KR20130004561A - 질량분석법에 의한 분자를 검출하기 위한 방법 - Google Patents

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제롬 르무안느
아르노 살바도르
쟝-필리프 샤리에
땅귀 포르뗑
필립 드고우흐드
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비오메리으
상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄
위니베르시테 끌로드 베르나르 리옹 Ⅰ
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Abstract

본 발명은 질량분석법에 의해서 시료에서 하나 이상의 대상 분자를 검출하기 위한 방법에 관한 것이며, a) 시료의 분자를 이온화는 단계,
b) 하기의 단계 (i) 및 (ii)는 n 회 실시되고, n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다:
(i) 상기 단계에서 얻어진 하나 이상의 이온을 질량분석기에서 대상 분자에 기초해서 선택하는 단계, 및
(ii) 이와 같이 선택된 이온을 분해 셀에서 분해하는 단계,
c) n이 0인 경우에 단계 a), 또는 n이 0 아닌 경우에 단계 b)에서 얻어진 2개 이상의 다른 이온을 질량분석기에서 트랩핑하는 단계, 이와 같이 트랩핑된 상기 2개 이상의 이온이 대상 분자의 특징인 질량-대-전하 비율 m/z을 갖는 단계,
d) 이와 같이 트랩핑된 상기 특징적인 이온을 상기 질량분석기로부터 방출하는 단계, 및
e) 이와 같이 방출된 상기 특징적인 이온을 검출장치에 의해서 검출하는 단계. 본 발명의 방법은 상기 특징적인 이온이 단계 d)와 동일한 시간에 방출되고 단계 e)와 동일한 시간에 검출되는 것을 특징으로 한다.

Description

질량분석법에 의한 분자를 검출하기 위한 방법{METHOD FOR DETECTING MOLECULES THROUGH MASS SPECTROMETRY}
본 발명은 화학 및/또는 생물학적 물질을 검출하거나 정량화하기 위한 방법 분야에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 주제는 질량분석법에 의해서 시료에서 하나 이상의 대상 분자를 검출하기 위한 신규한 방법이다.
질량분석법은 다양한 형태의 분자를 분석하고 검출하기 위한 강력한 도구이다. 일반적으로, 이온화될 수 있는 임의의 형태의 분자는 질량분석기를 사용하여 분자 질량에 따라서 검출될 수 있다. 검출될 분자의 상태에 따라서, 일부 질량 분석방법이 보다 적합할 수 있다. 비-제한 예에 의해서 매우 큰 분자, 예를 들면 폴리스티렌을 분석하기 위한 MALDI-TOF type (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight의 머리글자)의 질량분석법의 사용(D. Schriemer and L. Li, Analytical Chemistry, 1996, 68;2721-2725) 및 체액에서 작은 분자를 정량적으로 분석하기 위한 탄뎀 질량분석기의 사용(Hans H. Maurer, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 388, 1315-1325)을 들 수 있다.
문헌 DE 10 2007 060669 A1, US 2005/063864 A1 및 US 2005/211891 A1은, 예를 들면 이들 방법 및 그 가능한 조합을 설명한다.
검출에 사용된 질량 분석방법에 관계없이, 후자는 대상 분자를 "분자" 이온으로 이온화하는 단계 및 그 질량에 따라서 얻어진 분자 이온의 분리 단계를 포함한다.
모든 질량분석기는,
i) 분석될 시료에 존재하는 분자를 이온화하고, 즉 이들 분자에 포지티브 또는 네가티브 전하를 제공하는 이온화 소스;
ii) 그 질량-대-전하 비율(m/z)에 따라서, 이온화 분자 또는 분자 이온을 분리한 질량분석기.
iii) 하기 기재된 바와 같이, 분자 이온에 의해서 직접 또는 분자로부터 제조된 이온에 의해서 발생한 신호를 측정하기 위한 검출기.
m/z 비율에 따른 분자 이온의 분리는 1회 실시될 수 있고(하나의 질량 분석 또는 MS), 또는 그 밖에 여러 회 연속적인 MS 분리가 실시될 수 있다. 2회의 연속적인 MS 분리가 실시되면, 그 분석을 MS/MS 또는 MS2 라고 한다. 3회의 연속적인 MS 분리가 실시되면, 그 분석을 MS/MS/MS 또는 MS3 라고 하고, 보다 일반적으로 n회 연속적인 MS 분리가 실시되면, 분석을 MSn라고 한다. 여러 연속적인 분리를 실시하는 방법 중에서, 하나의 대상 분자를 분석하는 경우에 SRM(Selected Reaction Monitoring) 또는 여러 대상 분자를 분석하는 경우에 MRM(Multiple Reaction Monitoring) 모드는 특히 MS2 분리를 사용한다. 마찬가지로, MRM3 mode 는 특히 MS/MS/MS에 의한 분리를 사용한다.
하나의 MS 모드에서 검출하는 경우에, 분자 이온의 질량/전하 비율은 검출될 대상 분자에 대해서 상관관계가 있다.
MS/MS 모드에서 검출하는 경우에, MS 분석에 비해서 본질적으로 2개의 단계가 추가된다, 즉:
(i) 전구체 이온이라는 분자 이온을 분해하여 제 1 발생 단편 이온이라는 이온을 제공하는 단계
(ii) 그 질량에 따른 제 1 발생 단편 이온이라는 이온의 분리
얻어진 제 1 발생 단편 이온의 질량/전하 비율은 검출될 대상 분자에 대해서 상관관계가 있다. "제 1 발생 단편 이온"은 분해 단계 후의 전구체 이온에 기인한 이온을 의미하고, 그 질량-대-전하 비율 m/z는 상기 전구체 이온과 다르다.
임의의 경우에, 흥미있는 이온의 검출은 분석장치의 검출기에서 이온의 m/z 비율에 따라서 연속적으로 실시된다.
이들 검출 이외에, 질량분석법은 흥미있는 시료에서 하나 이상의 대상 분자를 정량적으로 분석할 수 있다. 질량분석법은 단백질의 분석에서 현저한 방법이며, 이는 종래에 개발된 방법을 대체할 수 있으며, 특히 ELISAs (Enzyme-linked immunosorbent assays)이다. 다양한 공지된 ELISA 방법 중에서, 샌드위치 반응이 가장 널리 사용된다. 이는 흥미있는 단백질의 2개의 항체를 필요로 하며, 하나가 효소에 결합된다.
흥미있는 단백질을 효소로 소화함으로써 얻어지고 흥미있는 단백질에 대해서 특이적인 질량분석법에 의해서, 프로테오티픽 펩티드를 통한 단백질의 정량적인 분석 단계는 출원인(T.　Fortin et al., MCP, 2008 E-pub) 및 그 외(L. Anderson & C. Hunter, MCP, 2006, 573-588　; H. Zhang et al., MCP, 2007, 64-71)에 의해서 복합 유체에서 입증되었다.
MS2 분리를 사용한 특정한 모드는 질량분석법에 의한 정량적인 분석에 특히 적합하다. SRM 및 MRM 모드는 큰 감도 및 높은 특이성으로 분석가능하다. 이들 MS2 모드는 3중-4중 극자 형태의 질량분석기에서 실시될 수 있다. SRM 모드 또는 그외의 MRM 모드의 원리는 전구체 이온을 특이적으로 선택하고 분해한 후, 단편 이온 중 하나를 특이적으로 선택한다. 이러한 적용에 대해서, 3중-4중 극자 장치 또는 3중-4중 극자 이온-트랩 하이브리드가 일반적으로 사용된다. MS3 모드에서 사용된 3중-4중 극자 장치(Q1q2Q3)의 경우에, 대상 단백질을 분석하기 위해서, 제 1 4중 극자(Q1)는 질량-대-전하 (m/z)에 따라서, 기존의 소화 단계에서 분석되고 얻어진 단백질의 특징인 프로테오티픽 펩티드에 상응해서 분자이온을 여과할 수 있다. 비율 (m/z)1라고 하는 프로테오티픽 펩티드의 질량/전하 비율을 갖는 펩티드는 제 2의 4중 극자(q2)로 전달되고 다음의 분해에 대해서 전구체 이온의 역할을 한다.
q2 분석 장치는 질량/전하 비율(m/z)1을 갖는 펩티드를 제 1 발생 단편 이온으로 분해할 수 있다. 분해는 일반적으로 전구체 펩티드를 q2에서 비활성 기체, 예를 들면 질소 또는 알곤과의 충돌에 의해서 얻어진다.
제 1 발생 단편 이온을 제 3의 4중 극자(Q3)로 전달하고, (m/z)2라고 하는 특정한 질량 대 전하 비율에 따라서 제 1 발생 단편 이온을 여과한다. 프로테오티픽 펩티드의 특징적인 단편의 질량/전하 비율(m/z)2을 갖는 제 1 발생 단편 이온을 검출기로 전달하여 정량화한다.
이러한 조작 모드는 한편으로 전구체 이온의 선택 및 또 다른 한편으로 제 1 발생 단편 이온의 선택에 대해서 이중 선택도를 갖는다. SRM 또는 MRM 모드에서 질량 분석은 정량화하는 데에 유리하다.
검출기에서 측정된 제 1 발생 단편 이온에 의해서 유도된 전류 세기는 제 1 발생 단편 이온의 양에 비례하고, 그 자체가 전구체 이온의 양에 비례하고, 그 자체가 분석될 단백질의 양에 비례한다. 제 1 발생 단편 이온에 의해서 유도된 측정된 전류의 양은 분석될 단백질의 양에 정비례한다. 검량은 제 1 발생 단편 이온에 의해서 유도된 전류의 양과, 제 1 발생 단편 이온의 상응하는 양, 및 결국 분석될 단백질의 양에 대한 상관관계를 얻기 위해서 필요하다. 전이라고 하는 (m/z)1 및 (m/z)2 쌍은 MS/MS 모드에서 조작할 수 있는 다양한 질량분석기 모델에서 분석될 수 있다.
하이브리드 3중-4중 극자 이온 트랩 형태의 장치에서, 조작 및 분석 모드는 상기 종래의 3중-4중 극자 모드와 동일할 수 있다. 또한, Q3 4중 극자는 3D 또는 선형 이온 트랩 모드에서 조작할 수 있다. 이러한 이온 트랩은 트랩에 인가된 전압의 변화에 따라서 이온을 분석하기 위해서, 여러 제 1 발생 단편 이온의 선택 및 점진적이고 연속적으로 방출시키고, 트랩에서 무선주파수 전압의 변화를 일으키며 제 1 발생 단편 이온의 공명을 일으켜서, 검출기에서 하나씩 방출시켜서 이를 정량하는 것이 바람직하다.
