KR20120116294A - 만성 ｂ형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법 - Google Patents
만성 ｂ형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군에 감염된 B형 간염 바이러스의 X 유전자 및 프리코어/코어 유전자 상에서 돌연변이의 발생빈도가 증가되는 돌연변이 양상을 다양한 분자유전학적 분석법을 통해 분석한 후, 간세포암 발병과 독립적으로 연관된 X 유전자 및 프리코어/코어 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들을 도출하고, 이러한 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 패턴, 즉 돌연변이 누적 개수 및/또는 조합을 이용하여 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도를 고감도 및 높은 특이도로 분석 및 예측하는 방법을 제공한다. 본 발명은 B형 간염 바이러스의 특성을 이용한 종양발생의 근본원인에 대한 고찰이 포함된 발병 예측 및 조기진단이 가능하여 간질환 증상의 진행 가능성을 예측하는 경우에 매우 유용하게 응용될 수 있고, 환자 개개인의 발병 위험 정도를 알려주어 간세포암 진단을 위한 정기 검사의 회수를 조절하는데 중요한 지표를 제시할 수 있다.
Description
본 발명은 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 (hepato celullar carcinoma, HCC) 발병 위험도를 분석 및 예측하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 패턴의 차이를 찾아내어 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도를 고감도 및 높은 특이도로 분석 및 예측하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군에 감염된 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV)의 X 유전자 및 프리코어/코어(precore/core) 유전자 상에서 돌연변이의 발생빈도가 증가되는 돌연변이 양상을 다양한 분자유전학적 분석법을 통해 분석한 후, 간세포암 발병과 독립적으로 연관된 X 유전자 및 프리코어/코어 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들을 도출하고, 이러한 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 패턴, 즉 돌연변이 누적 개수 및/또는 조합을 이용하여 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도를 고감도 및 높은 특이도로 분석 및 예측하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같이 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 패턴, 즉 돌연변이 누적 개수 및/또는 조합을 이용하여 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발생 위험도를 위험수위에 따라 계측적으로 분류함으로써 만성 B형 간질환 환자의 환자별 맞춤형 간세포암 조기진단 스크리닝 계획수립에 필요한 정보를 제공할 수 있는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도를 고감도 및 높은 특이도로 분석 및 예측하는 방법에 관한 것이다.
간세포암은 간에 발생하는 악성종양을 총칭하는 것으로, 일반적으로 간세포암이라 하면 대부분 간세포에서 원발성으로 발병하는 간세포암을 뜻하나 간 이외의 장기에서 발생하여 간으로 전이된 전이 간암을 지칭하기도 한다. 본 발명의 명세서에서 이후에 기술하는 "간세포암"은 원발성 간세포암을 의미한다.
우리나라의 간세포암 발생률은 10만 명당 남자 30.5명, 여자 7.6명이 매년 발병이 된다고 추정된다. 특히 40~60세까지의 중장년기에서의 간세포암 발생률은 남자 74.8명, 여자 15.6명으로 세계에서 가장 높은 발병률을 보이고 있으며 2008년 기준 인구 10만 명당 22.9명이 간세포암으로 사망하여 폐암(29.9명) 다음으로 높은 사망률을 보인다(2009 한국의 사회지표).
특히, B형 간염 바이러스(이하, "HBV"라고도 약칭함)는 간세포암의 주된 원인이다. HBV의 감염은 통상적으로 만성 간염, 간경변, 간세포암으로 이행되는 다양한 임상질환을 일으켜 궁극적으로 사망률을 증가시킨다. 현재 전 세계적으로 약 350 만명이 만성적인 HBV 보균자로 추정되고 있으며, HBV에 의한 만성 B형 간질환 환자에서 간세포암이 발생될 위험성은 연구에 따라 조금씩 다르지만 보균자가 아닌 대조군 일반인보다 70~200배 높은 것으로 보고되고 있다. 만성 HBV 보균자 (carrier)중 간세포암 유병율은 남자의 경우 400-700명(년간 100,000명 당)이고, 여자의 경우 120-180명(년간 100,000명 당)으로 남자가 여자보다 4배 이상 높다. HBV와 관련된 간세포암의 예후는 매우 나빠서, 일반적으로 중앙생존기간(median survival)이 16개월 미만이고, 진단 후 1년 생존율은 36%-67% 그리고 5년 생존율은 15%-26%로 알려져 있다. 우리나라의 경우 전체 간세포암의 약 75~78%가 HBV에 의해 유발된다고 알려져 있으며 이는 전체 간세포암의 약 50%만이 HBV에 의해 발생되는 미국을 비롯한 선진국에 비하여 매우 높은 비율이다. 비록 항바이러스제 사용 및 예방접종에 의해 만성 B형 간질환 유병율의 감소세가 나타나고 있으나, 여전히 HBV의 높은 감염율에 따른 간세포암의 높은 유병율 문제는 전 세계적 공중보건에 위협이 되고 있다(Nguyen VT et.al. J. Viral Hepat 2009;16:453-463).
B형 바이러스성 간경변증의 발생과 간세포암의 진행에는 보균자와 HBV의 여러 요인들이 복합적인 원인으로 작용한다. 보균자의 발병 요인들을 제외한 HBV의 발병 요소로는 특히 돌연변이가 발생한 HBV의 감염이 결정적인 역할을 한다. 빈번하게 발견되는 간세포암 발병 돌연변이로는 프리코어/코어(precore/core) 촉진자(promoter) 영역[Basal core promoter (BCP)]의 변이 그리고 HBx 인핸서 II(HBx enhancer II)에 속하는 변이 등이 원인 돌연변이로 알려져 있고, 단독 돌연변이 보다는 복합 돌연변이 패턴(조합 패턴)이 간경변증 진전에 더 중요하게 연관되어 있으며 돌연변이의 조합 패턴은 HBV 유전자형 B(genotype B)와 유전자형 C(genotype C) 사이에서 서로 다르다고 알려져 있다. 이러한 돌연변이는 간경변증이 발생되기 전에 선행되어 나타나며, 이들의 조합은 매우 다양하고 복잡하다.
한편, BCP(Basal core promoter) T1762/A1764 돌연변이는 특히 HBV 유전자형 C2(genotype C2)에서 빈도가 매우 높다. 그런데, 대부분의 보균자들이 HBV 유전자형 C2(genotype C2)가 감염되어 있는 특수한 상황에 있는 한국인의 경우에는 BCP T1762/A1764 돌연변이 만으로는 간세포암 위험인자로서의 변별능력이 상대적으로 저하되므로 다른 돌연변이를 추가적으로 찾아야만 한다.
예를 들어, 프리-S(pre-S), 코어 프로모터(core promoter) 영역 (BCP 1762/1764 인접 유전자), C 유전자 등에서 복합적으로 발생되는 돌연변이 조합 패턴은 간세포암 발생 위험도와 밀접한 연관성이 있으며, 이들에 대한 위험도 혹은 위험도의 진전단계를 지표화하여 정확하게 측정하는 것은 임상적으로 만성 B형 보균자들의 진료 및 관리에 매우 중요한 도움을 줄 것으로 예상되기 때문에 진단적 가치가 높을 것으로 판단된다. 이러한 관점에서 3가지 영역의 돌연변이 (X, BCP 1762/1764 및 주변 유전자, C-유전자 영역) 조합이 중요할 것으로 예상된다.
