KR20120121938A

KR20120121938A - 백하수오, 구절초 또는 측백엽 추출물을 포함하는 수면 장애의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120121938A
Application number: KR1020110039353A
Authority: KR
Inventors: 김동수; 조승목; 홍승철; 이창준; 강현실; 우준성; 양혜진; 윤민석; 용혜임
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2011-04-27
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2012-11-07
Also published as: KR101303713B1

Abstract

본 발명은 백하수오(Cynanchum wilfordii), 구절초(Chrysanthemum zawadskii ) 또는 측백엽(Thuja orientalis) 추출물을 포함하는 수면장애 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 천연 추출물 또는 그의 용매 분획(fraction)을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 종래 수면유도제로 사용되는 의약인 디아제팜과 거의 동일한 수준 또는 향상된 입면시간의 감소 및 수면시간의 증가 효과가 있다. 또한 천연물인 백하수오, 구절초 또는 측백엽로부터 추출한 것으로서 장기간 사용하여도 인지장애(cognitive impairment), 내성 또는 의존성이 형성되는 부작용이 없다.

Description

백하수오, 구절초 또는 측백엽 추출물을 포함하는 수면 장애의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Sleep Disorders Comprising Extract from Cynanchum wilfordii, Chrysanthemum zawadskii and Thuja orientalis}

본 발명은 백하수오(Cynanchum wilfordii), 구절초(Chrysanthemum zawadskii ) 또는 측백엽(Thuja orientalis) 추출물을 포함하는 수면장애 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

수면은 인간 수명의 1/3을 차지하고 있으며 가장 근본적이고 필수적인 생리현상으로 건강 유지 및 정신적 안정에 있어 매우 중요한 요소이다. 만성적인 수면 부족 및 장애는 심혈관 질환, 고혈압, 기억, 학습, 대사조절, 체중, 면역력, 암 저항력, 당뇨병, 안전사고 및 기분 등 전반적인 신체적 및 정신적 건강에 부정적인 영향을 끼친다. 현재, 세계 인구의 30% 정도가 불면증을 경험하고 있으며 10%는 만성적으로 겪고 있을 만큼 수면장애로 인한 문제가 최근 크게 대두되고 있다. 미국 국립수면협회(National Sleep Foundation USA, 2008)의 조사에 따르면, 미국 성인의 50% 정도가 1주일에 1회 이상 불면증을 경험하고 있으며, 미국 국민의 50% 정도가 자신의 수면에 대해 만족하지 못하는 것으로 조사되었다. 최근 국내의 불면증 및 수면장애 유병률은 빠르게 선진국 수준에 근접해가고 있는데 수면장애 진료 환자 수가 2001년 5만 1000명에서 2008년 22만 8000명으로 나타나 최근 8년간 4.5배 증가하였다(국민건강보험공단, 2009). 하지만 국내의 경우 아직 수면에 대한 관심이 높지 못하며, 특히, 의학적 치료를 받아야 한다거나 질환으로 생각하는 인식이 형성되고 있지 못한 실정이다. 따라서 수면제 장기복용자 및 제한자의 경우 이를 대체할 수 있는 수단으로 천연 보조제의 필요성이 높아지고 있으며, 수면 증진 건강기능식품에 대한 수요가 증대되고 있다.

백하수오(Cynanchum wilfordii, CW)는 다년생 덩굴성 초본 식물이다. 중국에서는 백수오(白首烏)라 해서 대근우피소(大根牛皮消 Cynanchum bungei Decne)를 쓰고 있다. 이 Cynanchum bungei라는 생약의 기술사항은 우리나라의 큰조롱과 대동소이하다. 약효 및 주치는 자양, 강장, 보혈약으로 취급되고 정기를 수렴하며 수염과 머리카락의 흰색을 검게 하고 오랜 투병에서 오는 쇠약, 빈혈, 만성풍비, 신경성쇠약, 치창, 장출혈, 양허구학, 궤양 및 변비 등에 이용한다.

우리나라산의 백하수오 성분에 관해서는 1970년대 이래 오늘에 이르기까지 그 연구가 진행되고 있다. 백하수오에는 프레난(Pregnan)계열의 물질을 제닌(genin)으로 하는 배당체의 존재가 함유되었다. 또 당도 다른 강심배당체에 들어 있는 사이마로즈(cymarose)가 존재하기 때문에 강심배당체로서의 기능이 예측되고 있다.