ELISA 분석에 비해서 질량분석법에 의한 분석의 이점은, 특히 ELISA 분석에 필요한 항체의 개발이 필요한 경우, 분석을 진행하는 데에 드는 비용 및 시간을 상당히 줄일 수 있다는 것이다. 이러한 질량 분석에 의한 방법은 단백질을 분석하기 위한 선택적인 방법이고, 예를 들면 프로테오믹 분석(S. Carr & L. Anderson, Clin. Cem. 2008, 1749-1752)에 대한 연구에 의해서, 잠재적인 마커로서 식별된 수많은 단백질 분석의 임상적인 이점을 간단하고 빠르게 입증할 수 있다.
다량의 비-단백질 분자가 질량분석법에 의해서 정량적으로 분석될 수 있다. 도핑 생성물((M. Thevis & W. Schanzer, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 388, 1351-1358), 환경에 존재하는 오염물(M. Kuster, M. Lopez de Alda, D. Barcelo, Journal of chromatography A, 2009, 1216(3), 520-529) 또는 식품 매트릭스 (Pico Y, Font G, Ruiz MJ, Fernandez M, Mass spectrometry review, 2006, 25(6), 917-960)의 검사를 들 수 있다. 그 감도 및 특이성 때문에, 질량분석법은 검출 한계를 훨씬 감소시킬 뿐 아니라 종래의 분석 방법(예를 들면, HPLC-UV)에 비해서 추출 프로토콜을 간략화할 수 있다. 현재, 이온 소스 및 인터페이스에 대한 유익한 발전에 따라서 종래에 기체 크로마토그래피에 의해서 분석되었던 분자(예를 들면, 에스트로겐)를 분석할 수 있다.
특정한 경우에, 전체 분자 패밀리 또는 심지어 여러 패밀리를 분석하는 것이 필요할 수 있다. 수백 개의 화합물을 동시에 분석할 수 있고, (J. Wang J, D. Leung, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009,57(6),2162-73), 이는 실험실에서 일상적으로 정기적으로 실시된다.
질량분석법에 의해서 제공된 이점에도 불구하고, 상기 분자의 분석 및 검출 사이클 회수는 일반적으로 비교적 길고, 이는 상기 종이 교대로 검출되기 때문이다.
이러한 점에서, 본 발명의 목적은 질량분석법에 의한 분석에서 검출 사이클 횟수를 상당히 감소시킬 수 있는 질량분석법에 의해서 분자를 검출 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
결국, 본 발명은 질량분석법에 의해서 시료에서 하나 이상의 대상 분자를 검출하기 위한 새로운 방법을 제공하고, 이는
a) 시료의 분자를 하나 이상의 이온화 장치에 의해서 이온화하여 분자 이온을 얻는 단계,
b) 하기의 단계 (i) 및 (ii)는 n 회 실시되고, n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다:
(i) 상기 단계에서 얻어진 하나 이상의 이온을 질량분석기에서 대상 분자에 따라서 선택하는 단계, 및
(ii) 이와 같이 선택된 하나 이상의 이온을 분해 셀에서 분해하는 단계,
c) n이 0인 경우에 단계 a), 또는 n이 0 이외의 값인 경우에 단계 b)에서 얻어진 2개 이상의 다른 이온을 질량분석기에서 트랩핑하는 단계, 이와 같이 트랩핑된 상기 2개 이상의 이온은 대상 분자의 특징을 갖고, 대상 분자의 특징인 질량-대-전하 비율 m/z를 갖는 것,
d) 이와 같이 트랩핑된 상기 특징적인 이온을 상기 질량분석기로부터 방출하는 단계, 및
e) 이와 같이 방출된 상기 특징적인 이온을 검출장치에 의해서 검출하는 단계.
특징적으로, 본 발명에 따른 방법에서, 상기 특징적인 이온을 단계 d)에서 동시에 방출하고, 단계 e)에서 동시에 검출한다.
본 발명자들은 상기 대상분자의 특징인 다양한 이온의 동시에 방출 및 검출에 의해서 처리될 데이터의 양을 상당히 감소시킬 수 있고, 따라서 사이클 및 분석 회수를 감소시킬 수 있는 것을 입증했다. 더 짧은 분석 사이클에 의해서, 다른 많은 분자를 연속적으로 검출할 수 있다. 이러한 가능성은 복합 분석을 필요로 하는 경우에 특히 유리하다.
또한, 대상 분자의 정량적인 분석이 대단히 유리하게 실시되면, 본 발명자들은 그 m/z 비율을 특징으로 하는 대상 분자의 특징인 다양한 이온의 동시의 방출은 시험된 시료에서 흥미있는 분자를 분석하기 위해서 사용할 수 있는 검출 신호의 신호/노이즈 비율을 상당히 개선시킨다. 이러한 신호/노이즈 비율의 개선에 의해서, 특히 공지된 MRM 방법에 비해서 방법의 정량 제한을 감소시킨다.
본 발명에 의한 방법은 그 상태에 관계없이 이온화될 수 있는 임의의 형태의 분자를 검출하는 데에 적당하고, 특히 펩티드, 리피드, 글리코리피드, 글리코프로테인, 헥산, 대사산물, 휘발성 화합물, 에스트로겐 형태의 작은 분자, 등을 검출하는 데에 적당하다.
본 발명의 방법이 실시될 수 있는 시료는 대상 분자를 함유할 수 있는 임의의 시료이다. 시료는 생물학적, 동물, 식물 또는 인간, 유기체일 수 있다. 체액의 종류 (예를 들면, 전체 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 유기 분비물), 조직 표본, 분리된 세포의 표본에 상응한다. 이러한 표본은 분석 전에 당업자에게 공지된 방법에 따라서 농축, 추출, 농도, 정제 형태를 제조하거나 제조할 수 있기 때문에 사용될 수 있다. 이러한 시료는 산업적 유래, 즉 비-제한 리스트에 따르는, 공기 표본, 물 표본, 표면, 성분 또는 제조된 제품 또는 식품 유래 제품으로부터 취한 표본일 수 있다. 식품 유래 시료중에서, 제한없이, 유제품(요거트, 치즈), 고기, 생선, 계란, 과일, 채소, 물 또는 드링크(우유, 과일주스, 소다, 등)를 들 수 있다. 이들 식품 유래 시료는 제조된 요리 또는 소스에 기인할 수 있다. 최종적으로, 식품 시료는 동물 사료, 예를 들면 특히 동물 먹이로부터 유도할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 특히 단백질의 프로테오티픽 펩티드를 분석하고 검출하기 위해서, 정제할 목적으로 시료를 전처리한다.
시료의 전처리는 당업자에게 널리 공지되고, 전기영동 또는 크로마토그래피 방법을 실시할 수 있다. 이들 분리방법만 사용하거나 서로 조합해서 사용되어 다차원 분리를 얻을 수 있다. 예를 들면,다차원 크로마토그래피는 상기 T. Fortin et al., above, H. Keshishian et al에 기재된 바와 같이, 이온교환 크로마토그래피에 의한 분리와 역상 크로마토그래피를 조합함으로써 사용될 수 있다. 이들 공보에서, 크로마토그래피 매질은 칼럼 또는 카트리지(고상 추출)일 수 있다.
프로테오티픽 펩티드의 전기 영동 또는 크로마토그래피 분율(또는 1차원 또는 다차원 크로마토그래피에서 유지시간)는 각각의 펩티드의 특징이고, 이들 방법을 실시해서 분석될 프로테오티픽 펩티드를 선택할 수 있다. 발생된 펩티드의 이러한 분별은 질량 분석에 의한 다음의 분석의 특이성을 증가시킬 수 있다.
펩티드를 분별하기 위한 전기영동 또는 크로마토그래피 방법에 대한 또 다른 방법은 N-글리코펩티드를 특이하게 정제하는 단계를 포함한다(J. Stal-Zeng et al., MCP, 2007, 1809-1817 and patent application WO 2008/066629). 그러나, 이러한 정제에 의해서 N-글리코실화 형태의 번역 후 개질을 실시한 펩티드를 정량화한다. 공교롭게도, 모든 단백질이 글리코실화되지 않아서 그 사용이 제한된다.
상기 펩티드를 분별하기 위한 또 다른 방법은 예를 들면 친화성 크로마토그래피에 의해서 흥미있는 펩티드를 면역정제하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 분석될 펩티드만(및 약간 오염된 펩티드)을 포함한 분율을 얻음으로써 시료의 복합성을 현저하게 감소시킬 수 있다. SISCAPA라고 하는 이러한 접근 방법은 상기 L. Anderson et al. 에 의해서 특허 출원 US 2004/0072251에 기재되어 있다.
바람직하게, 선택된 및 실시된 그 변동에 관계없이, 대상 분자가 단백질의 프로테오티픽 펩티드인 경우에 특히 유용하고 바람직하다.
이러한 경우에, 분석될 시료를 전처리해서 초기 시료에 존재한 모든 단백질로부터 펩티드를 발생시켜서, 이들 단백질을, 예를 들면 단백질 분해 효소(프로테아제)에 의한 소화 또는 화학제의 작용에 의해서 펩티드로 분해한다.
즉, 단백질의 절단은 물리화학적 처리, 생물학적 처리 또는 2개의 처리 조합에 의해서 실시될 수 있다. 사용될 수 있는 처리중에서, 하이드록실 라디칼, 특히 H2O2에 의한 처리를 들 수 있다. 하이드록실 라디칼에 의한 처리는 펩티드의 결합의 절단을 일으키고, 이는 단백질의 임의의 펩티드 결합에서 랜덤하게 발생한다. 하이드록실 라디칼의 농도에 의해서 실시된 절단 횟수를 조정하고, 따라서, 얻어진 펩티드 단편의 길이를 조정한다.
다른 화학적 처리는, 예를 들면 메티오닐 잔기의 카르복실기의 수준에서 펩티드 결합을 특이하게 절단하는 시아노겐 브로마이드(CNBr)에 의한 처리와 같이 사용될 수 있다. 단백질 용액을 트리플루오로아세트산에서 1000℃에서 가열함으로써 아스파르틸 잔기의 위치에서 부분적으로 산성 절단을 일으킬 수 있다.
