뉴런의 산화적 손상이 야기되어 최종적으로 치매에 이르는 것으로 여겨지고 있다. 베타-아밀로이드는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)의 단백질 분해에 의하여 생성된다. 아밀로이드 전구체 단백질의 분해와 관련해서 3개의 단백질 분해효소(proteolytic enzyme), 즉 알파-세크레타아제(α-secretase), 베타-세크레타아제(β-secretase) 및 감마-세크레타아제(γ-세크레타아제)가 관여한다.

이를 보다 구체적으로 설명하면, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 단일한 막관통 단백질(trans-membrane protein)로서, 590~680개의 아미노산으로 이루어진 세포외 아미노말단 도메인(extracellular N-terminal domain)과 세포내 신호 전달 서열(intracellular signal transduction sequence)을 포함하는 약 55개의 아미노산으로 구성된 세포질 테일(cytoplasmic tail)로 구성된다. 이와 같은 아밀로이드 전구체 단백질 유전자의 전사 RNA(mRNA)는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)을 통하여 8개의 동소체(isoform)를 형성하며, 그 중에서 3개의 동소체가 뇌에 주로 존재한다.

아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 크게 2개의 경로를 거쳐 단백질 분해 프로세싱(processing)을 거친다. 우선 알파-세크레타아제는 아밀로이드 전구체 단백질의 베타-아밀로이드 도메인의 17번째 아미노산을 절단하여 상대적으로 큰 수용성 N-말단 단편(APPsα)과 대략 10 KDa의 비-아밀로이드형 C-말단 단편(C83)을 형성하고, 이들 단편이 감마-세크레타아제에 의하여 추가적으로 분해되어 비-아밀로이드형 펩타이드(P3)를 생성한다. 또 하나의 선택적 경로로서, 베타-세크레타아제는 아밀로이드 전구체 단백질의 베타-아밀로이드 도메인 내에서 이 전구체 단백질을 절단하여, 대략 100-KDa의 짧은 수용성 N-말단 단편(APPsβ)과 아밀로이드 생성형의 대략 12-KDa의 C-말단 단편(C99)을 생성하고, 감마-세크레타아제에 의하여 C99 단편을 추가로 절단함으로써 베타-아밀로이드가 생성되는데, 감마-세크레타아제에 의하여 절단되는 부위에 따라 40개의 아미노산으로 구성되는 베타-아밀로이드(Aβ₄₀)와 42개의 아미노산으로 구성되는 베타-아밀로이드(Aβ₄₂)가 생성된다.

따라서 대표적인 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질병을 야기하는 것으로 알려진 베타-아밀로이드(Aβ)의 뇌세포 내에서의 축적을 방지하기 위해서는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이 아밀로이드 생성형의 C-단편(C99)로 절단되도록 유도하는 베타-세크레타아제의 활성을 억제할 필요가 있다.

베타-세크레타아제는 또한 BACE1(β-site APP-cleaving enzyme 1) 또는 메맙신 2(memapsin 2)로도 불린다. 현재까지의 일부 연구에 따르면, 막관통 아스파르트산 단백질 분해효소인 BACE1의 과-발현에 의하여 베타-세크레타아제의 활성이 증가하며, BACE1의 과-발현에 의하여 APP가 베타-세크레타아제의 절단 부위에서 정확하게 절단되며, BACE antisense 올리고뉴클레오티드에 의하여 베타-세크레타아제의 활성이 억제되며, 정제된 BACE가 APP를 정확하게 절단하여 베타-세크레타아제의 특성을 보인다는 연구(Robert Vassar et al., β-Secretase Cleavage of Alzheimer's Amyloid Precursor Protein by the Transmembrane Aspartic Protease BACE, Science, 286, 735-741 (1999))와 막-결합 단백질인 아스파르트산 단백질 분해효소 역시 베타-세크레타아제가 베타-아밀로이드의 생성을 억제하기 위한 표적 물질이라는 연구(Riqiang Yan et al, Membrane-anchored aspartyl protease with Alzheimer's disease β-secretase activity, Nature, 402, 533-537 (1999))가 보고되고 있다.

특히, 베타-세크레타아제는 베타-아밀로이드 생성을 개시하는 효소로서 베타-세크레타아제의 활성을 억제함으로써 베타-아밀로이드의 감소는 물론이고 그 이후의 해로운 모든 단계를 또한 방지할 수 있다는 점, 베타-세크레타아제를 코딩하는 유전자를 변형시키더라도 심각한 문제가 없으므로 임상적으로도 안전하다는 점에서 알츠하이머 질병의 치료를 위한 표적으로서 많은 이점을 가지고 있다. 베타-세크레타아제의 억제제와 관련해서 펩티드 결합을 가지는 히드록시에틸렌 계열의 물질나 N-말단을 페닐아세틸기로 치환한 화합물이 알려져 있으나, 치료적 활성을 갖는 효소 억제제는 700 Da 미만의 크기를 가져야만 체내의 대사과정에서 안정적으로 효과를 발휘할 수 있기 때문에 지속적인 연구가 필요하다. 아울러, 생체 유래의 물질로서 키토산 유도체라든가, 카테킨(catechins), 식물 유래의 페놀 화합물 등이 베타-세크레타아제의 억제제로서 보고되었지만, 아직까지 임상적 가능성까지는 이르지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 현재 대부분 폐기되고 있는 수산가공물인 어류의 껍질의 성분 중에서 상당 부분을 차지하는 단백질을 가수분해하여 얻어진 펩타이드의 생리적 활성 기능을 연구하였다. 전술한 것과 같이, 수산물의 소비량의 증가함에 따라, 다양한 형태의 수산가공물이 개발되어 이용되고 있다. 이에 따라 수산가공물 제조과정에 발생하는 수산가공 부산물 (어두, 어피, 내장, 어뼈 등)이 대량으로 발생하고 있어, 부산물에 대한 효율적인 처리가 필요한 실정이다. 수산가공부산물은 대부분 사료로 이용되거나 폐기 되어 자원의 효율적인 활용이 제대로 되지 않고 있으며 환경오염을 유발시키고 있다. 그러나 부산물 중에는 어피는 단백질 및 콜라겐 등의 유용한 성분이 다량 함유되어 있으며, 생리기능성 소재로 이용 가능성이 높다. 이에, 본 발명에서는 어류 껍질에 다량으로 함유된 단백질 및 콜라겐을 효율적으로 이용하기 위하여 효소 가수분해를 통한 단백질 가수분해물을 제조하였으며, 그 가수분해물로부터 항알츠하이머 활성의 펩타이드를 분리 정제하여 아미노산 서열을 확인하고, 이들 분리 정제된 펩타이드를 디-펩타이드 내지 헥사-펩타이드와 같은 저분자량의 펩타이드로 합성한 상태에서 항알츠하이머 활성의 지표라고 할 수 있는 베타-세크레타아제 저해 정도를 확인하였다.

