KR20120100964A - 개인용 보조인자 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20120100964A
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individual
cofactor
cofactors
vitamin
genetic
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KR1020127011246A
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니콜라스 마리니
제스퍼 라인
데니스 오스틴 길버트
브루스 코헨
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바이타패스 제네틱스 인코포레이티드
더 리젠트스 오브 더 유니이버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본원에서는, 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 검출하고, 보조인자 구제가능 병상에 대한 소인을 측정하고, 유전적 변이체를 기준으로 개인화된 영양적 조언 계획을 생성시킴으로써, 개인의 유전적 구성을 기준으로 개인에 대한 비타민과 같은 하나 이상의 보조인자를 확인하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 또한 본원에서는, 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 보조인자의 제형 및 이들 제형의 결정 및 제조 방법이 제공된다.

Description

개인용 보조인자 및 사용 방법 {COFACTORS AND METHODS FOR USE FOR INDIVIDUALS}
폴레이트 (folate)/호모시스테인 대사 경로는 폴레이트를 대사작용하고/하거나 호모시스테인에 영향을 주는 효소 및 효소 경로의 네트워크를 구성한다. 상기 경로는 메티오닌 신타아제 반응을 통해 연결되며, 세포 배양물에서의 미미한 폴레이트 결핍, 동물 모델 시스템 및 인간에서는 호모시스테인 재메틸화를 손상시킨다 (예를 들어, Stover PJ . 2004. Physiology of folate and vitamin B 12 in health and disease . Nutr Rev 62: S3 -12 참조).
폴레이트 불충분은 신경관 결함 ("NTD") 뿐 아니라 기타 출생적 결함 및 해로운 임신 결과물, 예컨대 구안지 구열, 임신중독증, 조산/저출생 체중 및 재발성 초기 자연유산과 연결되며 (예를 들어, Mills et al , 1995. Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects . Lancet 345:149-1151 참조), 폴레이트 불충분은 또한 심혈관계 질환, 관상동맥 질환, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 혈전증, 망막 동맥 폐쇄, 다운증후군, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열증, 알츠하이머병/치매, 노인성 황반 변성 및 녹내장과 연관된다.
폴레이트/호모시스테인 대사 경로에서의 모든 대사 단계는 폴레이트 불충분 및/또는 호모시스테인 신진대사와 연관된 병상 및 질환과 잠재적으로 관련된다. 관계되는 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 효소는 예를 들어, 이관능성 효소 AICAR 트랜스포르밀라아제 및 IMP 시클로히드롤라아제 (ATIC), 글리신아미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라아제 (GART), 메티오닌 아데노실트랜스퍼라아제 I, 알파 (MAT1A), 메티오닌 아데노실트랜스퍼라아제 II, 알파 (MAT2A), 메틸렌테트라히드로폴레이트 환원효소 (MTHFR) 및 메테닐테트라히드로폴레이트 합성효소 (MTHFS) 를 포함한다. 폴레이트 불충분은 또한 MTHFR 및 CBS 모두의 알로스테릭 저해제인 S-아데노실-메티오닌 ("SAM") 에 의해 매개되는 메틸화를 손상시킨다 (예를 들어, Kraus et al , 1999, Cystathionine 3- synthase mutations in homocystinuria. Hum Mut 13:362-375; Daubner et al , 1982. In Flavins and Flavoproteins, eds . Massey , V. & Williams , C. H, ( Elsevier , New York ), pp . 165-172 참조). S-아데노실-호모시스테인:S-아데노실메티오닌 (SAH/SAM) 비에서의 상승은 NTD 발전 메카니즘에서 제시된 바 있다.
5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 환원효소 (MTHFR) 는 호모시스테인이 메티오닌으로 전환되는 폴레이트-의존적 다단계 경로에 포함된다. 호모시스테인의 전환 감소는 고호모시스테인혈증을 일으킬 수 있다.
MTHFR 의 여러 희귀 돌연변이는 임상적 MTHFR 결핍, 상염색체 열성 장애와 연관되는 것으로 확인되었다. MTHFR 결핍의 임상적 증상은 매우 다양하며 발달 지연, 운동 및 보행 이상, 발작 및 조기 혈관 질환을 포함한다.
기능적으로 손상 대립형질 A222V 를 포함하는 MTHFR 의 통상적인 다형성이 또한 기재된 바 있다. 질환과 통상적인 다형성의 유전적 연관은 일치하지 않는다. 이는 질환의 기저 위험성을 막는 폴레이트 이용가능성 뿐 아니라 상기 질환에 대한 미확인 저빈도 손상 대립형질의 기여의 보상 효과로 일부 인한 것일 수 있다. 흥미롭게도, 통상적인 다형성은 메토트랙세이트 및 5-플루오로우라실과 같은 화학요법의 효능 및 독성에 있어서의 개체 변이와 연관되었다.
효모 유전자 met11 의 기능적 상보성에 대한 검정이 기재되어 있다 (Shan et al, JBC , 274:3261 3-3261 8, 1999). 이 검정에서, 야생형 인간 MTHFR 은 S. 세레비지에 (S. cerevisiae) 에서 met11 돌연변이를 보완하는 것으로 나타났다. 그러나, 야생형 효소에 비해 효모 돌연변이를 보완하기 위한 기능적 손상 대립형질 A222V 의 유사한 능력에 의해 입증된 바와 같이, 상기 검정은 MTHFR 돌연변이로 인한 활성에 있어서의 정량적 변화에 대해 민감하지 않았으며; 상기 검정은 폴레이트 이용가능성에 대해서도 민감하지 않았다.
폴레이트 이용 효소에 추가로, 소수의 비타민 B6- 및 B12-의존적 효소 및 효소 경로는 호모시스테인 신진대사, NTD 및 기타 출생적 결함 및 해로운 임신 결과물에 관련이 있다. 예를 들어, B6 이용 효소 시스타티오닌-13-신타아제 ("CBS") 에서의 결함은 호모시스테인의 축적을 일으킨다 (Kraus et al , 1999. Cystathionine 13- synthase mutations in homocystinuria . Hum Mut 13:362-375). 뿐만 아니라, B6 이용 효소 시스타티오닌-γ-리아제 ("CTH") 의 단일 뉴클레오티드 다형성 ("SNP") 은 또한 호모시스테인혈증과 연관되었다 (Wang et al , 2004. Single nucleotide polymorphism in CTH associated with variation in plasma homocysteine concentration . Clin Genet 65:483-486).
