KR20130020378A - 저온 공법을 이용한 홍삼 농축액의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저온 공법을 이용한 홍삼 농축액의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 추출 용매에 홍삼을 첨가하여 추출하는 단계; 얻어진 추출액을 냉각하여 저온 여과하는 단계; 얻어진 여액을 저온 농축하는 단계; 및 얻어진 농축액을 저온 숙성하는 단계를 포함하는 홍삼 농축액의 제조방법에 관한 것이다.
상기 홍삼 농축액은 면역을 증가시키고 기억력을 개선시키는 효과가 탁월하여 다양한 건강식품으로 응용될 수 있다.
상기 홍삼 농축액은 면역을 증가시키고 기억력을 개선시키는 효과가 탁월하여 다양한 건강식품으로 응용될 수 있다.
Description
본 발명은 홍삼 내 유효 성분인 진세노사이드, 아미노산, AFG 등을 높은 함량으로 함유하여 면역 증진 및 기억력 향상을 도모할 수 있도록 저온 공법을 이용한 홍삼 농축액의 제조방법에 관한 것이다.
건강에 대한 관심이 높아짐에 따라 면역력 증진 및 원기 회복 등의 효능이 있는 건강식품에 대한 복용이 증가하고 있다. 대표적인 건강식품으로는 홍삼이 있으며, 이러한 홍삼은 이에 함유된 사포닌 등에 의해 면역세포를 활성화시켜 신체의 감염물질에 대한 면역기능을 향상시킨다고 알려져 있다.
홍삼은 인삼 중에서 6년근 이상의 수삼을 찌고 말려 수분이 13% 정도로 제조한 것으로 붉은색이 감도는 것이 특징이다. 홍삼은 중추신경에 대해서 진정작용과 흥분작용이 있으며, 순환계에 작용하여 고혈압이나 동맥경화의 예방효과가 있다. 그러면서도 조혈작용(造血作用)과 혈당치(血糖値)를 저하시켜 주고, 간을 보호하며, 내분비계에 작용하여 성행동(性行動)이나 생식효과에 간접적으로 유효하게 작용하며, 항염(抗炎) 및 항종양작용(抗腫瘍作用)이 있고, 방사선에 대한 방어효과, 피부를 보호하며 부드럽게 하는 작용도 있다. 또한, 홍삼의 효과 중 중요한 것은 어댑토겐(adaptogen:適應素) 효과로서 주위 환경으로부터 오는 각종 유해작용인 누병(淚病), 각종 스트레스 등에 대해 방어능력을 증가시켜 생체가 보다 쉽게 적응하도록 하는 능력이 있음이 과학적으로 입증되고 있다.
인삼과 홍삼은 공통성분도 있지만 홍삼은 수증기로 인삼을 찔 때 열처리가 가해짐으로 제조과정 중 화학성분의 변환이 일어나 수삼이나 건삼에 존재하지 않은 일부 새로운 약효성분들이 생성된다. 홍삼과 인삼의 공통 함유성분은 총 18가지이며 홍삼에는 별도로 12종의 새로운 성분이 있는데, 예를 들면 암세포 증식억제 효능이 있는 G-Rh2나 노화억제 효능과 관련한 말톨(maltol) 등은 홍삼에만 존재한다.
홍삼 농축액은 홍삼을 물, 주정 또는 이들을 혼합한 용매로 추출 여과하여 가용성 홍삼 성분을 그대로 농축한 것으로, 홍삼 내 가용성 유효성분을 고함량으로 함유하고 있어, 농축액 상태로 시판되어 음용하고 있다.
이에 홍삼 농축액을 얻기 위한 다양한 방법 및 장치가 제안되었다.
대한민국 특허공개 제2006-0026719호는 홍삼 분말에 물/에탄올 혼합 용매를 사용하여 75～85℃에서 열수 추출한 후 냉각하는 단계를 여러 번 반복하고, 여과 후 고온에서 감압 농축하는 단계를 거쳐 홍삼 농축액을 얻는 방법을 제시하고 있다.
또한, 장치로서는 수삼을 수증기를 통해 중탕 후, 추출중탕 용기에서 히터를 통해 찜으로서 홍삼 농축액을 얻는 장치가 시판되고 있다.