본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다. 본 발명에 따라 사용된 어류 껍질은 동해안의 대표적인 수산자원인 오징어(Todarodes pacificus) 껍질과 연어(Oncorhynchus keta) 껍질 및 홍어(Raja Kenojei) 껍질이다.

우선, 연어 껍질, 오징어 껍질 및 홍어 껍질을 각각 마쇄한 뒤에 이들 껍질에 다량 함유되어 있는 단백질을 가수분해하기 위해서 다양한 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)를 사용하는 방법으로 펩타이드 상태의 가수분해 산물을 얻었다. 일반적으로 생물의 체성분 중에서 단백질만을 분리하는 방법으로 황산암모늄을 이용한 단백질 침전법이 알려져 있으나, 이 경우에 단백질 침지 반응 시간 및 탈염을 위한 추가적인 과정이 추가되어 비효율적일 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서는 홍어 껍질로부터 활성 물질을 추출하는 방법으로 효소적 가수분해 방법을 이용하였다.

본 발명의 실시예에 따라 사용되는 단백질 분해효소로는 알카라제(Alcalase), α-키모트립신(α-Chymotrypsin)과 같은 키모트립신, 뉴트라제(Neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 트립신(trypsin)을 사용하였으나, 그 외의 다른 단백질 가수분해효소, 예를 들어, 프로타막스(Protomax), 플라보자임(flavourzyme)과 같이 다른 저렴한 단백질 가수분해효소가 사용될 수 있음은 물론이다.

이때, 사용되는 단백질 가수분해의 활성을 위해서 각 효소의 최대 활성 pH, 활성 온도 등을 조절할 필요가 있는데, 각각의 단백질 분해효소의 체내에서의 최적 반응 조건과 동일한 조건을 적용할 수 있다. 이러한 가수분해효소에 대한 최대 활성 pH 등의 조건은 잘 알려져 있으므로 상세한 설명은 생략한다. 이때, 사용된 단백질 가수분해 효소와 기질로 사용된 홍어 껍질의 체성분은 대략 1:50 ~ 1:200 정도의 비율로 혼합될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 연어 껍질 체성분 중의 단백질 가수분해에 있어서는 트립신이, 오징어 껍질 체성분 중의 단백질 가수분해에 있어서는 뉴트라제가, 홍어 껍질 체성분 중의 단백질 가수분해에 있어서는 알카라제의 가수분해 효율이 양호하였다(실시예 1 참조).

이어서, 연어 껍질, 오징어 껍질 및 홍어 껍질 유래의 단백질 가수분해 산물을 대상으로 알츠하이머 질병의 주요한 원인인 베타-아밀로이드의 합성을 개시하는 베타-세크레타아제 활성 억제 정도를 분석하였다. 전술한 것처럼, 알츠하이머 질병의 원인과 관련해서 가장 폭넓게 지지되고 있는 '아밀로이드 가설'에 따르면 아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein, APP)이 베타-세크레타아제에 의하여 특정 위치에서 절단된 뒤, 감마-세크레타아제에 의하여 다른 위치에서 절단되어 생성된 베타-아밀로이드가 뇌세포 또는 신경세포 등에 축적됨으로써 알츠하이머 질병이 야기된다. 이에, 본 발명에서는 연어 껍질, 오징어 껍질 및 홍어 껍질의 체성분 중의 단백질에 대한 각각의 효소를 사용한 가수분해 산물이 알츠하이머 질병의 치료, 예방 등의 효과를 알아보기 위해서 각각의 단백질 분해효소에 의한 가수분해 산물이 베타-세크레타아제의 활성을 억제하는 정도를 우선 분석하였다. 흥미롭게도, 베타-세크레타아제 활성 억제와 관련해서, 연어 껍질 유래의 단백질 가수분해 산물 중에서는 파파인에 의한 가수분해 산물이(도 1 참조), 오징어 껍질 유래의 단백질 가수분해 산물 중에서는 펩신에 의한 가수분해 산물이(도 6 참조), 홍어 껍질 유래의 단백질 가수분해 산물 중에는 뉴트라제에 의한 가수분해 산물이(도 11 참조) 각각 양호하였다.

계속해서, 본 발명자들은 항알츠하이머 활성을 보이는 펩타이드 성분을 얻기 위하여 베타-세크레타아제 활성이 양호한 효소적 가수분해 산물을 분리, 정제하여 베타-세크레타아제 활성 억제가 양호한 펩타이드 성분과 그 아미노산 서열을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 어류 껍질 유래의 조추출물인 단백질 가수분해 산물을 분리하기 위한 방법으로서 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 1차 분획 성분을 분리하고, 그 중에서 베타-세크레타아제 억제 활성이 양호한 1차 분획 성분을 대상으로 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 2차 분획 성분을 분리 정제할 수 있다. 마지막으로 MS/MS 분석을 통하여 베타-세크레타아제 활성 억제 효과를 갖는 펩타이드의 아미노산 서열 및 분자량을 확인하였다. 물론, 펩타이드 형태의 조추출물을 분리, 정제할 수 있는 임의의 다른 방법을 사용할 수 있음은 물론이다.

