KR20120119896A

KR20120119896A - 한인진으로부터 추출한 항염증 조성물

Info

Publication number: KR20120119896A
Application number: KR1020120105597A
Authority: KR
Inventors: 신승원; 정은영
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2012-10-31

Abstract

본 발명은 한인진으로부터 추출된 한인진 정유를 유효 성분으로 함유함으로써, LPS로 처리된 대식세포에서의 산화질소(NO)의 생성을 현저히 감소시키고, LPS의 처리로 증가되는 COX-2 및 iNOS의 유전자 발현을 처리하기 전의 수치로 줄여 줌에 따라 산화질소의 합성을 억제할 뿐만 아니라 염증반응을 매개하는 PGE2, 인터루킨-1ß 및 인터루킨-6의 유전자 발현도 현저하게 낮출 수 있는 항염증 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항염증 조성물은, 한인진으로부터 추출한 한인진 정유(essential oil)를 유효 성분으로 포함한다.

Description

한인진으로부터 추출한 항염증 조성물{Anti-inflammatory composition extracted from Artemisisa iwayomogi}

본 발명은 항염증 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 한인진으로부터 추출된 항염증 조성물에 관한 것이다.

인체에서 발생하는 염증 반응은 크게 급성 염증 반응(Acute inflammation)과 만성 염증 반응(Chronic inflammation)으로 구분할 수 있다. 급성 염증 반응은 외부로부터 유입된 항원으로부터 신체를 보호하기 위해 급속하게 발생하는 반응이다.

염증(inflammation)은 병원체의 침입 또는 손상된 조직 제거를 개시하기 위해 상처부위에 대해 나타나는 지역적인 반응이다. 염증의 긍정적인 역할에도 불구하고 인간질병을 위한 가장 일반적인 발병 메커니즘의 하나가 되었다.

염증반응이 일어나면 여러 가지 염증인자들(pro-inflammatory mediators)이 만들어지는데, 염증인자에는 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)에 의해서 만들어지는 산화질소(nitric oxide, NO)와 사이클로 옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2, 이하 COX-2)에 의해서 만들어지는 프로스타글란딘(PGE₂) 등이 있다. 이러한 염증 인자는 염증반응의 전사인자인 핵내 전사 인자를 활성화하며, 그 결과 과량의 산화질소와 PGE₂를 생성하여 염증을 일으킨다

COX에 대해서는 1990년대 초반에 주로 연구되었는데, 이 또한 유사형태가 2가지 존재한다. COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, rostaglandin을 생산하여 신장의 혈액 흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적인 기능을 조절한다. 반대로, COX-2의 경우는 미생물에 의한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 대식세포 (Macrophage)에서 발현된다. 즉 iNOS와 COX-2의 발현과, 이에 따른 산화질소 및 PGE₂의 생산은 면역세포의 대표적인 염증인자이다. 또한 염증인자로 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)인 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) 등이 포함된다.

염증반응의 유도물질들 중에서 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, 이하 'LPS'라 한다)는 백혈구와 같은 면역세포와 상호작용을 하며, 단핵세포의 식세포들에 있어서 iNOS 활성화에 의한 산화질소 농도의 증대에 의한 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 하고 있다.

산화질소의 생산 및 성상세포에 의한 염증 사이토카인들을 통한 염증 진행은 중추신경계에서 염증의 유도 및 지속에 있어서 중추적인 역할을 하고, 그것은 다발성 경화증, 알츠하이머 병 및 뇌허혈등을 포함하는 다양한 신경염증 질환의 발전에 중요한 역할을 한다.

특히, 만성적인 또는 과도한 염증 반응에 의해 발생한 많은 양의 산화질소는 염증 질환의 발병에서 역할을 한다. 간 손상이 내독소혈증(endotoxemia), 간염(hepatitis), 출혈성 쇼크(hemorrhagic shock) 및 허혈성 재관류(ischemic reperfusion)를 포함한 다양한 손상으로부터 유래되어지는 동안, iNOS 발현 및 산화질소 생산은 방어 메카니즘으로서 손상을 조절하기 위해 증가되고, 이로 인해 간염의 발전 및 좀더 심각한 간 질환이 유발된다.

