KR20120124654A - 벌꿀의 순도 분석을 위한 혼입화분 분석법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벌꿀 순도 분석을 위한 혼입화분 분석법에 관한 것이다.
본 발명의 벌꿀 순도 분석을 위한 혼입화분 분석법은 벌꿀의 순도 및 혼입형태 분석용 화분분석툴을 준비하는 제1단계 및 순도 및 혼입형태 분석 대상의 벌꿀에 혼입되어 있는 혼입화분을 상기 화분분석툴에 적용하여 나타나는 특성을 판단함으로서 상기 벌꿀의 순도 및 혼입 상태를 분석하는 제2단계를 포함하여 구성된다.
본 발명에 의해, 단일밀원에서 채취된 벌꿀의 혼입화분을 분석하여 벌꿀의 순도 및 혼입상태 분석을 할 수 있는 방법이 제공된다.

Description

벌꿀의 순도 분석을 위한 혼입화분 분석법{ANALYSIS OF THE PURITY OF HONEY, USING POLLEN MIXED IN HONEY}
본 발명은 벌꿀의 순도 분석을 위한 혼입화분 분석법에 관한 것으로, 특히 특정 밀원에서 채취된 벌꿀의 혼입화분을 분석하여 벌꿀의 순도 및 혼입상태 분석을 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
꿀의 진위여부를 가리는 방법이나 품질평가에 관한 연구는 매우 오래전부터 많은 과학자들에 의하여 연구되어왔다. 이들 중 가장 일반적으로 적용되어온 방법은 꿀의 주성분인 당의 조성을 이용하는 방법에 관한 연구로써, 꿀의 주성분인 당의 조성은 프락토오스(fructose)와 글루코오스(glucose)가 주종을 이루고 있는데 이들의 함량은 전체 벌꿀의 70~80%인 반면에 자당은 소량 첨가되어 있다.
따라서 벌꿀에 설탕을 첨가한 경우에는 설탕을 용이하게 검출할 수 있으나 설탕액에 산가수분해물을 첨가하여 인위적으로 저화를 시키는 경우에는 당의 조성만으로는 판별이 어려웠다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 산가수분해를 검출하기 위한 레조르시놀(Resorcinol; Fieche) 측정법이나 아날린(Aniline; Feder) 측정법에 의한 정색반응이 집중적으로 연구되었다.
이 방법은 설탕의 산 가수분해에 의하여 생성된 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxy-methylfurfural-HMF)과 정색반응을 일으키는 원리를 이용한 방법이다.
그러나 하이드록시메틸풀푸랄(Hydroxy-methylfurfural-HMF)은 산가수분해에 의하여 생성되기도 하지만 꿀이 장기간 저장되었을 때나 밤꿀과 같이 밀원의 종류에 따라 그 농도가 높은 것이 있어 벌꿀의 순도 분석을 위한 기술로는 실용성이 떨어진다.
또한, 최근에는 생물공학적인 방법이 도입되어 효소를 이용한 가수분해법이 개발되어 1970년대 초반부터 글루코오스 아이소머레이즈(glucose isomerase)와 같은 글루코오스(glucose)를 프락토오스(fructose)로 전환시키는 효소를 이용하여 HFCS(high fructose corn syrup)를 생산하여 벌꿀과 혼입하는 사례가 있는데, 이들 당의 조성은 벌꿀의 당조성과 매우 유사한 프락토오스(fructose)42% 와 글루코오스(glucose)52%로 구성되어 HFCS를 벌꿀에 첨가하였을 때는 HPLC를 이용한 당의 조성을 분석하더라도 혼입여부를 판별이 불가능하다.
이외에도 벌꿀의 향기성분 조성에 의한 꿀의 품질평가방법, 꿀의 무기질 함량을 측정하여 나트륨/칼륨의 비율(Na/K)을 측정하여 혼입여부를 판별하는 방법, 효소의 역가를 측정하는 방법 등 여러 가지가 있으나 이들 방법 각각의 당위성과 벌꿀의 밀원별 다양성, 벌의 분류학상의 종별 특성, 계절적인 요인 및 지역적인 차이 등을 고려할 때 품질평가방법으로 적용하는데 문제가 있었다.