그러나 상기한 추출 방법이나 장치는 고온에서 열수 추출하는 방식을 사용하고 있으며, 홍삼 내 유효성분을 고함량으로 얻기 위해 상기 추출 공정을 수회 반복한다. 이러한 반복 추출 횟수가 많아질수록 소모 비용이 증가하여 비경제적이고, 단순히 열수 추출을 통해 홍삼 농축액을 얻기 때문에 홍삼 내 유효성분을 효과적으로 추출할 수 없다.
이에 대한민국 특허등록 제10-1034809호는 솔잎, 갈근 및 다시마를 물로 추출한 추출물을 이용하여 인삼과 함께 가열함으로써 사포닌 함량이 증진된 홍삼 농축액을 얻는 방법을 제안하였다.
또한, 대한민국 특허공개 제2011-0082866호는 홍삼을 숯 여과 시스템을 이용하여 제조한 숯 여과 정제수로 추출함으로써, 진세노사이드 및 아미노당 등의 유효성분의 함량 및 기호성을 높여주는 홍삼 농축액의 제조방법을 개시하고 있다.
이에 본 발명에서는 홍삼 내 다양한 유효성분을 높은 함량으로 효과적으로 추출할 수 있는 홍삼 농축액의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
추출 용매에 홍삼을 첨가하여 추출하는 단계;
얻어진 추출액을 냉각하여 저온 여과하는 단계;
얻어진 여액을 저온 농축하는 단계; 및
얻어진 농축액을 저온 숙성하는 단계를 포함하는 홍삼 농축액의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 얻어진 홍삼 농축액은 저온 공법을 통해 홍삼 내 유효 성분인 진세노사이드, 아미노산, AFG(Arginine-Frictose-Glucose) 등이 높은 함량으로 함유된다.
이러한 홍삼 농축액은 면역을 증가시키고 기억력을 개선시키는 효과가 탁월하여 다양한 건강식품으로 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 진세노사이드 관련 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 진세노사이드 관련 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 아미노산 관련 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 아미노산 관련 크로마토그램이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 AFG 관련 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 AFG 관련 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 진세노사이드 관련 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 아미노산 관련 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명의 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 아미노산 관련 크로마토그램이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 AFG 관련 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 AFG 관련 크로마토그램이다.
본 발명에 따른 홍삼 농축액을 추출한 후 저온 농축 및 저온숙성을 포함하는 저온 공법을 통해 얻어진다.
구체적으로, 홍삼 농축액은
(S1) 추출 용매에 홍삼을 첨가하여 추출하는 단계;
(S2) 얻어진 추출액을 저온 여과하는 단계;
(S3) 얻어진 여액을 저온 농축하는 단계; 및
(S4) 얻어진 농축액을 저온 숙성하는 단계를 거쳐 제조한다.
이하 본 발명을 각 단계별로 더욱 상세히 설명한다.
(S1) 추출 공정
먼저, 추출 용매에 홍삼을 첨가하여 홍삼 내 유효 성분을 추출하는 추출 공정을 수행한다.
홍삼 농축액을 얻기 위해 사용하는 홍삼은 홍삼 분말 또는 건조 홍삼을 사용하고, 높은 추출 효율을 얻기 위해서 홍삼 분말을 사용한다.
이때 추출 용매는 물, 탄소수 1～6의 저급 글리콜, 탄소수 1～4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다. 가장 바람직하게는 물 또는 주정을 추출용매로 하여, 실온에서 초음파 추출기로 1～12 시간 동안 추출한다. 상기 초음파 추출의 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있다. 바람직하기로, 홍삼 1g에 대해 추출 용매 10～1000ml로 사용한다.
특히, 본 발명에 따른 추출 공정은 추출 공정으로서, 종래 100℃ 부근의 열을 가하던 열수 추출이 아닌 이보다 낮은 온도에서 수행하여 홍삼 내 유효성분의 추출을 극대화한다.
바람직하기로, 50～90℃에서 1 내지 12시간 동안, 더욱 바람직하기로 70～90℃에서 3 내지 10시간 동안 수행한다.
본 추출 공정에서 추출 온도가 상기 온도/시간 미만이면 홍삼 내 유효성분을 충분히 추출할 수 없고, 반대로 상기 온도/시간을 초과하면 홍삼 내 유효성분이 파괴될 우려가 있으므로, 상기 범위 내에서 적절히 사용한다.