본 발명의 실시예에 따르면, 연어 껍질, 오징어 껍질 및 홍어 껍질 유래의 단백질 가수분해 산물을 1차로 분리하기 위하여 칼럼 크로마토그래피를 사용한다. 이 경우에, 각 어류 껍질 유래의 단백질 가수분해 산물인 펩타이드를 분자량별로 분획할 수 있는 지지체로서, 극성 유기용매 또는 수용매 혼합액 중의 지질(lipids), 호르몬(hormones), 비타민(vitamin), 다른 작은 생체분자와 같은 화합물의 분리와 추출에 효율적인 칼럼 충진제인 'Sephadex G-25'를 사용한 칼럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 연어 껍질 유래의 파파인에 의한 단백질 가수분해 산물의 칼럼 크로마토그래피 분석 결과 3개의 1차 분획 성분이 얻어졌으며 그 중에서 1번째 분획 성분이 베타-세크레타아제 억제 효과가 가장 뛰어나고(도 2 참조), 오징어 껍질 유래의 펩신에 의한 단백질 가수분해 산물의 칼럼 크로마토그래피 분석 결과 6개의 1차 분획 성분이 얻어졌으며 그 중에서 3번째 분획 성분이 베타-세크레타아제 억제 활성이 가장 뛰어나며(도 7 참조), 홍어 껍질 유래의 뉴트라제에 의한 단백질 가수분해 산물의 칼럼 크로마토그래피 분석 결과 4개의 1차 분획 성분이 얻어졌으며 그 중에서 4번째 분획 성분이 베타-세크레타아제 억제 활성이 가장 뛰어나다(도 12 참조).

한편, 칼럼 크로마토그래피 분석을 통해서 얻어진 1차 분획 성분 중에서 베타-세크레타아제 억제 효과가 뛰어난 분획 성분을 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)로 분석함으로써, 항알츠하이머 활성 효과를 가지는 펩타이드 성분(2차 분획 성분)을 더욱 구체적으로 분리 정제할 수 있다. 연어 껍질의 경우 항알츠하이머 활성이 가장 양호한 1차 분획 성분을 대상으로 HPLC로 분석하면 8개의 2차 분획성분이 얻어지고 그 중에서 3번째 분획 성분의 베타-세크레타아제 억제 활성이 가장 양호하고(도 3 참조), 오징어 껍질의 경우 항알츠하이머 활성이 가장 양호한 1차 분획 성분을 대상으로 HPLC로 분석하면 7개의 2차 분획 성분이 얻어지고 그 중에서 5번째 분획 성분의 베타-세크레타아제 억제 활성이 가장 양호하며(도 8 참조), 홍어 껍질의 경우 항알츠하이머 활성이 가장 양호한 1차 분획 성분을 대상으로 HPLC로 분석하면 4개의 2차 분획 성분이 얻어지고 그 중에서 2번째 분획 성분의 베타-세크레타아제 억제 활성이 가장 양호하다(도 13 참조).

계속해서, HPLC 분석을 통하여 가장 양호한 베타-세크레타아제 억제 효과를 갖는 분획 성분에 대하여 역-상 HPLC(reverse-phase HPLC)를 통해 재-분리 정제한 분획분이 2차 분획 성분에 비하여 베타-세크레타아제 활성 억제 효과가 더욱 양호하다(연어 껍질과 관련해서는 도 4 참조, 오징어 껍질과 관련해서는 도 9 참조, 홍어 껍질과 관련해서는 도 14 참조).

이어서, 본 발명자들은 MS/MS 기기를 사용하여 최종적으로 항알츠하이머 활성을 갖는 분획분에 포함되어 있는 아미노산 서열을 분석하였다. 홍어 껍질 유래의 펩타이드는 QGTRPLRGPEFL(Gln-Gly-Thr-Arg-Pro-Leu-Arg-Gly-Pro-Glu-Phe-Leu, 서열번호 1), 연어 껍질 유래의 펩타이드는 ILFPL(Ile-Leu-Phe-Pro-Leu, 서열번호 12), 오징어 껍질 유래의 펩타이드는 (His-Val-Met-Leu, 서열번호 17)로 3종의 정제된 펩타이드의 C-말단에는 로이신이 공통적으로 결합되어 있었다.

이어서 본 발명자들은 전술한 서열번호 1, 서열번호 12 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드가 생체내에서의 가수분해에 의한 분해를 방지하고 흡수율 및 안전성을 향상시키기 위해서 해당 서열의 아미노산 중 일부만으로 구성되는 펩타이드를 합성하였다.

구체적으로, 홍어 껍질 유래의 펩타이드(서열번호 1)와 관련해서는 QGTR(Gln-Gly-Thr-Arg, 서열번호 2), QGT(Gln-Gly-Thr, 서열번호 3), QG(Gln-Gly, 서열번호 4), GTR(Gly-Thr-Arg, 서열번호 5), TR(Thr-Arg, 서열번호 6), PEFL(Pro-Glu-Phe-Leu, 서열번호 7), PEF(Pro-Glu-Phe, 서열번호 8), PE(Pro-Glu, 서열번호 9), EFL(Glu-Phe-Leu, 서열번호 10), FL(Phe-Leu, 서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하였다. 연어 껍질 유래의 펩타이드(서열번호 12)와 관련해서는 ILF(Ile-Leu-Phe, 서열번호 13), IL(Ile-Leu, 서열번호 14), FPL(Phe-Pro-Leu, 서열번호 15), PL(Pro-Leu, 서열번호 16)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하였다. 오징어 껍질 유래의 펩타이드(서열번호 17)와 관련해서는 HV(His-Val, 서열번호 18), ML(Met-Leu, 서열번호 19), HVM(His-Val-Met, 서열번호 20) 및 VML(Val-Met-Leu, 서열번호 21)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하였다.