이러한 이유로 최근 식품화학분야에 널리 이용되고 있는 탄소동위원소 측정법은 식물이 광합성에 의해서 대기중에 탄소를 고정할 때에 서로 다른 두 경로를 거치게 되며, 이들 두 부류에 속하는 식물군들은 탄소동화작용으로 고정되는 12C와 13C와의 비율이 상이하여 이들의 저장에너지를 분석하면 근원이 되는 식물군의 판별이 가능하게 된다.
이러한 사실은 꿀을 생산하는 식물은 모두 C3군에 속하는 반면 꿀에 흔히 혼입되는 설탕이나 HFCS의 원료가 되는 사탕수수 및 옥수수는 C4군에 속하며, 이들로부터 얻어진 탄소원은 어떠한 물리적 처리에도 불구하고 일정한 13C값을 갖는다.
따라서 꿀의 탄소동위원소 비율을 측정하여 당의 생성원을 추정하는 새로운 분석방법인 탄소동위원소분석법은 지금까지 벌꿀의 품질을 평가하기 위한 방법으로 이용되고 있다.
그러나 이러한 기술은 사탕무 설탕을 이용하여 가짜 꿀을 생산시 사탕무는 C3식물이므로, 사탕무로 만든 설탕은 탄소동위원소 수치로 꽃에서 분비한 꿀과 구분이 불가능할 뿐만 아니라 사탕무 설탕액을 전화시켜서 벌꿀과 섞는 방법이 암암리에 이루어져 시중에 유통되는 우수한 벌꿀과 구분이 되지 않아서 이러한 기술적인 맹점을 이용하여 가짜꿀 또는 불량한 꿀이 시중에 대량 유통되게 한 단초를 제공하였다.
실제로 벌꿀의 경우 대표적인 단일벌꿀이 아카시아, 밤꿀의 경우 탄소동위원소비(13C/12C)가 -23.5‰이하(-23.0‰~-28.1‰)로 측정되는 경우가 대부분이며, 잠화꿀은 -22.5‰이하(-23.0‰~-26.0‰)로 측정되는 것이 대부분인데, 사탕무 설탕을 사용하여 벌꿀을 생산시에는 꿀의 경우와 유사한 (-23‰~-27‰) 범위에서 측정되며, 물엿, 이성화당, 당밀, 사탕수수 설탕은 -9.0‰~-11.0‰의 범위에서 측정이 되는 특성을 감안할 때 탄소동위원소에 의한 벌꿀의 순도 분석도 불완전한 기술로써 우수한 벌꿀을 생산하는 농가에게 상대적인 손실을 초래하고 이러한 사실로 인하여 벌꿀의 대국민 신뢰도 하락에 영향을 미쳤다.
본 발명의 목적은 양봉농가의 소득의 대부분을 차지하고 있는 벌꿀의 순도 분석을 위한 기술을 개발하여 벌꿀 시장 투명성 확보를 통한 벌꿀에 대한 대국민 신뢰회복으로 건전한 양봉농가의 소득안정화를 모색하고 나아가 국내 우수한 단일 밀원 벌꿀의 고품질화를 통한 세계적 브랜드 개발의 기반을 조성하여 국내 양봉산업의 발전을 위한 기반을 조성하는데 목적이 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 벌꿀 순도 분석을 위한 혼입화분 분석법은 벌꿀의 순도 및 혼입형태 분석용 화분분석툴을 준비하는 제1단계 및 순도 및 혼입형태 분석 대상의 벌꿀에 혼입되어 있는 혼입화분을 상기 화분분석툴에 적용하여 나타나는 특성을 판단함으로서 상기 벌꿀의 순도 및 혼입 상태를 분석하는 제2단계를 포함하여 구성된다.
이때 화분분석툴은 화분의 밀도에 의하여 밴드의 위치로 구별되는 밀도구배 층이 준비되며, 또한 화분의 함량 측정을 통하여 단백질 농도를 측정하는 일련에 분석툴을 준비하는 것이다. 또한 더 나아가 일련의 화분분석툴은 분리된 화분의 게놈 DNA를 특정 프라이머로 PCR 증폭을 하고, 유전자 검증을 수행함으로써 주요 밴드의 위치 및 사이즈를 분석함으로 벌꿀의 종류를 판별할 수 있는 과정을 추가한다.