이와 같은 HBV 돌연변이 조합 패턴의 중요성과 한국인 만성 B형 간질환 환자의 대부분이 유전자형 C2에 감염되어 있다는 것을 감안할 때, 유전자형 C2에 누적되는 돌연변이들 중에서도 간세포암(HCC) 발생 위험도를 유의하게 증가시키는 돌연변이들을 도출하는 것과 이러한 바이러스 돌연변이들 중 간세포암(HCC) 발생 위험도와 유의적인 연관성을 갖는 돌연변이 조합 패턴을 도출하는 것은 간세포암 발병 예측과 조기 진단에 있어서 매우 중요하다고 할 것이다.
최근까지 간세포암의 진단 후 각종 수술, 화학요법, 방사선치료 및 면역요법 등의 치료법의 발전이 있어 왔지만 여전히 간세포암을 완치하기는 매우 어렵다. 이는 치료법 자체가 결함을 가지고 있다기 보다는 대부분의 암이 치료가 어려울 정도로 확산 및 전이된 이후에 발견되어 치료를 하기 어렵기 때문이다. 따라서, 간세포암은 발병 예측과 조기진단이 치료에 매우 중요하다
한편, 간세포암은 예후가 나쁜 질병이기 때문에 예방과 조기발견이 중요함에도 불구하고, 지금까지는 감염된 HBV의 특정 돌연변이와 돌연변이 조합 패턴이 간세포암 발병에 미치는 위험도에 대한 종합적인 분석 및 평가 보다는 임상 데이터 수치들을 활용하여 의사가 발병가능성을 경험적으로 판단하는 수준에 머물고 있었다.
예를 들어, 종래의 간세포암 진단 검사로는 초음파 검사와 알파태아단백(α-fetoprotein, AFP)의 혈중농도측정이 주로 시행되고 있다. 초음파검사는 사용이 간편하나 소간세포암 (2cm 미만)에 대한 진단의 민감도가 약 30~70%로 검사자의 숙련도에 따라 진단의 정확도가 달라지는 문제가 있다. 또한, AFP 검사는 현재 가장 널리 사용되는 검사법이나 소간세포암 중 약 35%에서 AFP 수치는 정상이며, 간세포암 이외에 간염의 악화(간경변증) 또는 간세포의 활발한 재생시기(급성간염 회복기) 등 비특이적인 경우에도 AFP 수치 상승이 나타나는 문제가 있다. 이러한 AFP 수치 진단의 문제점은 AFP가 개체 발생기의 세포증식에 관여하고 종양뿐만 아니라 세포 괴사 및 염증 후 재생 과정에서 그 수치가 증가할 수 있기 때문에 발생한다. 또한, AFP 수치는 간염 및 간경변의 질병 활성도(disease activity) 등 여러 요인에 의해 변동될 수 있기 때문에, 수치의 지속성이 떨어지고 통상 3개월을 주기로 연내 여러 번을 검사를 시행해야 하는 불편이 있다.
결국, 종래의 간세포암 검사법들은 암이 발병한 후 진행 단계에서 진단이 가능하다는 한계로 인해 예진이 불가능하며 특히 우리나라와 같이 바이러스성 간세포암 발병률이 높은 경우 환자가 지니는 간염 바이러스의 특성을 무시하고 치료를 진행하여 재발률을 낮추는데 도움이 되지 않는다는 문제점을 지니고 있다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 B형 간염 바이러스의 특성을 이용하여 종양발생의 근본원인에 대한 고찰이 포함된 발병 예측 및 조기진단이 가능한 새로운 유전자 검사가 요구되는 실정이다.
본 발명은 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군에 감염된 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV)의 X 유전자 및 프리코어/코어(precore/core) 유전자 상에서 돌연변이의 발생빈도가 증가되는 돌연변이 양상을 다양한 분자유전학적 분석법을 통해 분석한 후, 간세포암 발병과 독립적으로 연관된 X 유전자 및 프리코어/코어 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들을 도출하고, 이러한 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 패턴, 즉 돌연변이 누적 개수 및/또는 조합을 이용하여 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도를 고감도 및 높은 특이도로 분석 및 예측하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같이 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 패턴, 즉 돌연변이 누적 개수 및/또는 조합을 이용하여 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발생 위험도를 위험수위에 따라 계측적으로 분류함으로써 만성 B형 간질환 환자의 환자별 맞춤형 간세포암 조기진단 스크리닝 계획수립에 필요한 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.
궁극적으로, 본 발명은 전술한 간세포암 발병 위험도를 분석 및 예측하는 방법들을 이용하여 간염 보균자 내지는 간질환 환자 집단에서의 간세포암 발병 위험도를 제시하여 각 환자 별 최적치료에 필요한 정보를 제공하고, B형 간염 바이러스의 특성을 이용하여 종양발생의 근본원인에 대한 고찰이 포함된 발병 예측 및 조기진단이 가능한 새로운 유전자 검사법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 야생형이라 함은 정상형을 의미하며 자연계에서 다수 발견되는 유전자를 말한다. 또한, 변이형이라 함은 유전자 상에 변화가 생겨 야생형과 다른 유전자를 말한다. 야생형과 다른 유전형을 가지는 변이형 각각을 돌연변이라 하며, 돌연변이를 표현할 때에는 야생형, 유전자부위, 변이형 순서로 표현한다. 예를 들어, 후술하는 간세포암 예측용 마커 G1613A의 경우에는 유전자 위치가 유전자형 C형의 HBV의 전체 게놈 3215 bp 중 1613번째 bp이며, 야생형은 G, 변이형은 A라는 의미이다.
또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 HBV 유전자 영역에서의 간세포암 예측용 마커의 돌연변이라 함은 HBV 유전자 상의 X 유전자 및 프리코어/코어(precore/core) 유전자 내 돌연변이를 포괄하는 것으로서, 그 중에서도 G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 또는 G1899A 마커의 돌연변이를 포함한다(상기 마커들 중 "T1753V"에서 "V"는 염기 A, C, G를 의미하고, "A1846B"에서 "B"는 염기 C, G, T를 의미함). 상기 염기서열 위치는 야생형 유전자형 C형의 HBV의 전체 게놈 3215bp (NCBI Reference Sequence: NC_003977.1)를 기준으로 표시한 것이다.
또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 돌연변이의 누적 개수라 함은 간세포암 예측용 마커의 돌연변이의 총 개수를 의미하는 것으로서, 예를 들어, G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들에 있어서 변이형이 나타난 마커들의 총 개수를 의미한다.
또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 간세포암 특이적 돌연변이의 조합 또는 간세포암 특이적 돌연변이의 조합 패턴이라 함은, 예를 들어 G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들로부터 가능한 모든 돌연변이 조합 중 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합을 의미하는 것으로서, 구체적으로는 상기 8개의 간세포암 예측용 마커들로부터 가능한 모든 돌연변이 조합인 28 = 256개의 돌연변이 조합 중 통계학적으로 유의하게 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합을 의미한다.
또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 단변량 분석(uivariate analysis)이라 함은 종속변수인 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이 각각의 관계를 분석하여 선형 관계를 밝혀내는 분석 방법을 의미하며, 본 발명에서는 SPSS version 15.0 (SPSS Inc., USA)을 통해 시행하나, 이에 국한되지 않으며 사용가능한 모든 분석 프로그램을 이용하여 시행할 수 있다.