서열번호 2에서 서열번호 21까지의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 사용하여 베타-세크레타아제 억제 활성을 측정한 결과, 특히 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 19, 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드의 활성이 양호하였다. 그 중에서 특히 서열번호 7, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 19 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드의 항알츠하이머 활성이 양호하였으며, C-말단에 로이신(leucine)을 갖는 펩타이드 중에서는 서열번호 7, 서열번호 15, 서열번호 19 및 서열번호 21로 구성되는 군에서 선택되는 펩타이드의 활성이 양호하였다.

이러한 결과에 비추어 볼 때, 본 발명에 따라 어류 껍질에서 유래한 전술한 펩타이드는 항알츠하이머 활성을 가지기 때문에, 약품이나 건강기능식품 중의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

따라서 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 펩타이드의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명과 관련한 알츠하이머 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물은 어류 껍질 유래의 전술한 펩타이드를 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 어류 껍질 유래의 펩타이드를 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 어류 껍질 유래의 펩타이드는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제와 같은 희석제 또는 부형제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약리적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 유효성분인 펩타이드에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 및 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.

또한, 본 발명의 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 당해 기술분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화 될 수 있다.

아울러, 본 발명에 따른 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

상기 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료를 위한 약리 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명에 따른 어류 껍질 유래의 펩타이드를 0.001 ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 하지만, 본 발명의 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료를 위한 약리 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료용 조성물 및 항균 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 구체적으로는 상기 포유류는 인간, 돼지, 소 또는 염소 등일 수 있다.

본 발명에 따른 어류 유래의 펩타이드는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 포함하는 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 어류 껍질 유래의 펩타이드는 0.001 ~ 10.0 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.005 ~ 5.0 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 0.01 ~ 5.0 ㎎/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따라 베타-세크레타아제 활성을 억제하는 어류 껍질 유래의 펩타이드는, 이 펩타이드 성분을 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품과 같은 식품 조성물에 활용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다. 본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이며, 바람직하게는 껌 또는 캔디일 수 있다.

따라서 본 발명은 전술한 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드를 첨가할 수 있는 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있으며 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 구체적으로, 본 발명의 펩타이드가 활용될 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육 가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 구강질환의 예방 또는 개선에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

본 발명에 따른 어류 껍질 유래의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용할 경우, 이 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 알츠하이머 질병의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제 성분을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당은 물론이고, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제 또는 감미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진)과 같은 천연 향미제/감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제/감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내 지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 10g이다. 상기 천연탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 펩타이드는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 식품공학적 조성물 중에는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 펩타이드 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부, 바람직하게는 0.01 ~ 1.0 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 예시적인 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 결코 아니다.

실시예 1 : 어류 껍질 유래의 효소적 단백질 가수분해물 제조

본 실시예에서는 어류 껍질의 단백질 및 콜라겐을 이용하기 위하여 단백질 가수분해효소를 이용하여 가수분해를 실시한 후, 가수분해도를 측정하였다. 원료로 사용된 홍어(Raja Kenojei) 껍질, 연어(Oncorhynchus keta) 껍질 및 오징어(Todarodes pacificus) 껍질은 각각 전라남도, 강릉시 주문진항 등에서 구입하여 - 80℃의 냉동고에 보관하였으며, 전처리 과정으로 원료를 깨끗이 수세한 후 잘게 마쇄하여 실험에 사용하였다. 단백질 가수분해 효소는 Alcalase(Novozyme사, Denmark), Neutrase(Novozyme사), α-chymotrypsin(Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO. USA), papain(Sigma-Aldrich사), trypsin(Sigma-Aldrich사) 및 pepsin(Junsei사, Japan)을 사용하였다.

홍어 껍질, 연어 껍질 및 오징어 껍질 각각 1.0g을 100 mL의 buffer에 넣고, pH와 온도를 각 효소의 최적 조건에 맞추어 1 시간 반응시킨 후 효소 : 기질을 1:100 비율로 효소를 넣어 준 후 12시간 반응 시켰다. 12 시간 반응 후 원심분리하여 상등액을 수거하고, 수거된 상등액은 동결건조하여 β-secretase 활성 측정에 사용하였다. 하기 표 1에서는 본 실시예에 따른 가수분해 효소의 가수분해도 측정 결과를 보여주고 있다. 연어 껍질, 오징어 껍질 및 홍어 껍질에서 각각 trypsin 가수분해물, Neutrase 가수분해물 및 Alcalase 가수분해물의 가수분해도가 높게 나타났다.

어류 껍질의 효소적 가수분해물의 가수분해도

	가수분해도 (%)
	연어 껍질	오징어 껍질	홍어 껍질
Alcalase	51.03±1.24	60.12±3.01	79.61±3.98
α-chymotrypsin	69.32±1.64	75.34±3.76	72.26±3.61
Neutrase	52.81±1.94	81.23±4.06	79.23±5.31
Papain	70.16±1.54	62.78±3.19	16.09±1.28
Pepsin	74.63±2.01	18.34±0.91	67.54±4.79
Trypsin	81.61±2.12	63.17±3.15	51.95±2.60

실시예 2 : 연어 껍질 가수분해물의 베타- 세크레타아제 저해 활성

본 실시예에서는 위 실시예 1에서 사용한 다양한 단백질 가수분해효소를 처리하여 얻어진 연어 껍질 유래의 가수분해물의 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환의 예방, 치료 효과를 확인하기 위하여, 이들 단백질 가수분해 산물이 알츠하이머 질병 진행의 주요 기작에 관여하는 베타-세크레타아제의 억제 활성 정도를 β-secretase inhibitory activity assay를 통하여 분석하였다.