상기 혼입화분은 희석된 벌꿀을 원심분리하여 얻은 것이 특징이며, 바람직하게는 12,000~14,000rpm에서 0.5~1시간동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 얻는 것이 좋다. 이때 벌꿀의 함량은 동일량의 벌꿀을 희석시켜 적용을 하며, 단백질 농도 측정 등을 통하여 동일 꿀 내에 화분의 종류 및 함량을 분석함으로써 혼입 벌꿀 내지 순수 벌꿀의 진위 확인이 가능하게 된다.
상기 제1단계에서, 화분분석툴은 먼저 화분분석띠의 패턴을 통해 화분의 종류를 판별할 수 있다.
상기 화분분석띠의 패턴은 밀도순으로 서로 적층된 슈크로스층들 중 어느 하나 이상의 층들에 화분이 모여 형성되며, 상기 슈크로스층들은 농도가 10 %씩 낮아지는 순으로 적층되는 것이 바람직하다.
상기 화분은 원심분리에 의해 해당 슈크로스층에 모여 상기 화분분석띠의 패턴을 형성하며, 바람직하게는 0~10 ℃, 30,000~34,000rpm에서 2~4시간동안 원심분리가 이루어지는 것이 좋다.
또한, 상기 제1단계에서, 상기 화분분석툴은 원심분리된 밀도구배 슈크로스층 밴드 내 특정 밴드를 이루는 화분의 단백질 분석을 통하여 동일 꿀의 전체 함량 내 특정 꿀의 함량을 판단할 수 있는 특징이 있다.
상기 분석용액들은 단일화분을 조단백질 상태로 분쇄한 후, 표준 단백질과 생리식염수를 혼합하여 생성된 단백질 용액에 지시약을 첨가한 후 농도차를 두고 희석하여 제조된다.
또한 추가적으로, 상기 화분분석툴은 화분의 단백질 유전자 패턴을 통해 화분의 종류를 표시하여 이루어지기도 하는데, 상기 단백질 유전자 패턴은 Rop26sF(CCAGAAGCTGGGTCAGGTGCCC) 프라이머와 Rop26sR(GGACCAGATCCCCAGAAGCTG) 프라이머를 Forward 및 Reverse로 활용하여 PCR을 통해 증폭시키고, 전기영동을 통한 주요 밴드의 위치 및 사이즈 확인을 통해 확인하는 과정을 갖는다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 단일 밀원 벌꿀의 혼입화분 분석을 통한 벌꿀 순도 및 혼입형태 분석 기술의 개발은 양봉산업의 가장 중요한 부분인 벌꿀 시장안정화를 유도하고, 고질적인 가짜꿀의 생산 및 유통을 방지하여 벌꿀 품질관리를 위한 기준을 마련하는데 이용이 가능하여 양봉농가의 생산 안정화 및 벌꿀에 대한 소비자 신뢰 회복에 기여하여 궁극적인 양봉농가 및 산업의 발전에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 벌꿀 혼입화분 분석을 위한 벌꿀 초원심분리 하는 모습을 나타낸 도면이다.
도 2a는 도 1의 방법을 사용하여 분리된 아카시나무 꽃꿀에 대한 혼입화분의 순도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2b는 도 1의 방법을 사용하여 분리된 벚꽃꿀에 대한 혼입화분의 순도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2c는 도 1의 방법을 사용하여 분리된 밤꽃꿀에 대한 혼입화분의 순도 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 벌꿀 혼입화분 단백질 정량화 기술을 이용한 등급화 모델을 나타낸 도면이다. 이때 단백질 함량별 흡광도는 단백질 표준곡선(Protein standard curve)을 나타내어 적용할 수 있다.
도 4는 벌꿀 혼입화분의 게놈 DNA PCR을 위한 프라이머 세트를 나타낸 도면이다.
도 5는 도 1에서 분리된 화분의 유전자 검증법을 통해 나타난 도면이다.
1 : 아카시나무 꽃꿀의 혼입 1번째 층 화분
2: 아카시나무 꽃꿀의 혼입 2번째 층 화분
3: 아카시나무 꽃꿀의 혼입 3번째 층 화분
4: 벚꽃 화분
5: 벚꽃꿀 혼입화분
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 벌꿀의 순도 및 혼입상태 분석을 위한 혼입화분 분석법으로 벌꿀의 순도 및 혼입형태 분석용 화분분석툴을 준비한 후, 순도 및 혼입형태 분석 대상의 벌꿀에 혼입되어 있는 혼입화분을 상기 화분분석툴에 적용하여 나타나는 특성을 판단함으로 인해 상기 벌꿀의 순도 및 혼입상태를 분석하는 방법을 제공한다.