또한, 본 발명의 명세서에서 사용되는 다변량 분석(multivariate analysis)이라 함은 종속변수인 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이 전체와의 관계를 한번에 분석하여 선형 관계를 밝혀내는 분석 방법을 의미하며, 본 발명에서는 SPSS version 15.0 (SPSS Inc., USA)을 통해 시행하나 이에 국한되지 않으며 사용가능한 모든 분석 프로그램을 이용하여 시행할 수 있다.
한편, 이하에서 설명될 본 발명의 일실시예의 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법에서는 각각의 만성 B형 간질환 환자의 검사시점에서의 간세포암 발병 가능성에 따른 저위험군/고위험군 분류의 민감도, 특이도, 양성예측도(positive predictive value, PPV), 음성예측도(negative predictive value, NPV) 및 오즈비 (odds ratio, OR) 값을 구할 수 있도록 공식화하였다.
본 발명의 일실시예의 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법은,
(a) 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서, 간세포암 종속변수인 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이 각각 또는 돌연변이 조합들과의 관계를 분석하는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계의 분석을 통해 도출된 종속변수인 간세포암 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이와의 관계를 이용하여, 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 돌연변이가 나타나는 간세포암 예측용 마커들인 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A 마커들을 선정하는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 선정된 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들로부터 가능한 모든 돌연변이 조합인 28 = 256개의 돌연변이 조합 중 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합을 결정하는 단계와,
(d) 만성 B형 간질환 환자에서 채취한 시료로부터 B형 간염 바이러스(HBV)의 유전자형을 분석하고, 분석된 유전자형으로부터 상기 선정된 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이들의 유무를 판단하는 단계와,
(e) 상기 (d) 단계에서의 돌연변이들의 유무 판단 후, 돌연변이가 나타난 마커들의 조합이 상기 (c) 단계에서 결정된 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합에 해당하는 경우 간세포암 발병 고위험군으로 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법에 있어서, 상기 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합은, "G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1896A"의 제1 돌연변이 조합, "T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 제2 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A"의 제3 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A"의 제4 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1896A"의 제5 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1899A"의 제6 돌연변이 조합, 또는 "C1653T, T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 제7 돌연변이 조합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일실시예의 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법은,
(a) 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서, 종속변수인 간세포암 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이의 관계를 분석하는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계의 분석을 통해 도출된 종속변수인 간세포암 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이와의 관계를 이용하여, 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 돌연변이가 나타나는 간세포암 예측용 마커들을 선정하는 단계와,
(c) 만성 B형 간질환 환자에서 채취한 시료로부터 B형 간염 바이러스(HBV)의 유전자형을 분석하고, 분석된 유전자형으로부터 상기 선정된 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이들의 유무를 판단하는 단계와,
(d) 상기 (c) 단계에서의 돌연변이들의 유무 판단 후, 상기 선정된 간세포암 예측용 마커들에 있어서 돌연변이가 나타난 마커들의 총 개수를 계수하고, 돌연변이 누적 개수가 미리 결정된 컷 오프값 이상인 경우 간세포암 발병 고위험군으로 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법은, 상기 (a) 단계에서 간세포암 종속변수인 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이들 전체 또는 돌연변이 조합들과의 관계를 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법에 있어서, 상기 선정된 간세포암 예측용 마커들은 HBV의 X 유전자 및 프리코어/코어 유전자 상의 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들인 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 컷 오프값은 3개 내지 6개인 것이 바람직하고, 6개인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일실시예의 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법에 있어서, 상기 컷 오프값이 6개이고 돌연변이 누적 개수가 6개 미만인 경우라도 "T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 간세포암 예측용 마커들에 돌연변이가 발생하거나, "C1653T, T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 간세포암 예측용 마커들에 돌연변이가 발생한 경우에는 간세포암 발병 고위험군으로 결정할 수 있다.
본 발명은 전술한 바와 같이 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 패턴, 즉 돌연변이 누적 개수 및/또는 조합을 이용하여 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발생 위험도를 위험수위에 따라 계측적으로 분류함으로써 만성 B형 간질환 환자의 환자별 맞춤형 간세포암 조기진단 스크리닝 계획수립에 필요한 정보를 제공하고, 환자 개개인의 진료지침과 치료방향을 보다 효율적으로 판단할 수 있도록 하는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 특성을 이용하여 종양발생의 근본원인에 대한 고찰이 포함된 발병 예측 및 조기진단이 가능한 새로운 유전자 검사법으로서, 간질환 발병 이전부터 확인 가능하며 AFP 수치와 달리 변동성이 적어 검사의 주기를 짧게 가질 필요가 없는 장점이 있다. 즉, 본 발명의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측 방법은 환자의 간질환 단계로의 진전과 연동하는 것으로 입증되어, 간질환 증상의 진행 가능성을 예측하는 경우에 매우 유용하게 응용될 수 있고, 환자 개개인의 발병 위험 정도를 알려주어 간세포암 진단을 위한 정기 검사의 회수를 조절하는데 중요한 지표를 제시할 수 있다.
도 1은 간세포암 예측용 마커의 돌연변이의 누적 개수에 따른 간세포암 환자와 간세포암이 아닌 HBV 감염 환자 사이의 비율을 표시한 그래프이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 간세포암 예측용 마커의 돌연변이의 누적 개수와 간세포암 발병 사이에는 선형관계(linear dose-risk relationship)가 있고 돌연변이 누적 개수가 6개 이상인 환자는 90% 이상이 간세포암 환자이며 돌연변이 누적 개수가 2개 이하인 환자는 85% 이상이 간세포암이 아닌 환자임을 알 수 있다.
도 2는 간세포암 환자와 간세포암이 아닌 HBV 감염 환자에서의 각 돌연변이 조합의 패턴을 돌연변이의 누적 개수에 따라 분류한 그래프이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 돌연변이의 누적 개수와 간세포암 발병 사이에 선형관계(linear dose-risk relationship)가 있고 간세포암 특이적 돌연변이 조합 패턴에서 간세포암 발병이 증가함을 확인할 수 있다.
도 3는 간세포암 환자와 간세포암이 아닌 HBV 감염 환자에서의 각 돌연변이 조합의 패턴을 간세포암 특이적 돌연변이 조합 패턴의 순위에 따라 나눈 그래프이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 간세포암 특이적인 돌연변이 조합 패턴 상위 7개에서 간세포암의 대부분을 차지하는 것을 확인할 수가 있다.
도 2는 간세포암 환자와 간세포암이 아닌 HBV 감염 환자에서의 각 돌연변이 조합의 패턴을 돌연변이의 누적 개수에 따라 분류한 그래프이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 돌연변이의 누적 개수와 간세포암 발병 사이에 선형관계(linear dose-risk relationship)가 있고 간세포암 특이적 돌연변이 조합 패턴에서 간세포암 발병이 증가함을 확인할 수 있다.
도 3는 간세포암 환자와 간세포암이 아닌 HBV 감염 환자에서의 각 돌연변이 조합의 패턴을 간세포암 특이적 돌연변이 조합 패턴의 순위에 따라 나눈 그래프이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 간세포암 특이적인 돌연변이 조합 패턴 상위 7개에서 간세포암의 대부분을 차지하는 것을 확인할 수가 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
간세포암 예측용 마커 분석 및 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측 모델
1. 간세포암 환자 및 만성 B형 간질환 환자의 X 유전자 및 프리코어 유전자 상의 간세포암 예측용 마커 분석
본 발명자들은 국내의 간세포암 발병과 연관된 X 유전자 및 프리코어 유전자 상에서 간세포암 예측용 마커로서 이용가능한 돌연변이의 양상을 분석하기 위하여, 나이, 성별, HBeAg가 일정한 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군을 포함하는 총 150명 HBV 감염환자의 HBV X 유전자 및 프리코어 유전자 염기서열을 분석하였다. 간세포암 환자 75명과 만성 B형 간염 환자 75명에 대하여 시퀀싱 분석으로 확보한 염기서열을 간세포암 환자 군과 만성 B형 간염 환자 군으로 나누어 정렬한 다음, 같은 위치에 한 가지 이상의 돌연변이가 나타나는 경우를 모두 표시하여 빈도 별로 정리하였다.