쑥은 국화과의 일종으로서, 한국에서 쉽게 발견할 수 있는 다년생 식물로서, 한방에서는 쑥 잎을 지혈?진통?강장제로서 냉(冷)에 의한 자궁출혈?생리불순?생리통 등의 치료에 사용한다. 또한 민간에서는 날잎을 베인 상처나?타박상, 복통?백선(白癬) 등에 외용하거나 내복하기도 한다. 여름철에 쑥으로 불을 피워 모기를 쫓는 데 쓰며 말린 쑥은 뜸을 뜨는 데 사용된다.

특히, 한인진은(Artemisia iwaymogi), 일명 더위지기라고도 하며, 예로부터 해열제, 지혈제, 피부병치료제 및 살충제 등으로 사용하고 있다.

그러나, 종래에는, 쑥, 특히 한인진으로부터 추출하여 분획된 조성물에 대한 정확한 성분 분석 및 이를 이용한 함염증 효과에 대한 연구가 진행되지 않았다.

이에 따라, 본 발명은 쑥, 특히 한인진으로부터 증기 분류하여 얻어진 분획된 한인진 정유(essential oil)를 포함하는 조성물이 다양한 시험을 통해 염증에 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은, LPS로 처리된 대식세포에서의 산화질소(NO)의 생성을 현저히 감소시키고, LPS의 처리로 증가되는 사이클로 옥시게나아제(이하 'COX-2'라 한다) 및 유도성 산화질소 합성효소(이하 'iNOS'라 한다)의 유전자 발현을 처리하기 전의 수치로 줄여 줌에 따라 산화질소의 합성을 억제할 뿐만 아니라 염증반응을 매개하는 PGE₂, 인터루킨-1ß 및 인터루킨-6의 유전자 발현도 현저하게 낮출 수 있는 항염증 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 항염증 조성물은 쑥의 일종인 한인진(Artemisia iwaymogi)으로부터 추출한 한인진 정유(essential oil)를 유효성분으로 포함하고 있다. 상기 한인진 정유는, 한인진의 잎 및 꽃을 채취한 후, 이를 작게 분쇄한 후, 에테르와 같은 용매가 담긴 증기 증류 장치를 이용하여 추출한 후 분리하여 얻어질 수 있다.

상기 한인진으로부터 추출하여 분획된 한인진 정유(essential oil)는 벌가론 비(vulgarone B), 캠퍼(camphor) 및 보네올(borneol)을 포함한다. 특히, 상기 벌가론 비는 상기 분획된 한인진 정유 중 15 내지 25 중량%을 함유하고 있다.

상기 벌가론 비는 실리카 겔 크로마토그래피를 이용하여 상기 한인진 정유로부터 분리되어 항염증 예방 및 치료제 등에 사용될 수 있다.

이와 같이 얻어진 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비는, LPS로 처리된 대식세포에서의 산화질소의 생성을 현저히 감소시키고, LPS의 처리로 증가되는 COX-2 및 iNOS의 유전자 발현을 처리하기 전의 수치로 줄여 줌에 따라 산화질소의 합성을 억제할 뿐만 아니라 염증반응을 매개하는 PGE₂, 인터루킨-1ß 및 인터루킨-6의 유전자 발현도 현저하게 낮출 수 있기 때문에 항염증 예방 및 치료제 등에 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 한인진으로부터 증기 분류에 의해 추출된 벌가론 비가 포함된 한인진 정유를 유효 성분으로 함유하는 항염증성 조성물은 전염증성 TNF-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6과 같은 사이토카인 및 프로스타글란딘(PGE₂)의 발현 및 생성을 억제하고, LPS로 처리된 대식세포에서의 산화질소의 생성을 현저히 감소시키며, COX-2 및 iNOS의 유전자 발현을 억제함에 따라 항염증 효과가 있다. 또한, 상기 벌가론 비가 포함된 한인진 정유는 세포독성이 없다.