발명의 개요
본 발명은 대사 경로 내 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 확인하고 이의 보조인자 치료에 대한 감수성을 측정하기 위한 신규한 생체내 검정의 개발에서 일부 유래한다. 관심의 기능적 상동 효소에 의한 상보를 가능하게 하는 제 1 돌연변이체, 및 균주가 보조인자 보충에 의존적이게 하는 제 2 돌연변이체 (또는 돌연변이군) 을 포함하는 화합물 효모 돌연변이체는, 보조인자 이용가능성의 함수로서 효소 상보성의 연구를 제공한다. 구제가능 대립형질을 포함하는 보조인자-민감성의 손상 대립형질이 확인될 수 있으며, 보조인자-이용가능성:효소-활성 관계가 본원에 개시된 검정을 사용하여 분석될 수 있다. 수득한 결과는 대사 효소 기능 장애 및 비정상적 신진대사와 연관되는 병상 및 질환을 예방하고 치료하기 위한 예방적 및 치료적 영양 보충 접근방식을 알리는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 처음으로, 효소-인코딩 유전자에서의 저-빈도 손상 대립형질의 보조인자 치료가 놀랍게도 통상적인 것이라는 논증에서 일부 유래한다. 본원에서 예시된 바와 같이, 대사 경로에서의 다수의 보조인자-민감성 유전자는 각각 집단에서의 다수의 저빈도 돌연변이를 가질 수 있다. 종합하여, 이들 돌연변이는 단일 유전자의 단일 저빈도 손상 대립형질의 검사로부터 명백한 것보다, 대사 경로에 대해 집합적으로 더 유의한 영향을 갖는다. 또한, 다수의 이러한 저빈도 손상 대립형질에 대해 이종접합성인 세포가 정량적 결함을 나타내기 때문에, 이러한개체적으로 희귀한 대립형질의 응집물 빈도는 심지어 보다 통상적인 다형성(들) 의 부재 하에서도 통상적인 표현형에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 효소-인코딩 유전자에서의 이러한 저빈도 손상 대립형질의 검출 및 분석, 및 이의 효과적인 치료의 결정에 중점을 둔 진단 및 예측법을 계획한다.
본 발명은 또한 특히 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 효소-인코딩 유전자에서의 신규한 저빈도 손상 대립형질을 확인하고 분석하기 위한 이들 검정의 특정 적용에서 일부 유래한다. MTHFR 과 관련하여 본원에서 입증한 바와 같이, 효소 결핍에 점증적으로 기여할 수 있으나 보조인자 보충에 의해 또한 해소될 수 있는 많은 저빈도 손상 대립형질이 존재한다. 본 발명은 또한 MTHFR 의 손상 대립형질이 효소의 N-말단 촉매 도메인의 코딩 서열에 대한 맵인 서열 변화를 포함한다는 발견에서 일부 유래한다.
그러므로 한 양상에서 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 효소-인코딩 유전자의 손상되었으나 구제가능한 대립형질 (예를 들어, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR 및 MTHFS 포함) 을 검출하기 위한 생체내 검정을 제공한다. 야생형 인간 MTHFR 활성 보완 met11 결핍을 기재한 상보성 검정 (Shan et al, JBC, 274:32613-32618, 1999) 은, 매우 민감성은 아니었으며 모든 기능적으로 손상된 인간 MTHFR 대립형질을 검출할 수 없었다. 예를 들어, 상기 검정은 야생형 MTHFR 과 기능적으로 손상된 통상적 다형성 A222V 를 구별할 수 없다. 또한, 이 검정은 폴레이트 수준과 효소 활성 사이의 관계에 대해 아무것도 밝혀내지 못했다.
MTHFR 에 대해 본원에서 입증된 바와 같이, 본원에서 개시된 생체내 검정은 매우 민감하며 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 드러낼 수 있는 한편, 폴레이트에 대한 이의 감수성을 동시에 측정할 수 있다. 확인된 대립형질은 이형접합체로서 표현형을 나타내는 저빈도 대립형질, 우위종 또는 공동우위종 대립형질, 폴레이트-민감성인 대립형질 (폴레이트 구제가능 대립형질 포함) 및 이들 특징의 조합을 갖는 대립형질을 포함한다. 중요하게는, 이들 손상 대립형질은 다양한 병상 및 질환의 위험성 뿐 아니라 화학요법제의 다양한 효능 및 독성과 연관된다. 이들 손상 대립형질의 결핍은 폴레이트 이용가능성의 보상 효과로 인해 병상, 질환 또는 일부 개인에서의 화학요법에 대한 다양한 반응으로서 명백하지 않을 수 있다. MTHFR 의 기능적 손상 대립형질을 드러내는 능력은 이러한 병상 및 질환의 위험성 뿐 아니라 화학요법의 잠재적 치료 효능 및 독성을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 CTH 및 CBS 의 손상 대립형질을 검출하기 위한 생체내 검정을 제공한다. 이들 유전자의 기능적 손상 대립형질을 드러내는 능력은 연관 질환 및 병상의 위험성을 스크리닝하는 방법을 유사하게 제공한다.
따라서 한 양상에서, 본 발명은 대사 경로에서의 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 검출하고 보조인자에 대한 이의 감수성을 검출하기 위한 생체내 검정을 제공한다. 상기 검정은 야생형 효소-인코딩 유전자에 의해 보완될 수 있는 제 1 유전자에서의 제 1 돌연변이, 및 효모 균주가 제 1 유전자의 기능에 관련된 검정가능한 표현형에 대한 보조인자 (또는 이의 전구체) 공급에 의존적이게 하는 제 2 유전자 (또는 유전자군) 를 포함하는 효모 균주의 사용을 포함한다.
상기 방법은 (i) 효모 세포를 효소-인코딩 유전자의 시험 대립형질에 도입하고 (상기 효모 세포는 효소-인코딩 유전자에 대해 기능적으로 상동인 제 1 유전자에서의 제 1 돌연변이, 및 효모 세포가 효소 기능에 필요한 보조인자 보충에 의존적이게 하는 제 2 유전자 (또는 유전자군) 에서의 제 2 돌연변이를 포함하며, 상기 제 1 돌연변이는 제 1 유전자의 기능과 관련된 효모의 측정가능한 특징을 변경시킴); (ii) 성장 배지에 보조인자를 보충하고; (iii) 야생형 효소의 존재 하에서보다 시험 대립형질의 존재 하에서 측정가능한 특징이 덜 회복되는 것을 측정함으로써 시험 대립형질에 의한 제 1 유전자 돌연변이의 불완전 상보성을 검출하고 손상 대립형질로서 시험 대립형질을 확인하는 것을 포함한다. 보충된 보조인자의 양을 적정함으로써, 손상 대립형질의 보조인자 이용가능성에 대한 감수성을 측정한다.