구절초(Chrysanthemum zawadskii var ., CZ)는 국화과에 속하는 다년생초로 산기슭 풀밭에 흔히 나는 식물이다. 구절초는 여성질환과 신경통 등에 탁월한 효능이 있으며 꽃이 달린 식물 전체를 캐서 그늘에서 말린 구절초는 한방과 민간에서 부인냉증, 위장병 및 치풍 등을 치료하는데 쓰고 있다.

측백엽(Thuja orientalis F., TO)은 측백나무과에 속하는 상록 비늘잎 교목이다. 잎과 가지를 햇빛에 말린 측백엽은 한방에서 치습제 및 지혈제로 사용되거나 대하증의 치료에 쓰인다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 수면 장애의 예방 또는 치료 효능이 있는 천연물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물이 수면 장애의 예방 또는 치료 효과가 우수함을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 수면 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 수면 장애의 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 천연 추출물 또는 그의 용매 분획(fraction)을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 수면 장애의 예방 또는 치료 효능이 있는 천연물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물이 수면 장애의 예방 또는 치료 효과가 우수함을 규명하였다.

본 명세서에서 백하수오, 구절초 및 측백엽을 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’은 백하수오, 구절초 및 측백엽에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 백하수오, 구절초 및 측백엽 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 백하수오, 구절초 및 측백엽 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 백하수오, 구절초 및 측백엽 추출물을 백하수오, 구절초 및 측백엽에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran)를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 조합을 백하수오, 구절초 및 측백엽에 처리하여 수득한 것이다.

바람직하게는 본 발명의 조성물은 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물을 모두 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 백하수오, 구절초 및 측백엽 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 백하수오, 구절초 및 측백엽 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 백하수오, 구절초 및 측백엽 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물뿐만 아니라, 그의 용매 분획도 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 용매 분획은 플라보노이드 분획 또는 오일 분획인 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는, 상기 플라보노이드 분획 또는 오일 분획은 구절초 추출물 및 측백엽 추출물의 플라보노이드 분획 또는 오일 분획이다.

본 명세서에서 용어 ‘플라보노이드 분획’은 상술한 추출물에 추가적으로 용매를 처리하여 플라보노이드가 인리치먼트(enrichment)된 분획을 의미한다. 본 명세서에서 용어 '오일 분획‘은 상술한 추출물에 추가적으로 용매를 처리하여 오일 성분이 인리치먼트(enrichment)된 분획을 의미한다. 이러한 오일 분획은 당업계에 공지된 초임계 추출방법 및 증류방법 등으로 얻을 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 백하수오, 구절초 및 측백엽 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 백하수오, 구절초 및 측백엽로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위내에서 선택하여 실시할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 의해 예방 또는 치료되는 수면 장애의 예방 또는 치료는 진정작용, 또는 수면 유도 또는 개선 작용이다.

종래의 신경질환 치료제들은 인지장애(cognitive impairment), 내성 또는 의존성의 형성과 같은 부작용이 있는 문제점이 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 인체에 전혀 무해한 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물을 이용하기 때문에, 부작용이 없다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 매우 우수한 진정작용, 수면 유도 또는 개선 작용을 나타내면서도 부작용을 우려하지 않는 매우 우수한 의약이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 백하수오, 구절초 또는 측백엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방 또는 치료용 조성물이다.

(b) 본 발명의 조성물은 종래 수면유도제로 사용되는 의약인 디아제팜과 거의 동일한 수준 또는 향상된 입면시간의 감소 및 수면시간의 증가 효과가 있다.

(c) 본 발명의 조성물은 천연물인 백하수오, 구절초 또는 측백엽로부터 추출한 것으로서 장기간 사용하여도 인지장애(cognitive impairment), 내성 또는 의존성이 형성되는 부작용이 없다.