따라서, 본 발명의 항염증성 조성물은 염증성 질환의 치료제 또는 건강기능식품 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 벌가론 비의 구조식이다.
도 2는 MTT 에세이에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율 결과를 도시한 것이다.
도 3은 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비의 처리 농도에 따른 LPS 처리된 RAW 264.7 세포의 산화질소 생성 억제 효과를 도시한 것이다.
도 4는 ELISA 측정방법에 의해 LPS 처리된 시료의 분획된 한인진 정유의 처리농도에 따른 PGE₂, TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6 감소 효과를 도시한 것이다.
도 5는 웨스턴 블럿 분석에 의해 분획된 한인진 정유의 처리농도에 따른 COX-2 및 iNOS 수치 결과를 도시한 것이다.

본 명세서에서 “항염증” 또는 “염증억제”라 함은, 질병 상태로 진행된 만성 염증, 꽃가루와 같이 일반적으로 무해한 물질에 의한 염증반응, 천식 혹은 류마티스성 관절염과 같은 자가 면역 반응에 의한 염증반응 등 인체에 유해한 염증반응의 억제를 의미한다.

본 명세서에서 “한인진 추출물인 분획된 한인진 정유”라 함은, 천연물인 한인진으로부터 유효성분을 추출하여 얻어진 것이라면 특별히 한정하지 않고 모두 포함한다. 예컨대, 한인진을 물이나 유기용매에 넣고 교반, 가압 또는 가열 등의 수단을 통해 유효성분을 용출함으로써 얻어진 결과물을 들 수 있다. 또한, 상기와 같이 얻어진 액상 추출물을 동결건조함으로써 얻어진 동결건조물을 포함한다.

본 발명에 따른 한인진 추출물인 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비의 항염증 효과를 측정하기 위하여 RAW 264.7 대식세포를 대상으로 산화질소 생성 억제, PGE₂ 생성 억제, iNOS 및 COX-2 발현 억제, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6 발현 억제 및 세포독성 평가 실험을 수행하였다.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 화학적 자극에 의하여 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 산화질소를 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)나 TNF-α와 같은 사이토카인 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 산화질소를 생산한다. 또한, iNOS, COX-2 및 인터루킨-1β나 TNF-α와 같은 여러 종류의 사이토카인 등은 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

PGE₂는 환상구조를 지닌 20개의 탄소를 포함하고 있는 불포화 지방산 유도체로 주로 만성 염증 질환에 관여하는 화학 전달물질이며 천식 등의 자가면역질환에도 관여한다. 이러한 프로스타글란딘은 COX에 의하여 생합성된다. 특히, COX-2는 염증이나 기타 면역 반응시 세포분열 인자나 사이토카인에 의해 세포 내에서 일시적이고 빠르게 발현된다.

*실험결과, 본 발명의 한인진 추출물인 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비는 전염증성 TNF-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6과 같은 사이토카인 및 PGE₂의 발현 및 생성을 억제하고, LPS로 처리된 대식세포에서의 산화질소의 생성을 현저히 감소시키며, COX-2 및 iNOS의 유전자 발현을 억제하고, 세포독성이 없는 것을 알 수 있었다. 이에 따라, 본 발명에 따른 한인진 추출물인 한인진 정유 및 벌가론 비는 우수한 항염증 효과가 있기 때문에 염증성 질환의 치료제 또는 건강기능식품 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 분획된 한인진 정유 제조

(1) 분획된 한인진 정유(Essential oil fraction)의 제조방법

대한민국 경상북도 영천에서 재배된 한인진의 잎 및 꽃을 1:1로 채취하여 건조시켜 분말을 얻었다. 상기 한인진 분말을 증기 증류 장치(steam distillation-extraction apparatus, 덕산과학)를 이용하여 추출하였다. 보다 구체적으로 설명하면 상기 한인진 분말을 에테르 용매를 사용하여 5시간 동안 수증기 증류하여 에테르층 및 물층을 분리하고, 상기 물층은 에테르를 이용하여 재추출하여 분리하고 이를 상기 분리된 에테르층과 합한 후, 감압 농축하여 분획된 한인진 정유를 제조하였다.