한 구현예에서, 이배체 효모 세포를 사용한다. 이배체 효모는 시험 대립형질에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 이배체 효모는 야생형 유전자 및 시험 대립형질을 포함할 수 있다. 이배체 효모는 시험 대립형질의 조합을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 대립형질, 또는 개인 자연발생적 대립형질의 편집물에 대한 서열에 상응한다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 인간 효소-인코딩 유전자의 대립형질, 또는 개인 인간 대립형질의 편집물을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 효모는 S. 세레비지에이다.
한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 met13 이며 제 2 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주는 MTHFR 대립형질의 활성, 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 MTHFR 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 폴레이트 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 인간 MTHFR 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 MTHFR 대립형질의 편집물을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 검정 방법은 관심 MTHFR 대립형질의 활성을 야생형 MTHFR 의 활성에 대해 비교하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 검정 방법은 MTHFR 효소가 폴레이트 이용가능성에 대해 민감한지 여부를 측정하기 위해 폴레이트의 양을 적정하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 효모는 이배체이다. 한 구현예에서, 이배체 효모는 상보성에 대해 시험하는 MTHFR 대립형질에 대해 이형접합성이다. 한 구현예에서, 이배체 효모는 야생형 MTHFR 및 돌연변이체 MTHFR 대립형질을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 검정의 측정 산출물은 성장이다.
한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 ade16 또는 ade17 이며 제 2 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주를 사용하여 이관능성 효소 AICAR 트랜스포르밀라아제 및 IMP 시클로히드롤라아제 (ATIC) 대립형질의 활성, 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 ATIC 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 폴레이트 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 인간 ATIC 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 ATIC 대립형질의 편집물을 포함한다.
한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 ade7 이며 제 2 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주를 사용하여 글리신아미드 리보뉴클레오티드 트랜스포르밀라아제 (GART) 대립형질의 활성, 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 GART 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 폴레이트 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 인간 GART 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 GART 대립형질의 편집물을 포함한다.
한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 sam1 또는 sam2 이며 제 2 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주를 사용하여 메티오닌 아데노실트랜스퍼라아제 I, 알파 (MAT1A) 대립형질의 활성, 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 MAT1A 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 폴레이트 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 인간 MAT1A 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 MAT1A 대립형질의 편집물을 포함한다.
한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 sam1 또는 sam2 이며 제 2 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주를 사용하여 메티오닌 아데노실트랜스퍼라아제 II, 알파 (MAT2A) 대립형질의 활성, 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 MAT2A 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 폴레이트 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소 인코딩 유전자는 자연발생적 인간 MAT2A 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 MAT2A 대립형질의 편집물을 포함한다.
한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 fau1 이며 제 2 효모 유전자는 fol3 이다. 이러한 효모 균주를 사용하여 메테닐테트라히드로폴레이트 합성효소 (MTHFS) 대립형질의 활성, 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 MTHFS 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 폴레이트 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 인간 MTHFS 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 MTHFS 대립형질의 편집물을 포함한다.
또다른 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 cys3 이며, 효모 유전자의 제 2 군은 6 겹 (sextuple)-결실 sno1 △ sno2 △ sno3 △ snz1 △ snz2 △ snz3 △ 이다. 이러한 효모 균주를 사용하여 CTH 대립형질의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 CTH 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 비타민 B6 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 인간 CTH 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 CTH 대립형질의 편집물을 포함한다.
또다른 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 cys4 이며, 효모 유전자의 제 2 군은 6 겹-결실 sno1 △ sno2 △ sno3 △ snz1 △ snz2 △ snz3 △ 이다. 이러한 효모 균주를 사용하여 CBS 대립형질의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정할 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 CBS 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 비타민 B6 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 자연발생적 인간 CBS 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 개인 인간 CBS 대립형질의 편집물을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질 및 보조인자에 대한 이의 감수성을 검출할 수 있는 효모 균주를 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR 및 MTHFS 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 검출할 수 있으며 폴레이트에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 일부 구현예에서, 효모는 각각의 이러한 효소-인코딩 유전자에 대한 각각의 돌연변이 및 상기 기재된 부가물을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CTH 의 손상 대립형질을 검출할 수 있으며 비타민 B6 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CBS 의 손상 대립형질을 검출할 수 있으며 비타민 B6 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 대사 경로, 예를 들어 폴레이트/호모시스테인 신진대사에서의 효소 인코딩 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 손상 대립형질(들) 은 인간 ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR 및/또는 MTHFS 에서 자연발생적이다. 한 구현예에서, 손상 대립형질은 CBS 대립형질이다. 한 구현예에서, 손상 대립형질은 CTH 대립형질이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 제공된 생체내 검정 및 방법을 사용하여 보조인자-구제가능성인 것으로 나타난 대사 효소-인코딩 유전자에서의 손상 대립형질을 검출하는 것을 포함한다.
또다른 양상에서 본 발명은, 대상으로부터 샘플을 수득하고 상기 샘플 내 다수의 손상 대립형질의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 (하나 이상의 손상 대립형질의 존재는 대상이 효소 결핍의 위험성에 있다는 것을 나타냄), 대상에서의 대사 효소 결핍을 확인하고/하거나 분석하기 위한 방법을 제공한다. 다수의 손상 대립형질은 대사 경로에서의 동일한 효소-인코딩 유전자로부터의 것일 수 있거나, 동일한 경로에서의 다수 유전자로부터의 대립형질일 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 손상 대립형질은, 예를 들어, 일반적으로 일반 인구의 3% 미만, 바람직하게는 일반 인구의 2.5% 내지 2% 미만, 가장 바람직하게는 일반 인구의 1% 미만으로 발현되는 저빈도 대립형질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 손상 대립형질은 보조인자 구제가능 대립형질이다. 특히 바람직한 구현예에서, 보조인자-구제가능 손상 대립형질은 본원에 제공된 생체내 검정 및 방법에 의해 확인된다.
또다른 양상에서, 대상으로부터 샘플을 수득하고 상기 샘플에서의 다수의 손상 대립형질의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 (하나 이상의 손상 대립형질의 존재는 대상이 구제가능 효소 결핍을 가질 수 있음을 나타냄), 대상에서의 보조인자-의존적 효소 결핍에 대한 소인을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 다수의 손상 대립형질은 대사 경로에서의 동일한 효소-인코딩 유전자로부터의 것일 수 있거나, 동일한 경로에서의 다수 유전자로부터의 대립형질일 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 손상 대립형질은, 예를 들어, 일반적으로 일반 인구의 4% 미만, 보다 일반적으로는 일반 인구의 3% 미만, 바람직하게는 2.5% 내지 2% 미만, 가장 바람직하게는 일반 인구의 1% 미만으로 발현되는 저빈도 대립형질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 손상 대립형질은 보조인자 구제가능 대립형질이다. 특히 바람직한 구현예에서, 보조인자-구제가능 손상 대립형질은 본원에 제공된 생체내 검정 및 방법에 의해 확인된다.