(S2) 저온 여과 공정
다음으로, 상기 추출 공정을 거쳐 얻어진 추출액을 냉각하여 여과하는 공정을 수행한다.
구체적으로, 추출액을 1～30℃의 온도로 냉각한 다음, 온도별로 4회 이상 나누어 수행하는 저온 여과 공정을 수행한다.
구체적으로, 25～30℃로 냉각하고, 이 온도에서 여과 공정을 1회 수행하고, 이어서 5～10℃ 간격으로 냉각할 때마다 저온 여과 공정을 수행하는 방식으로 진행될 수 있다. 일례로, 30℃, 20℃, 10℃, 및 1℃에서 여과 공정을 수행한다.
통상적인 여과의 경우 많은 침전물이 동시에 생성되어, 추출 수율이 극도로 저하되며, 이러한 문제를 본 발명에서는 다단 여과 공정을 통해 해소함과 동시에 홍삼 내 유효성분의 추출율을 향상시킬 수 있다.
여과는 원심 분리기를 사용하여 수행한다. 원심 분리기를 사용한 여과는 원심력에 의해 입자, 즉 침전물과 추출액을 효과적으로 분리할 수 있다. 상기 원심 분리기로는 본 발명에서 특별이 한정하지 않으며, 공지의 관형(tubular centrifuge)과 원판형(disc or bowlcentrifuge)의 원심 분리기가 사용될 수 있으며, 이때 회전수는 1000～5000rpm, 바람직하기로 1500～3000rpm의 범위에서 사용이 가능하며, 30분～1시간 동안 수행한다.
(S3) 저온 농축 공정
다음으로, 상기 단계에서 얻어진 여액을 저온 농축한다.
농축은 감압 농축기, 대표적인 예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축을 수행하여 추출 용매를 제거하여 유효성분을 함유하는 고농도의 홍삼 농축액을 얻는다.
특히, 본 발명에서 농축은 50～70℃에서 1～24시간, 바람직하기로 55～65℃에서 3～10시간 동안 저온에서 농축을 수행한다. 이러한 저온 농축 공정시 온도가 상기 범위 미만이면 추출 용매를 효과적으로 제거하지 못하거나, 추출 용매의 제거를 위해 농축 시간이 필요 이상으로 길어져 공정 시간이 길어지는 문제가 발생한다. 이와 반대로, 온도가 상기 범위를 초과하면 홍삼 농축액 내 휘발 온도가 낮은 유효성분이 같이 제거되어 전체적으로 추출 효율이 크게 저하되는 문제가 발생하므로, 상기 범위 내에서 적절히 수행한다.
(S4) 저온 숙성 공정
다음으로, 상기 단계에서 얻어진 농축액을 저온 숙성하여 홍삼 농축액을 얻는다.
숙성은 저온창고에서 10～40℃에서 10～20일 동안 숙성을 실시하여 홍삼 본연의 향과 부드러운 맛을 갖는 홍삼 농축액을 얻는다.
이와 같이 제조된 홍삼 농축액은 실험예 1을 통해 8종의 진세노사이드인 Ra1, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, 및 Rg1를 25.38mg/g을 포함하고, 아미노산인 아스파라긴(asparagine), 세린(serine), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 히스티딘(hystidine), 아르기닌(arginine), 트레오닌(threonine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 시스틴(cystine), 티로신(tyrosine), 발린(valine), 메티오닌(methionine), 라이신(lysine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 및 페닐알라닌(phenylalanine)이 21.49mg/g을 포함하고, AFG(아르기닐-프룩토실-글루코스, Arginine-Frictose-Glucose)를 69.01mg/g의 함량으로 포함하여, 종래 알려진 그 어떤 홍삼 농축액과 비교하여 상기 유효성분을 높은 함량으로 함유함을 확인하였다. 또한, 그 외 성분인 산성 다당체(RGAP)와 미네랄도 적정 조화를 이루며 존재한다.
또한, 실험예 2를 통해 본 발명에 따른 홍삼 농축액이 면역 증진 효과가 크게 향상되고, 실험예 3을 통해 기억력 또한 향상시키는 효과가 있음을 확인하였다.