상술한 바와 같이 제조된 한인진 정유를 에테르 용액에 녹여 2% 용액의 분석시료를 제조하고, 이 중 1㎕를 분석기(Hewlett-Packard 6890 GC, Hewlett-Packard 5973 MSD)에 주입하여 다음 조건에서 분석하였다. 이때 분석 조건은, 운반 기체 : 헬륨, 컬럼 : HP-5MS(30 m × 250 ㎛ × 0.25 ㎛)capillary column, 오븐 온도 : 50℃(5분), 2℃/분, 180℃(5분 유지), 20℃/분(220℃까지 승온) 이었다.

상술한 GC-MS의 분석결과, 분획된 상기 한인진 정유는 벌가론 비(vulgarone B, 19.07%), 캠퍼(camphor, 10.22%) 및 버넬(bornel, 6.67%)을 포함한다.

(2) 벌가론 비(vulgarone B)의 제조방법

상술한 바와 같이 제조된 한인진 정유(2 g)를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(헥산-에틸아세테이트=5:95)를 이용하여 분획한 후, 이 중 분획 22-31을 재크로마토그래피(헥산-메틸렌 클로라이드, 8:2 - 2:8 구배)하여 벌가론 비를 제조하였다. 이때 제조된 벌가론 비는 순도 98.8%, 생성율 0.28 g 이었다.

상술한 바와 같이 제조된 벌가론 비는 도 1에 도시된 바와 같은 구조식을 가지지며, UV, MS, 및 NMR 측정기기를 이용하여 다음의 측정 결과로부터 상기 벌가론 비의 구조식을 확인하였다. 분석결과, 무색; C₁₅H₂₂O, EL-MS m/z:218[M]+; UV(CH₂Cl₂)λ_max nm:250.322; IR(KBr)ν_max㎝^-1:3038,2867,1676,1374; H-NMR (300 MHz,CDCl₃)δ:5.75(1H, br s, H-3), 2.78(1H, d, J=6.6, H-5), 2.56(1H, d, J=6.6, H-1), 2.04(1H, s, H-7), 2.08(3H, s, H-8), 2.02-1.43(6H, m, H-10, H-11, H-12), 0.96(6H, s, H-14, H-15), 0.87(3H, s, H-9); C-NMR (75 MHz, CDCl₃)δ:205.4(C-4), 173(C-2), 122.9(C-3), 67.2(C-5), 58.3(C-7), 55.3(C-6), 50.4(C-1), 42.0(C-12), 38.9(C-10), 34.2(C-13), 28.2(C-15), 27.1(C-14), 25.1(C-9), 23.7(C-8), 21.7(C-11).

실험예

(1) RAW264.7 세포 배양

한국셀라인뱅크(Korean Cell Line Bank)에 의해 공급된 RAW264.7 세포를, 페니실린(10U/㎖), 스트렙토마이신(streptomycin, 10㎍/㎖), 및 10% 태아소혈청(fetal Bovine Serum, FBS)이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서, 37℃ 및 5%이산화탄소가 유지된 상태에서 배양하였다. 여러 시험을 위해 상기 배양된 RAW264.7 세포는 상기 방법과 같이 연속적으로 배양되었다.

(2) 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(이하, 'MTT'라 한다) 에세이를 통한 세포 생존율 측정

한인진 추출물인 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비의 세포독성 실험은 MTT 분석법을 통해 측정하였다. 상기 배양된 100㎕의 RAW264.7 세포를 5×10⁴ cells/well의 밀도(헤마토사이토미터로 측정)로 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고, 세포가 고착되도록 24시간 동안 배양 후, 각 웰로부터 5㎕의 배지를 제거하였다. 이어서, 각 웰은 0.5 내지 1000 ㎍/㎖ 범위의 농도에서 5 ㎕의 제조된 분획된 한인진 정유 또는 벌가론 비로 처리되었다. 이렇게 처리된 세포를 2시간 동안 배양하고, 25㎕의 MTT 용액(5㎎/㎖ in PBS)을 처리하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 추가로 배양한 후, 배지를 제거하고, 0.04 M의 HCl이 포함된 아이소프로판올을 가해 생성된 포마잔(formazan)을 용해하였다. 상기 포마잔의 양은 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 570 ㎚의 흡광도에서 측정하여 분석하였다. 상대적인 세포 생존율은 포마잔으로 전환된 MTT의 양에 의해 결정되며 미처리 시료와 비교하여 이를 백분율로서 표현하였다.