상기 벌꿀은 하나의 밀원으로부터 추출한 것으로서, 보통 아카시나무 꽃꿀, 벚꽃꿀, 밤꽃꿀 등으로 지칭한다.
이때, 상기 벌꿀의 순도는 특정 꽃의 화분 함유량 정도에 따라 정해지게 된다.
예컨대, 아카시나무( Robinia pseudoacacia) 꽃꿀(일명 아카시아 꿀이라고 지칭한다)의 경우 아카시나무 꽃 화분이 얼마만큼 함유되어 있는지에 따라 순도가 결정되는 것이다.
구체적으로 설명하면, 첫째, 단일밀원에서 생산된 벌꿀 내에 자연적으로 꿀벌에 의하여 혼입되어 있는 화분의 슈크로스 밀도구배에 의한 초원심분리법을 통해 특정벌꿀의 혼합 특성을 구분한다.
일단 화분분석툴로 화분분석띠의 패턴을 통해 화분의 종류를 표시할 수 있는 화분 분석툴을 제조한다
즉, 초원심분리용 튜브에 하단부터 슈크로스를 30%~90%까지 밀도구배를 주어 생성하고, 여기에 화분을 주입한 후 초원심분리하여 화분의 종류를 판단할 수 있는 화분분석띠의 패턴을 나타내는 화분분석툴을 제조한다.
그 다음 벌꿀에 혼입된 혼입화분을 상기와 같이 제조된 화분분석툴과 비교하여 상기 혼입화분의 혼입특성을 판단하게 된다.
즉, 초원심분리용 튜브에 하단부터 슈크로스를 30%~90%까지 밀도구배를 주어 생성하고, 여기에 희석한 벌꿀을 원심분리하여 회수한 혼입화분을 주입한 후 초원심분리하여 생성된 화분분석띠의 패턴을 상기 화분분석툴에서 생성된 화분분석띠의 패턴과 비교하여 혼입된 화분의 종류 및 순도를 판단할 수 있게 된다.
여기서 바람직하게는 상기 혼입화분은 벌꿀로부터 깔끔하게 분리하기 위해서는 12,000~14,000rpm에서 0.5~1시간동안 원심분리하여 얻는 것이 좋다.
또한, 상기 화분분석띠의 패턴은 상기 단일화분 또는 혼입화분이 원심분리에 의해 해당 슈크로스층에 모여 상기 화분분석띠의 패턴을 형성하는 것으로, 정확한 패턴을 형성하기 위해 0~10 ℃, 30,000~34,000rpm에서 2~4시간동안 원심분리가 이루어지는 것이 좋다.
둘째, 본 발명은 벌꿀의 순도를 분석하기 위해 혼입화분의 단백질 농도를 측정하여 농도별 발색의 진하기에 따른 벌꿀의 순도차를 이용한 등급화 기술을 발명한 것으로써, 설명하면 분리된 혼입화분을 조단백질 상태로 분쇄한 후 로우리(Lowry)법에 의하여 단백질 함유량에 따른 발색정도를 통한 정량 및 등급화 기준을 마련한 것이다.
일단 화분분석툴로 사용하기 위해 화분의 단백질 함유량에 따라 발색 정도가 달리 나타나는 분석용액들을 제조한다.
즉, 단일화분을 조단백질 상태로 분쇄한 후, 표준 단백질과 생리식염수를 혼합하여 생성된 단백질 용액에 지시약을 첨가한 후 농도차를 두고 희석하여 서로 발색정도가 다른 분석용액들을 제조한다.
그 다음 혼입화분을 조단백질 상태로 분쇄한 후, 표준 단백질과 생리식염수를 혼합하여 생성된 단백질 용액에 지시약을 첨가하여 생성된 발색용액을 상기 화분분석툴과 비교하여 발색의 진하기에 따른 화분의 함량 차이를 확인하여 벌꿀순도 등급화를 할 수 있게 된다.