이를 위하여, β-secretase inhibitory activity assay를 이용하여 각 가수분해물 중 β-secretase 저해 활성이 높은 펩타이드가 다량 함유되어 있는 효소 가수분해물을 선정하였다. 베타-세크레타아제 억제 활성은 베타-세크fp타제 assay kit에서 제시한 방법을 변형하여 측정하였다.

우선, 이 분석 기법을 이용하여 각각의 단백질 가수분해 산물 중에서 베타-세크레타아제 억제 활성이 높은 펩타이드가 다량 함유되어 있는 효소 가수분해 산물을 선정하였다. 베타-세크레타아제 억제 활성은 베타-세크레타아제 분석 키트(β-secretase assay kit)에서 제시한 방법을 변형하여 측정하였다.

즉, 70 ㎕ buffer (50 mM sodium acetate, pH 4.5), 10 ㎕ β-secretase (1.0 Unit/㎖), 10 ㎕ substrate (10 mM MCA-[ASN670, LEU671]-AMYLOID BETA/A4 PRECURSOR PROTEIN 77, 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.5)를 10 ㎕의 시료액과 혼합 후 25℃에서 20분간 암조건에서 반응시켰다. 형광 reader(Bio-Rad)는 excitation 360 ㎚로 하고, emission 405 ㎚로 하여 측정하였다. 베타-세크레타아제의 저해율은 하기 공식을 사용하였다.

Inhibition (%) = [1-{(S-S₀)/(C-C₀)}]×100

C :　시료액을 첨가하지 않은 실험군(Enzyme + buffer + substrate)의 반응 시작 후 20분 후의 형광도값

C₀: 시료액을 첨가하지 않은 실험군(Enzyme + buffer + substrate)의 반응 직전(zero time)의 형광도값

S : 시료액이 첨가된 실험군(Enzyme + sample + substrate)의 반응 20분 후의 형광도값

S₀: 시료액이 첨가된 실험군(Enzyme + sample + substrate)의 반응 직전(zero time)의 형광도값

연어 껍질 유래의 각 가수분해물의 β-secretase 저해활성은 IC₅₀값으로 측정하였으며, 그 결과가 도 1에 도시되어 있다. 가수분해물 중에서 β-secretase 저해활성은 papain 가수분해물의 IC₅₀값이 0.83 ㎎/㎖로 다른 가수분해물에 비해 높게 나타났다.

실시예 3 : 연어 껍질 유래의 베타-세크레타아제 저해 펩타이드 정제

(1) 칼럼 크로마토그래피 분석

연어 껍질 유래의 단백질 가수분해 산물 중에서 베타-세크레타아제 억제 활성 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 파파인 가수분해산물로부터 베타-세크레타아제 억제 활성 펩타이드를 분리, 정제하였다. 파파인으로 분해된 연어 껍질 유래의 가수분해물을 100 ㎎/㎖ 농도로 탈이온수에 녹인 후, 겔 여과를 위하여 Sephadex G-25를 충진시킨 칼럼(2.5 × 75 ㎝)에 주입하였다. 분리 용매는 탈이온수를 사용하여 1.5 ㎖/min 유속으로 분리하였으며, 분획량은 7.5㎖로 조절하여 흡광도 215 ㎚에서 결과를 측정하여 각 획분으로 분리하였다. 각 획분을 동결건조한 후, 베타-세크레타아제 활성을 측정하였다. 측정 결과가 도 2에 도시되어 있다. 도시된 것과 같이, 연어 껍질의 파파인 가수분해물로부터 3개의 1차 획분(F1~F3)을 얻었으며, 3개의 획분 중에서 F1의 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호하여, 실시예 2에서와 같은 방법으로 측정한 IC₅₀ 값은 F1이 0.75 ㎎/㎖이었다.

(2) HPLC 분석

위에서 얻어진 1차 분획 성분 중에서 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 높은 획분(F1)을 ODS column(5 ㎛, 10 × 250 ㎜, YMC, Inc. Japan)을 사용하여 고성능 액상 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC, Aglient 1100, Kyoto, Japan)에서 분리 정제하였다. 분리 용매는 acetonitrile(0.1% trichloroacetic acid, J.T. Baker 사, USA)을 60분간 0%에서 45%로 선형 농도구배를 하여 2.0 ㎖/min의 유속으로 분리하였다. 분리 결과는 흡광도 215 ㎚에서 측정하였으며, 측정 결과가 도 3에 표시되어 있다. 도시된 것과 같이 8개의 2차 획분(A~H)으로 분리되었으며, 각 획분을 동결건조한 후 실시예 2에서와 같이 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 각 획분의 베타-세크레타아제 저해 활성은 획분 C에서 가장 양호하여 IC₅₀ 값은 0.53 ㎎/㎖이었다.

(3) 재분리

HPLC 분석 결과, 2차 분획 성분 중에서 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 높은 C 획분을 ODS column을 사용하여 역상-HPLC(reverse-phase HPLC, Agilent 1100)에서 재분리, 정제하였다. 이를 위하여 분석용 column(particle size : 5 ㎛, 4.6 × 250 ㎜)를 사용하여 유속 0.5 ㎖/min의 조건으로 분리하였다. 분리 결과는 흡광도 215 ㎚에서 측정하였으며, 해당 획분에 대해서도 동결건조 후 실시예 2에서와 같이 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 측정 결과가 도 4에 도시되어 있는데, 재분리 정제 결과 C-1 획분의 단일 펩타이드로 분리되었으며, 최종 분리 정제된 획분(C-1)의 베타-세크레타아제 저해 활성을 IC₅₀값으로 나타내었을 때, 0.07 ㎎/㎖이었다.