도 1은 구절초(CZ) 및 측백엽(TO)의 에탄올 추출물로부터 고함유 분획의 계통분획화과정의 모식도를 보여준다.
도 2는 마우스를 이용한 펜토바비탈 수면유도 실험의 프로토콜을 나타낸다. 마우스를 1주일동안 적응시키고, 24시간 절식한 후에 사용하였다. 각 추출물을 경구투여 한 후 45분 후에 펜토바비탈을 복강투여한 실험디자인을 보여준다.
도 3는 마우스 두부의 EEG 및 EMG의 위치(a)이며, (b)는 레코딩 챔버를 보여준다.
도 4은 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 백하수오(CW), 구절초(CZ) 및 측백엽(TO)의 물 및 20%, 95% 주정 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 ml/kg), DZP(2 mg/kg) 및 백하수오(CW), 구절초(CZ) 및 측백엽(TO)의 물 및 20%, 95% 주정 추출물(500 mg/kg)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 5은 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 백하수오(CW) 주정 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 백하수오(CW) 주정 추출물(100, 250, 500 및 1000 mg/kg)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 6은 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 구절초(CZ) 주정 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 구절초(CZ) 주정 추출물(100, 250, 500 및 1000 mg/kg)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 7은 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 측백엽(TO) 주정 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 측백엽(TO) 주정 추출물(100, 250, 500 및 1000 mg/kg)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 8은 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 백하수오(CW), 구절초(CZ) 및 측백엽(TO) 에탄올 추출물을 중량 기준 2:4:4의 비율로 혼합한 혼합물(CCT)의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 혼합물(100, 250, 500 및 1000 mg/kg)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 9는 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 구절초(CZ) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 구절초(CZ) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)(100 및 200 ㎎/㎏)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 10은 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 측백엽(TO) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 측백엽(TO) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)(100 및 200 ㎎/㎏)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 11은 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 구절초(CZ) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)으로 분리하고 이를 플라보노이드 고함유 분획(EB-DW) 및 오일 고함유 분획(HE-OL)의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 구절초(CZ) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)으로 분리하고 이를 플라보노이드 고함유 분획(EB-DW) 및 오일 고함유 분획(HE-OL)(100 및 250 ㎎/㎏)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 12는 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간 및 수면시간에 대한 측백엽(TO) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)으로 분리하고 이를 플라보노이드 고함유 분획(EB-DW) 및 오일 고함유 분획(HE-OL)의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg) 및 측백엽(TO) 주정 추출물을 물 분획(DW), 플라보노이드 분획(EB) 및 오일 분획(HE)으로 분리하고 이를 플라보노이드 고함유 분획(EB-DW) 및 오일 고함유 분획(HE-OL)(100 및 250 ㎎/㎏)을 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(± SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 13은 추출물을 경구투여하고 뇌파측정을 시작한 후 10초 에폭 단위의 NREM 수면이 12번 이상 연속적으로 나타난 첫 에폭에 도달하는데 걸리는 시간을 정의한 입면시간 및 총 수면시간을 보여준다. *은 대조군과 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서, ***은 대조군과 비교하여 p<0.001에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON는 대조군; DZP는 디아제팜을 나타낸다.
도 14는 C57BL/6N의 수면 구조에 대한 백하수오(CW), 구절초(CZ), 측백엽(TO) 및 혼합물(CCT)의 영향을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

추출물 제조

수면증진 효과 탐색을 위해 선정된 원료로부터 물 및 에탄올 추출물을 제조하였다. 백하수오(Cynanchum wilfordii, CW), 구절초(Chrysanthemum zawadskii var., CZ) 및 측백엽(Thuja orientalis F., TO)의 물 추출물은 분쇄 시료 100 g에 증류수 1 L를 넣어 3시간 동안 100℃로 가열하여 수득하였다. 에탄올 추출물은 시료에 20%에서 95% 에탄올을 5배에서 10배(w/v) 가하여 50℃ 항온기에서 3일 동안 추출하여 얻었으며, 하루에 90 분간 3번씩 초음파 처리하였다. 물 및 에탄올 추출물은 여과 및 감압농축을 거쳐 동결건조한 후 분말화하여 실험에 사용하였다.