이러한 홍삼 농축액은 다양한 용도로서 사용이 가능하다.
일례로, 홍삼 농축액은 건강기능식품으로 사용될 수 있으며, 이때 건강기능식품은 홍삼 농축액 그 자체로 사용되거나 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 홍삼 농축액은 식품 또는 음료에 첨가되어 사용될 수 있고, 여기서 식품 또는 음료 중의 상기 홍삼 농축액의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 홍삼 농축액 제조
홍삼((주)한국인삼공사, 6년근)이 충분히 잠기도록 정제수(홍삼 1g 대비 500ml)를 투입한 후 항온수조(Multi water bath, 비젼텍)에 넣고 50℃에서 12시간 동안 추출 공정을 수행하였다.
이어서, 추출액을 30℃로 냉각한 후, 1500～1800 rpm에서 30분간 1차 원심 분리하고, 다시 20℃로 냉각한 후 동일 조건에서 2차 원심 분리하고, 20℃로 냉각한 후 동일 조건에서 3차 원심 분리하고, 다시 1℃로 냉각한 후 동일 조건에서 2차 원심 분리하여 여과 공정을 수행하였다.
이어서, 얻어진 여액을 감압 농축기에 넣은 후, 55℃에서 10시간 동안 농축시킨 후, 20℃에서 20일 이상 저온 숙성시켜 홍삼 농축액을 얻었다.
비교예 1: 홍삼 농축액의 제조
통상의 방법으로 홍삼 농축액을 얻었다.
홍삼((주)한국인삼공사, 6년근)이 충분히 잠기도록 정제수(홍삼 1g 대비 900ml)를 투입한 후 항온수조(Multi water bath, 비젼텍)에 넣고 95℃에서 12시간 동안 고온 열수 추출 공정을 수행하였다.
이어서, 추출액을 50℃로 냉각한 후,여과 공정을 수행하였다.
이어서, 얻어진 여액을 감압 농축기에 넣은 후, 80℃에서 10시간 동안 농축시켜 홍삼 농축액을 얻었다.
실험예 1: 홍삼 농축액의 성분 분석
상기 실시예 및 비교예에서 제조된 홍삼 농축액 내 유효성분의 함량을 분석하고, 그 결과를 하기 표 1 내지 3에 나타내었다.
(1) 진세노사이드 함량: UPLC (Waters)를 이용하여 BEH C18 (2.1×500 mm, 1.7μm, Waters),을 사용하여 203nm에서 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 1과, 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1은 본 발명의 실시예 1, 도 2는 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 진세노사이드 관련 크로마토그램이다.
| mg/g | 실시예 1 | 비교예 1 |
| Ra1 | 1.69 | 1.33 |
| Rb1 | 8.99 | 6.59 |
| Rb2 | 3.36 | 2.61 |
| Rc | 3.84 | 2.87 |
| Rd | 1.13 | 1.07 |
| Re | 2.75 | 1.52 |
| Rf | 1.58 | 1.59 |
| Rg1 | 2.04 | 1.07 |
| 총 합 | 25.38 | 18.67 |
상기 표 1, 도 1 및 도 2를 참조하면, 실시예 1 및 비교예 1의 홍삼 농축액은 현행 건강기능식품공전의 인삼 또는 홍삼 농축액 기준인 0.8～34 mg/g를 만족시키는 결과를 나타내었다.
그러나 실시예 1의 홍삼 농축액의 경우 비교예 1에 비해 진세노사이드의 함량이 18.67 mg/g에서 25.38mg/g으로 약 36% 정도 증가하는 결과를 보여, 본 발명에 따른 추출 공정을 통해 홍삼 농축액 내 진세노사이드의 함량을 높일 수 있음을 알 수 있다.