실시예 4 : 연어 껍질 유래의 펩타이드 분석

실시예 3의 HPLC 및 베타-세크레타아제 활성 억제 분석을 통하여 가장 우수한 효과를 갖는 것으로 확인된 분리, 정제된 분획(C-1)의 활성 펩타이드의 아미노산 서열과 분자량을 측정하였다. 아미노산 서열 분석은 순차적으로 nano Ultra Performance Liquid Chromatography (nanoUPLC, Waters Corporation, Milford, MA)와 연결된 nano-전자분부(ESI) 사극 자(quardrupole) 이온 비행 시간차 분석기(TOF) 질량 분석기(Q-TOF Premier, Waters Corporation, Manchester, UK)를 이용하여 분석하였다. 모든 분석은 양이온 모드로 분석하였다. 이때 scan은 0.6초 간격으로, MS spectra는 m/z 100에서 m/z 1,600의 범위에서 분석하였다. 이때, 초당 이온 검출 강도 20 이상인 이온 중에서, 가장 높은 강도를 보이는 3개를 선택하여 이온 비행 시간차 분석기를 통해 m/z 50에서 m/z 1,990 범위에서 1.2초 동안 MS/MS spectra를 받았다. 데이터 수집은 초당 이온 검출 강도 20 이상인 이온을 선택하여 분석하였다. 분석 결과가 도 5에 표시되어 있으며, 최종적으로 분석된 펩타이드는 ILFPL(Ile-Leu-Phe-Pro-Leu, 서열번호 12)의 5개의 아미노산 잔기를 가지고 있었으며, 분자량은 609 Da이었다.

실시예 5 : 오징어 껍질 가수분해물의 베타-세크레타아제 저해 활성

실시예 1에서 사용한 다양한 단백질 가수분해효소를 처리하여 얻어진 오징어 껍질 유래의 가수분해물을 사용하여 실시예 2에서와 동일한 절차에 따라 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 측정 결과가 도 6에 표시되어 있다. 오징어 껍질 유래의 가수분해물 중에서 펩신 가수분해물의 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호하여 IC₅₀값은 2.12 ㎎/㎖이었다.

실시예 6 : 오징어 껍질 유래의 베타-세크레타아제 저해 펩타이드 정제

(1) 칼럼 크로마토그래피

실시예 5에 따라 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 우수한 오징어 껍질의 펩신 가수분해물로부터 Sephadex G-25 column을 사용하여 실시예 3에서와 같이 칼럼 크로마토그래피로 분리하여, 각 획분에 대하여 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 측정 결과가 도 7에 도시되어 있는데, 6개의 1차 획분(F1~F6)으로 분리되었으며, 그 중에서 F3 획분의 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호하여, IC₅₀값은 0.93 ㎎/㎖이었다.

(2) HPLC 분석

베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 높은 1차 분획 성분인 F3 획분에 대하여 실시예 3에서와 동일한 column과 HPLC 장비를 사용하여 HPLC 분석하고 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 분리 용매인 acetonitrile(0.1% trichloroacetic acid)를 50분간 0%에서 40%로 농도구배를 하여 2.0 ㎖/min의 유속으로 분리하였고, 분리결과는 흡광도 215 ㎚에서 측정하였다. 측정 결과가 도 8에 도시되어 있는데, 7개의 2차 획분(A~G)으로 분리되었으며, 그 중에서 획분 E의 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호하여, 획분 E의 IC₅₀ 값은 31.2 ㎍/㎖이었다.

(3) 재분리

베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호한 2차 획분 E에 대해서 실시예 3에서와 같이 역상-HPLC로 재분리하여 획분을 얻은 뒤에 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 분석용 column (particle size : 5 ㎛, 4.6 × 250 ㎜)을 사용하여 분리 용매인 acetonitrile(0.1% trichloroacetic acid)를 50분간 10%에서 40%로 0.5 ㎖/min의 유속으로 전개시켰다. 분리결과는 흡광도 215 ㎚에서 측정하였다. 측정 결과가 도 9에 도시되어 있는데, E 획분의 단일 펩타이드로 분리되었으며, 베타-세크레타아제 저해 활성을 IC₅₀으로 나타내면 20.3 ㎍/㎖이었다.

실시예 7 : 오징어 껍질 유래의 펩타이드 분석

실시예 6에서 최종 분리 정제된 획분 E에 대하여 실시예 4에서와 동일한 절차와 방법에 따라 아미노산 서열 및 분자량을 측정하였다. 분석 결과가 도 10에 도시되어 있으며, 정제된 펩타이드는 HVML(His-Val-Met-Leu, 서열번호 17)의 4개의 아미노산 잔기를 가지고 있었으며, 분자량은 505 Da이었다.

실시예 8 : 홍어 껍질 가수분해물의 베타-세크레타아제 저해 활성

실시예 1에서 사용한 다양한 단백질 가수분해효소를 처리하여 얻어진 홍어 껍질 유래의 가수분해물을 사용하여 실시예 2에서와 동일한 절차에 따라 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 측정 결과가 도 11에 표시되어 있다. 홍어 껍질 유래의 가수분해물 중에서 뉴트라제 가수분해물의 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호하여 IC₅₀값은 0.56 ㎎/㎖이었다.

실시예 9 : 홍어 껍질 유래의 베타-세크레타아제 저해 펩타이드 정제

(1) 칼럼 크로마토그래피

실시예 8에 따라 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 우수한 오징어 껍질의 뉴트라제 가수분해물로부터 Sephadex G-25 column을 사용하여 실시예 3에서와 같이 칼럼 크로마토그래피로 분리하여, 각 획분에 대하여 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 탈이온수에 100 ㎎/㎖ 농도로 희석한 Neutrase 가수분해물을 Sephadex G-25 column(2.5×75 ㎝)에 주입하였으며, 1.5 ㎖/min의 유속으로 분리용매인 탈이온수를 전개하여 분리하였다. 분리된 각 획분은 흡광도 215 ㎚에서 측정하였으며, 각 획분을 동결건조한 후 일정량을 취하여 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 측정 결과가 도 12에 도시되어 있는데, 4개의 1차 획분(F1~F4)으로 분리되었으며, 그 중에서 F4 획분의 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호하여, IC₅₀값은 69.0 ㎍/㎖이었다.