그럼에도 불구하고, 효소 소화에 의한 단백질 처리가 바람직하다. 물리화학적인 처리에 비해서, 단백질의 구조가 더 많이 보존되며, 제어가 보다 용이하다. "효소 소화"는 적당한 반응 조건하에서 하나 이상의 효소의 별개의 또는 조합 작용을 의미한다. 프로테아제라고 하는 단백질 분해를 일으키는 효소는 특이한 부위에서 단백질을 절단한다. 일반적으로, 각각의 프로테아제는 동일한 절단을 실시한 아미노산 서열을 인지한다. 특정한 프로테아제는 하나의 아미노산 또는 절단을 실시한 2개의 아미노산 서열을 인지하고; 다른 프로테아제는 더 긴 서열을 인지한다. 이들 프로테아제는 엔도프로테아제 또는 엑소프로테아제일 수 있다. 공지된 프로테아제중에서, WO2005/098071에 기재된 바와 같이 하기를 들 수 있다:
-특정한 효소, 예를 들면 Arg 및 Lys 잔기의 카르복실산기에서 펩티드 결합을 절단하는 트립신, 리신의 -CO 기의 펩티드 결합을 절단하는 엔도리신, 방향족 잔기(Phe, Tyr 및 Trp)의 카르복실산기에서 펩티드 결합을 가수분해하는 키모트립신, 방향족 잔기(Phe, Tyr 및 Trp)의 NH2 기에서 절단하는 펩신, Glu 잔기의 카르복실산기에서 펩티드 결합을 절단하는 스타필로코커스 아우레우스의 V8 변종의 V8 프로테아제
-비특이성 효소, 예를 들면 소수성 아미노산(Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe)의 NH2기의 펩티드 결합을 가수분해하는 박테리아 바실러스 써머프로테오리티쿠스로부터 발생한 써모리신, 및 실제로 모든 결합을 가수분해하고 제어된 반응 조건(효소 농도 및 반응시간)하에서 단백질을 올리고펩티드로 변환할 수 있는 세균성 프로테아제인 섭티리신 및 프로나제.
작용 모드가 상용가능하거나 연속적으로 사용될 수 있다면, 여러 프로테아제가 동시에 사용될 수 있다. 본 발명의 점에서, 시료의 소화는 프로테아제 효소, 예를 들면 트립신의 작용에 의해서 실시되는 것이 바람직하다.
이러한 처리 단계는 초기의 시료에 존재하는 단백질로 나타낸 큰 분자를 흥미있는 시료에 존재할 더 작은 분자인 펩티드로 변환할 수 있다. 질량 분석에 의해서 얻어진 검출의 감도가 증가한다. 또한, 처리 단계는 소정의 목적 단백질에 대해서 리포터 펩티드(reporter peptide)라고 하는 여러 프로테오티픽 펩티드를 발생할 수 있다.
각각의 프로테오티픽 펩티드의 특이성은 예를 들면 그 외의 단백질이 동일한 펩티드 서열을 포함하지 않거나 그 외의 전이가 간섭하지 않는 것을 보장함으로써 입증되어야 한다. 이와 같이, 처리는 분석될 단백질에 대해서 특이한 하나 이상의 프로테오티픽 펩티드를 얻을 가능성을 증가시킬 수 있다. 각각의 프로테오티픽 펩티드는 독립적인 분석에 의해서 단백질을 정량화할 수 있다.
또한, 복합 유체(혈액, 혈청, 혈장, 소변, 대변, 가래 등)에서 수 ng/mL의 농도의 단백질의 분석에 적합한 감도 및 특이성을 확인하기 위해서, 질량분석법에 의한 정량적인 분석은 소화 단계 이외에, 예를 들면 소화 단계 근방에 다른 단계를 배치해서 진행할 필요가 있다.
상태 1: 대상 단백질에 상응하지 않는 현저한 단백질을 제거하기 위해서, 단백질 분별 또는 그 밖에 임의의 적당한 방법, 예를 들면 전기영동, 크로마토그래피, 면역포획에 의해서 시료의 정제(Kulasingam et al., J. Proteome Res., 2008, 640-647). 그러나, 후자의 방법은 대상 단백질에 대한 특이한 항체의 존재 또는 제조를 필요로 하고, 이는 얻는 데에 시간이 오래 걸리며 고가일 수 있다. 또한, 다음의 질량분석법에 의한 분석의 성능 수준은 항체의 품질 및 특이성에 부분적으로 결합될 것이다.
상태 2: 변성, 환원 및 티올기의 블록킹
상태 3: 소화
상태 4: 펩티드 분별
상태 2는 재생산성 및 신뢰성의 점에서, 소화량을 증가시킬 수 있으며 양호한 분석 안정성을 보장한다. 높은 감도가 필요하지 않은 경우, 상태 1 및 4는 선택적이다(L.　Anderson & C. Hunter, MCP, above). 한편, 높은 감도가 필요할 경우 (수 ng/mL), 이들이 필요하다. 이것은 상기 T. Fortin et al., H. Keshishian et al., MCP, 2007, 2212-2229　및 V. Kulasingam et al., J. Proteome Res., 2008, 640-647, L.　Anderson et al., J. Proteome Res., 2004, 235-2344 및 US　2004/0072251에 의해서 증명된 것이다. 또한, 질량분석법의 크로마토그래피 상류에 의한 펩티드의 분리는 오염된 펩티드의 수를 감소시킴으로써 부가적인 특이성 수준을 제공한다(M. Duncan et al., Proteomics, 2009, 9:1124-1127).
본 발명의 방법에서, 실시된 이온화 단계 a)는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해서 실시될 수 있다. 이온화 소스에 의해서 분자를 기화시키고 이온화할 수 있다. 이온화 소스는 포지티브 이온을 연구하기 위한 포지티브 모드 또는 네가티브 이온을 연구하기 위한 네가티브 모드에서 사용될 수 있다. 여러 타입의 소스가 존재하고 원하는 결과 및 분석된 분자에 따라서 사용될 것이다. 특히,
- 전자 이온화(EI), 화학 이온화(CI), 및 탈착-화학 이온화(DCI),
- 빠른 원자 충격(FAB), 준안정 원자 충격(MAB) 또는 이온 충격(SIMS, LSIMS),
- 유도 결합 플라즈마(ICP),
- 대기압 화학 이온화(APCI) 및 대기압 광이온화(APPI),
- 전기분무 이온화(ESI),
- 매트릭스-지원 레이저 탈리 이온화(MALDI), 표면 향상 레이저 탈리 이온화(SELDI) 또는 실리콘에 대한 탈리/이온화(DIOS),
- 준안정 종과 상호작용에 의한 이온화-탈리(DART).
특히, 이온화는 다음과 같이 실시될 수 있다: 대상 분자를 함유한 시료를 이온화 소스에 도입하고, 분자를 기체 상태로 이온화하여 초기 분자에 상응한 분자 이온으로 변환시킨다. 이온화 소스에 의해서 분자를 이온화하고, 포지티브 모드에서 하나, 2개, 또는 심지어 3개 이상의 추가의 프로톤을 갖고 따라서 하나, 2개, 또는 3개 이상의 전하를 갖는, 액체상태로 존재한 분자에 상응한 분자를 이온을 얻을 수 있다.
예를 들면, 대상 분자가 단백질인 경우, 포지티브 모드에서 조작한 전기분무 형태의 소스에 의해서, 대상 단백질을 분별한 후에 얻어진 프로테오티픽 펩티드의 이온화에 의해서, 하나, 2개 또는 3개 이상의 추가의 프로톤을 갖고, 따라서 하나, 2개 또는 3개 이상의 전하를 갖는 기체 상태의 폴리펩티드 이온을 형성하고, 액체 상태로부터 기체상태로 변환이 가능하다(Gaskell, Electrospray: principles and practise, J. Mass Spectrom. (1997), 32, 677-688). 이러한 형태의 소스는 얻어진 대상 분자 또는 프로페오티픽 펩티드가 역상 액체 크로마토그래피에 의해서 미리 분리되는 경우에 특히 안정하다. 그럼에도 불구하고, 시료에 존재한 분자의 이온화로부터 생성량은 존재하는 다양한 종의 농도 및 상태에 따라서 변화할 수 있다. 이러한 현상은 당업자에게 공지된 매트릭스 작용을 일으킨다.
MALDI 이온화 소스는 고체 상태의 시료로부터 분자를 이온화할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 트랩핑 단계 b)가 실시된 질량분석기는 질량/전하 비율(m/z)에 의한 이온을 분리할 수 있다.
당업자에게 공지된 임의의 질량분석기가 사용될 수 있다. 4중 극자(Q), 3D 이온 트랩(IT) 또는 선형 이온 트랩(LIT) 형태의 저해상도 분석기, 및 검체의 정확한 질량을 측정하고, 특히 전기 부분에 결합된 자기 부분을 사용한 고해상도 분석기, 비행시간(TOF)를 들 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 특징에 따라서, 단계 c)에서 사용된 질량분석기는 이온 트랩이다. 이러한 이온 트랩이 m/z 비율에 따른 이온의 선택, 또한 m/z 비율이 흥미있는 대상 분자의 특징인 이온의 동시의 방출이 가능한 이점을 갖는다. 바람직하게, 이러한 이온 트랩은 3D 또는 선형 형태일 수 있다.
이러한 이온 트랩의 사용에 의해서, 대상분자의 특징인 질량 대 전하 비율 m/z을 갖는 이온의 방출은 이온 트랩에서 무선주파수에 의해서 동시에 이온을 공명시킴으로써 실시된다. 이들 무선주파수는 이온 트랩의 구성 전극의 공급 전압의 변화에 의해서 제공된다. 방출된 이온의 모든 무선주파수를 포함한 광대역 무선주파수가 인가될 수 있다. 사용된 무선주파수 범위가 일련의 무선주파수 밴드의 중첩에 상응할 수 있고, 각각은 방출될 이온의 트랩에서 특징적인 진동 주파수 또는 영년 운동(secular motion)의 주파수에 집중한다(R. E. March, Int. J. Mass Spectrom., 1997, 32: 351.).
바람직하게, 각각의 밴드는 방출된 이온의 영년 운동의 특징적인 주파수에 집중된 무선주파수 밴드에 상응할 것이다. 다른 질량 대 전하 비율 m/z 값을 갖는 다양한 이온의 동시의 방출이 얻어진다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 특징에 따르면, 대상 분자의 특징인 질량 대 전하 비율 m/z를 갖는 이온의 방출 및 검출 전에, 질량분석기를 비운다. 예를 들면, 다음에 방출된 특징적인 이온의 무선 주파수를 포함하지 않는 광대역 무선주파수가 인가될 수 있다. 사용된 무선주파수 범위는 일련의 무선주파수 밴드를 포함하고, 각각은 특징적인 이온의 영년 운동의 특징적인 주파수에 집중한다.