(2) 아미노산 함량: HPLC (Waters)를 이용하여 측정하였고, 이때 칼럼으로는 Discovery C18 (4.6×250 mm, 5μm), Supelco을, 검출기로는 Fluorescence Detector (Excitation wavelenght 250 nm, Emission wavelenght 395 nm)를 사용하였으며, 그 결과를 하기 표 2와, 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3은 본 발명의 실시예 1, 도 4는 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 아미노산 관련 크로마토그램이다.
| mg/g | 실시예 1 | 비교예 1 |
| 아스파라긴(asparagine) | 1.30 | 0.77 |
| 세린(serine) | 0.21 | 0.12 |
| 글루타민(glutamine) | 0.47 | 0.29 |
| 글리신(glycine) | 0.18 | 0.15 |
| 히스티딘(hystidine) | 0.50 | 0.46 |
| 아르기닌(arginine)) | 16.44 | 9.03 |
| 트레오닌(threonine) | 0.35 | 0.26 |
| 알라닌(alanine) | 0.78 | 0.69 |
| 프롤린(proline) | 불검출 | 불검출 |
| 시스틴(cystine) | 불검출 | 불검출 |
| 티로신(tyrosine) | 0.34 | 0.27 |
| 발린(valine) | 0.22 | 0.19 |
| 메티오닌(methionine) | 불검출 | 불검출 |
| 라이신(lysine) | 0.16 | 0.04 |
| 이소루신(isoleucine) | 0.13 | 0.09 |
| 루신(leucine) | 0.23 | 0.16 |
| 페닐알라닌(phenylalanine) | 0.19 | 0.11 |
| 총 합 | 21.49 | 12.61 |
상기 표 2, 도 3 및 도 4를 참조하면, 아미노산의 함량 또한 12.61mg/g에서 21.49mg/g으로 약 70% 이상 증가하는 결과를 보였다. 특히, 필수 아미노산인, 트레오닌, 발린, 메티오닌, 라이신, 이소루신, 루신, 및 페닐알라닌의 함량 또한 크게 증가하였다.
(3) AFG(아르기닌-프룩토즈-글루코스), 산성 다당체 함량 분석: Bio-LC (Dionex)를 이용하여 CarboPac PA-1 Column (4×250 mm), Doinex 칼럼을 사용하고, 검출기로 PAD (Pulse amperometric detector)를 사용하여 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3과, 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5는 본 발명의 실시예 1, 도 6은 비교예 1에서 얻어진 홍삼 농축액의 AFG 관련 크로마토그램이다.
| mg/g | 실시예 1 | 비교예 1 |
| AFG(아르기닌-프룩토즈-글루코스) | 69.01 | 14.75 |
| 산성 다당체 | 57.66 | 59.89 |
상기 표 3, 도 5 및 도 6을 참조하면, AFG 함량 또한 14.75mg/g에서 69.01mg/g으로 약 368% 이상 증가하는 결과를 보였다. 산성 다당체 또한 적정 수준으로 측정되었다.
실험예 2: 홍삼 농축액의 면역 증진 효과
본 발명에 따른 홍삼 농축액의 면역 증진 효과를 알아보기 위해, 항체 생성능, 면역 작용을 담당하는 면역 세포수, 및 IL-4 분비능을 측정하였다.
(1) 항체 생성능:
정상군, cyclophosphamide(CY) Control, 비교예 1의 홍삼 농축액 250, 500 mg/kg 투여군, 실시예 1의 홍삼 농축액 250, 500 mg/kg 투여군으로 나누어 10일 동안 매일 강제 경구 투여하였다. 부검 5일전에 50 mg/kg의 CY를 복강 투여하였으며, 이때 정상군은 생리식염수를 복강 투여하였다. 부검 4일전에 모든 군은 5% 면양적혈구(SRBC)를 0.5 ml씩 복강 투여하여 면역반응을 유발하였다. 비장세포의 IgM 용혈반 생성 세포수(antibody forming cell, AFC)를 측정하기 위하여 South Pacific Sera Ltd.(Timaru, New Zealand)에서 구입한 면양혈액을 냉장보관하여 1주 이내에 사용하였다. 부검 5일전(day 5)에 50 mg/kg의 CY를 복강 투여하였으며, 이때 정상군은 생리식염수를 복강 투여하였다. 부검 4일전(day 6)에 SRBC를 EBSS 용액으로 3회 원심세척(1200 rpm, 10 min, 4℃)한 후, 면양적혈구(sheep red blood cell, SRBC)농도가 5×108 cells/ml(약 5%)가 되도록 EBSS 용액으로 조정하여 이 부유액 0.5 ml을 모든 실험동물의 복강내에 주사하여 면역반응을 유발하였다. 부검일(day 10)에 모든 실험동물의 비장을 적출하여 빙냉의 EBSS 용액에 넣고 비장을 메쉬를 이용하여 단일 세포 부유액으로 만들었다. 원심분리(1200 rpm, 10 min, 4℃)하여 상등액을 제거하고 5 ml EBSS 용액을 넣어 다시 원심분리(1200 rpm, 10 min, 4℃)하여 상등액을 제거한 후 3 ml EBSS 용액을 넣어 비장세포 현탁액을 만들었다. 이를 100 ul 취하여 2.9 ml EBSS 용액에 넣어 30배 희석한 세포현탁액을 만들었다. SRBC 부유액은 냉장 보관된 면양혈액을 사용직전에 EBSS 용액으로 3회 원심세척(1200 rpm, 10 min, 4℃)한 후 사용하였다. Agar 350 ul, SRBC 부유액 25 ul, guinea pig complement 25 ul, 세포현탁액 100 ul를 혼합하여 200 ul를 취하여 plate에 떨어뜨린 후 커버 글라스로 덮었다. 이를 37℃, 5% CO2 incubator에서 4시간동안 배양한 후, 형성되는 용혈반 생성 세포수를 현미경으로 측정하였다.