이와 같이 도출한 HBV 유전자의 간세포암 예측용 후보 마커들에 대해서 간세포암 발병과의 연관성을 분석하기 위해 단변량 분석을 실시하였으며, 이를 통해 최종적으로 G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A의 총 8개의 마커들 각각의 돌연변이에 대한 오즈비(Odds ratio, OR)가 2 이상이고, P값이 0.05 이하로 나타나 이들 8개의 마커들의 돌연변이가 간세포암 발병과 연관되어 있음을 확인하였다.
또한, 상기 8개의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수, AFP, 혈소판에 대해 단변량 분석을 실시한 결과, P값이 0.05 이하로 나타나서 상기 8개의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수가 간세포암 발병과 연관되어 있음을 확인하였다. 그리고, 상기 간세포암 예측용 마커들의 8개 돌연변이, 돌연변이 누적 개수, AFP, 혈소판에 대해서 전체 다변량 분석을 시행한 결과, 최종적으로 돌연변이의 누적 개수에 대한 P값이 0.05 이하의 값을 가져 상기 8개의 간세포암 예측용 마커들은 간세포암 발병 예측 진단에 좋은 마커임을 확인하였다.
2. 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수에 따른 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법 (예측 방법 1)
본 발명에서는 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 개수가 증가함에 따라 간세포암 발병 환자의 수가 늘어나는 것을 통해 돌연변이의 누적 개수가 간세포암의 발병과 연관성이 높다는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수가 6개 이상일 경우 간세포암 환자의 비율이 매우 높다는 점(>94%), 그리고 2개 이하일 경우 간세포암 환자의 비율이 매우 낮다는 점(<13%)을 감안할 때, 이 두 기준점이 간세포암 발병 위험도인 저위험군과 고위험군을 나누는 기준이 될 수 있다(도 2 참조).
돌연변이의 누적 개수에 따른 간세포암 발병 위험도를 수치로 제시하기 위해 환자군에서 돌연변이의 누적 개수에 따른 간세포암 환자와 간세포암이 아닌 환자 사이의 발병 비율을 계산하여 이를 위험도로 제시하였다. 각 돌연변이의 누적 개수에 따른 발병 위험도는 다음과 같다(Mn: Mutation number, 돌연변이 누적 개수):
Mn=0, 1일 때, 0.001% (간세포암 환자 0명, 간세포암이 아닌 환자 11명);
Mn=2일 때, 18.2% (간세포암 환자 4명, 간세포암이 아닌 환자 18명);
Mn=3일 때, 33.3% (간세포암 환자 9명, 간세포암이 아닌 환자 18명);
Mn=4일 때, 50.0% (간세포암 환자 17명, 간세포암이 아닌 환자 17명);
Mn=5일 때, 57.1% (간세포암 환자 12명, 간세포암이 아닌 환자 9명);
Mn=6일 때, 94.1% (간세포암 환자 16명, 간세포암이 아닌 환자 1명);
Mn=7,8일 때, 94.5% (간세포암 환자 17명, 간세포암이 아닌 환자 1명).
상기한 바와 같이 구한 돌연변이의 누적 개수에 따른 간세포암 발병 위험도를 이용하여 다양한 컷오프(cut-off)값에 따른 간세포암 예측 성능(Predictive performance)을 비교한 결과, 돌연변이의 누적 개수가 6개 이상일 경우에 해당하는 위험도가 70% 이상인 경우를 고위험군으로 분류한 결과, 민감도 44%, 특이도 97.3%, 양성예측도 94.3%, 그리고 음성예측도 63.5%로 나타났다.
또한, 돌연변이의 누적 개수가 2개 이하일 경우에 해당하는 위험도가 30% 이하인 경우를 저위험군으로 분류한 결과, 저위험군이 아닌 것으로 분류된 예측 성능은 민감도 94.7%, 특이도 38.7%, 양성예측도 60.7%, 음성 예측도 87.9%로 나타났다.
마지막으로, 돌연변이 누적 개수가 3개 이상 5개 이하의 환자군은 중위험군으로 결정한다.
이러한 고위험군 판정은 오즈비(odds ratio, OR)를 통해 확인할 수 있다. 돌연변이의 누적 개수가 6개 이상일 경우 오즈비는 28.7로서 다른 기준에 비하여 2~3배 높은 것을 확인할 수 있다(하기 표 1 참조).
하기 표 1에서 도시된 바와 같이, 간세포암 발병 위험도 예측을 위한 저위험군, 중위험군 및 고위험군 결정 기준에 있어서 임상에서 요구되는 성능에 따라 고위험군 분류 기준은 돌연변이 누적 개수 1~8개로 할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 누적 개수가 2개 이하인 경우 저위험군으로 분류하고 돌연변이 누적 개수가 6개 이상인 경우 고위험군으로 분류할 수 있다.
3. 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이
조합 패턴의 도출 및 이에 따른 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법 (예측 방법 2)
본 발명에서는 나이, 성별, HBeAg가 일정한 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군을 포함하는 총 150명 HBV 감염환자의 간세포암 발병과 연관된 X 유전자 및 프리코어 유전자 상의 간세포암 예측용 마커로서 이용가능한 총 8개의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 조합 패턴을 모두 검사하였다. 야생형을 0으로, 변이형을 1로 판정하여 150명의 환자군에 대해 돌연변이 지역을 검사한 결과, 총 8개의 돌연변이 지역의 가능한 조합인 28 = 256개 조합 중에서 총 55개의 돌연변이 조합 패턴을 확인하였으며, 간세포암에서만 특이적으로 나타나는 간세포암 발병 위험이 높은 총 7개의 돌연변이 조합 패턴을 확인하였다.
본 발명에서는 하기 표 2에 도시된 바와 같이 간세포암 발병 위험이 높은 상위 7가지 돌연변이 조합 패턴을 다음과 같이 정의한다:
"G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1896A"의 제1 돌연변이 조합;
"T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 제2 돌연변이 조합;
"G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A"의 제3 돌연변이 조합;
"G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A"의 제4 돌연변이 조합;
"G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1896A"의 제5 돌연변이 조합;
"G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1899A"의 제6 돌연변이 조합;
"C1653T, T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 제7 돌연변이 조합.
상위 7개의 돌연변이 조합 패턴은 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군에서는 40% 관찰되었으나, 간세포암이 아닌 환자군에서는 2.7%만이 나타났다. 따라서, 상기 7개의 돌연변이 조합 패턴이 관찰된다면 간세포암 발병 고위험군으로 판정할 수 있다. 돌연변이 조합 패턴의 순위에 따라 그래프를 그려본다면 7개의 상위 돌연변이 조합 패턴에서 간세포암이 집중적으로 나타나는 것을 확인할 수 있으며 8위 이후의 하위 랭크에서는 간세포암이 아닌 환자가 눈에 띄게 늘어나는 것을 확인할 수 있다(도 3 참조).