바람직하게, 각각의 부재 밴드는 특징적인 이온의 영년 운동의 특징적인 주파수에 집중된 무선주파수 밴드에 상응할 것이다. 다음에 방출될 질량분석기에 존재한 모든 이온의 동시의 방출이 얻어지고, 선택된 다양한 특징적인 이온을 제외한다.
본 발명의 방법은 n 값에 따른 MSn +1 일 수 있고, n은 분해 단계가 실시된 회수에 상응한 정수이다.
따라서, 본 발명의 방법이 1회의 MS이면, n은 0이고, 단계 b)를 갖지 않으며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 시료의 분자를 하나 이상의 이온화 장치에 의해서 이온화하여 분자 이온을 얻는 단계,
c) 단계 a)에서 얻어진 2개 이상의 다른 이온을 질량분석기에서 트랩핑하는 단계, 이와 같이 트랩핑된 상기 2개 이상의 이온은 대상 분자의 특징을 갖고, 대상 분자의 특징인 질량-대-전하 비율 m/z를 갖는 것,
d) 이와 같이 트랩핑된 상기 특징적인 이온을 상기 질량분석기로부터 방출하는 단계, 및
e) 이와 같이 방출된 상기 특징적인 이온을 검출장치에 의해서 검출하는 단계.
특징적인 이온이 단계 d)에서 동시에 방출되고 단계 e)에서 동시에 검출된 것을 알 수 있다.
본 발명의 방법이 1회의 MS가 아닌 경우에, n은 1,2, 3 또는 4이다.
하나의 실시 변형에 따르면, 본 발명의 방법은 MS/MS이어서, n이 1이고, 단계 c)에서 트랩핑된 2개 이상의 다른 이온이 제 1 발생 단편 이온이다.
이 경우에, 본 발명의 방법은 다음의 단계를 포함한다.
a) 시료의 분자를 하나 이상의 이온화 장치에 의해서 이온화하여 분자 이온을 얻는 단계,
b) 하기의 단계 (i) 및 (ii)가 1 회 실시되고:
(i) 상기 단계에서 얻어진, 전구체 이온이라고 하는 하나 이상의 이온을 대상 분자에 따라서 질량분석기에서 선택하는 단계, 및
(ii) 이와 같이 선택된 하나 이상의 이온을 분해 셀에서 분해하여 2개 이상의 제 1 발생 단편 이온을 제공하는 단계,
c) 단계 b)에서 얻어진 2개 이상의 다른 이온을 질량분석기에서 트랩핑하는 단계, 이와 같이 트랩핑된 상기 2개 이상의 이온은 대상 분자의 특징을 갖고, 대상 분자의 특징인 질량-대-전하 비율 m/z를 갖는 것,
d) 이와 같이 트랩핑된 상기 특징적인 이온을 상기 질량분석기로부터 방출하는 단계, 및
e) 이와 같이 방출된 상기 특징적인 이온을 검출장치에 의해서 검출하는 단계.
특징적인 이온이 단계 d)에서 동시에 방출되고 단계 e)에서 동시에 검출되는 것을 알 수 있다.
이 경우에, 단계 b)에서 질량에 따른 이온을 선택하기 위해서 사용된 질량분석기는 당업자에게 공지된 임의의 질량분석기이고, 예를 들면 이온 트랩 또는 4중 극자 분석기이다.
선택된 이온의 분해는 중성 기체, 예를 들면 알곤 또는 질소와 충돌, 강한 광소스에 의한 광 여기 또는 광 분해, 전자 또는 자유라디칼 종과 충돌, 포텐셜 차의 적용, 또는 임의의 다른 활성 모드에 의해서 실시된다. 이온의 분해는 3중-4중 극자 형태 (L. Anderson & C. Hunter, MCP, 2006, 573-588) 또는 이온 트랩 형태(B. Han & R. Higgs, Brief Funct Genomic Proteomic. 2008 Sep;7(5):340-54), 또는 그외의 비행 시간(TOF) 형태(K.-Y. Wang et al., Anal Chem, 2008, 80(16) 6159-6167)의 모델과 같은 분해 셀에서 실시되고, 이온 분리 가능하다.
분해가 비활성기체, 예를 들면 질소 또는 알곤과 충돌에 의해서 실시되는 경우, 전기장에서 실시되고, 또는 비행 시간 튜브에서 포텐셜 차의 적용에 의해서만 실시된다. 전기장의 특징은 분해의 세기 및 상태를 조절한다. 따라서, 비활성 기체의 존재하에서, 예를 들면 4중 극자에 인가된 전기장은 이온에 공급된 충돌에너지를 조절한다. 이러한 충돌에너지는 당업자에 의해서 최적화되어 사용된 분광장치에 따라서 분석될 전이의 감도를 증가시킬 것이다. 일례로, Applied Biosystems (Foster City, United States of America)로부터 AB SCIEX QTRAP? 5500 질량분석기에서 q2에서 충돌에너지를 5 내지 180 eV로 변화시킬 수 있다. 마찬가지로, 이온 트랩 내에서 충돌단계 기간 및 여기 에너지는 당업자에 의해서 최적화되어서 가능한 높은 감도로 분석할 것이다. 일례로, Applied Biosystems에 의한 AB SCIEX QTRAP? 5500 질량분석장치에서 Q3에서 여기 시간이라고 하는 이러한 기간을 0.010 내지 50 ms 및 여기 에너지를 0 내지 1 (임의의 유닛)에서 변화시킬 수 있다.
또 다른 형태에 따르면, 본 발명의 방법이 MS/MS/MS이어서 n은 2이고 단계 c)에서 트랩핑된 2개 이상의 다른 이온이 제 2 발생 단편 이온이다.
이 경우에, 본 발명의 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 시료의 분자를 하나 이상의 이온화 장치에 의해서 이온화하여 분자 이온을 얻는 단계,
b) 하기의 단계가 실시되고:
(i) 상기 단계에서 얻어진 전구체라고 하는 하나 이상의 이온을 질량분석기에서 대상 분자에 따라서 선택하는 단계, 및
(ii) 이와 같이 선택된 하나 이상의 이온을 분해 셀에서 분해하여 제 1 발생 단편 이온을 제공하는 단계,
(iii) 하나 이상의 제 1 발생 단편 이온을 대상 분자에 따라서 질량분석에서 선택하는 단계, 및
(iv) 상기 선택된 하나 이상의 이온을 분해 셀에서 분해해서 2개 이상의 제 2 발생 단편 이온을 제공하는 단계,
c) 단계 b)에서 얻어진 2개 이상의 다른 제 2 발생 단편 이온을 질량분석기에서 트랩핑하는 단계, 이와 같이 트랩핑된 상기 2개 이상의 이온은 대상 분자의 특징을 갖고, 대상 분자의 특징인 질량-대-전하 비율 m/z를 갖는 것,
d) 이와 같이 트랩핑된 상기 특징적인 이온을 상기 질량분석기로부터 방출하는 단계, 및
e) 이와 같이 방출된 상기 특징적인 이온을 검출장치에 의해서 검출하는 단계.
특징적인 이온이 단계 d)에서 동시에 방출되고 단계 e)에서 동시에 검출되는 것을 알 수 있다.
이 경우에, 단계 b)에서 질량에 따라서 이온을 선택하기 위해서 사용된 질량분석기는 당업자에게 공지된 임의의 질량분석기이고, 예를 들면 이온 트랩 또는 하이브리드 3중-4중 극자 (Q1q2Q3) 이온 트랩분석기이고, 이는 4중 극자 Q3가 3D 또는 선형 이온 트랩 모드에서 조작한 점에서 4중 극자 분석기와 다르다.
본 발명에 따른 방법이 탄뎀 질량분석(MS2, MS3, MS4 또는 MS5)을 실시하면, 여러 질량분석기는 함께 결합될 수 있다. 예를 들면, 제 1 분석기는 이온을 분리하고, 충돌 셀에 의해서 이온을 분해할 수 있고, 제 2 분석기는 단편 이온을 분리한다. 일부 분석기, 예를 들면 이온 트랩 또는 FT-ICR은 하나에서 여러 분석기를 구성하고, 이온을 분해하고 직접 단편을 분석할 수 있다.
본 발명의 방법은 특히, 제한없이 MRM3라는 분광 방법에 적용될 수 있다. 이러한 방법에 의해서, 하이브리드 3중-4중 극자 이온 트랩 형태의 실험적 분석기 구성이 가장 일반적으로 사용된다. 이러한 질량분석기 구성은 매우 양호한 감도 및 양호한 검출감도를 표시하고, 이는 복합 시료, 예를 들면 체액의 시료에서 단백질의 양호한 정량을 실시하는 데에 매우 중요하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따라서, 실시된 분석은 MSn +1 형태이고, n은 1, 2, 3 또는 4이다:
-단계 b)에서 사용된 질량분석기는 이온 트랩 또는 4중 극자이다
-분해 셀은 이온트랩 또는 4중 극자이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 하나의 MS 이외의 모드에서, 단계 b) 및 c)는 하나의 장치, 즉 이온 트랩에서 실시되고, 이는 사용된 물질을 간단하게 한다.
일반적으로, 본 발명의 방법에서 특이적 단편 이온의 동시의 방출 및 이온 트랩에서 존재한 오염된 이온의 방출 전에 이들의 동시의 검출을 고안하고 실시할 수 있다. 이러한 경우에, 다음에 방출될 특징적인 이온의 무선주파수를 포함하지 않는 광대역 무선주파수가 인가된다.
이러한 방법은 4중 극자에서 동일한 분자의 이온화에 기인한 다른 m/z 값을 갖는 분자 이온의 동시의 전송을 위해서 G. Cooks [Q. Song et al. Anal . Chem . 2009, 81, 1833-840] 그룹에 의해서 최근에 공개된 공보에 따른 장치에서 흥미롭다. 이러한 경우에, 2개의 분자 이온의 분해에 의한 단편 이온을 동시에 방출하기 위해서, 동일한 분자로부터 2개의 분자 이온을 동시에 트랩핑하고 분해할 수 있다.