샘플에서의 특정 대립형질의 검출은 당업계에서 통상적이며, 본원에 기재된 바와 같이, 임의의 통상적인 검출 프로토콜이 예를 들어 하이브리드화, 증폭, 서열분석, 서열분석, RFLP 분석 등을 기준으로 하는 프로토콜을 포함하는 대상 방법에서 유리하게 이용될 수 있다. 핵산 샘플에서의 대립형질의 검출에 있어서 특히 이용되는 장차 개발되는 프로토콜 및/또는 물질이 또한 사용을 위해 계획된다.
추가의 양상에서, 본원에서 기재되는 바와 같은, 이러한 결핍을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상으로부터 샘플을 수득하고, 샘플에서의 다수의 보조인자-구제가능 손상 대립형질의 존재 또는 부재를 검출하고, 샘플에서 검출된 손상 대립형질(들) 의 수 및 유형을 기준으로 대상에게 적절한 보조인자 보충물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서의 대사 효소 결핍 치료 방법이 제공된다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 효소 활성을 측정하기 위한 생체내 검정의 사용을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 효소 활성을 측정하고 효소-인코딩 핵산에서의 돌연변이를 검출하기 위한 생체내 검정의 사용을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 효소 활성을 측정하기 위한 생체내 검정, 및 승온에서의 효소 안정성을 측정하기 위한 온도 감수성 검정의 사용을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 효소 활성을 측정하기 위한 생체내 검정, 및 효소의 특이적 활성을 측정하기 위한 시험관내 검정의 사용을 추가로 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 비정상적 호모시스테인 신진대사와 연관된 질환 또는 병상의 위험성에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질에 대한 스크리닝을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에서 기재된 생체내 검정을 사용하여 분석한 손상 대립형질을 검출하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 질환 또는 병상은 심혈관계 질환, 관상동맥 질환, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결함, 구안지 구열, 임신중독증, 조산/저출생 체중, 재발성 초기 자연유산, 혈전증, 망막 동맥 폐쇄, 다운증후군, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열증, 알츠하이머병/치매, 노인성 황반 변성 및 녹내장으로 이루어지는 군에서 선택된다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR 및/또는 MTHFS 의 손상 대립형질에 대한 스크리닝을 포함한다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, CBS 의 손상 대립형질에 대한 스크리닝을 포함한다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, CTH 의 손상 대립형질에 대한 스크리닝을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 개인의 화학요법 반응 가능성을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 방법의 사용을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다. 본원에 기재된 생체내 검정 방법 및/또는 특이적 대립형질에 대한 검출 방법의 적용에 의한 개인에서의 손상 대립형질 검출은 감소된 반응 가능성을 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 개인에 대한 잠재적 화학요법 독성의 측정 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 방법의 사용을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다. 본원에 기재된 생체내 검정 방법 및/또는 특이적 대립형질에 대한 검출 방법의 적용에 의한 개인에서의 손상 대립형질 검출은 증가된 독성 가능성을 나타낸다.
한 양상에서, 본 발명은 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소-인코딩 유전자의 대립형질에 대해 서열에 있어서 상응하는 단리된 핵산을 제공한다. 한 구현예에서, 단리된 핵산은 MTHFR 유전자의 대립형질의 서열을 갖고/갖거나 포함한다 (예를 들어, 표 A 에 개시된 SNP). 한 구현예에서, 단리된 핵산은 ATIC 유전자의 대립형질의 서열을 갖고/갖거나 포함한다 (예를 들어, 표 B 에 개시된 SNP). 한 구현예에서, 단리된 핵산은 MTHFS 유전자의 대립형질의 서열을 갖고/갖거나 포함한다 (예를 들어, 표 C 에 개시된 SNP). 한 구현예에서, 단리된 핵산은 MAT1A 유전자의 대립형질의 서열을 갖고/갖거나 포함한다 (예를 들어, 표 D 에 개시된 SNP). 한 구현예에서, 단리된 핵산은 MAT2A 유전자의 대립형질의 서열을 갖고/갖거나 포함한다 (예를 들어, 표 E 에 개시된 SNP). 한 구현예에서, 단리된 핵산은 GART 유전자의 대립형질의 서열을 갖고/갖거나 포함한다 (예를 들어, 표 F 에 개시된 SNP). 한 구현예에서, 핵산은 MTHFR 대립형질의 서열에 상응하며 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L 및 Q648P 로 이루어지는 군에서 선택되는 MTHFR 단백질에서의 비-동의성 돌연변이를 인코딩하는 서열을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 어레이를 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFR 및 MTHFS 로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 어레이는 군에서 선택되는 유전자에 대한 하나 초과의 손상 대립형질을 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 어레이는 군에서 선택되는 다수의 유전자에 대한 하나 초과의 손상 대립형질을 검출할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 어레이는 군에서 선택되는 다수의 유전자 각각으로부터의 하나 초과의 손상 대립형질을 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 어레이는 구제가능 손상 대립형질인 손상 대립형질을 검출할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 어레이는 구제가능 손상 대립형질인 다수의 손상 대립형질을 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 손상 대립형질 중 하나 이상은 저빈도 대립형질이다.
한 구현예에서, 본 발명은 손상된 MTHFR 대립형질을 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 한 구현예에서, 상기 어레이는 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L 및 Q648P 를 인코딩하는 것들로 이루어지는 군에서 선택되는 비-동의성 돌연변이를 포함하는 MTHFR 대립형질에 하이브리드화될 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CBS 의 손상 대립형질을 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 상기 어레이는 CBS 의 손상 대립형질에 하이브리드화될 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CTH 의 손상 대립형질을 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 상기 어레이는 CTH 의 손상 대립형질에 하이브리드화될 수 있는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 다수의 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 어레이를 제공한다. 본 발명의 어레이는 당업계에 알려져 있는 많은 어레이, 프로브 및 판독 기술 중 임의의 것을 사용할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 구제가능 손상 대립형질을 갖는 개인에서의 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 병상 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 개인의 폴레이트 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 개인의 비타민 B6 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 질환 또는 병상의 위험성을 스크리닝하는 방법을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 환자가 폴레이트/호모시스테인 신진대사에서 포함되는 유전자의 구제가능 손상 대립형질을 갖는, 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 병상 또는 질환의 치료 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 환자의 폴레이트 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 개인의 비타민 B6 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 질환 또는 병상의 위험성을 스크리닝하는 방법을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 구제가능 손상 대립형질을 갖는 개인의 화학요법 반응 가능성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 폴레이트 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 질환 또는 병상의 위험성을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다.
한 양상에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 구제가능 손상 대립형질을 갖는 개인에 대한 화학요법의 독성을 감소시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 폴레이트 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 질환 또는 병상의 위험성을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다.