셋째, 본 발명은 상기 기술의 정확도를 증가시키기 위하여 혼입화분의 게놈을 분리한 후 PCR을 이용한 유전자 형태를 분석하는 방법을 적용한 것으로써, 분리된 혼입화분은 게놈(genomic) DNA를 분리하여 특이적인 프라이머를 사용한 PCR 수행결과 각각의 밀원에서 증폭되는 결과의 차이를 가지고 밀원의 종류를 검정하는 방법을 사용하는 것이 특징이다.
즉, 화분분석툴은 화분분석띠의 패턴을 통해 단일화분의 종류를 표시하는데, 이 화분분석띠의 패턴은 화분의 단백질 유전자 패턴을 나타낸 것이다.
특히, 상기 단백질 유전자 패턴은 Rop26sF(CCAGAAGCTGGGTCAGGTGCCC) 프라이머와 Rop26sR(GGACCAGATCCCCAGAAGCTG) 프라이머를 통해 특이적으로 발현된다.
그 다음, 분석되는 벌꿀을 물에 희석한 후 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 생성된 상기 혼입화분에 물을 첨가하여 혼입화분이 함유된 용액을 제조하고, 상기 혼입화분이 함유된 용액의 DNA를 추출한 후 이를 PCR을 실시하여 상기 혼입화분의 단백질 유전자 패턴을 발현시킨다.
이렇게 발현된 단백질 유전자 패턴을 상기 화분분석툴의 패턴과 비교하여 해당하는 패턴을 확인함으로써 화분 분석밴드의 벌꿀 종류를 정확하게 확인할 수 있다.
다음은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 벌꿀 순도 및 혼입형태 분석을 위한 혼입화분 분석법에 대하여 도면 및 표를 참조하여 상세히 설명하도록 한다.
도 1에서 제시된 바와 벌꿀에 혼입되어 있는 화분 분석을 위한 혼입화분을 분석하기 위하여 초원심분리용 원심분리 튜브에 밀도 구배를 가지는 슈크로스(sucrose) 용액을 넣었다.
이들 슈크로스(sucrose) 용액은 각각 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%용액을 만들어서 124℃에서 15분간 멸균 후 초원심분리용 튜브에 조심스럽게 90%~30%의 층을 가지게 하였다.
벌꿀의 혼입화분은 벌꿀 300㎖에 멸균수 300㎖을 첨가하여 50%농도로 희석한 후 원심분리용 튜브에 넣어서 1,4000rpm, 4℃조건으로 30분간 원심분리하고 상층액은 조심스럽게 버리고 남은 화분에 멸균수 5㎖를 첨가하여 교반기기(voltex)를 이용한 화분을 고르게 풀어주었다.
이러한 화분용액은 준비된 초원심분리용 슈크로스 밀도구배(sucrose gradient) 튜브의 최상단에 조심스럽게 첨가한 후 초원심분리용 원심분리기를 이용하여 34,000rpm, 4℃ 조건에서 4시간 동안 초원심분리를 하였다.
도 2a 제시된 바와 같이 초원심분리된 각각의 벌꿀에서 아카시나무 꽃꿀의 경우에는 3개의 층으로 분리됨이 확인되었다.
도 2b에서 제시된 바와 같이 벚꽃꿀의 경우 2개의 층을 형성하는데 벚꽃꿀의 경우는 벚꽃 개화기가 진달래의 개화기와 비슷하여 진달래 화분이 일부 첨가되는 것을 확인할 수 있으나, 벚꽃과 진달래꽃에서만 따로 채취한 화분을 초원심분리한 결과, 서로 다른 부위에 층을 형성하여서 벚꽃 단일 화분을 분리하여 농도를 측정하여 벌꿀의 순도를 측정할 수 있었다.
도 2c에 제시된 바와 같이 밤꿀의 경우 4개의 화분층을 형성하고 있으며, 이들 각각의 화분층은 모두 밤꽃 화분으로 확인되었다. 이러한 단일 벌꿀의 혼입화분의 분석은 밤꿀의 경우 유전자 검사를 거치지 않아도 광학현미경(×4000)하에서 쉽게 화분을 식별할 수 있었다.