상기 대상 분자에 상관관계를 갖도록 검출된 특징적인 이온은 당업자에 의해서 표준 방법에 따라서 선택된다. 이들의 선택은 동시에 재현성 및 신뢰성에 대해서 가능한 민감하고, 특이적이고 안정한 분석이 가능하다. 프로테오티픽 펩티드 (m/z)1, 및 제 1 발생 단편 (m/z)2, 을 선택하기 위해서 개발된 방법에서, 선택은 본질적으로 반응 세기에 기초한다. 더욱 상세하게, V. Fusaro et al., Nature Biotech. 27; 2009; 190-198을 참조할 수 있다. 시판 소프트웨어, 예를 들면 Applied Biosystems 또는 그 밖의 MRMaid로부터 MIDAS 및 MRM Pilot 소프트웨어 (J. Mead et al., MCP, Nov 15, 2008, E-pub) 는 당업자에 의해서 사용되어 모든 가능한 전이 쌍을 예상할 수 있다. 이들은 과학 커뮤니티에 의해서 기재된 모든 펩티드 MRM 전이를 편집하기 위해서 F. Desiere et al. (Nucleic Acids Res. 2006, Jan 1; 34(database issue): D655-8)에 의해서 실시된 PeptideAtlas라고 하는 데이터베이스를 사용할 수 있다. 이러한 PeptideAtlas 베이스는 인터넷에 자유로운 접근이 가능하다. 비-단백질 분자에 대해서, 데이타베이스, 예를 들면 Applied Biosystems (United States of America)로부터 Cliquid 소프트웨어를 통해서 접근가능한 400 살균제의 베이스를 사용할 수 있다.
단계 e)에서 선택된 특징적인 이온의 검출은 종래에 특히 검출기 및 처리시스템에 의해서 실시된다. 검출기는 방출된 이온을 수집하고 전기적 신호를 생성하며, 그 강도는 수집된 이온의 양에 따라서 다르고, 이러한 신호를 증폭시켜서 전산처리할 수 있다. 이온수가 많을수록, 전류가 높아진다. 얻어진 전기 신호는 검출기에 동시에 방출된 모든 수집된 이온에 상응한다.
검출기에 결합된 처리 시스템은 종래에 검출기에 의해서 수신된 정보를 분석하고 정량화할 수 있는 데이터 처리 전산 시스템이며, 이 경우에 선택된 이온에 의해서 유도된 전류 세기는 대상 분자의 양에 비례한다.
동시에 방출 및 동시에 검출 후에, 검출된 특징적인 이온을 정량화해서 대상 분자를 정량화할 수 있다.
그럼에도 불구하고, 검출된 이온에 의해서 유도된 전류의 양을 분석된 대상 분자의 양과 상관관계를 갖기 위해서 검량이 필요하다. 이와 같이 측정된 전류 세기는 존재하는 대상 분자의 양을 결정하기 위한 정량적인 측정 수단으로서 역할을 할 수 있고, 이는 mol/㎥ 또는 kg/㎥ 형태의 국제 유닛(SI 유닛)으로 표시하고, 또는 이들 유닛의 배수 또는 약수, 또는 그 배수 또는 약수를 포함한 SI 유닛의 일반적인 도함수에 의해서 표시하는 것을 특징으로 한다. 비제한 예로서, 유닛, 예를 들면 ng/mL 또는 fmol/L는 정량적인 측정을 특징으로 한 유닛이다.
이에 대해서, 종래에 질량분석법에 사용된 검량은 본 발명의 문맥에서 실시될 수 있다. MRM 분석은 종래에 외부의 표준, 또는 바람직하게 T.Fortin 등에 의해서 기재된 내부 표준을 사용하여 검량한다. 대상분자가 프로테오티픽 펩티드인 경우, 대상 프로테오티픽 단백질의 정량적인 측정 및 양과 흥미있는 단백질의 정량적인 측정 및 양 사이의 상관관계는 분석될 양이 공지된 표준 신호에 대해서 측정된 신호를 검량함으로써 얻어진다. 검량은 검량곡선에 의해서 실시될 수 있는데, 이러한 검량곡선은 예를 들면 다양한 농도에서 표준 프로테오티픽 펩티드의 연속적인 주입(외부 검량)에 의해서 얻어지거나, 또는 바람직하게 하기 기재된 AQUA, QconCAT 또는 PSAQ방법에 따르는 무거운 펩티드를 내부 표준으로서 사용한 내부 검량에 의해서 얻어질 수 있다. "무거운 펩티드"는 프로테오티픽 펩티드에 상응하는 펩티드를 의미하지만, 하나 이상의 탄소 12(12C) 원자는 탄소 13(13C)으로 대체되고, 및/또는 하나 이상의 질소 14(14N) 원자는 질소 15(15N)로 대체된다.
내부 표준(AQUA)으로서 무거운 펩티드의 사용은 특허출원 US　2004/0229283에서 상기 S.A. Gerber et al에 의해서 제안되었다. 원리는 일반적인 천연 동위체보다 무거운 동위체를 포함한 아미노산에 의해서 프로테오티픽 펩티드를 인공적으로 합성한 것이다. 이러한 아미노산은 예를 들면 일부 탄소 12(12C)원자를 탄소 13(13C)로 대체하거나, 일부 질소 14(14N)원자를 질소 15(15N)로 대체함으로써 얻어진다. 이와 같이 합성된 인공적인 펩티드(AQUA)는 천연 펩티드와 완전히 동일한 물리화학적 특성을 갖는다(높은 질량 제외). 일반적으로, 예를 들면 흥미있는 시료의 단백질의 절단을 일으키는 처리와 상기 처리단계 후 얻어진 펩티드의 분별 사이에서, 질량분석법에 의해서 분석한 상부 흐름 시료에 소정의 농도로 부가한다. 결과적으로, AQUA 펩티드는 펩티드의 분별동안 분석될 천연 펩티드와 함께 정제된다. 2개의 펩티드는 분석용 질량분석장치에 동시에 주입된다. 이들은 소스에서 동일한 이온화 생성을 실시한다. 천연펩티드의 피크 영역과 AQUA 펩티드의 피크 영역 사이의 비교에 대해서 공지된 농도에 의해서 천연 펩티드의 농도를 산출하고 따라서 분석될 단백질의 농도를 산출할 수 있다. AQUA 방법의 변화는 J.-M. Pratt et al. (Nat. Protoc. 2006, 1:1029-1043) 에 의해서 QconCAT으로 제안되었다. 이러한 변화는 특허 출원 WO　2006/128492에 기재되어 있다. 다양한 AQUA 펩티드를 연결하는 단계 및 인공 폴리펩티드를 무거운 재조합 단백질의 형태로 제조하는 단계를 포함한다. 재조합 단백질은 무거운 동위체를 포함한 아미노산에 의해서 합성된다. 이와 같이 해서, 낮은 비용으로 여러 단백질의 동시의 분석을 검량하기 위한 표준을 얻을 수 있다. QconCAT 표준은 초기부터, 단백질 분별, 변성, 환원 후 단백질 티올기의 블록킹 단계(이러한 단계가 존재한다면) 전에 단백질 절단을 일으키는 처리의 상류에 첨가된다. QconCAT 표준은 천연 단백질과 동일한 단백질의 절단을 일으키는 동일한 처리 사이클을 실시하고, 이는 단백질의 절단을 일으키는 처리 단계의 수율을 고려할 수 있다. 즉, 특히 천연 단백질의 소화에 의한 처리는 완전하지 않을 수 있다. 이 경우에, AQUA 표준의 사용은 실제보다 적은 천연 단백질의 양을 생성할 수 있다. 절대적인 분석을 위해서, 단백질의 절단을 일으키는 처리로부터 수율을 고려하는 것이 중요할 수 있다. 그러나, V. Brun et al. (MCP, 2007, 2139-2149) 는 QconCAT 표준은 의심의 여지없이 QconCAT 단백질의 3차원 구조가 다르기 때문에 특히 천연 단백질의 소화에 의한 처리에서 수율을 정확하게 재현하지 못하는 경우가 있는 것을 알았다.
V. Brun et al. 는 특허 출원 WO　2008/145763에 기재된 PSAQ라고 하는 방법을 사용해서 제안했다. 이 경우에, 내부 표준은 천연 단백질과 동일한 서열을 갖는 재조합 단백질이지만, 무거운 아미노산에 의해서 합성된다. 상기 합성은 생체외에서 무거운 아미노산에 의해서 실시된다. 이러한 표준은 천연 단백질과 완전히 동일한 물리화학적 특성을 갖는다(높은 질량 제외). 이는 초기부터 단백질 분별 단계(상기 단계가 존재한다면) 전에 첨가된다. 단백질 분별단계 중에 천연 단백질과 함께 정제된다. 특히 소화에 의해서 천연 단백질과 동일한 처리 수율을 나타낸다. 펩티드 분별 단계가 실시된다면 절단 후에 얻어진 무거운 펩티드는 천연 펩티드와 함께 정제된다. 2개의 펩티드는 동시에 질량분석기로 주입되어 정량적으로 분석된다. 이들은 소스 내에서 동일한 이온화가 생성된다. 모든 단계의 분석 방법을 고려하면서, 천연 펩티드의 피크 영역과 PSAQ 방법에서 참조 펩티드의 피크 영역의 비교에 의해서 분석될 단백질의 농도를 산출할 수 있다.
질량 분석방법에 의한 분석 및 특히 MRM 또는 MS 분석에서 사용된 모든 이들 방법, 즉 AQUA, QconCAT 또는 PSAQ 또는 임의의 다른 검량 방법을 실시하여 본 발명의 점에서 검량을 실시할 수 있다.
본 발명의 방법 및 그 이점은 다양한 생물학적 용액의 질량분석법에 의한 분석의 점에서 본 발명의 방법의 3개의 예시의 실시형태에 관한 본 명세서의 하기의 부분에 기재될 것이다. 이들 시료는 수반된 도면을 참조한다,
본 발명은 질량분석법에 의해서 시료에서 하나 이상의 대상 분자를 검출하기 위한 방법에 관한 것이며, a) 시료의 분자를 이온화는 단계,
b) 하기의 단계 (i) 및 (ii)는 n 회 실시되고, n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다:
(i) 상기 단계에서 얻어진 하나 이상의 이온을 질량분석기에서 대상 분자에 기초해서 선택하는 단계, 및
(ii) 이와 같이 선택된 이온을 분해 셀에서 분해하는 단계,
c) n이 0인 경우에 단계 a), 또는 n이 0 아닌 경우에 단계 b)에서 얻어진 2개 이상의 다른 이온을 질량분석기에서 트랩핑하는 단계, 이와 같이 트랩핑된 상기 2개 이상의 이온이 대상 분자의 특징인 질량-대-전하 비율 m/z을 갖는 단계,
d) 이와 같이 트랩핑된 상기 특징적인 이온을 상기 질량분석기로부터 방출하는 단계, 및
e) 이와 같이 방출된 상기 특징적인 이온을 검출장치에 의해서 검출하는 단계. 본 발명의 방법은 상기 특징적인 이온이 단계 d)와 동일한 시간에 방출되고 단계 e)와 동일한 시간에 검출되는 것을 특징으로 한다.