상기와 같은 상위 7가지 돌연변이 조합 패턴이 간세포암과 연관성이 높은 이유는 상위 7가지 돌연변이 조합 패턴은 BCP 이중 변이인 A1762T, G1764A의 돌연변이를 가지고 있으며, 추가로 적어도 2개의 C1653T, T1753V, A1846B 또는 G1896A의 돌연변이를 가지고 있으므로 HBV X 단백질의 변이 유도, 세포 성장 제어 및 DNA 수복 기능의 저하를 유도하여 간세포암 발병에 관여하는 것으로 사료된다.
또한, 본 발명에서는 이러한 돌연변이 조합 패턴에 따른 간암 발생 위험도를 수치로 제시하기 위해 환자군에서의 돌연변이 조합 패턴에 따른 간세포암 환자와 간세포암이 아닌 환자 사이의 비율을 계산하여 이를 위험도로 계산하였다. 상위 7가지 돌연변이 조합 패턴이 나타난 환자들 중에서 간세포암 환자가 30명, 간세포암이 아닌 환자가 1명으로 확인되어 위험도는 93.8%로 계산되었다.
상기와 같이 구한 돌연변이 조합 패턴에 따른 간세포암 발병 위험도를 이용한 간세포암 발병 간세포암 예측 성능 (Predictive performance)을 비교한 결과, 상위 7개의 돌연변이 조합 패턴이 있는 경우를 고위험군으로 판정할 때, 민감도 40%, 특이도 97.3%, 양성예측도 93.8%, 그리고 음성예측도 61.9%로 나타났다.
한편, 간세포암 발병 위험도 예측을 위한 저위험군, 중위험군 및 고위험군 결정 기준에 있어서 임상에서 요구되는 성능에 따라 고위험군 판정을 위한 돌연변이 조합 패턴은 총 8개의 돌연변이의 조합을 통해 나타나는 28 = 256개의 모든 돌연변이 조합 패턴을 포함할 수 있으나, 전술한 바와 같은 상위 7가지의 돌연변이 조합 패턴이 바람직하다.
4. 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴을 모두 적용한 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법 (예측 방법 3)
본 발명에서는 전술한 바와 같은 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴(간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법 1 및 2)을 모두 적용하여 간세포암 발병 예측 진단 능력을 판정하였다.
간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수가 6개 이상일 경우, 그리고 돌연변이 누적 개수가 6개 보다 적은 경우라도 예측방법 2에서의 제2 돌연변이 조합 패턴, 제7 돌연변이 조합 패턴이 나타나는 경우에는 간세포암 환자가 대부분을 차지함을 확인할 수 있다(도 2 및 도 3). 그리고, 이러한 경우의 환자를 간세포암 발병 고위험군으로 판정할 때, 민감도 56%, 특이도 94.7%, 양성예측도 91.3%, 그리고 음성예측도 68.3%로 나타났다.
즉, 예측 방법 3은 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수가 6개 이상인 경우일 때의 간세포암 진단 능력과 비교하여 민감도가 12.0%~16.0%, 음성예측도가 4.8~6.4% 향상되는 것을 보임으로써 단순히 예측방법 1, 예측방법 2를 각각 적용하였을 때 보다 간세포암 발병 예측 능력이 향상되는 것을 확인할 수 있다.
한편, 간세포암 발병 위험도 예측을 위한 저위험군, 중위험군 및 고위험군 결정 기준에 있어서 임상에서 요구되는 성능에 따라 고위험군 판정을 위한 돌연변이 누적 개수는 2~8개가 바람직하나, 6개 이상인 경우가 가장 바람직하다. 또한, 돌연변이 조합 패턴은 총 8개의 돌연변이의 조합을 통해 나타나는 28 = 256개의 모든 돌연변이 조합 패턴을 포함할 수 있으나, 전술한 바와 같은 상위 7가지의 돌연변이 조합 패턴이 바람직하다.
기존 AFP 진단법의 경우에는 컷 오프 값인 20 ng/ml 이상일 경우를 간세포암 발병 위험군으로 분류하고 200 ng/ml 이상일 경우를 간세포암으로 의심하여 확진검사를 실시하도록 권장하도록 분류하는데, AFP 진단법의 경우 간세포암 발병 진단능력은 민감도가 적어도 50% 이상, 특이도 90% 정도로서, 본 발명의 HBV 유전자 돌연변이 누적 개수의 진단 능력과 비슷한 수준을 보여준다. 또한, 본 발명에서는 실험 환자군에서의 데이터를 이용하여 두 진단법의 진단 능력을 비교하였다(표 3 참조).
그런데, 본 발명의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴은 간세포암 발병 이전부터 확인할 수 있는 장점이 있다.
즉, 기존의 진단 마커인 AFP의 경우, AFP는 개체 발생기의 세포증식에 관여하기 때문이며 종양뿐만 아니라 세포 괴사 및 염증 후 재생과정에서 AFP 수치가 증가할 수 있기 때문에, 간염 및 간경변의 질병 활성도(disease activity) 등 여러 요인에 의해 수치의 지속성이 떨어지고 통상 3개월을 주기로 연내 여러 번을 시행해야 하는 문제점이 있는 반면에, 본 발명의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴의 검사는 간세포암의 발병 원인으로서 간질환 발병 이전부터 확인이 가능하며 AFP 수치와 달리 변동성이 적어 검사의 주기를 짧게 가질 필요 없이 지속적인 위험도 예측 지표로서 활용이 가능하다.
또한, 본 발명의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수를 이용한 간세포암 발병 위험도 예측 방법은 돌연변이 누적 개수가 5개 이하에서도 HCC 위험도와 명확한 선형관계(linear dose-risk relationship)를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이의 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴을 이용한 간세포암 진단법은 기존의 진단능력과 동일한 또는 그 이상의 진단능력을 보이며, 동시에 기존의 진단법과 달리 지속적인 위험도 예측 지표로서 활용가능한 장점을 갖고 있다.
실제 환자별 간세포암 발병 위험도 분석 사례
실시예 1:
1. 재료 및 방법
1) 대상환자
간세포암 발병 예측 방법의 타당성 분석을 위해 분당제생병원과 인천성모병원에서 HBsAg (hepatitis B surface antigen) 양성인 환자를 무작위로 추출하였고, HBV 감염 환자에 특이적인 간질환 증상 진행 여부를 보다 정확하게 조사하기 위하여 알코올성 간질환이 합병된 경우와 C형 간질환을 동반하는 환자는 배제하였으며, 나이, 성별, HBeAg가 일정한 환자만을 선별하였다.
2) 임상 데이터 조사
상기 선별된 환자들에 대하여 혈액을 채취한 후 기본적인 혈청 생화학적 검사를 시행하였다. 첫 내원 시 HBsAg 양성인 경우, 항-HBs, e항원 (HBeAg), 항-HBe, HBV-DNA, 알파태아단백(alpha-fetopretein, AFP) 검사 및 CBC 및 LFT 검사를 하고 남은 혈액은 -80℃에서 냉동 보관하였다. 혈청 HBV DNA의 정량은 리얼타임(real-time) PCR(Applied Biosystems)을 이용하였으며 이 검사의 HBV DNA 검출한계는 500 Copies/mL이다.