(2) HPLC 분석

베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 높은 1차 분획 성분인 F4 획분에 대하여 실시예 3에서와 동일한 column과 HPLC 장비를 사용하여 HPLC 분석하고 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. β-secretase저해 활성이 가장 높은 F4 획분을 ODS column (5 ㎛, 10 × 250 mm, YMC, lnc. Japan)을 사용하여 HPLC(agilent 1100)에서 분리용매인 acetonitrile(0.1% trichloroacetic acid)를 40분간 0%에서 50%까지 농도구배를 하여 분당 2.0 ㎖의 유속으로 분리하였고, 분리 결과는 흡광도 280 ㎚에서 측정하였다. 측정 결과가 도 13에 도시되어 있는데, 4개의 2차 획분(F1~F4)으로 분리되었으며, 그 중에서 획분 F2의 베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호하여, 획분 F2의 IC₅₀ 값은 51.3 ㎍/㎖로서, 분리 정제 이전 가수분해물에 비하여 활성이 10.9배 증가하였다.

(3) 재분리

베타-세크레타아제 저해 활성이 가장 양호한 2차 획분 F2에 대해서 실시예 3에서와 같이 역상-HPLC로 재분리하여 획분을 얻은 뒤에 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 분석용 column (particle size : 5 ㎛; 4.6 × 250 ㎜)을 사용하여 분리 용매인 acetonitrile(0.1% trichloroacetic acid)를 40분간 0%에서 40%로 0.5 ㎖/min의 유속으로 전개시켰다. 분리결과는 흡광도 280 ㎚에서 측정하였다. 측정 결과가 도 14에 도시되어 있는데, F2-1 획분의 단일 펩타이드로 분리되었으며, F2-1 획분의 베타-세크레타아제 저해 활성을 IC₅₀으로 나타내면 32.5 ㎍/㎖로서, 리 정제 이전의 가수분해물에 비하여 17.2배 증가하였다.

실시예 10 : 홍어 껍질 유래의 펩타이드 분석

실시예 9에서 최종 분리 정제된 획분 F2-1에 대하여 실시예 4에서와 동일한 절차와 방법에 따라 아미노산 서열 및 분자량을 측정하였다. 분석 결과가 도 15에 도시되어 있다. 본 실시예에 따라 최종적으로 정제된 펩타이드는 QGTRPLRGPEFL(Gln-Gly-Thr-Arg-Pro-Leu-Arg-Gly-Pro-Glu-Phe-Leu, 서열번호 1)의 12개의 아미노산 잔기를 가지고 있었으며, 분자량은 1391 Da이었다.

실시예 11 : 최종 정제된 펩타이드의 베타-세크레타아제 활성 분석

본 실시예에서는 실시예 4에서 분석된 연어 껍질 유래의 서열번호 12의 펩타이드, 실시예 7에서 분석된 오징어 껍질 유래의 서열번호 17의 펩타이드, 실시예 10에서 분석된 홍어 껍질 유래의 서열번호 1의 펩타이드를 대상으로, 실시예 2에서와 같은 방법으로 베타-세크레타아제 활성 억제 정도를 측정하여, 항알츠하이머 효과를 살펴보았다. 측정 결과가 하기 표 2에 표시되어 있다.

정제된 펩타이드의 베타-세크레타아제 억제 활성

어류 껍질	서열번호	펩타이드 아미노산 서열	IC₅₀값(μM)
연어 껍질	12	Ile-Leu-Phe-Pro-Leu	137.1
오징어 껍질	17	His-Val-Met-Leu	40.28
홍어 껍질	1	Gln-Gly-Thr-Arg-Pro-Leu-Arg-Gly-Pro-Glu-Phe-Leu	24.46

표 2의 측정 결과로부터 알 수 있는 것과 같이, 연어 껍질, 오징어 껍질 및 홍어 껍질로부터 각각 유래된 펩타이드는 정제 이전의 가수분해물과 비교해서 베타-세크레타아제 저해 활성 억제 정도가 증가하였다. 이에 따라, 이들 정제된 펩타이드로부터, 이들 펩타이드보다 적은 수의 아미노산으로 구성되는 펩타이드, 예를 들어 디-펩타이드 내지 헥사-펩타이드 형태의 펩타이드에 대해서 항알츠하이머 효과를 살펴볼 필요성이 추론되었다.

실시예 12 : 항알츠하이머 펩타이드의 아미노산 합성 및 활성

전술한 실시예 11을 통하여 어류 껍질 유래의 항알츠하이머 효능을 갖는 3종의 정제된 펩타이드의 아미노산 서열을 기반으로 그와 동일하거나 또는 그 일부분의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 합성하였다. 항알츠하이머 활성을 펩타이드의 아미노산 서열을 토대로 N-말단 및 C-말단의 아미노산 서열을 조합하여 di-, tri- 및 tetra-펩타이드로 새로운 펩타이드를 디자인하였다. 3종의 정제된 펩타이드와 그와 유사한 구조를 가지는 펩타이드의 합성은 펩타이드 자동합성기를 이용하여 SPPS(Solid Phase Peptide Synthesis) 기법으로 합성하였다.

펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 Nα-amino group의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법(solid phase method)을 적용한 펩타이드 자동합성기(PeptrEx)에서 합성하였다. 구체적으로, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA Resin을 최초물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 최초물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장(elongation)은 Nhydroxybenzo-triazole (HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide (DCC)법에 의하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄(DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA (trifluoroacetic acid)-phenolthioanisole-H₂O-triisop-ropylsilane(85: 5: 5: 2.5: 2.5, v/v) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 침전된 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 acetonitrile 농도 구배로 하여 reverse phase-HPLC에서 C18 column(Delta Pak, C18 300 Å, 15 ㎛, 19.0 ㎜ × 30 ㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다.