도 1은 실시예 1에서 사용된 TP171 단백질의 배치 No.1의 MS 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 2a는 실시예 2에서 처리된 여성 혈청에서 200㎍/mL의 농도를 갖는 PSA 단백질의 시료에 대해서 9.08분에 636.8　Th 이온의 MS2 스펙트럼을 도시한다.
도 2b는 실시예 2에서 처리된 여성 혈청에서 200㎍/mL의 농도를 갖는 PSA 단백질의 시료에 대해서 9.08분에 제 1 발생 단편 이온의 총합의 크로마토그램을 도시한다.
도 3a는 실시예 3에서 처리된 여성 혈청에서 1㎍/mL의 농도를 갖는 PSA 시료에 대해서, 11.914 내지 12.058 minute 사이에 636.8　Th 전구체 이온에 의한 제 1 발생 단편 472.3 Th의 MS3 스펙트럼을 도시한다.
도 3b는 실시예 3에서 처리된 여성 혈청에서 1㎍/mL의 농도를 갖는 PSA 시료에 대해서, 11.98분에 제 1 발생 단편 이온의 총합의 크로마토그램을 도시한다.
다음에 기재된 실시예에서, 본 발명의 방법은 Applied Biosystems (Foster City, United States of America)로부터 AB Sciex QTRAP? 5500 LC/MS/MS 3중-4중 극자 이온-트랩 분석 장치를 사용해서 실시되었다.
실시예 1: 이온트랩.MS 분석에서 리포터 프로테오티픽 펩티드의 동시의 방출에 의해서 재조합 단백질의 순도의 검사
TP171 재조합 단백질은 서열 SEQ ID No . 1을 갖는, 매독(syphilis)에 의한 제제인 Treponema pallidum의 재조합 단백질이다.
SEQ ID No . 1:
MRGSASFSSIPNGTYRATYQDFDENGWKDFLEVTFDGGKMVQVVYDYQHKEGRFKSQDADYHRVMYASSGIGPEKAFRELADALLEKGNPEMVDVVTGATVSSQSFRRLGAALLQSARRGEKEAIISRGSSKYKYHHHHHH.
TP171 재조합 단백질의 3개의 배치는 다음의 프로토콜에 따라서 소화된다:
- 50 mM 비카르보네이트 3mL, pH 8.0에서 최종 농도 10 ㎍/mL를 얻기 위해서 TP171 용액의 희석
- 최종 농도 15 mM을 얻도록 디티올트레이톨(DTT)의 첨가
- 60℃에서 40분동안 환원
- 튜브를 실내온도로 냉각
- 최종 농도 25 mM를 얻도록 이오도아세트아미드 첨가
-실내온도에서 암실에서 40분동안 알킬화
-1/30의 비율로 트립신 첨가
-37℃에서 4시간동안 소화
-10mM의 최종농도를 얻도록 DTT의 첨가
-60℃에서 40분동안 환원
-튜브를 실내온도에서 냉각
최종 농도 10% ACN 및 0.5% 포름산을 얻도록 아세토니트릴(ACN) 및 포름산 첨가.
얻어진 시료를 10㎕/min의 유속으로 AB Sciex QTRAP?5500 질량분석기의 이온화 소스에 연속적으로 직접 주입한다. 질량분석기의 3중-4중 극자를 이온트랩 모드에서만 사용하고, 4중 극자는 4중 극자 Q3의 트랩에서 이온을 안내하는 역할을 한다.
본 발명의 방법에 사용된 동시의 방출 모드를, 모든 이온을 연속적으로 방출하기 위해서 트랩에서 스캔을 실시하는 단계를 포함한 EMS 모드(Enhanced Mass Spectrometry) 와 비교한다.
사용된 다른 기계 변수는 다음 표시에 기재된다:
극성 Positive
이온화 소스 Turbo V™(Applied BioSystems)
Q3에서 선형 이온 트랩 충전 시간 0.05 과 250.00 ms 사이
커튼 기체 압력 30.00 psi
콘 전압 5500.00 V
분무 기체 압력 25.00 psi
관찰된 총신호를 측정한다(Total Ion Count, TIC). 시료에 존재한 모든 이온은 관찰된 신호에 기인한다.
EMS 모드에서, 총신호를 분해하고 모든 질량의 스캔에 의해서 배치 No.1에 대해서 도 1에 나타낸 질량 스펙트럼을 얻을 수 있다. 350 내지 800 Th에서, 스캔 시간은 1000 Da/s의 속도에서 450.1 ms이다.
분석된 혼합물은 오염 이온 및 프로테오티픽 이온을 함유하고, 후자는 TP 171 단백질의 특징이다. 이들 프로테오티픽 이온 및 그 특징적인 질량-대-전하 비율 m/z가 이하 표 2에 기재된다.
프로테오티픽 이온 서열 m/z
ELADALLEK SEQ ID No. 2 501.6 (이중 충전된 이온)
DFLEVTFDGGK SEQ ID No. 3 614.3 (이중 충전된 이온)
EAIISR SEQ ID No. 4 688.6 (하나 충전된 이온)
MVQVVYDYQHK SEQ ID No. 5 713.4 (산화된 메티오닌으로 이중 충전된 이온)
표 3에서 기재된 바와 같이, 비율은 모든 프로테오티픽 이온에 의해서 얻어진 신호를 총 이온(오염 이온 + 프로테오티픽 이온)에 의해서 얻어진 신호로 나눔으로써 생성된다.
TP171 배치 프로테오티픽 이온/총이온 비율
1 0.068
2 0.069
3 0.047
얻어진 비율은 TP171에 대해서 시료의 순도의 대표적인 값이다. 이들은 참조 배치와 비교해서 TP171의 배치의 순도를 쉽고 빠르게 평가할 수 있다. 따라서, 배치 No.2는 배치 No.1(참조 배치)와 유사한 순도를 갖는 반면, 배치 No.3은 덜 순수하다.
또한 및 비교하면, 동일한 실험을 본 발명의 방법에 따라서 실시한다. 프로테오티픽 이온을 하나 이상의 전극에 무선주파수 전압의 중첩을 적용함으로써 간단하고 빠르게(1.6 ms) 동시에 방출된다. 각각의 프로테오티픽 이온에 대해서, 이러한 이온의 영년 운동의 특징적인 주파수에 대해서 집중된 주파수 노치를 적용한다. 노치의 주파수 폭은 각각의 이온의 이론적 질량에 대해서 0.7 질량 유닛의 윈도우에 상응한다. 적용된 전압은 이들 다양한 노치의 총합이다.
동시에 방출되고 검출된 프로테오티픽 이온의 질량이 표 2에 제공된다.
이와 같이 적용된 광대역 웨이브에 의해서 0.8 ms에서 모든 프로테오티픽 이온을 방출했다. 얻어진 신호 S1를 측정한다.
트랩에서 트랩핑된 모든 잔류 이온을 0.8 ms에서도 동시에 방출하여 이를 비운다. 얻어진 신호 S2를 측정한다.
S1을 (S1+S2)로 나눈 값을 산출한다.
이러한 신호 비율을 얻은 경우에, EMS 방법을 사용해서 표 3에서 얻어진 값과 정확하게 동일한 값이 얻어지는 것을 주목한다.
본 발명의 분석방법은 이들 프로테오티픽 이온을 통해서 TP171의 분석이 가능하고, 이는 훨씬 짧은 시간을 제외하고, EMS 방법과 같이 정확하다.
실시예 2: 복합 혼합물에서 높은 농도의 단백질을 3중-4중 극자 Q1q2Q3 구성을 갖는 AB Sciex QTRAP?5500 LC/MS/MS 질량분석기를 사용하여 1회 분해 사이클로 측정하고, 상기 4중 극자 Q3는 이온 트랩모드.MS/MS분석에서 조작한다
PSA의 5mg (English company Scipac에 의한 프로스테이트 특이적 항원), 참조 P117-8을 실시예 1의 프로토콜에 따라서 소화한다.
PSA를 함유하지 않는 여성 혈청 1mL을 실시예 1의 프로토콜에 따라서 소화한다. 여성 혈청은 프랑스 혈액은행(Etablissement Francais du Sang [French Blood Bank])으로부터 얻었다. 특정한 병리학적인 경우를 제외하고, 여성들은 PSA를 합성하지 않는다. 일반적으로 여성의 혈청은 PSA를 함유하지 않는다. 본원에 사용된 여성 혈청에서 PSA의 부재는 bioMerieux S.A. (Marcy l'Etoile, France)로부터 Vidas TPSA에 의해서 미리 확인했다.
소화 후, 500, 200, 100, 50 및 0 ㎍/mL의 PSA 농도를 갖는 용액을 얻도록, 소화된 여성 혈청 용액을 소화된 PSA 용액으로 보충한 다양한 앨리쿼트로 분할한다.
얻어진 분할단위의 100 ㎕를 다음의 조건에 따라서 주입하고 분석한다:
- Dionex (Sunnyvale, California, United States of America)로부터 Ultimate 3000 크로마토그래프 시스템
- Waters (Milford Massachusetts, United States of America)로부터 2.1 mm 내경, 100 mm 길이, 3.5 ㎛ 입자크기의 C18 symmetry 칼럼
-용매 A: H2O + 0.1% 포름산
-용매 B: ACN + 0.1% 포름산.
이하, 표4에 정의된 HPLC 구배는 크로마토그래픽 분석에 적용된다.
시간 유속 (㎕) 용매 A (%) 용매 B (%)
0 300 95 5
3 300 95 5
15 300 78 22
16 300 0 100
24 300 0 100
24.1 300 95 5
32 300 95 5
크로마토그래픽 칼럼 출력 용리액은 질량분석기의 이온화 소스에 직접 주입된다.
질량분석기의 4중 극자 Q1을 사용하고 0.7 질량 유닛의 해상도에 의해서 636.8 Th의 이온을 특이적으로 선택한다. 이들 이온은 실시예 1의 방법에 따라서 PSA의 최종 농도가 100, 50, 10, 5 및 0 ㎍/mL인 여성혈청에 도입된 PSA 단백질을 트립신에 의한 프로테오티픽 가수분해에 의한, 서열 LSEPAELTDAVK (SEQ ID No . 6)을 갖는 하나 이상의 펩티드의 분자이온이다.
리포터 서열이라는 이러한 펩티드 서열은 PSA 단백질 분석에 대한 지지체로서 역할한다.
636.8 Th의 이온을 4중 극자 q2를 사용해서 제 1 발생 단편으로 분해한다. Q1에서 선택된 이온은 q2에서 충돌 활성 공정을 실시해서 중성 단편 및 제 1 발생 단편이온으로 분해하고, 그 세기는 943.5, 846.5, 775.4 및 312.2　Th의 m/z값이다.