최적 제조조건

백하수오(CW), 구절초(CZ) 및 측백엽(TO)의 에탄올 추출조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법(Response Surface Methodology, RSM)을 이용하였다. 실험디자인(experimental design)은 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD)에 의하여 설정되었다. 반응에 영향을 미치는 인자(parameter)인 독립변수(independent variable)는 에탄올 농도(20-95%)와 추출시간(12-72 시간)으로 설정하였다. 가수량의 경우는 10배 이상에서 거의 영향을 미치지 않아 10배로 고정하였다. 종속변수(dependent variable)로는 500 ㎎/㎏ 농도에서의 수면시간(분)으로 설정하였다. 실험결과, 백하수오(CW)는 에탄올 농도 80-90%, 추출시간 60-70 시간의 조건에서 118.4분으로 가장 좋았고, 구절초(CZ)는 에탄올 농도 20-30%, 추출시간 40-50 시간의 조건에서 119.5분으로 가장 좋았으며, 측백엽(TO)은 에탄올 농도 85-95%, 추출시간 15-25 시간의 조건에서 141.4분으로 가장 좋았다.

플라보노이드 분리

상기 수득한 추출물을 분별 깔때기에 넣어, 계통분획법에 의해 플라보노이드 고함유 분획을 분리하였다(도 1). 추출물을 물로 현탁한 후 n-헥산:EtOAc = 1:1 의 조건으로 2회 추출하고 추출액을 합하여, 무수황산마그네슘으로 탈수, 여과지로 여과한 후 감압 농축하였다(HE 분획). 남은 수층을 다시, EtOAc:n-BuOH = 1:3 의 조건으로 3회 추출하고 추출물을 합하여 감압 농축하였다(EB 분획). EB 분획에서 플라보노이드 고함유 분획을 분리하기 위하여, n-헥산: EtOAc = 2:1 의 조건으로 3회 추출하고 추출물을 합하여 감압 농축하였다(EB-HE 분획 및 EB-D 분획). EB-D 분획이 플라보노이드 고함유 분획에 해당하는 분획이다. 구절초에서 플라보노이드 고함유 분획의 수율은 8.09%, 측백엽의 플라보노이드 고함유 분획의 수율은 19.727%로 측정되었다.

오일의 분리

구절초 및 측백엽 에탄올 추출물의 오일은 초임계 유체추출기(SFT-100XW, Supercritical Fluid Technologies INC, 미국)를 사용하여 분리하였으며 분리 조건은 표 1과 같다.

초임계 유체추출기의 오일 분리 조건

항목	조건
샘플 중량	9.25 g
추출기 오븐 온도	30~50 ℃
리스트릭터 블록 온도	80~90 ℃
CO₂ 압력	5,800 psi
추출 시간	4 시간

실험 동물

ICR 마우스(18-22 g, 웅성) 및 C57BL/6N 마우스(28~30 g, 웅성)를 (주)코아텍에서 분양받아 실험동물용 사육상자에 일주일간 적응된 후 실험에 사용되었다. 동물의 사육은 온도 23± 1℃, 습도 55±5%, 광/암 주기(광주기는 09:00-21:00), 조도 3000 Lux의 조건하에 이루어졌으며, 사료 및 음수는 자유 급여하였다. 모든 동물들은 한국식품연구원 동물관리위원회(KFRI-IACUC, Korea Food Research Institute-Institutional Animal Care and Use Committee)의 실험동물 사용지침에 의해 관리되었다.

펜토바비탈 수면유도 실험( Pentobarbital - induced sleep test )

펜토바비탈(Pentobarbital) 수면유도 실험은 오후 1시에서 5시 사이의 일정한 시간 내에 진행되었다. 그룹 당 10마리(n=10)의 마우스를 사용하였으며, 실험 전 24시간동안 마우스를 절식시켜 사용하였다. 모든 시료는 0.5% CMC-식염수 용액을 이용하여 제조하였으며, 펜토바비탈(한림제약(주)) 투여 45분 전에 경구투여(oral administration, p.o.)하였다. 일반 대조군 실험군은 0.5% CMC-식염수 수용액을 10 ㎎/㎏의 농도로 처리하였으며, 다이아제팜(Diazepam, DZP, (주)명인제약)은 대표적인 수면제 중 하나로 추출물의 수면증진 효과를 비교하기 위하여 양성대조군 약물로 사용하였다. 펜토바비탈은 실험디자인에 따라 45 ㎎/㎏(수면제 복용량, hypnotic dosage)의 농도로 복강주사(intraperitoneal injection, i.p.)를 통해 사용되었다. 펜토바비탈 처리 후 각각의 개체를 독립된 공간에 옮겨서 입면시간(sleep latency) 및 수면시간(sleep duration)을 측정하였다. 입면시간은 펜토바비탈을 복강주사한 후 정반사(righting reflex)를 1분 이상 상실할 때까지의 경과시간으로 간주하였고, 수면시간은 다시 정반사를 회복할 때까지의 시간으로 설정하였다(도 2). 펜토바비탈 투여 후 10분이 지나도 수면행동을 보이지 않은 마우스는 실험에서 제외되었다.