또다른 양상에서, 본 발명은 보조인자를 포함하는 제형을 제공하는데, 상기 보조인자는 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재한다. 본 발명의 제형은 다수의 보조인자를 포함할 수 있는데, 상기 다수 내 상기 보조인자의 하나 이상의 부분집합은 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재한다. 한 구현예에서, 상기 보조인자는 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (칼시페롤), 비타민 E, 비타민 K (필로퀴논), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B9 (폴레이트/엽산), 비타민 B12 (토코페롤), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B5 (판토텐산) 및 콜린으로 이루어지는 군에서 선택된다. 또다른 구현예에서, 상기 다수의 보조인자는 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (칼시페롤), 비타민 E, 비타민 K (필로퀴논), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B9 (폴레이트/엽산), 비타민 B12 (토코페롤), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B5 (판토텐산) 및 콜린으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 개 이상의 보조인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 제형은 서방형 형태로서 제조될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 경구 섭취가능하다. 상기 제형은 정제 또는 캡슐 형태 또는 액체 형태로, 단위 투약량으로서일 수 있다. 상기 제형은 또한 정맥내, 피하, 또는 근육내 투여를 위해 제조될 수 있다. 필요하다면, 본 발명의 제형에는 상기 개인에 의한 사용을 위한 지시사항이 동반될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 보조인자를 선택하고 (상기 보조인자는 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재함); (b) 상기 보조인자를 섭취가능 또는 주사가능 형태로 부형제와 혼합하는 것을 포함하는 제형 제조 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 선택 단계는 다수의 보조인자를 선택하는 것을 포함하는데, 상기 다수 내 상기 보조인자의 하나 이상의 부분집합은 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재한다. 또다른 구현예에서, 상기 보조인자는 개인의 하나 이상의 개인적 특징을 기준으로 선택되는데, 상기 개인적 특징은 체중, 키, 체질량 지수, 인종, 가계, 성별, 연령, 가족력, 의료 기록, 운동 습관 및 식습관으로 이루어지는 군에서 선택된다.
관련되지만 별도의 양상에서, 본 발명은 (a) 개인의 생물학적 샘플로부터의 다수의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 검출하고 (상기 다수의 유전적 변이체는 하기 표 A-X 에서 선택됨); (b) 상기 다수의 유전적 변이체가 상기 생물학적 샘플에서 검출되는 경우 보조인자 구제가능 병상에 대한 소인을 측정하는 것을 포함하는, 개인에서의 보조인자 구제가능 병상에 대한 위험성 또는 소인을 측정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 다수의 유전적 변이체는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 개 이상의 유전적 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 대상 방법은 개인에 대한 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성 또는 개인의 건강 관리 운영을 보고하는 것을 추가로 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) 개인의 생물학적 샘플로부터의 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 검출하고 (상기 하나 이상의 유전적 변이체는 상기 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량에 비해 보조인자 질량의 1% 이상으로 상이한 보조인자 권장량과 상관관계가 있음); (b) 상기 하나 이상의 유전적 변이체가 상기 생물학적 샘플에서 검출되는 경우 개인에 대한 보조인자의 상이한 양을 권장하는 것을 포함하는, 개인에 대한 보조인자의 양을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 유전적 변이체는 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량보다 적어도 1% 초과로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있다. 다른 구현예에서, 유전적 변이체는 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량보다 적어도 1% 미만으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있다. 다른 구현예에서, 유전적 변이체는 500% 이상으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있다. 개인은 보조인자 구제가능 병상에 대한 위험성 또는 소인을 갖는 여성일 수 있다.
본 발명은 단리된 핵산 또는 이의 보체를 추가로 제공하는데, 상기 핵산은 표 A-X 에서 나타낸 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 포함한다. 그에 고정된 본 발명의 다수의 단리된 핵산을 포함하는 어레이가 또한 계획된다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는, 개인에 대한 개인화된 영양적 조언 계획을 제공하는 컴퓨터 지원 방법을 제공한다: (i) 제 1 데이터세트를 데이터 처리 장치 상에 제공하고 (상기 제 1 데이터세트는 개인의 유전적 변이체의 존재와 상관관계가 있는 정보를 포함하며, 유전적 변이체는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성에 있음을 나타냄); (ii) 제 2 데이터세트를 데이터 처리 장치 상에 제공하고 (상기 제 2 데이터세트는 하나 이상의 생활방식 권장사항과 보조인자-의존적 효소 결핍을 매치시키는 정보를 포함함); (iii) (i) 의 유전적 변이체를 기준으로 개인화된 영양적 조언 계획을 생성시킴 (상기 계획은 단계 (ii) 에서 매치된 하나 이상의 생활방식 권장사항을 포함함). 일부 구현예에서, 상기 개인화된 생활방식 조언 계획은 최소 및/또는 최대 권장량의 비타민 아형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제 1 데이터세트는 표 A-X 에서 선택되는 다수의 유전적 변이체를 포함한다. 다른 구현예에서, 개인화된 생활방식 조언 계획은 개인의 유전적 변이체를 기준으로 하는 양으로 권장된 하나 이상의 보조인자를 포함한다. 필요하다면, 상기 방법은 고유한 식별자 코드를 사용하여 인터넷을 통해 개인에게 상기 계획을 전달하는 단계를 포함한다. 이러한 전달은 개인 또는 그 대리인에게 무선으로, 예를 들어, I-Phone® 을 통해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 계획은 하나 이상의 웹 페이지에 대한 하이퍼링크를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 대상 방법에 의해 분석되는 하나 이상의 보조인자-의존적 효소 결핍은 폴레이트/엽산 결핍이다. 다른 구현예에서, 상기 컴퓨터 지원 방법은 데이터 처리 장치 상에 제 3 데이터세트를 포함하는데, 상기 제 3 데이터세트는 개인의 하나 이상의 개인적 특징에 대한 정보를 포함한다. 개인적 특징(들) 은 체중, 키, 체질량 지수, 인종, 가계, 성별, 연령, 가족력, 의료 기록, 운동 습관 및 식습관을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 실제로 상기 방법, (i) 의 제 1 데이터세트를 제공하고/하거나 (ii) 의 제 2 데이터세트를 제공하는 단계는 개인 또는 그 대리인에 의해 각각의 데이터세트 정보를 입력함으로써 실행될 수 있다.