상술한 바와 같이, MTT 분석방법을 이용하여 배양된 RAW264.7 세포를 분획된 한인진 정유 또는 벌가론 비로 처리한 후 세포 생존율은 측정한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 0.1 내지 0.001 ㎎/㎖ 농도의 한인진 정유 또는 벌가론 비로 처리한 경우 세포 생존율이 크게 떨어지지 않음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명의 한인진 정유 또는 벌가론 비는 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.

(3) 산화질소 생성 억제에 대한 에세이

본 발명의 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비의 산화질소 및 PGE₂의 생성에 대한 억제 효과는 다음의 0.1 ㎍/㎖의 LPS(시그마-알드리치, 미국)를 처리하여 측정하였다. 배양된 상기 200 ㎕의 RAW264.7 세포를 5×10⁴ cell/well의 농도로 96 웰 플레이트에 각각 주입하였다. 이를 24시간 동안 배양 후 배지를 버리고 6 내지 100 ㎍/㎖의 농도에서 2.5㎕의 상기 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비로 처리하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 배양하고 2㎕의 LPS(0.1 ㎍/㎖)로 처리한 후 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 18시간 동안 추가로 배양하였다. 이어서 각 셀의 상층액(100 ㎕)을 100 ㎕의 그리스(Griess) 시약(1% 술판닐아마이드와 0.1% 나프틸에틸렌 디하이드로클로라이드 1:1 혼합액 in 5% 인산)과 혼합한 후, 상온에서 10분 동안 배양시켰다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 ㎚에서 상기 배양된 시료의 흡광도를 측정하였다. 산화질소 생성의 억제의 정도는 한인진 정유 및 벌가론 비가 처리된 웰과 이를 처리하지 않은 웰의 흡광도를 비교하여 측정하였다.

산화질소는 활성화된 대식세포로 인해 발생하는 중요한 염증 매개체이다. 이러한 산화질소 수치의 증가는 염증 질환에서 관찰된다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 한인진 정유 및 벌가론 비는 0.1 ㎍/㎖의 LPS 처리된 RAW264.7 세포에서 산화질소 생성에 대해 용량 의존적인 억제 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 상기 한인진 정유 및 벌가론 비는 대부분의 테스트 농도에서 산화질소의 생성을 억제하고 이러한 억제비율은 이들이 처리되지 않은 시료와 비교해서 50%이상 효과가 있음을 확인하였다.

(4) PGE₂, TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6 생성 억제 분석

PGE₂ 수치를 정량적으로 측정하기 위하여 분석 키트를 미국, R&D 시스템으로부터 구입하였다. 상술한 방법으로 배양된 세포를 벌가론 비 및 한인진 정유로 처리하고, 상술한 산화질소 생성 억제 에세이와 유사한 방법으로 LPS를 처리하고, 상층액은 분석용 150 ㎕ 시료를 만들기 위해 3배로 희석하여 사용하였다. 200 ㎕ 및 150 ㎕의 Calibrator Diluent RD5-39가 각각 NSB 웰에 첨가되었다. PGE₂ 수치는 제조사의 지침(KGE004)에 따라 분석되었다.

TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6의 생성을 측정하기 위해 200㎕의 상기 세포 현탁액(5×10⁴/㎖)을 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, DMSO에 희석한 0.007 내지 0.1 ㎎/㎖ 농도의 벌가론 비 및 한인진 정유를 1시간 동안 처리하고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 18시간 동안 추가로 배양시켜 상층액을 얻었다. 이와 같이 얻어진 상층액 100㎕를 제조사의 지시에 따라 ELISA 키트(Komabiotech, 한국)를 이용하여 분석하였다.