트랩핑될, 4중 극자 q2을 탈리한 모든 단편 이온을 4중 극자 Q3으로 전달하고, 이는 이온 트랩모드에서 조작한 이온 트랩이다.
사용된 다른 기기 변수는 실시예 1의 변수와 동일하다.
본 발명의 동시의 방출 모드를 EPI (Enhanced Product Ion) 분석 모드와 비교한다.
이러한 EPI 분석 모드는 모든 이온을 연속적으로 방출하기 위해서 Q3에서 이온 트랩에서 실시된 300 내지 1000 Th의 스캔을 포함한다.
EPI 모드에서, 200 내지 1000 Th 의 모든 질량의 스캔에 의해서 질량 스펙트럼을 얻을 수 있다. 9.08 분에 얻어진 스펙트럼의 시료는 도 2에서 PSA 200 ㎍/mL 농도를 갖는 시료에 대해서 도시한다. 스캔 시간은 1000 Da/s의 속도에서 700 ms이다.
PSA 및 혈청의 혼합물의 크로마토그래픽 용리액을 질량분석기에 연속적으로 주입하기 때문에, 제 1 발생 단편 이온의 크로마토그램의 형태에서 시간에 따라서 신호를 얻을 수 있다. 따라서, PSA 프로테오티픽 펩티드 LSEPAELTDAVK (SEQ ID No.　6)에 상응한, 제 1 발생 단편 이온 y9 (943.5　Th), y8 (846.5　Th), y7 (775.4　Th) 및 b3 - 물의 한분자 (312.2　Th)는 9 내지 9.15 분에서 용리된다. 943.5, 846.5, 775.4 및 312.2　Th 의 이온에 대해서 얻어진 신호의 합계는 도 2b에서 PSA 200㎍/mL 농도로 시료에 대해서 도시된다.
분석 1.5 소프트웨어에 의해서 도 2b의 크로마토그램에 대해서 관찰된 피크 하에서 영역을 적분할 수 있다. 따라서, 943.5, 846.5, 775.4 및 312.2　Th의 이온의 총합 신호의 측정에 의해서 표 5에 제공된 결과를 얻었다:
피크하 영역 PSA 농도 (㎍/ml)
1.25 e+005 0
5.54 e+006 50
1.13 e+007 100
2.23 e+007 200
5.56 e+007 500
또한, 동일한 실험은 본 발명의 동시의 방출 방법을 적용함으로써 실시된다.
이것에 의해서, m/z 943.5, 846.5, 775.4 및 312.2의 방출될 이온의 무선주파수를 포함한 광대역 웨이브가 적용된다. 방출될 제 1 발생 단편 이온의 m/z 값 근방에서 0.7 질량 유닛의 윈도우가 사용되고, 이는 적용된 무선주파수가 각각 m/z 값 943.5, 846.5, 775.4 및 312.2　Th 근방에서 0.7 질량 유닛의 노치를 형성하는 것을 의미한다. 이와 같이 적용된 광대역 웨이브는 0.8 ms에서 모든 제 1 발생 단편 이온을 방출시킨다. 얻어진 신호를 측정한다. 트랩에서 트랩핑된 모든 잔류 이온은 0.8 ms에서도 동시에 방출하여 이를 비운다.
PSA의 소정의 농도를 갖는 각각의 용액에 대해서 얻어진 신호가 측정되면, 신호 피크가 얻어지고, 그 영역은 분석된 대상분자의 농도를 대표한다. 시험된 각각의 용액에 대한 모든 제 1 발생 단편 이온의 동시의 방출 중에 얻어진 신호에 상응한 각각의 피크하의 영역은 더 강한 신호를 나타낸 0 점을 제외하고, PSA 농도에 비례하고 EMS 모드에서 얻어진 것에 상당한다. 본 발명의 분석 방법은 프로테오티픽 이온 LSEPAELTDAVK (SEQ ID No . 6)의 제 1 발생 단편을 통해서 PSA의 정량적인 분석이 가능하고, 훨씬 짧은 시간을 제외하고 EPI 방법처럼 정확하다.
짧은 분석 시간 또는 사이클 횟수의 사용에 의해서 여러 다른 생성물을 연속적으로 분석할 수 있고, 특히 복합 분석을 실시할 필요가 있는 경우에 바람직하다.
또한, PSA의 0㎍/mL에서 시료에 대해서 관찰된 배경 노이즈는 본 발명의 방법에 의해서 더 낮아진다. 본 발명에 따른 방법은 종래에 비해서 배경 노이즈를 감소시킬 수 있다. 공교롭게도, 배경 노이즈의 감소에 의해서 측정 감도를 개선시킬 수 있다는 것이 당업자에게 공지되어 있다.
실시예 3: 3중-4중 극자 Q1q2Q3 구성을 갖는 질량분석기를 사용하고 복합화합물에서 낮은 농도의 단백질 농도를 2회 분해 사이클로 측정하고, 상기 4중 극자 Q는 이온트랩모드 MS/MS/MS 분석에서 조작한 것.
PSA 용액 및 PSA를 함유하지 않은 여성 혈청은 실시예 2의 프로토콜에 따라서 소화된다.
소화된 여성 혈청 100 ㎕에 PSA 농도 1000, 500, 100, 50, 10 및 0　ng/ml를 갖는 용액을 얻기 위해서 소화된 PSA를 보충한다. 실시예 2에서보다 훨씬 낮은 농도를 사용한다.
얻어진 시료의 100 ㎕를 실시예 2의 프로토콜에서 처리된 바와 같이 크로마토그래피 칼럼, 그 다음에 질량분석기에 주입한다.
질량분석의 4중 극자 Q1을 사용해서 0.7 질량 유닛의 해상도로 636.8　Th의 이온을 특이적으로 선택한다. 4중 극자 q2를 사용해서 636.8　Th의 이온을 제 1 발생 단편으로 분해한다. 4중 극자 Q3을 사용해서 472.3 Th의 제 1 발생 단편을 선택하고 분해한다. 모든 제 2 발생 단편 이온은 Q3 내의 트랩에서 트랩핑된다.
본 발명의 방법에 의해서 제안된 동시의 방출 모드에 따라서 얻어진 분석 결과 및 공지의 MS/MS/MS 모드에 따라서 얻어진 분석 결과를 비교한다. 이러한 모드는 Q1 및 q2에서 상기 기재된 EPI 모드와 동일하지만, 4중 극자 Q3는 472.3 Th의 제 1 발생 단편 이온을 제 2 발생 단편이온으로 분해하기 위한 트랩핑 모드에서 사용된 후, 트랩에서 500 내지 850 Th의 스캔을 실시하여 모든 이온을 연속적으로 방출시킨다 .
사용된 다른 기기 변수가 실시예 1의 변수와 동일하다.
MS/MS/MS 모드에서, 500 내지 850 Th의 모든 질량의 스캔에 의해서 도 3a에 도시된 질량 스펙트럼을 얻을 수 있다. 스캔 시간은 1000 Da/s의 속도에서 350.1 ms이다.
제 2 발생 단편 이온에 의해서 유발된 신호를 측정한다. 이 신호는 제 1 발생 단편 이온의 양에 비례하고, 이는 프로테오티픽 펩티드의 양에 비례하고, PSA 단백질의 양에 비례한다. 신호는 주입되고 분석된 혼합물에서 PSA 단백질의 양에 비례한다.
PSA 및 혈청의 혼합물의 크로마토그래프 용리액을 질량분석기에 연속적으로 주입하기 때문에, 도 3b에 도시된 바와 같이 제 2 발생 단편 이온의 크로마토그램의 형태에서 시간에 따라서 신호를 얻을 수 있다. 따라서, PSA 프로테오티픽 펩티드 LSEPAELTDAVK (SEQ ID No .　6)에 상응하는 제 2 발생 단편 이온은 11.9 내지 12.1 분 에서 용리된다.
Analyst 1.5 소프트웨어는 도 3b에서 크로마토그램에서 관찰된 피크하의 영역을 적분할 수 있다. 따라서, 펩티드 LSEPAELTDAVK (SEQ ID No .　6)의 이온 y5 (533.3　Th); y6 (646.4　Th); y7 (775.4　Th) 및 y8 (846.5　Th)의 총합 신호의 측정에 의해서 다음 표 6을 얻을 수 있다:
피크하의 영역 PSA 농도 (ng/ml)
1.50e+005 0
1.79e+006 10
8.90e+006 50
1.77e+007 100
8.91e+007 500
1.78e+008 1000
또한, 동일한 실험을 본 발명의 동시의 방출 방법을 적용함으로써 실시한다. 상기 실시예와 같이, 분광기의 Q3에서 동시의 방출은 상기 4중 극자 Q3에서 광대역 웨이브의 방출에 의해서 실시되고, 제 2 발생 단편 이온 y5 (533.3　Th); y6 (646.4　Th); y7 (775.4　Th) 및 y8 (846.5　Th) 의 공명 주파수에 상응한 주파수 노치가 삽입된다. 각각의 제 1 발생 단편 이온 질량 근방에서 0.7 질량 유닛의 윈도우가 사용된다. 이와 같이 적용된 광대역 웨이브에 의해서 0.8 ms에서 모든 오염 이온을 방출한다. Q3 트랩에서 트랩핑된 모든 잔류 이온을 0.8 ms에서 300 내지 700 Th의 이온의 모든 무선주파수를 포함한 광대역 웨이브를 적용함으로써 동시에 방출하여 이를 비운다.
본 발명에 의해서 제안된 방출 및 동시의 검출에 의해서 분석 모드에서, 분석 시간은 1.6 ms이므로, 상기 예에서와 같이 MS/MS/MS 모드 보다 상당히 짧다.
소정의 PSA 농도를 갖는 각각의 용액에 대해서 얻어진 신호를 측정하면, 하나의 피크가 얻어지고, 그 영역은 분석된 대상 분자의 농도를 대표한다. 시험된 각각 용액에 대해서 제 2 발생 단편 이온의 동시의 방출 동안 얻어진 신호에 상응한 각각의 피크하의 영역은 더 강한 신호를 나타낸 0점을 제외하고, PSA 농도에 비례하고 EPI 모드에서 얻어진 것에 상응한다.
상기 실시예에서 나타낸 바와 같이 전구체 이온의 분해에 대해서 특이적인 일련의 단편 이온의 동시의 방출 원리는 제 1 발생 단편 이온의 분해에 대해서 특이적인 일련의 제 2 발생 단편 이온의 동시의 방출로 확장될 수 있다.