3) HBV X 유전자 및 프리코어(precore) 유전자 영역의 증폭
상기 선별된 환자들의 각각의 혈액으로부터 QIAamp DNA 블러드 미니 키트 250(QIAamp DNA Blood Mini Kit 250) (Qiagen 51106)을 이용하여 HBV의 DNA를 분리하였다. 이를 이용하여 인핸서 II/BCP 부위가 포함된 X 유전자 부위를 전부 포함하는 영역(603-bp, 469-bp)을 두 번의 PCR로 증폭하였고 프리코어(precore) 유전자 부위를 전부 포함하는 영역(810-bp)을 표적으로 하여 PCR로 증폭한 후, 각각 염기서열을 분석하였다. 염기서열 위치의 기준은 야생형 유전자형 C형의 HBV의 전체 게놈 3215-bp (NCBI Reference Sequence: NC_003977.1)으로 하였다.
X 유전자 부위의 1차 PCR을 위한 프라이머 쌍으로는 정방향 프라이머로서 HBx-F1 프라이머(서열번호 1) (5'-TGT TTT GCT CGC AGC TGG TCT G-3'; 센스 뉴클레오타이드, 1291번째 염기부터 1312번째 염기까지에 해당)와 역방향 프라이머로서 HBx-R1 프라이머(서열번호 2) (5'-AGC CAC CCA AGG CAC AGC TTG G-3'; 안티센스 뉴클레오타이드, 1872번째 염기부터 1893번째 염기까지에 해당)를 이용하였고, X 유전자 부위의 2차 PCR을 위한 프라이머 쌍으로는 정방향 프라이머로서 HBx-F2 프라이머(서열번호 3)(5'-CAT GGC TGC TAG GCT GTG CTG-3'; 센스 뉴클레오타이드, 1373번째 염기부터 1393번째 염기까지에 해당)와 역방향 프라이머로서 HBx-R2 프라이머(서열번호 4)(5'-GAG ATG ATT AGG CAG AGG TGA AAA AG-3'; 안티센스 뉴클레오타이드, 1820번째 염기부터 1845번째 염기까지에 해당)를 이용하였다.
프리코어(Precore) 유전자 부위의 PCR을 위한 프라이머 쌍으로는 정방향 프라이머로서 preC-F1 프라이머(서열번호 5)(5'-GTG CAC TTC GCT TCA CCT CTG CAC-3'; 센스 뉴클레오타이드, 1579번째 염기부터 1602번째 염기까지에 해당)와 역방향 프라이머로서 preC-R1 프라이머(서열번호 6)(5'-AGG CGA GGG AGT TCT TCT TCT AGG -3'; 안티센스 뉴클레오타이드, 2366번째 염기부터 2389번째 염기까지에 해당)를 이용하였다.
PCR 조건으로서, 최초 변성(denature)은 94℃에서 5분간 수행하였고, "94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초"의 반응조건을 40사이클(cycle)로 반복 수행하였고, 최종 연장(final extension)은 72℃에서 5분간 수행하였다. X 유전자 부위의 2차 PCR 조건으로서, 최초 변성(denature)은 94℃에서 5분간 수행하였고, "94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초"의 반응조건을 35사이클(cycle)로 반복 수행하였고, 최종 연장(final extension)은 72℃에서 5분간 수행하였다.
4) 시퀀싱(Sequencing)을 통한 HBV X 유전자 및 프리코어 유전자 부위의 간세포암 예측용 마커들 조사
증폭된 PCR 산물은 인트론 PCR 클린-업 키트(Intron PCR clean-up kit)를 이용하여 회수하였고, X 유전자 부위의 상기 PCR 산물에 대한 염기서열 분석을 위한 프라이머 쌍으로는 정방향 프라이머로서 HBx-S1 프라이머(서열번호 7)(5'-CGG CGC TGA ATC CCG CGG AC-3'; 센스 뉴클레오타이드, 1436번째 염기부터 1455번째 염기까지에 해당)와 역방향 프라이머로서 HBx-S2 프라이머(서열번호 8)(5'-TGA ACA TAC CAA TTT ATG CC-3'; 안티센스 뉴클레오타이드, 1786번째 염기부터 1805번째 염기까지에 해당)를 이용하였고, 프리코어 유전자 부위의 상기 PCR 산물은 preC-F1 프라이머(서열번호 5)와 preC-R1 프라이머(서열번호 6)를 이용하여 양쪽으로 염기서열을 분석하였다.
각 검체 당 X 유전자와 프리코어 유전자 부위의 염기서열을 분석하여 돌연변이 여부를 판단하였다. 염기서열 분석은 자동염기서열 분석장치인 어플라이드 바이오시스템즈 모델 3100 DNA 제네틱 애널라이저(Applied Biosystems model 3100 DNA genetic analyser)로 수행하였고, 반응은 빅다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit)를 이용하여 수행하였다. 주형 DNA로는 30ng의 회수된 PCR 산물을 사용하였고, 프라이머는 X 유전자 또는 프리코어 유전자에 대한 양방향 프라이머 중에 한쪽 방향의 프라이머 3 pmol을 빅다이 터미네이터 v3.1 RR-100 믹스(BigDye Terminator v3.1 RR-100 mix) 0.5㎕에 첨가하고 멸균증류수를 추가하여 최종 부피가 10㎕가 되도록 하여 반응을 수행하였다. 반응 조건은 "96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 2분"으로서 25 사이클을 반복 수행하였다. 이와 같은 방법으로 분석된 염기서열을 사용하여 G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A, G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들에 대하여 조사하였다.
그러나, 본 발명의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법은 전술한 분석법에 국한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 모든 분자생물학적 유전자 분석 방법, 예를 들어, 제한효소 절편 질량 다형성법(restriction fragments mass polymorphism; RFMP), DNA 칩 등을 이용하여 수행될 수 있음은 물론이다.
2. 결과 및 분석
1) HBV 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴을 이용한 간세포암 발병 예측 방법에 따른 각 환자 별 발병 위험도
본 실시예 1에서 조사한 HBV 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴에 대한 환자 별 예시는 하기 표 4와 같다.
상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, HBV 유전자 상의 돌연변이의 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴을 이용하면 각 환자의 간세포암 발병 위험도를 예측할 수가 있다.
예를 들어, 상기 표 4의 환자 1의 경우, 7개의 돌연변이 누적 개수가 확인되어 고위험군으로 분류된다. 또한, 환자 1은 간세포암에 특이적인 돌연변이 조합 패턴과도 일치하여 고위험군인 것을 확인할 수 있으므로 고위험군으로서 간세포암 발병 위험도가 매우 높음을 확인할 수 있으며 따라서 향후 발병에 대비하여 특별 관리가 필요하다고 할 수 있다. 환자 2의 경우, 4개의 돌연변이 누적 개수가 확인되어 돌연변이 누적 개수만으로는 중위험군으로 분류되나, 간세포암에 특이적인 돌연변이 조합 패턴(제2 돌연변이 조합)과 일치하여 간세포암 발병 위험도가 높은 고위험군으로 분류할 수 있으므로 향후 발병에 대비하여 주의해서 관리할 필요성이 있다. 반면에, 환자 3 및 환자 4의 경우는 간세포암에 특이적인 돌연변이 조합 패턴도 없고 6개 미만의 돌연변이 누적 개수가 확인되므로 저위험군, 중위험군으로서 간세포암 발병위험이 적은 것으로 판정할 수가 있다.