PGE2, 및 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6과 같은 사이토카인의 증가는 활성화된 대식세포의 자극에 의한 것이다. 이들 염증 매개체에 대한 한인진 정유 및 벌가론 비의 효과는 LPS 처리 후 ELISA 분석방법에 따라 측정하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 0.006 내지 0.1㎎/㎖의 농도에서 분획된 한인진 정유 및 벌가론 비를 처리했을 경우 용량 의존적으로 PGE₂, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6의 생성이 현저하게 감소함을 알 수 있다.

(4) COX-2 및 iNOS에 대한 웨스턴 블롯(western blot)

서브 배양된 RAW 264.7 세포 현탁액(10 ㎖/plate)를 5×10⁴/㎖의 농도로 7개의 페트리디쉬(1은 세포만, 2는 LPS처리, 3-6까지는 LPS와 함께 2~20%의 DMSO에 의해 희석된 0.006~0.1 ㎎/㎖ 다양한 농도의 분획된 한인진 정유가 처리된 세포)에 담았다.

1시간 동안 상기 분획된 한인진 정유를 처리 후, LPS(1㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 배양한 후, 이렇게 배양된 RAW264.7 세포를 찬 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 수세하고 원심분리하였다.

Pro-PREP Protein Extraction Solution(인스트론 바이오테크놀로지 제조)은 제조사에 의해 제공된 매뉴얼에 따라 세포를 용혈시키는데 사용하였다. 각각의 대표 샘플 농도를 브래드포드(Bradford)법에 의해 측정한 후, 세포 현탁액은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) 채워진 버퍼(buffer)에서 끓여졌다.

각 샘플에서 20 ㎍의 단백질을 전기영동하고 전기영동학적으로 니트로셀룰로스 막에 이식하였다. 상기 막은 5% 스킴 밀크(skim milk)로 증류수 환경의 교반기(shaker) 안에서 상온 조건으로 90분 동안 차단(blocking)된다. 이어서, 상기 막을 일차 항체(1:1000, anti-iNOS, anti-COX-2, or anti-actin antibodies, 산타크루즈바이오테크놀로지(미국)) 안에서 3시간 동안 상온으로 배양하였다.

이어서, 0.5% TBS-T로 3번 세 번 수세하고, 세정한 후, 블롯(Blots)은 HRP-conjugated 이차 항체(Komabiotech, 한국) 용액에서 90분 동안 상온에서 다시 세 번 수세 된다. 해당되는 밴드는 chemiluminescence 시약(ECL)으로 측정되고 뒤따르는 photographic 필름에 1분간 노출시킴으로 확인하였다.

본 발명의 한인진 정유의 iNOS 및 COX-2에 대한 억제작용을 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 측정된 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 0.1 내지 0.025 ㎎/㎖ 농도의 한인진 정유를 처리했을 경우 iNOS의 밴드 강도가 급격히 감소함을 알 수 있다. COX-2 수치는 iNOS의 수치보다 다소 떨어짐을 확인하였다.

상술한 실험 결과, 본 발명의 한인진 정유 및 벌가론 비는 세포독성이 없고, TNF-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-6과 같은 전염증성 사이토카인 및 PGE₂의 발현 및 생성을 억제하고, LPS로 처리된 대식세포에서의 산화질소의 생성을 현저히 감소시키며, COX-2 및 iNOS의 유전자 발현을 억제함에 따라 항염증 효과가 있음을 알 수 있었다.

Claims

벌가론 비(vulgarone B)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
제1항에 있어서,
상기 벌가론 비는 증기 증류(steam distillation) 방법을 통해 한인진으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
제1항에 있어서,
상기 항염증 조성물은 캠퍼(camphor) 및 보네올(borneol)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.
제1항에 있어서,
상기 벌가론 비는 15 내지 25 중량%의 함량으로 이루어진 것을 특징으로 하는 항염증 조성물.