이러한 적용은 특히 복합 혼합물에서 여러 분자를 높은 감도 및 높은 특이성으로 복합방법으로 분석될 필요가 있는 경우 바람직하다. 본 발명은 혈류에서 임상적으로 흥미있는 단백질의 복합 분석에 특히 적당하다.
실시예 2에서와 동일한 방법으로, PSA를 함유하지 않는 시료에 대해서, MS/MS/MS 방법에 비해서 동시의 방출에 의한 방법으로 낮은 배경 노이즈가 관찰되고, 이는 본 발명의 방법이 양호한 감도를 갖는 것을 의미한다.
SEQUENCE LISTING <110> bioM?ieux Universit?Claude Bernard Lyon 1 Centre National de la Recherche Scientifique <120> Proc??de d?ection des mol?ules par spectrom?rie de masse <130> 14619FR36EB <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 141 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Prot?ne recombinante TP171 de Treponema pallidum <400> 1 Met Arg Gly Ser Ala Ser Phe Ser Ser Ile Pro Asn Gly Thr Tyr Arg 1 5 10 15 Ala Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Glu Asn Gly Trp Lys Asp Phe Leu Glu 20 25 30 Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys Met Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln 35 40 45 His Lys Glu Gly Arg Phe Lys Ser Gln Asp Ala Asp Tyr His Arg Val 50 55 60 Met Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Gly Pro Glu Lys Ala Phe Arg Glu Leu 65 70 75 80 Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys Gly Asn Pro Glu Met Val Asp Val Val 85 90 95 Thr Gly Ala Thr Val Ser Ser Gln Ser Phe Arg Arg Leu Gly Ala Ala 100 105 110 Leu Leu Gln Ser Ala Arg Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ile Ile Ser Arg 115 120 125 Gly Ser Ser Lys Tyr Lys Tyr His His His His His His 130 135 140 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Ion prot?typique <400> 2 Glu Leu Ala Asp Ala Leu Leu Glu Lys 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Ion prot?typique <400> 3 Asp Phe Leu Glu Val Thr Phe Asp Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Ion prot?typique <400> 4 Glu Ala Ile Ile Ser Arg 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Ion prot?typique <400> 5 Met Val Gln Val Val Tyr Asp Tyr Gln His Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Peptide du PSA <400> 6 Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys 1 5 10

Claims (13)

  1. a) 시료의 분자를 하나 이상의 이온화 장치에 의해서 이온화하여 분자 이온을 얻는 단계,
    b) 하기의 단계 (i) 및 (ii)는 n 회 실시되고, n은 0, 1, 2, 3 또는 4이다:
    (i) 상기 단계에서 얻어진 하나 이상의 이온을 질량분석기에서 대상 분자에 따라서 선택하는 단계, 및
    (ii) 이와 같이 선택된 하나 이상의 이온을 분해 셀에서 분해하는 단계,
    c) n이 0인 경우에 단계 a), 또는 n이 0 이외의 수인 경우에 단계 b)에서 얻어진 2개 이상의 다른 이온을 질량분석기에서 트랩핑하는 단계, 이와 같이 트랩핑된 상기 2개 이상의 이온은 대상 분자의 특징을 갖고, 대상 분자의 특징인 질량-대-전하 비율 m/z를 갖는 것,
    d) 이와 같이 트랩핑된 상기 특징적인 이온을 상기 질량분석기로부터 방출하는 단계, 및
    e) 이와 같이 방출된 상기 특징적인 이온을 검출장치에 의해서 검출하는 단계인 질량분석법에 의해서 시료에서 하나 이상의 대상 분자를 검출하기 위한 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 c)에서 사용된 질량분석기가 이온 트랩인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 이온 트랩은 3D 또는 선형 형태의 이온 트랩인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 단계 d)에서 상기 특징적인 이온의 방출은 상기 대상 분자의 특징인 질량 대 전하 비율 m/z를 갖는 상기 이온을 이온트랩에서 무선주파수에 의해서 동시에 공명시킴으로써 실시된 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 분자의 특징이 아닌 이온은 특징적인 이온의 트랩핑 후, 및 특징적인 이온의 방출 및 검출 전에 단계 c)의 질량분석기를 비우는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, n은 1, 2, 3 또는 4이고, 단계 b)에서 질량분석기는 이온 트랩 또는 4중 극자 분석기인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 분해셀은 이온 트랩인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 단계 b) 및 c)는 동일한 장치, 즉 이온 트랩에서 실시된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, n은 1이고 단계 c)에서 트랩핑된 2개 이상의 이온이 제 1 발생 단편 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 6 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, n은 2이고 단계 c)에서 트랩핑된 2개 이상의 이온이 제 2 발생 단편 이온인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 정제하기 위해서 상기 시료를 전처리한 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 대상 분자가 단백질의 프로테오티픽 펩티드이고, 상기 시료를 전처리해서 흥미있는 단백질로부터 펩티드를 발생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 동시에 방출 및 동시에 검출 후에, 검출된 특징적인 이온을 정량화해서 상기 대상 분자를, 검량 곡선을 만들거나 상기 대상분자와 유사한 분자로 내부 검량함으로써 정량화하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230091632A (ko) 2021-12-16 2023-06-23 한국전자기술연구원 스마트 안전바 시스템

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2833454C (en) * 2011-04-21 2020-03-10 Biomerieux Inc. Method of detecting at least one mechanism of resistance to cephalosporins by mass spectrometry
US9870911B2 (en) * 2013-12-23 2018-01-16 Dh Technologies Development Pte. Ltd. Method and apparatus for processing ions
WO2016134365A1 (en) * 2015-02-20 2016-08-25 The Johns Hopkins University Biomarkers of myocardial injury
JPWO2016147839A1 (ja) * 2015-03-17 2017-12-28 アサヒビール株式会社 ハイドロフォビンの定量方法及び発泡麦芽飲料の噴き性予測方法
JP6473366B2 (ja) * 2015-03-31 2019-02-20 シスメックス株式会社 温度判定方法、標的ペプチドの検出方法および温度判定試薬
KR102062149B1 (ko) * 2015-05-22 2020-01-03 익스프레션 패톨로지, 인크. 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A(p16) 단백질에 대한 SRM/MRM 분석법
US11511213B2 (en) 2015-08-13 2022-11-29 Waters Technologies Corporation Nickel-cobalt alloy material devices and components
US10900936B2 (en) * 2015-10-28 2021-01-26 Shimadzu Corporation Gas chromatograph and sample injection method
EP3373324A1 (en) * 2017-03-10 2018-09-12 Thermo Finnigan LLC Methods and systems for quantitative mass analysis
GB201802917D0 (en) 2018-02-22 2018-04-11 Micromass Ltd Charge detection mass spectrometry
US11984311B2 (en) * 2018-10-10 2024-05-14 Purdue Research Foundation Mass spectrometry via frequency tagging
US11842891B2 (en) 2020-04-09 2023-12-12 Waters Technologies Corporation Ion detector
US11232936B2 (en) * 2020-05-28 2022-01-25 Thermo Finnigan Llc Absolute quantitation of a target analyte using a mass spectrometer

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5171991A (en) * 1991-01-25 1992-12-15 Finnigan Corporation Quadrupole ion trap mass spectrometer having two axial modulation excitation input frequencies and method of parent and neutral loss scanning
US5200613A (en) * 1991-02-28 1993-04-06 Teledyne Mec Mass spectrometry method using supplemental AC voltage signals
CA2240325A1 (en) * 1998-03-27 1998-11-14 Synsorb Biotech, Inc. Methods for screening compound libraries
GB2389704B (en) * 2002-05-17 2004-06-02 * Micromass Limited Mass Spectrometer
US20070269895A1 (en) 2002-06-03 2007-11-22 The Institute For Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
US7501286B2 (en) 2002-08-14 2009-03-10 President And Fellows Of Harvard College Absolute quantification of proteins and modified forms thereof by multistage mass spectrometry
US7632686B2 (en) 2002-10-03 2009-12-15 Anderson Forschung Group High sensitivity quantitation of peptides by mass spectrometry
JP4515819B2 (ja) * 2003-08-13 2010-08-04 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析システム
US7473892B2 (en) * 2003-08-13 2009-01-06 Hitachi High-Technologies Corporation Mass spectrometer system
US6958473B2 (en) * 2004-03-25 2005-10-25 Predicant Biosciences, Inc. A-priori biomarker knowledge based mass filtering for enhanced biomarker detection
JPWO2005098071A1 (ja) 2004-04-08 2008-02-28 株式会社 東北テクノアーチ 水素処理により合金の結晶粒を微細化する方法
JP4300154B2 (ja) 2004-05-14 2009-07-22 株式会社日立ハイテクノロジーズ イオントラップ／飛行時間質量分析計およびイオンの精密質量測定方法
JP2006300758A (ja) 2005-04-21 2006-11-02 Apro Life Science Institute Inc 内部標準ペプチドを用いて生体由来試料に含まれる標的タンパク質を定量する方法
EP1736480B9 (en) 2005-06-02 2009-03-04 Polyquant GmbH Artificial protein, method for absolute quantification of proteins and uses thereof
GB0511386D0 (en) * 2005-06-03 2005-07-13 Shimadzu Res Lab Europe Ltd Method for introducing ions into an ion trap and an ion storage apparatus
GB0524042D0 (en) * 2005-11-25 2006-01-04 Micromass Ltd Mass spectrometer
JP5259169B2 (ja) * 2007-01-10 2013-08-07 日本電子株式会社 タンデム型飛行時間型質量分析装置および方法
GB0701476D0 (en) * 2007-01-25 2007-03-07 Micromass Ltd Mass spectrometer
GB0703378D0 (en) * 2007-02-21 2007-03-28 Micromass Ltd Mass spectrometer
WO2008146100A1 (en) 2007-06-01 2008-12-04 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for absolute quantification of polypeptides
GB0717146D0 (en) * 2007-09-04 2007-10-17 Micromass Ltd Mass spectrometer
US8399827B1 (en) * 2007-09-10 2013-03-19 Cedars-Sinai Medical Center Mass spectrometry systems
GB2463633B (en) * 2008-05-15 2013-02-27 Thermo Fisher Scient Bremen MS/MS data processing
JP5449701B2 (ja) * 2008-05-28 2014-03-19 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析計
WO2009146418A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Purdue Research Foundation Non-destructive, high order harmonic ion motion image current detection
GB201011862D0 (en) * 2010-07-14 2010-09-01 Thermo Fisher Scient Bremen Ion detection arrangement

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230091632A (ko) 2021-12-16 2023-06-23 한국전자기술연구원 스마트 안전바 시스템

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