수면구조 분석

C57BL/6N 마우스(28-30 g, 웅성)를 1주일간 적응시킨 후 뇌파(Electroencephalogram, EEG) 및 근전도도(Electromyogram, EMG) 측정을 위해 전극 삽입 수술을 실시하였다. 마우스를 펜토바비탈(50 ㎎/㎏, i.p.)로 마취시키고 뇌정위기(stereotaxic instrument)에 두부를 고정시켰다. 두부 피하 결합조직을 절개한 후 EEG 및 EMG 측정을 위하여 마우스 EEG/EMG Headmount(Pinnacle Technology Inc, 오레곤, 미국)를 도 3-2a와 같이 삽입하였다. 이후 치과용 시멘트로 고정시키고 봉합하였다. 수술부위의 소독 및 항생제 투여를 3일 동안 실시하여 수술로 인한 염증을 예방하였으며, 7일간 회복기간을 두었다. 측정환경에 적응시키기 위하여 측정 4일 전부터 대조군에 사용하는 0.5% CMC-식염수 용액을 경구투여한 후 레코딩 장치를 연결하여 본 실험과정에 순응하도록 유도하였다(도 3-2b). 시료 경구투여 후 5분간 안정화 시킨 다음 PAL-8200 series(Pinnacle Technology Inc, 오레곤, 미국)를 이용하여 9:00부터 21:00까지 12시간동안 뇌전도(electroencephalogram(EEG)) 및 근전도(electromyogram(EMG))를 측정하였다. EEG 및 EMG의 샘플링 레이트(Sampling Rate)는 200 Hz로 설정하고 에폭(epoch) 시간: 10 s), EEG는 0.1-25 Hz, EMG는 10-100 Hz의 필터 영역을 설정하여 데이터를 기록하였다. 수면구조 분석은 FFT(fast Fourier transform) 알고리즘에 의해 수행 하였으며, SleepSign 프로그램(Ver. 3.0, Kissei Comtec, Nagono, Japan)을 이용하였다. 분석결과는 각성(wake), 렘수면(REM sleep, rapid eye movement, theta band: 6-10 Hz), 논렘수면(NREM sleep, non-rapid eye movement, delta band: 0.65-4 Hz)으로 구분하여 나타내었다. 입면시간은 10 초 에폭 단위의 논렘 수면이 12번 이상 연속적으로 나타나는데 걸리는 시간으로 설정하였다.

결과 및 고찰

백하수오 ( CW ), 구절초( CZ ) 및 측백엽 ( TO ) 물 및 주정 추출물의 hypnotic dose pentobarbital 수면유도 증진효과

백하수오(CW), 구절초(CZ) 및 측백엽(TO)의 물 및 20%, 95% 에탄올 추출물을 500 ㎎/㎏의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈(45 ㎎/㎏, i.p.)에 의한 수면유도 효과를 알아보았다(도 4). 백하수오, 구절초 및 측백엽 물 추출물과 20% 및 95% 주정 추출물 모두 입면시간이 유의적으로 감소(p<0.01)하였다. 수면시간에서도 모든 추출물들이 유의적으로 증가시켜 수면증진 효과가 있음을 알 수 있었다.