본 발명은 하기를 포함하는 컴퓨터 시스템을 추가로 제공한다: (i) 제 1 데이터세트 및/또는 제 2 데이터세트를 처리하도록 설정된 데이터 처리 장치 (상기 제 1 데이터세트는 개인의 유전적 변이체의 존재와 상관관계가 있는 정보를 포함하며 상기 유전적 변이체는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성에 있음을 나타내고, 상기 제 2 데이터세트는 하나 이상의 생활방식 권장사항과 보조인자-의존적 효소 결핍을 매치시키는 정보를 포함함); 및 (ii) 개인의 유전적 변이체를 기준으로 개인화된 영양적 조언 계획이 생성되도록 설정된 출력 장치 (상기 계획은 (i) 에서 매치된 하나 이상의 생활방식 권장사항을 포함함). 본원에 제공된 컴퓨터 시스템은 제 1 데이터세트 및/또는 제 2 데이터세트에 정보를 입력하기 위해 설정된 입력 장치를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 입력 장치는 개인의 하나 이상의 개인적 특징에 대한 정보를 입력하도록 설정된다.
또한 본 발명에서는, 하기를 포함하는 개인에 대한 개인화된 영양적 조언 계획을 제공하는 비즈니스 방법이 제공된다: 개인의 생물학적 샘플로부터의 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재에 관련되는 정보를 수집하고 (상기 하나 이상의 유전적 변이체는 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량에 비해 보조인자의 1% 이상으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있음); 하나 이상의 유전적 변이체가 생물학적 샘플에서 검출되는 경우 개인에 대한 보조인자의 상이한 양을 권장함.
본원에서 계획된 방법은 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량보다 적어도 1%, 5%, 10%, 100%, 500%, 1000% 초과로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 양상을 포함한다. 본 대상 방법은 또한 유전적 변이체가 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량의 적어도 1%, 5%, 10%, 100%, 500%, 1000% 미만으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 양상을 계획한다. 본원에 개시된 본 발명은 또한 신경관 결함 (예를 들어, 이분척추증), 구개열, 또는 무뇌증을 갖는 자손을 갖는 것, 또는 조산이 발생하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 보조인자 구제가능 병상을 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 대상의 개인은 임신한 여성이며 상기 보조인자 구제가능 병상은 이분척추증을 갖는 자손을 갖는 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1. fol3 △:: KanMX 세포의 성장률 및 인간 MTHFR 의 세포 활성에 대한 폴린산 보충의 효과. (a) fol3 △:: KanMX MET13 반수체 효모의 성장을 '물질 및 방법' 에서 기재된 바와 같은 96-웰 플레이트에서 측정하였다. 배지를 표시된 농도에서 폴린산으로 보충하였다. FOL3 ( FOL3 MET13 ) 로 표지된 곡선은 폴린산 없는 배지에서의 성장의 경우이다. (b) 메티오닌이 결핍되며 표시된 농도에서 폴린산으로 보충된 배지에서 phMTHFR 로 형질전환된 fol3 △:: KanMX met13 △:: KanMX 반수체 효모의 성장. 3 개의 독립적인 형질전환체를, 재생력을 시험하기 위한 각각의 폴린산 농도에서 시험하였다. met13 △ 로 표지된 곡선은 50 ug/㎖ 폴린산에서 성장한, 빈 벡터로 형질전환된 세포의 단일 단리물을 나타낸다.
도 2. 비-동의성 MTHFR 집단 변이체의 기능적 영향 및 폴레이트-구제가능성. (a) 6 개 MTHFR 변이체를 3 가지 상이한 폴린산 농도에서의 메티오닌 결핍 배지에서 fol3 △:: KanMX met13 △:: KanMX 세포를 구제하기 위한 능력에 대해 시험하였다. M110I 대립형질 및 M110IA222V 이중-치환 대립형질을 50 및 25 ug/㎖ 폴린산에서만 시험하였다. '주요' 로 표지된 곡선은 집단에서 가장 흔한 MTHFR 대립형질에 상응한다. 각각의 곡선은 3-6 개 독립적 형질전환체의 풀 (pool) 로부터의 것이다. (b) 거의 동일한 크기 (35) 의 N-말단 촉매 도메인 및 C-말단 조절 도메인으로 나뉜 MTHFR 단백질 (656 개 아미노산) 의 모식도. 모든 비-동의성 변화의 위치를 표시하였다. 양성 (Benign) 변화는 녹색이다. 1 에서 4 로 번호매겨진 변화는 중증도 증가 순서로 표시된 폴레이트-구제성 대립형질을 나타낸다. 변화 #5 (R134C) 는 거의 기능 손실이며 폴레이트-구제성인 것으로 지정되지 않았으나 (결과 참조), 다소 폴레이트-증대가능하였다.
도 3. MTHFR 변이체의 효소 활성. 표시된 MTHFR 구성물로 형질전환된 세포로부터의 미정제 효모 추출물을 제조하고, 본원에서 기재된 바와 같이 MTHFR 활성에 대해 검정하였다. 표시된 시간 동안의 열 처리를, 방사성 표지된 기질의 추가 전에 반응물에 대해 수행하였다. 측정값은 삼중 검정의 2 개 독립적 세트의 평균이었으며; 오류 막대는 6 개 데이터 지점에 대한 표준 편차이다.
도 4. 효모에서 요약한 바와 같은 MTHFR 변이체에 대한 이형접합체 표현형. MTHFR 대립형질의 동형접합성 또는 이형접합성을 본원에서 기재된 바와 같이 주요, R134C 및 A222V 대립형질에 대해 이배체 효모에서 재생성시켰다. 이배체를, 게놈 내에서 통합된 MTHFR 의 단일 대립형질을 각각 발현한 반수체 균주의 접합으로부터 수득하였다. 폴린산 보충의 함수로서의 성장을 반수체에 대한 것으로서 정확히 검정하였다.
도 5. 효모에서 발현된 인간 MTHFR 변이체의 면역블롯. (a) 상이한 MTHFR 대립형질을 갖는 효모 세포로부터 추출물을 만들고, 본원에서 기재된 바와 같이 항-HA 항체로 검출하였다. A222V M110I 은 이중 치환된 대립형질이었고; '주요' 는 집단에서 가장 흔한 MTHFR 대립형질을 나타낸다. 가장 우측 레인 2 개는 나란히, 주요 대립형질 및 비-인산화성 T34A 대립형질이었다 (37). (b) 이 연구에서 확인된 MTHFR 의 모든 변이체에 대한, 인산화된 상부 밴드에 대한 비인산화된 하부 밴드의 신호 세기 비를 기능적 영향의 중증도 증가의 함수로서 표시하였다. x-축에서의 대립형질을 활성에 대해 양성 또는 순위-순서로 분류하였다. 모든 양성 대립형질 (주요 대립형질 및 모든 조절 도메인 변화 포함) 을 표시하고, 거의 동일한 비의 2 가지 MTHFR 종류를 나타내었다 (이에 따라 기호가 겹침).
도 6. 2 가지 인간 B 효소: CBS 및 CTH 에서의 B6 (피리독신)-반응성에 대한 검정.