실시예 2:
1. 재료 및 방법
1) 대상환자
간세포암 발병 예측 방법의 타당성 분석을 위해 분당제생병원과 인천성모병원에서 HBsAg (hepatitis B surface antigen) 양성인 환자를 무작위로 추출하였고, HBV 감염 환자에 특이적인 간질환 증상 진행 여부를 보다 정확하게 조사하기 위하여 알코올성 간질환이 합병된 경우와 C형 간질환을 동반하는 환자는 배제하였으며, 나이, 성별, HBeAg가 일정한 환자만을 선별하였다.
2) 임상 데이터 조사
상기 선별된 환자들에 대하여 혈액을 채취한 후 기본적인 혈청 생화학적 검사를 시행하였다. 첫 내원 시 HBsAg 양성인 경우, 항-HBs, e항원 (HBeAg), 항-HBe, HBV-DNA, 알파태아단백(alpha-fetopretein, AFP) 검사 및 CBC 및 LFT 검사를 하고 남은 혈액은 -80℃에서 냉동 보관하였다. 혈청 HBV DNA의 정량은 리얼타임(real-time) PCR(Applied Biosystems)을 이용하였으며 이 검사의 HBV DNA 검출한계는 500 Copies/mL이다.
3) HBV X 유전자 및 프리코어(precore) 유전자 영역의 증폭
상기 선정된 환자들의 각각의 혈액으로부터 QIAamp DNA 블러드 미니 키트 250(QIAamp DNA Blood Mini Kit 250) (Qiagen 51106)을 이용하여 HBV의 DNA를 분리하였다. 이를 이용하여 G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커 유전자 영역을 표적으로 하여 RFMP 분석을 시행하였다. 참고로, 제한효소 절편 질량다형성법(RFMP)은 본 출원인이 개발한 유전자형 분석방법으로서, 정밀하게 설계된 프라이머와 제한효소를 이용하여 조사하고자 하는 변이부위를 포함하는 최소 길이의 두 가닥의 염기서열 절편을 생성하고 이를 질량분석기로 분석하여 조사대상 유전자 영역의 변이를 효율적이고 정밀하게 분석하는 방법이다(대한민국 등록특허 제10-0477766호와 제10-0642829호 참조).
제한효소 절편 질량다형성법(RFMP)을 위한 염기서열 위치의 기준은 야생형 유전형 C형의 HBV의 전체 게놈 3215-bp (NCBI Reference Sequence: NC_003977.1)으로 하였다. 1차 PCR을 위한 프라이머 쌍으로는 정방향 프라이머로서 preC-F1 (서열번호 5)(5'-GTG CAC TTC GCT TCA CCT CTG CAC-3'; 센스 뉴클레오타이드, 1579번째 염기부터 1602번째 염기까지에 해당)와 역방향 프라이머로서 preC-R1(서열번호 6)(5'-AGG CGA GGG AGT TCT TCT TCT AGG -3'; 안티센스 뉴클레오타이드, 2366번째 염기부터 2389번째 염기까지에 해당)를 이용하였고, G1613A, C1653T, T1753V 및 A1846B의 간세포암 예측용 마커 유전자 영역의 2차 PCR을 위한 프라이머 쌍으로는 하기 표 5에 도시된 바와 같은 RFMP1613-F/R 프라이머 쌍, RFMP1653-F/R 프라이머쌍, RFMP1753-F/R 프라이머 쌍, RFMP1846-F/R 프라이머 쌍 그리고 RFMP1762-F/1899-R 프라이머 쌍을 사용하였다.
PCR 조건으로서, 최초 변성(denature)은 94℃에서 5분간 수행하였고, "94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초"의 반응조건을 40사이클(cycle)로 반복 수행하였고, 최종 연장(final extension)은 72℃에서 5분간 수행하였다. 2차 PCR 조건으로서, 최초 변성(denature)은 94℃에서 5분간 수행하였고, "94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초"의 반응조건을 35사이클(cycle)로 반복 수행하였고, 최종 연장(final extension)은 72℃에서 5분간 수행하였다.
4) PCR 증폭산물의 제한효소에 의한 절단
상기 PCR 증폭을 통해 만들어진 PCR 증폭산물들은 효소반응을 위해 제한효소인 FokI 2유닛(unit)과 FokI 반응 버퍼 (50mM CH3COOK, 20mM 트리스-아세테이트, 10mM (CH3COO)2Mg, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)) 10㎕ 그리고 PCR 증폭산물 10㎕를 혼합하여 37℃에서 2시간, 42℃에서 2시간 동안 효소 반응시켰다. 이를 통해 하기 표 6과 같은 DNA 절편을 얻을 수 있다.
5) MALDI-TOF를 이용한 HBV X 유전자와 프리코어 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 여부 조사
상기 제한효소 반응을 통해 수득한 DNA 절편들은 오아시스(Oasis)(Waters) C18 이온 수지 교환 컬럼(C18 reverse phase column chromatography)을 이용하여 순수 분리한다.
이를 위해, 수득된 제한효소 반응물에 0.15M 트리 에틸암모늄아세테이트(TEAA, pH 7.6) 70 ㎕를 넣어 1분간 두었다. C18 이온 수지 교환 컬럼에 100% 아세토니트릴(ACN; Sigma, USA)과 0.1M TEAA 1 ㎖을 통과시켜 레진(Resin)을 활성화시킨 후, 상기 수득된 제한효소 반응물 용액과 0.15M TEAA와의 혼합액 100 ㎕, 0.1M TEAA 2 ㎖ 및 3차 증류수 1 ㎖를 차례로 완전히 통과시켰다. 수집 플레이트(Collection Plate) 위에 상기 컬럼을 위치시키고, 70% ACN 100 ㎕을 넣어 통과시켰다. 용출액이 상기 수집 플레이트에 모아지면, 상기 수집 플레이트를 120℃에서 60분간 건조시켰다.
말디 매트릭스(MALDI matrix)[22.8 ㎎ 암모늄 시트레이트, 148.5 ㎎ 히드록시피콜린산(hydroxypicolinic acid), 1.12 ㎖ 아세토니트릴, 7.8 ㎖ H2O] 4㎕를 말디-토프 매스 스펙트로메트리(Biflex IV, Bruker)의 앵커 칩 플레이트(Anchor chipplate)에 미리 점적(dotting)하였고, 정제 및 탈염과정을 거친 수집 플레이트의 샘플에 3차 증류수를 10 ㎕을 넣어 녹여낸 후 건조된 말디 매트릭스 위에 2 ㎕ 점적하였으며, 말디 매트릭스를 다시 37℃에서 20분 동안 건조시킨 후 말디-토프(MALDI-TOF) 매스 스펙트로메트리로 분석한다. 분석방법은 말디-토프 매스 스펙트로메트리의 매뉴얼을 따른다.
말디-토프 매스 스텍트로메트리 그래프를 통해서 분자량을 확인하면 상기 표 6의 절편화된 DNA를 토대로 예측한 절편들의 분자량에 따라 8개의 간세포암 예측용 마커들의 야생형 또는 변이형을 분석하는 것이 가능하다.
예를 들어, G1613A에 대한 RFMP 분석 결과 분자량이 2867.8, 2785.8이 나왔다면, 상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 해당 검체의 HBV 간세포암 예측용 마커 G1613A에서는 1613 위치의 염기가 야생형인 G인 것을 알 수 있다.