백하수오 ( CW ), 구절초( CZ ) 및 측백엽 ( TO ) 에탄올 추출물의 투여량-의존적 수면 유도 증진 효과의 확인

최적제조 조건하에서 제조된 백하수오(CW), 구절초(CZ) 및 측백엽(TO) 주정 추출물을 100, 250, 500 및 1,000 ㎎/㎏의 농도로 경구투여한 후 펜토바비탈(45 ㎎/㎏, i.p.)에 의한 수면유도 효과를 알아보았다(도 5-7). 실험결과, 백하수오, 구절초 및 측백엽에서 유의적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 용량의존적인 수면시간의 증가(p<0.01)를 나타내었다. 백하수오 주정 추출물에서는 500, 1,000 ㎎/㎏의 농도에서 수면효과가 있었고, 낮은 농도에서는 수면효과가 나타나지 않았다. 구절초 주정 추출물에서는 100 ㎎/㎏의 낮은 농도에서는 수면효과가 나타나지 않았지만, 250, 500, 1,000 ㎎/㎏의 농도에서 높은 수면효과를 나타냈으며, 측백엽 주정 추출물에서는 낮은 농도인 100 ㎎/㎏에서도 수면효과가 뛰어난 것으로 나타났다. 또한, 백하수오, 구절초 및 측백엽 주정 추출물 1,000 ㎎/㎏의 농도에서는 양성대조군인 DZP과 비슷한 수준의 수면시간의 증가를 확인 할 수 있었다.

백하수오 ( CW ), 구절초( CZ ) 및 측백엽 ( TO ) 혼합물( CCT )의 수면유도 증진효과

최적제조 조건하에서 제조된 백하수오(CW), 구절초(CZ) 및 측백엽(TO) 에탄올 추출물을 중량 기준 2:4:4의 비율로 혼합한 혼합물(CCT)을 100, 250, 500 및 1,000 ㎎/㎏의 농도로 경구투여한 후 펜토바비탈(45 ㎎/㎏, i.p.)에 의한 수면유도 효과를 알아보았다(도 8). 실험결과, 유의적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 용량의존적인 수면시간의 증가(p<0.01)를 나타내었다. 혼합물(CCT)이 100 ㎎/㎏의 낮은 농도에서는 수면효과가 나타나지 않았지만, 250, 500, 1,000 ㎎/㎏의 농도에서 높은 수면효과를 나타냈으며 1,000 ㎎/㎏의 농도에서는 양성대조군인 DZP과 비슷한 수준의 수면시간의 증가를 확인 할 수 있었다.

구절초( CZ ) 및 측백엽 ( TO ) 주정 추출물의 오일 및 플라보노이드 분획의 hypnotic dose pentobarbital 수면유도 증진효과

최적제조 조건하에서 제조된 구절초(CZ) 및 측백엽(TO) 주정 추출물을 물 분획(DW 분획), 플라보노이드 분획(EB 분획) 및 오일 분획(HE 분획)으로 분리 정제하여 100 및 200 ㎎/㎏의 농도로 경구투여한 후 펜토바비탈(45 ㎎/㎏, i.p.)에 의한 수면유도 효과를 알아보았다(도 9-10). 실험결과, 구절초 및 측백엽의 물 분획, 플라보노이드 분획 및 오일 분획에서 유의적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 용량의존적인 수면시간의 증가(p<0.01)를 나타내었다. 특히, 구절초와 측백엽 모두 플라보노이드 분획(CZ-EB, TO-EB)에서 물 분획이나 오일 분획보다 높은 수면효과를 나타내었고, 양성대조군인 DZP과 비슷한 수준의 수면시간의 증가를 확인 할 수 있었다. 오일 분획에서 구절초와 측백엽 100 ㎎/㎏의 농도에서는 수면효과가 나타나지 않았지만, 200 ㎎/㎏의 농도에서는 수면효과가 유의성 있게 증가하였다.