(2) 비장 임파구 분포도:
정상군, cyclophosphamide(CY) Control, 비교예 1의 홍삼 농축액 250, 500 mg/kg 투여군, 실시예 1의 홍삼 농축액 250, 500 mg/kg 투여군으로 나누어 10일 동안 매일 강제 경구 투여하였다. 부검 3일 전에 50 mg/kg의 CY를 복강 투여하여 면역저하를 유도하였다. 부검 당일 시험동물의 비장을 적출하여 메쉬를 이용하여 단일 세포 부유액으로 만들었다. 원심분리(1200 rpm, 10 min, 4℃)하여 상등액을 제거하고 2 ml ACK lysis buffer를 넣은 후 1분 동안 흔들어 용혈시켰다. RPMI 1640 complete (10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 unit penicillin, 100 ug streptomycin 및 5×10-5 2-Mercaptoethanol) 배양액 5 ml을 첨가한 후 5분 동안 실온에서 방치하였다. 원심분리(1200 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 제거한 후 RPMI 1640 배양액으로 2회 세척하여 단일 세포 부유액을 만들었다. 비장 단일 세포부유액에 대한 T 세포의 구성비를 Flow cytometry(Beckman coulter, FC500- 2 laser 5 color)장비를 이용하여 측정하였다. 총 세포수는 coulter counter(Beckman coulter, Vi-cell- Tryphan Blue method full automation)로 측정하였다. Fc blocking을 위해 purified anti-mouse CD16/CD32 Fc receptor를 사용하였고, 총 T 세포는 peridinin chlorophyll-a protein(PerCP)- conjugated anti-mouse CD3e(clone: 145-2C11)로 염색하였다. 비장의 CD4 T 세포(helper T 세포)와 CD8 T 세포(suppressor/cytotoxic T 세포)의 비율을 측정하기 위해 FITC-conjugated anti-mouse CD4(clone: GK1.5) 및 R-PE-conjugated anti-mouse CD8a(clone: 53-6.7)을 이용하여 염색하였다. 방법을 간단히 설명하면, 먼저 anti-mouse CD16/CD32 Fc receptor(1 ug/tube)로 4℃에서 15분간 Fc receptor blocking했다. 그리고 2개의 anti-mouse monoclonal antibodies(1 ug/tube)를 조합하여 얼음에서 30분간 염색한 후 PBS로 3번 세척하였다. 그리고 나서 0.3 ml의 PBS를 각 튜브에 넣은 후 잘 섞고, Flow cytometry로 분석하였다.