그러나, 본 발명의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법은 전술한 분석법에 국한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 모든 분자생물학적 유전자 분석 방법, 예를 들어, 전술한 시퀀싱법, DNA 칩 등을 이용하여 수행될 수 있음은 물론이다.
2. 결과 및 분석
1) HBV 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴을 이용한 간세포암 발병 예측 방법에 따른 각 환자 별 발병 위험도
본 실시예 2에서 조사한 HBV 유전자 상의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴에 대한 환자 별 예시는 하기 표 7과 같다.
상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, HBV 유전자 상의 돌연변이의 누적 개수와 돌연변이 조합 패턴을 이용하면 각 환자의 간세포암 발병 위험도를 예측할 수가 있다.
예를 들어, 상기 표 7의 환자 1의 경우, 비록 간세포암에 특이적인 돌연변이 조합 패턴이 나타나지는 않았으나 돌연변이 누적 개수가 6개로 확인되어 고위험군으로 분류된다. 따라서 향후 발병에 대비하여 특별 관리가 필요하다고 할 수 있다. 환자 2의 경우, 5개의 돌연변이 누적 개수가 확인되어 중위험군으로 분류되나, 간세포암에 특이적인 돌연변이 조합 패턴(제7 돌연변이 조합)과 일치하여 간세포암 발병 위험도가 높은 고위험군으로 분류할 수 있으므로 향후 발병에 대비하여 주의해서 관리할 필요성이 있다. 반면에, 환자 3 및 환자 4의 경우는 간세포암에 특이적인 돌연변이 조합 패턴도 없고 6개 미만의 돌연변이 누적 개수가 확인되므로 저위험군, 중위험군으로서 간세포암 발병위험이 적은 것으로 판정할 수가 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
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occurred in chronic hepatitis B infected patients
<130> P10-0244KR
<160> 18
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<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBx-F1 forward primer
<400> 1
tgttttgctc gcagctggtc tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBx-R1 reverse primer
<400> 2
agccacccaa ggcacagctt gg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBx-F2 forward primer
<400> 3
catggctgct aggctgtgct g 21
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBx-R2 reverse primer
<400> 4
gagatgatta ggcagaggtg aaaaag 26
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> preC-F1 forward primer
<400> 5
gtgcacttcg cttcacctct gcac 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> preC-R1 reverse primer
<400> 6
aggcgaggga gttcttcttc tagg 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBx-S1 forward primer
<400> 7
cggcgctgaa tcccgcggac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBx-S2 reverse primer
<400> 8
tgaacatacc aatttatgcc 20
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RFMP1613-F forward primer
<400> 9
tcgcttcacc ggatgctgca cgtcgcatgg a 31
<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agacttggtg ggatggcgtt cacggtggt 29
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RFMP1653-F forward primer
<400> 11
cccaccaagt ggatgttgcc caaggtctta 30
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<211> 33
<212> DNA
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<220>
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<400> 12
catcgctgag ggatggtcca agagtcctct tat 33
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 13
ggactgggag ggatgagttg ggggaggaga 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
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cctcctagta ggatgaaaaa tcattaacct a 31
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<212> DNA
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<220>
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<400> 15
actttttcac ggatgtctgc ctaatcatct c 31
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<220>
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ggaggcttga ggatgcagta ggacatgaac a 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RFMP1762-F forward primer
<400> 17
tgggggagga gattggtagg ttaa 24
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RFMP1899-R reverse primer
<400> 18
attctttata cgggtcaatg tggatg 26
Claims (8)
- (a) 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서, 간세포암 종속변수인 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이 각각 또는 돌연변이 조합들과의 관계를 분석하는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계의 분석을 통해 도출된 종속변수인 간세포암 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이와의 관계를 이용하여, 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 돌연변이가 나타나는 간세포암 예측용 마커들인 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A 마커들을 선정하는 단계와,
(c) 상기 (b) 단계에서 선정된 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들로부터 가능한 모든 돌연변이 조합인 28 = 256개의 돌연변이 조합 중 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합을 결정하는 단계와,
(d) 만성 B형 간질환 환자에서 채취한 시료로부터 B형 간염 바이러스(HBV)의 유전자형을 분석하고, 분석된 유전자형으로부터 상기 선정된 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이들의 유무를 판단하는 단계와,
(e) 상기 (d) 단계에서의 돌연변이들의 유무 판단 후, 돌연변이가 나타난 마커들의 조합이 상기 (c) 단계에서 결정된 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합에 해당하는 경우 간세포암 발병 고위험군으로 결정하는 단계를 포함하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법. - 제1항에 있어서,
상기 간세포암 환자에게서 특이적으로 확인되는 돌연변이 조합은, "G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1896A"의 제1 돌연변이 조합, "T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 제2 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, T1753V, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A"의 제3 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B, G1896A 및 G1899A"의 제4 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1896A"의 제5 돌연변이 조합, "G1613A, C1653T, A1762T, G1764A, A1846B 및 G1899A"의 제6 돌연변이 조합, 또는 "C1653T, T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 제7 돌연변이 조합인 것을 특징으로 하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법. - (a) 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서, 종속변수인 간세포암 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이의 관계를 분석하는 단계와,
(b) 상기 (a) 단계의 분석을 통해 도출된 종속변수인 간세포암 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이와의 관계를 이용하여, 만성 B형 간질환 환자군과 만성 B형 간질환으로부터 간세포암으로 진행된 환자군 사이에서 통계학적으로 유의적인 차이를 보이는 돌연변이가 나타나는 간세포암 예측용 마커들을 선정하는 단계와,
(c) 만성 B형 간질환 환자에서 채취한 시료로부터 B형 간염 바이러스(HBV)의 유전자형을 분석하고, 분석된 유전자형으로부터 상기 선정된 간세포암 예측용 마커들의 돌연변이들의 유무를 판단하는 단계와,
(d) 상기 (c) 단계에서의 돌연변이들의 유무 판단 후, 상기 선정된 간세포암 예측용 마커들에 있어서 돌연변이가 나타난 마커들의 총 개수를 계수하고, 돌연변이 누적 개수가 미리 결정된 컷 오프값 이상인 경우 간세포암 발병 고위험군으로 결정하는 단계를 포함하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법. - 제3항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 간세포암 종속변수인 발병/비발병과 독립변수인 HBV 유전자 상의 돌연변이들 전체 또는 돌연변이 조합들과의 관계를 분석하는 단계를 더 포함하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 선정된 간세포암 예측용 마커들은 HBV의 X 유전자 및 프리코어/코어 유전자 상의 G1613A, C1653T, T1753V("V"는 염기 A, C, G를 의미함), A1762T, G1764A, A1846B("B"는 염기 C, G, T를 의미함), G1896A 및 G1899A의 총 8개의 간세포암 예측용 마커들인 것을 특징으로 하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법. - 제5항에 있어서,
상기 컷 오프값은 3개 내지 6개인 것을 특징으로 하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법. - 제6항에 있어서,
상기 컷 오프값은 6개인 것을 특징으로 하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 컷 오프값이 6개이고 돌연변이 누적 개수가 6개 미만인 경우라도 "T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 간세포암 예측용 마커들에 돌연변이가 발생하거나, "C1653T, T1753V, A1762T, G1764A 및 G1896A"의 간세포암 예측용 마커들에 돌연변이가 발생한 경우에는 간세포암 발병 고위험군으로 결정하는 것을 특징으로 하는 만성 B형 간질환 환자의 간세포암 발병 위험도 분석 및 예측방법.
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