도 7. 개인에 대해서, 개인의 유전적 구성을 분석하고 보조인자 제형, 보조인자 구제가능 병상의 위험성 또는 소인, 또는 둘 모두를 측정하기 위한 예시적 시스템의 모식도.
발명의 상세한 설명
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 대사 경로 내 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 확인하고, 보조인자 치료에 대한 이의 감수성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공한다. 관심 기능적 상동 효소에 의한 상보성을 허용하는 제 1 돌연변이, 및 균주가 보조인자 보충에 의존적이게 하는 제 2 돌연변이 (또는 돌연변이군) 을 포함하는 화합물 효모 돌연변이체는, 보조인자 이용가능성의 함수로서의 효소 상보성의 연구를 제공한다. 유의하게는, 본 발명은 또한 효소-인코딩 유전자에서의 저빈도 손상 대립형질의 보조인자 치료가 놀랍게도 통상적이며, 이들 대립형질이 대사 경로에 대해 유의한 영향을 집합적으로 가질 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명은 효소-인코딩 유전자에서의 이러한 저빈도 손상 대립형질의 검출 및 분석, 및 이의 효과적인 치료의 결정에 대해 특히 중점을 둔 진단 및 예측 방법을 계획한다.
MTHFR 의 "N-말단 촉매 도메인" 은 인간 MTHFR 에서의 아미노산 1-359 를 지칭한다. 참조 인간 MTHFR mRNA 서열은 Genbank 수탁 번호 NM 005957 에서 발견되는 한편, 인코딩된 656 개 아미노산 서열은 Genbank 수탁 번호 NP005958 에서 발견된다.
MTHFR 기능 장애는, 야생형 MTHFR 활성으로부터의 일탈을 의미한다. 효소 기능 장애 및 연관된 병상 및 질환은, 예를 들어, 효소의 특이적 활성에 있어서의 변화, 효소의 위치화 오류 (mislocalization), 효소 수준에 있어서의 변화 및 기타 변화를 통해 발생할 수 있다.
효소 활성 및 보조인자에 대한 이의 감수성을 측정하기 위한 생체내 검정
본원에 제공된 검정은 기능적 상동 효모 유전자에서의 돌연변이를 보완하기 위한 효소 인코딩 유전자의 대립형질의 능력을 시험할 뿐 아니라, 이들 효소의 보조인자에 대한 반응성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 검정은 산출물, 또는 효모 유전자의 정상 기능과 연관되며 이의 기능장애에 의해 변경되는 표현형을 측정하는 것을 포함한다.
상기 검정은 관심 기능적 상동 효소에 의한 상보성을 허용하는 제 1 돌연변이, 및 균주가 제 1 유전자의 기능과 관련된 검정가능한 표현형에 대한 보조인자 보충에 의존적이게 하는 제 2 돌연변이를 포함하는 효모 균주의 사용을 포함한다.
상기 방법은 하기를 포함한다: (i) 효모 세포에 효소-인코딩 유전자의 시험 대립형질을 도입하고 (상기 효모 세포는 효소-인코딩 유전자에 기능적으로 상동인 제 1 유전자에서의 제 1 돌연변이, 및 효모 세포가 효소 기능에 필요한 보조인자 보충에 의존적이게 하는 제 2 유전자 (또는 유전자군) 에서의 제 2 돌연변이를 포함하며, 상기 제 1 돌연변이는 제 1 유전자의 기능에 관련된 효모의 측정가능한 특징을 변경시킴); (ii) 성장 배지에 보조인자를 보충하고; (iii) 야생형 효소의 존재 하에서보다 시험 대립형질의 존재 하에 측정가능한 특징이 덜 회복되는 것을 측정함으로써 시험 대립형질에 의한 제 1 유전자 돌연변이의 불완전 상보성을 검출하고 손상 대립형질로서 시험 대립형질을 확인함. 보충된 보조인자의 양을 다양하게 함으로써, 손상 대립형질의 보조인자 이용가능성에 대한 감수성을 측정한다.
바람직한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자의 시험 대립형질은 자연발생적 대립형질, 또는 개인 자연발생적 다형성의 편집물에 대한 서열에 상응한다. 바람직한 구현예에서, 시험 대립형질은 인간 유전자의 대립형질, 또는 다수의 인간 대립형질에서의 개인 다형성의 편집물에 대한 서열에 상응한다.
바람직한 구현예에서, 다른 종류의 효모가 사용될 수 있으나, 효모는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae ("S. cerevisiae") 이다.
한 구현예에서, 이배체 효모가 사용된다. 이배체 효모는 시험 대립형질에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 이배체 효모는 야생형 유전자 및 시험 대립형질을 포함할 수 있다. 이배체 효모는 시험 대립형질의 조합을 포함할 수 있다. 본원에서 입증한 바와 같이, 기능적 손상 대립형질은 이형접합성 표현형을 갖는 대립형질을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 이배체 효모는 상보성에 대해 시험되는 대립형질에 대해 이형접합성이다. 한 구현예에서, 이배체 효모는 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질 및 야생형 대립형질을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 검정의 측정된 산출물은 성장이다.
바람직한 구현예에서, 검정 방법은 관심 시험 대립형질의 활성을 상응하는 야생형 대립형질의 활성에 대해 비교하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 시험 대립형질, 예를 들어, 효소-인코딩 유전자의 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공한다. 한 구현예에서, 효소-인코딩 유전자는 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되거나 관련된다. 또다른 구현예에서, 시험 대립형질은 MTHFR 대립형질, ATIC 대립형질, GART 대립형질, MAT1A 대립형질, MAT2A 대립형질 및 MTHFS 대립형질로 이루어지는 군에서 선택되는데, 검정은 폴레이트 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 또다른 구현예에서, 효소-인코딩 대립형질은 CTH 대립형질 및 CBS 대립형질로 이루어지는 군에서 선택된다.