(3)
IL
-4
분비능
:
정상군, cyclophosphamide(CY) Control, 비교예 1의 홍삼 농축액 250, 500 mg/kg 투여군, 실시예 1의 홍삼 농축액 250, 500 mg/kg을 10일 동안 매일 강제 경구 투여하면서, 부검 3일전에 50 mg/kg의 CY를 복강 투여한 마우스에서 비장을 분리하여 단일 세포 부유액을 얻었다. 단일 세포액의 농도를 1×106 세포/ml로 조정하여, 180 ul의 세포액을 96-well 배양접시에 분주하고, 20 ul의 Con A(5 ug/ml)를 넣어 총 용량을 200 ul가 되도록 통일시켰다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 72시간동안 배양한 후 각 실험군의 배양액을 50 ul이상씩 얻어서 -70℃에 보관하고, 이 배양액 중에 유리된 각 사이토카인을 mouse IL-4 (invitrogen)에 대한 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
상기 (1) 내지 (3)은 정상군, 면역 저하군, 면역 저하군(비교예 1의 홍삼 농축액 투여), 면역 저하군(실시예 1의 홍삼 농축액 투여)로 나뉘어 수행하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
|
|
항체생성능 | 면역세포수 |
IL-4 분비능 (pg/㎖) |
||
| AFC/106 spleen cell | T-세포수 (×107) |
CD4-T-세포수 (×107) |
CD8-T-세포수 (×107) |
||
| 정상군 | 2400 | 0.82 | 0.58 | 0.14 | 340 |
| 면역 저하군 | 847** | 0.31** | 0.23** | 0.05** | 205** |
| 면역 저하군+비교예 1의 홍삼 농축액 250 mg/kg | 1308**## | 0.50**## | 0.38**# | 0.09**# | 224** |
| 면역 저하군+비교예 1의 홍삼 농축액 500 mg/kg | 1722*## | 0.51**## | 0.39**## | 0.08**# | 330## |
| 면역 저하군+실시예 1의 홍삼 농축액 250 mg/kg | 1503**## | 0.46**## | 0.34**# | 0.08**# | 272**## |
| 면역 저하군+실시예 1의 홍삼 농축액 500 mg/kg | 1826*## | 0.58**## | 0.45**## | 0.09**## | 339## |
** P<0.01: 정상군 vs 면역저하군,
#P<0.05, ## P<0.01: 면역저하군 vs 홍삼 농축액군
상기 표 4를 참조하면, 본 발명에 따른 홍삼 농축액의 경우 면역 증진 효과가 월등히 우수함을 알 수 있다.
실험예
3: 홍삼 농축액의 기억력 개선 효과
본 발명에 따른 홍삼 농축액의 기억력 개선 효과를 알아보기 위해, 기억력 개선 효과 및 공간 인지능 개선 작용을 측정하였다.
(1) 기억력 개선 효과
수동회피반응은 step-down type 시험 장치 (Muromachi사)을 사용하였으며, 세 면이 검정색이고 한 면은 투명한 아크릴로 구성된 상자로 바닥은 0.2 cm의 굵기인 전기가 통할 수 있는 그리드(grid)로 구성되었다. 바닥의 한쪽 구석에 위치시킨 platform에 생쥐를 올려놓고 바닥으로 내려오면 0.4 mA를 2초 동안 전기 충격을 주었다. 1차적으로 각각의 그룹을 선택하기 위하여 3～15초 사이의 잠복시간 (이때는 그리드에 전기충격을 주지 않음)을 갖는 마우스를 선택하였다. 기억을 저하시키기 위해 scopolamine 2mg/kg 피하주사하였으며 정상군, 대조군(scopolamine 투여군), 홍삼 농축액 (100mg/kg) + scopolamine, 홍삼 농축액 (250mg/kg) + scopolamine그룹으로 하였다.
홍삼 농축액은 7일간 경구투여하였으며, 마지막 7일째 홍삼 농축액을 투여 30분 후에 1차 학습을 시킨 뒤 1시간 뒤에 1차 학습에서 잠복시간이 3～15초 사이의 마우스만을 선택하여 2차 학습을 실시하였으며 기억 재생은 2차 학습 후 24시간 후에 실시하였다. 기억저하는 2차 학습하고 15분 후에 scopolamine 2 mg/kg을 피하 주사하였다. 잠복시간 제한은 120초를 적용하였다.