따라서 본 발명에서는 각각의 벌꿀의 초원심분리 결과인 서로 다른 형태의 분리형태를 확인한 결과에 특이성이 있는 형태로 구성되어 있었다.
도 3에서 제시된 단일 벌꿀 혼입화분의 단백질 정량화를 위한 단백질 농도 측정 및 이를 이용한 단백질 정량표준 시약제조에 대한 발명은 초원심분리에 의하여 분리된 벌꿀 혼입화분을 초원심분리된 튜브에서 수거하여 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 1분간 5회 초음파 분해(sonication)하여 혼입화분을 고르게 마쇄하였다.
마쇄된 혼입화분은 로우리(lowry)법에 의거하여 단백질 정량을 실시하였다.
1. lowry법에 사용된 시약은 하기에 전술한 바와 같다.
1) 단백질 표준물(BSA, Bovine Serum albumin): 1 mg/㎖
2) 뷰렛(Biuret) 시약 : 황산동(cupric sulfate) 75 mmol/ℓ, 염화나트륨(sodium chloride) 94 mmol/ℓ, 주석산염(tartrate), 요오드화물(iodide), 탄산염(carbonate)
3) Folin-Ciocalteu reagent : 2.0 Normal
4) 단백질 미지시료
5) 생리식염수(Saline solution, 0.85%)
6) 흡광도 측정: S-3130 (PDA UV-Vis Spectrophotometer)
7) LabPro ®Plus S/W
8) 큐벳(10 mm 광경로)
2. 단백질 표준용액의 농도
시약(㎖) 테스트튜브(Test tube) no.
1 2 3 4 5 6
1mg/㎖ 표준 단백질
(standard Protein, ㎖)		 - 0.05 0.1 0.15 0.2 -
혼입화분 단백질
(㎖)		 0.2
생리식염수
(Saline Solution, ㎖)		 0.2 0.15 0.1 0.5 - -
농도
(Concentration, mg/dl)		 0 25 50 75 100
상기 표 1과 같이 표준 단백질(standard protein)과 생리식염수(saline solution)을 섞어 단백질 용액을 만들고 2.2 ㎖의 뷰렛(Biuret) 시약을 첨가한 후 실온에서 10분간 방치하였다.
그리고 0.1㎖의 Folin-Ciocalteu reagent의 첨가 후, 즉시 혼합 후 실온에서 30분간 반응한 용액을 측정파장이 725nm로 설정된 수량화 표준모드(Quantification Standard mode)에서 테스트 튜브(test tube)1을 대조로 하여 test tube 1부터 5까지의 1시간이내로 흡광도를 측정하였다.
측정된 혼입화분의 흡광도를 측정하여 농도를 계산하였다.
농도 측정된 용액 중 가장 농도가 높은 시료를 기준으로 10단계로 희석하여 도 3과 같은 표준 용액을 제조하였으며, 흡광도 측정을 통하여 Protein standard curve를 통한 단백질 함량 및 직접 육안으로 등급을 측정할 수 있는 기준을 만들었다.
이는 혼입화분 농도 측정을 위한 비색법으로 이를 통해 용이하게 비색농도에 따른 등급화를 할 수 있게 된다.
도 4에 제시된 혼입화분 유전자 분석을 위한 프라이머는 포워드(Forward) 프라이머의 염기서열이 5말단 CCAGAAGCTGGGTCAGGTGCCC 3말단으로 끝나는 22개의 염기서열로 구성된 Rop26sF로 제작되었으며, 리버스(Reverse) 프라이머는 5말단 GGACCAGATCCCCAGAAGCTG 3말단으로 끝나는 21개의 염기서열로 구성된 Rop26R로 제작된 PCR용 프라이머로 구성된 것이다.
도 5에서 제시된 혼입화분 유전자 분석용 PCR은 94℃ 5분, 33cycle(94℃ 1분, 50℃ 30초, 72℃ 45초), 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 실시하여 그 결과를 1% 아가로스 DNA 전기영동 겔을 사용하여 전기영동하여 아카시나무 꽃꿀의 혼입화분과 벚꽃 꿀 혼입화분의 유전자 증폭 형태를 검사하였다.
그 결과, 아카시나무 화분의 경우 3개의 층에서 동일한 유전자 증폭 형태를 보이고 벚꽃 화분의 유전자 증폭 결과도 꽃에서 분리한 화분과 동일한 형태의 유전자 증폭형태를 보였다.