합성된 펩타이드의 아미노산 서열을 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다. 아울러, 합성된 펩타이드를 대상으로 실시예 2에서와 같은 방법으로 베타-세크레타아제 저해 활성을 측정하였다. 하기 표 3에서는 홍어 껍질 유래의 펩타이드 및 그 일부분인 펩타이드의 서열과 각 펩타이드의 베타-세크레타아제 저해 활성 측정 결과를 표시하고 있고, 하기 표 3에서는 홍어 껍질에서 유래한 것과 동일한 아미노산 서열로 구성된 합성된 펩타이드 및 일부 아미노산으로 구성된 합성된 펩타이드의 아미노산 서열과 각 펩타이드의 베타-세크레타아제 저해 활성 측정 결과를 표시하고 있다.

홍어 껍질 유래의 펩타이드를 기준으로 한 합성펩타이드의 베타-세크레타아제 저해활성

서열번호	펩타이드의 아미노산 서열	IC₅₀값 (μM)
1	QGTRPLRGPEFL	28.86±1.44
2	QGTR	25.05±1.25
3	QGT	23.17±1.15
4	QG	26.21±1.31
5	GTR	21.60±1.08
6	TR	21.44±1.07
7	PEFL	14.66±1.75
8	PEF	111.72±5.58
9	PE	23.03±1.15
10	EFL	27.49±1.37
11	FL	24.88±1.24

한편, 하기 표 4에서는 연어 껍질에서 유래한 것과 동일한 아미노산 서열로 구성된 합성된 펩타이드 및 일부 아미노산으로 합성된 펩타이드의 아미노산 서열과 각 펩타이드의 베타-세크레타아제 저해 활성 측정 결과를 표시하고 있다.

연어 껍질 유래의 펩타이드를 기준으로 한 합성펩타이드의 베타-세크레타아제 저해활성

서열번호	펩타이드의 아미노산 서열	IC₅₀값 (μM)
12	ILFPL	126.77±8.70
13	ILF	66.65±0.52
14	IL	22.50±4.88
15	FPL	11.71±1.54
16	PL	18.68±0.93

또한, 하기 표 5에서는 오징어 껍질에서 유래한 것과 동일한 아미노산 서열로 구성된 합성된 펩타이드 및 일부 아미노산으로 합성된 펩타이드의 아미노산 서열과 각 펩타이드의 베타-세크레타아제 저해 활성 측정 결과를 표시하고 있다.

오징어 껍질 유래의 펩타이드를 기준으로 한 합성펩타이드의 베타-세크레타아제 저해활성

서열번호	펩타이드의 아미노산 서열	IC₅₀값 (μM)
17	HVML	44.52±1.37
18	HV	34.37±7.18
19	ML	5.62±0.04
20	HVM	8.37±1.55
21	VML	4.20±0.21

특히, 서열번호 7, 서열번호 15, 서열번호 19 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드가 베타-세크레타아제 저해 활성이 우수한 것을 알 수 있다. 특히 C-말단에 로이신을 갖는 펩타이드 중에서 서열번호 7, 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21의 펩타이드가 주목된다.

<110> KANGNUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> Pharmaceutical Composition and Functional Food Having Anti-Alzheimer Activity Containing Peptides from Fish Skins <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 1 Gln Gly Thr Arg Pro Leu Arg Gly Pro Glu Phe Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 2 Gln Gly Thr Arg 1 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 3 Gln Gly Thr 1 <210> 4 <211> 2 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 4 Gln Gly 1 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 5 Gly Thr Arg 1 <210> 6 <211> 2 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 6 Thr Arg 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 7 Pro Glu Phe Leu 1 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 8 Pro Glu Phe 1 <210> 9 <211> 2 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 9 Pro Glu 1 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 10 Glu Phe Leu 1 <210> 11 <211> 2 <212> PRT <213> Raja kenojei <400> 11 Phe Leu 111 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Oncorhynchus keta <400> 12 Ile Leu Phe Pro Leu 1 5 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Oncorhynchus keta <400> 13 Ile Leu Phe 1 <210> 14 <211> 2 <212> PRT <213> Oncorhynchus keta <400> 14 Ile Leu 144 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Oncorhynchus keta <400> 15 Phe Pro Leu 1 <210> 16 <211> 2 <212> PRT <213> Oncorhynchus keta <400> 16 Pro Leu 166 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Todarodes pacificus <400> 17 His Val Met Leu 1 <210> 18 <211> 2 <212> PRT <213> Todarodes pacificus <400> 18 His Val 188 <210> 19 <211> 2 <212> PRT <213> Todarodes pacificus <400> 19 Met Leu 199 <210> 20 <211> 3 <212> PRT <213> Todarodes pacificus <400> 20 His Val Met 1 <210> 21 <211> 3 <212> PRT <213> Todarodes pacificus <400> 21 Val Met Leu 1

Claims

서열번호 2에서 서열번호 21의 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 예방 또는 치료 효과를 가지는 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 서열번호 12 내지 서열번호 16의 펩타이드들은 연어 껍질을 구성하는 단백질을 파파인으로 처리한 가수분해산물이거나 이 가수분해산물의 일부이며, 상기 서열번호 17 내지 서열번호 21의 펩타이드들은 오징어 껍질을 구성하는 단백질을 펩신으로 처리한 가수분해산물이거나 이 가수분해산물의 일부인 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료 효과를 가지는 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 펩타이드는 베타-세크레타아제(β-secretase) 활성 억제 효과를 가지는 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료 효과를 가지는 약학 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 펩타이드는 상기 약학 조성물 중에 0.001 ~ 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함되어 있는 알츠하이머 질병의 예방 또는 치료 효과를 가지는 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드 중에서 C-말단에 로이신이 결합된 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질병의 예방 또는 개선용 약학 조성물.
서열번호 2에서 서열번호 21의 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 예방 또는 개선용 건강기능식품.