(2) 공간 인지능
(모리스 수미로 시험: Morris water maze test)
직경이 90 cm인 원통형 수조에 동서남북을 표시하여 방위를 표시하고 수심이 30 cm되도록 물 (수온 26±1 ℃)을 채우고 남서방향 중앙에 투명하고 직경이 6 cm인 원형 플랫폼을 수면아래 0.5～1.0 cm되게 설치한다. 실험동물이 플랫폼을 식별하지 못하게 물에 우유 1000 ml를 넣어 고르게 섞었다. 실험동물을 4방향 (동, 서, 남, 북)에서 수조에 놓고 남서방향의 플랫폼으로 수영하여 도달하는 시간 (탈출시간)을 측정하였다. 기억을 저하시키기 위해 홍삼 농축액을 250mg/kg 경구 투여 30분 후에 scopolamine 2 mg/kg를 피하주사 하였다. 피하주사 30분 후에 1일 1회 동서남북 방향에서 남서방향 중앙에 고정된 플랫폼에 도착하는 시간을 3일간 측정하였다. 제한시간 2분을 초과한 실험동물은 인위적으로 플랫폼 위에 실험동물을 5초 동안 올려놓고 플랫폼을 인지시켰다. 실험이 진행되는 동안 수미로에서 나온 동물실험은 물기를 제거한 후 사육 케이지에 옮겨 놓았으며 모든 실험군은 군당 5마리의 실험동물울 사용하였다. 1일 4방향에서 얻어진 수치를 합산하여 1일 평균으로 사용하였다. 이때 비교를 위해, 정상군, 기억 저하군, 홍삼 농축액+기억 저하군으로 3일간 공간 인지능을 측정하였다.
| 시험군 | 잠복시간(초) |
| 정상군 | 81.37 |
| 기억 저하군 | 35.28** |
| 기억 저하군+비교예 1 홍삼 농축액(100mg/kg) | 91.61## |
| 기억 저하군+비교예 1 홍삼 농축액(250mg/kg) | 89.43## |
| 기억 저하군+실시예 1 홍삼 농축액(100mg/kg) | 97.28## |
| 기억 저하군+실시예 1 홍삼 농축액(250mg/kg) | 107.97## |
** P<0.01: 정상군 vs 기억저하군, ## P<0.01: 기억저하군 vs 홍삼 농축액군
| 시험군 | 탈출시간(초) | |||
| 0 일 | 1일 | 2일 | 3일 | |
| 정상군 | 52.1 | 39.6 | 24.1 | 15.3 |
| 기억 저하군 | 80.6 | 99.9** | 75.3** | 65.2** |
| 기억 저하군+비교예 1의 홍삼 농축액(250mg/kg) | 79.6 | 71.5# | 60.7 | 48.9 |
| 기억 저하군+실시예 1의 홍삼 농축액(250mg/kg) | 77.3 | 68.6# | 39.4# | 31.3# |
** P<0.01: 정상군 vs 기억저하군, # P<0.05: 기억저하군 vs 홍삼 농축액군
상기 표 5, 및 표 6을 참조하면, 본 발명에 따른 홍삼 농축액의 경우 기억력 개선 효과가 월등히 우수함을 알 수 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 저온 공법을 수행하여 홍삼 내 진세노사이드, 아미노산 유도체 및 AFG 성분 등의 함량을 증가시켰고, 면역력을 증가시키고 기억력을 향상시키는 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명에 따른 홍삼 농축액은 유효성분의 함량이 높아 면역 증진 효과 및 기억력 개선 효과가 탁월하여 각종 질병 및 질환을 예방하고 건강을 유지하는 기능성 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (10)
- 추출 용매에 홍삼을 첨가하여 추출하는 단계;
얻어진 추출액을 냉각하여 저온 여과하는 단계;
얻어진 여액을 저온 농축하는 단계; 및
얻어진 농축액을 저온 숙성하는 단계를 포함하는 홍삼 농축액의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 홍삼은 홍삼 분말 또는 건조 홍삼인 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 추출 용매는 물, 탄소수 1～6의 저급 글리콜, 탄소수 1～4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 홍삼 1g에 대해 추출 용매 10～1000ml로 사용하여 추출을 수행하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 추출은 50～90℃에서 1～12시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 저온 여과는 1～30℃의 온도로 냉각한 다음, 온도에 따라 다단으로 수행하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 저온 여과는 온도별로 4회 이상 나누어 수행하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 저온 여과는 원심 분리기를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 저온 농축은 50～70℃에서 1～24시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 저온 숙성은 10～40℃에서 10～20일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 홍삼 농축액의 제조방법.
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