그러나 아카시나무 꽃꿀의 혼입화분과 벚꽃 꿀 혼입화분은 동일한 프라이머와 동일한 조건으로 PCR을 수행한 결과임에도 서로 다른 형태의 유전자 증폭 형태를 보였다.
이러한 결과로 도 4에서 제시된 프라이머 세트는 각각의 벌꿀 내 혼입된 화분 DNA의 유전자 증폭 PCR 결과로 혼입화분의 종류를 판별할 수 있는 것이다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 벌꿀의 순도 및 혼입상태 분석용 화분분석툴을 준비하는 제1단계; 및
    순도 및 혼입상태 분석 대상의 벌꿀에 혼입되어 있는 혼입화분을 상기 화분분석툴에 적용하여 나타나는 특성을 판단함으로서 상기 벌꿀의 순도 및 혼입 상태를 분석하는 제2단계를 포함하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼입화분은 희석된 벌꿀을 원심분리하여 얻은,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 혼입화분은 12,000~14,000rpm에서 0.5~1시간동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 얻은,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계에서, 상기 화분분석툴은 화분분석띠의 패턴을 통해 화분의 종류를 판별하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 화분분석띠의 패턴은 밀도순으로 서로 적층된 슈크로스층들 중 어느 하나 이상의 층들에 화분이 모여 형성되는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 화분은 원심분리에 의해 해당 슈크로스층에 모여 상기 화분분석띠의 패턴을 형성하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 원심분리는 0~10 ℃, 30,000~34,000rpm에서 2~4시간동안 이루어지는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제2단계는 상기 분석되는 벌꿀을 물에 희석한 후 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 생성된 상기 혼입화분에 물을 첨가하여 상기 혼입화분이 함유된 용액을 제조하는 단계;
    상기 혼입화분이 함유된 용액을 상기 슈크로스층에 투입한 후 원심분리하여 상기 혼입화분이 모여 이루어진 띠를 형성하는 단계; 및
    상기 띠의 패턴을 만족하는 상기 화분분석툴을 조사하여 벌꿀의 순도 및 혼입상태를 분석하는 단계;를 포함하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계에서, 상기 화분분석툴은 서로 발색정도가 다른 분석용액들인 것을 특징으로 하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 분석용액들은 화분의 단백질 함유량에 따라 서로 발색 정도를 달리하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 분석용액들은 단일화분을 조단백질 상태로 분쇄한 후, 표준 단백질과 생리식염수를 혼합하여 생성된 단백질 용액에 지시약을 첨가한 후 농도차를 두고 희석하여 제조된,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 제2단계는 상기 분석되는 벌꿀을 물에 희석한 후 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 생성된 혼입화분을 얻는 단계;
    상기 혼입화분을 조단백질 상태로 분쇄하는 단계;
    상기 분쇄된 혼입화분에 표준 단백질과 생리식염수를 혼합한 후 지시액을 첨가하여 발색된 단백질 용액을 만드는 단계; 및
    상기 발색된 단백질 용액을 만족하는 상기 화분분석툴을 조사하여 벌꿀의 순도 및 혼입상태를 분석하는 단계;를 포함하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  13. 제4항에 있어서,
    상기 화분분석툴은 화분의 단백질 유전자 패턴을 통해 화분의 종류를 표시하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 단백질 유전자 패턴은 Rop26sF(CCAGAAGCTGGGTCAGGTGCCC) 프라이머와 Rop26sR(GGACCAGATCCCCAGAAGCTG) 프라이머를 통해 발현되는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제2단계는 상기 분석되는 벌꿀을 물에 희석한 후 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 생성된 상기 혼입화분에 물을 첨가하여 혼입화분이 함유된 용액을 제조하는 단계;
    상기 혼입화분이 함유된 용액의 DNA를 추출한 후 이를 PCR을 실시하여 상기 혼입화분의 단백질 유전자 패턴을 발현시키는 단계; 및
    상기 혼입화분의 단백질 유전자 패턴을 만족하는 상기 화분분석툴을 조사하여 벌꿀의 순도 및 혼입 상태를 분석하는 단계;를 포함하는,
    벌꿀의 순도 및 혼입 상태 분석을 위한 혼입화분 분석법.
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