구절초( CZ ) 및 측백엽 ( TO ) 주정 추출물의 오일 고함유 성분 및 플라보노이드 고함유 성분의 hypnotic dose pentobarbital 수면유도 증진효과

최적제조 조건하에서 제조된 구절초(CZ) 및 측백엽(TO) 주정 추출물을 물 분획(DW 분획), 플라보노이드 분획(EB 분획) 및 오일 분획(HE 분획)으로 분리하였고, 이를 플라보노이드 고함유 분획(EB-DW 분획)과 오일 고함유 분획(HE-OL 분획)으로 분리하여 100 및 250 ㎎/㎏의 농도로 경구투여한 후 펜토바비탈(45 ㎎/㎏, i.p.)에 의한 수면유도 효과를 알아보았다(도 11-12). 실험결과, 구절초 및 측백엽의 플라보노이드 고함유 분획에서 용량의존적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 용량의존적인 수면시간의 증가(p<0.01)를 나타내었다. 구절초보다 측백엽 플라보노이드 고함유 분획에서 수면효과가 높게 증가하였고, 낮은 농도인 100 ㎎/㎏에서도 수면효과를 보였다. 또한, 구절초 및 측백엽의 오일 고함유 분획에서도 용량의존적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 용량의존적인 수면시간의 증가(p<0.01)를 나타내었다. 오일 고함유 분획에서는 플라보노이드 고함유 분획과 반대로 측백엽보다 구절초에서 수면효과가 높게 증가하였고, 낮은 농도인 100 ㎎/㎏에서도 수면효과를 보였다.

백하수오 ( CW ), 구절초( CZ ) 및 측백엽 ( TO ) 혼합물( CCT )의 수면구조 분석

도 13은 추출물을 경구투여하고 뇌파측정을 시작한 후 10초 에폭 단위의 NREM 수면이 12번 이상 연속적으로 나타난 첫 에폭에 도달하는데 걸리는 시간으로 정의한 입면시간 및 총 수면시간을 나타내었다. 대조군의 평균 입면시간은 70.6분 이였으며 백하수오, 구절초, 측백엽 및 혼합물의 입면시간은 각각 41.4분, 49.3분, 41.9분, 48.7분으로 전체적으로 약 21~29분정도 단축 되었다. 총 수면 시간에서는 대조군이 420분 이였고 백하수오, 구절초, 측백엽 및 혼합물을 경구 투여 하였을 때 각각 560분, 524분, 517분 및 576분으로 약 97~152분 정도 증가하였다.

C57BL/6N의 수면 구조를 분석하여 도 14에 나타내었다. NREM이 증가하면서 상대적으로 각성이 감소하였으며 대조군의 NREM이 370분이었고, 백하수오, 구절초, 측백엽 및 혼합물의 NREM이 각각 505분, 469분, 528분 및 530분으로 약 232분으로 약 99~160분 정도 증가하였고, 총 수면 시간의 증가량의 대부분은 NREM인 것으로 나타났다.

한편, 발레리안(valerian)은 현재 전통적인 불면증 치료제로 널리 사용되는 약초로 많은 연구가 이루어 졌다. Shin 등(2007)은 수면을 박탈한 래트에서 1,000 ㎎/㎏의 발레리안 추출물 프렙(BIM)과 발레리안 추출물의 입면시간이 각각 약 20분, 40분이 감소되었음을 보고하였으며, Kazuaki 등(2005)의 연구에서도 발레리안 추출물의 농도가 300 ㎎/㎏ 일 때 입면시간이 약 25분가량 감소하였고 1,000 ㎎/㎏과 3,000 ㎎/㎏의 경우 각각 40분과 45분으로 고농도에서는 큰 차이를 보이지 않았다. 입면시간으로만 보았을 때 각 추출물 및 추출혼합물이 발레리안 추출물 보다 그 효과가 약간 낮았으나 NREM의 증가 시간과 총 수면시간 증가로 보면 월등히 우수하였다. 이것으로 미루어 보아 백하수오, 구절초, 측백엽 및 혼합물이 수면유도에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단되며 이는 천연 수면보조제로써의 가능성을 보였다고 할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 천연 추출물 또는 그의 용매 분획(fraction)을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 수면 장애의 예방 또는 치료는 진정작용, 또는 수면 유도 또는 개선 작용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 용매 분획은 플라보노이드 분획 또는 오일 분획인 것을 특징으로 하는 조성물.
백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 개선용 식품 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 백하수오 추출물, 구절초 추출물 및 측백엽 추출물을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 수면 장애의 개선은 진정작용, 또는 수면 유도 또는 개선 작용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 용매 분획은 플라보노이드 분획 또는 오일 분획인 것을 특징으로 하는 조성물.