한 구현예에서, 시험 대립형질은 MTHFR 대립형질이며 N-말단 촉매 도메인에서의 하나 이상의 치환기 및 C-말단 조절 부위에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. C-말단 부위에서의 치환 단독은 통상 기능을 손상시키지 않지만, 이는 다른 치환기와 조합되어 대립형질을 기능적으로 손상시킬 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제 1 돌연변이는 효모 유전자 met13 인데, 이는 야생형 인간 MTHFR 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다. 또다른 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 ade16 또는 ade17 인데, 이는 야생형 인간 ATIC 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다. 한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 ade7 인데, 이는 야생형 인간 GART 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다. 한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 sam1 또는 sam2 인데, 이는 야생형 인간 MAT1A 또는 야생형 인간 MAT2A 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다. 한 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 faul 인데, 이는 야생형 인간 MTHFS 에 의해 기능적으로 보완될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제 2 돌연변이는 효모 유전자 fol3 에 있는데, 이는 효모가 보충 배지에서 폴레이트에 의존적이게 한다. 이러한 효모 균주는 시험 대립형질, 제 1 돌연변이에 의존적인 시험 대립형질의 활성, 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 효모 유전자 met1 에서의 제 1 돌연변이, 및 효모 유전자 fol3 에서의 제 2 돌연변이를 갖는 화합물 효모는, MTHFR 대립형질의 활성 및 폴레이트 상태에 대한 이의 반응을 측정하는데 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 검정 방법은 시험 대립형질에 인코딩되는 효소가 폴레이트 이용가능성에 민감한지 여부를 측정하기 위해 폴레이트의 양을 가변적으로 하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 검정 방법은 50 ug/㎖ 미만의 폴레이트의 존재 하에서 산출물을 측정하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 검정 방법은 약 50 ug/㎖ 의 폴레이트의 존재 하에서 산출물을 측정하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 검정 방법은 50 ug/㎖ 초과의 폴레이트의 존재 하에서 산출물을 측정하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 폴레이트는 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질이 폴레이트에 의해 구제가능한지 여부가 측정되도록 가변적이다.
또다른 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 cys3 이며, 제 2 효모 유전자는 6 겹-결실 sno1 △ sno2 △ sno3 △ snz1 △ snz2 △ snz3 △ 이다. 이러한 효모 균주는 CTH 대립형질의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 CTH 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 비타민 B6 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, CTH 대립형질은 자연발생적 인간 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, CTH 대립형질은 개인 인간 CTH 대립형질의 편집물을 포함한다.
또다른 구현예에서, 제 1 효모 유전자는 cys4 이며, 제 2 효모 유전자는 6 겹-결실 sno1 △ sno2 △ sno3 △ snz1 △ snz2 △ snz3 △ 이다. 이러한 효모 균주는 CBS 대립형질의 활성, 및 비타민 B6 상태에 대한 이의 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 따라서 한 구현예에서, 본 발명은 CBS 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정을 제공하는데, 이는 비타민 B6 상태의 함수로서의 활성을 추가로 측정할 수 있다. 바람직한 구현예에서, CBS 대립형질은 자연발생적 인간 대립형질을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, CBS 대립형질은 개인 인간 CBS 대립형질의 편집물을 포함한다.
하기 표 1 은 효소-인코딩 유전자를 열거하며, 효소-인코딩 유전자의 대립형질의 활성을 측정하는데 사용될 수 있는 예시적 화합물 효모 돌연변이를 제공한다.
표 1 : 효소-인코딩 유전자 및 효모 배경
Figure pct00001
효모 균주는 당업계에 널리 알려져 있는 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, [Shan et al , JBC , 274:32613-32618, 1999] 를 참조한다.
핵산을 효모 균주 내로 도입하는 것은, 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, [Shan et al , JBC , 274:32613-32618, 1999] 를 참조한다.
효소-인코딩 유전자의 대립형질
실시예 부분에서 기재된 바와 같이, 효소에 미묘하게 영향을 주는 (예를 들어, 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 야기함) 단일 뉴클레오티드 다형성은 대립형질의 빈도에 관계없이 본원에서 개시된 생체내 검정을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법을 대립형질이 손상 대립형질인지의 여부, 그리고 그렇다면 손상 대립형질이 보조인자-구제가능인지의 여부를 측정하는데 사용하였다. 표 4 및 표 A-F 에 제공된 것은 본원에 기재된 검정에 의해 분석되었거나 (표 4) 분석될 수 있는 (표 A-F) 효소-인코딩 유전자 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 에 대한 단일 뉴클레오티드 다형성이다. 이들 표는 이전에 확인되지 않았던 이들 유전자에 대한 SNP 를 또한 제공한다. 따라서, 본원에서는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소-인코딩 유전자에 대한 대립형질이 개시된다. 또한 본원에서는, 유전자 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 뿐 아니라 AHCY, AMT, CBS, CTH, DHFR, FPGS, MTHFD1, MTHFD2, MTR, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS, 예컨대 표 A- X 에서 열거된 것들의 유전적 변이체가 제공된다.
이들 대립형질은 본원에 개시된 검정을 사용하여 분석될 수 있으며, 유리하게는 본원에 개시된 바와 같은 스크리닝, 예방 및 치료 방법에서 검출될 수 있다. 통상의 기술을 갖는 숙련자는 보조인자 구제가능성으로서의 손상 대립형질의 분석이 본원에서 개시된 바와 같은 스크리닝, 예방 및 치료 방법을 알려준다는 것을 인지하고 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대립형질" 은 게놈에서 하나 초과의 형태로 존재하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "대립형질" 은 게놈 유전자자리 (locus) 의 자연발생적 서열에 제한되지 않는다. "대립형질" 은 전사체 및 이로부터 유래한 스플라이싱된 서열을 포함한다 (예를 들어, mRNA 서열, cDNA 서열). "대립형질" 은 자연발생적 대립형질 또는 합성 대립형질일 수 있다. 이들은 N-말단 촉매 도메인에서의 돌연변이 뿐 아니라 C-말단 조절 부위에서의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 "동형접합성" 은, 2 카피의 유전자 또는 SNP 가 다른 대립형질에 대한 서열에 있어서 동일하다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 효소-인코딩 유전자의 야생형 대립형질에 대한 대상 동형접합성은 2 개 이상의 동일한 카피의 서열을 포함한다. 이러한 대상은 대사 경로 내 보조인자-의존적 효소 결핍이 되기 쉽지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "이형접합성" 은, 상이한 2 카피의 대립형질이 게놈에 존재하는 것을 나타낸다 (예를 들어 1 카피의 야생형 대립형질 및 손상 대립형질일 수 있는 1 카피의 변이체 대립형질). 이러한 게놈을 갖는 대상은 이형접합성이며, 대사 질환 내 보조인자-의존적 효소 결핍이 되기 쉬울 수 있다. "이형접합성" 은 또한 이의 대립형질 내 2 가지 상이한 돌연변이를 갖는 대상을 포함한다.
"손상 대립형질" 은 기능적으로 손상된 (기능적 손상은 보조인자-구제가능할 수 있거나 가능하지 않을 수 있음) 대사 효소를 인코딩하는 유전자의 대립형질을 의미한다.
"손상 대립형질 돌연변이" 는 손상 대립형질의 기능적 손상에 기초가 되며 돌연변이 장소에서 야생형 서열과 손상 대립형질을 구별시키는 특정 핵산 돌연변이를 지칭한다. 통상, 손상 대립형질 돌연변이는 단일 코돈에서의 비-동의성 점 돌연변이이다.
"보조인자-구제가능" 은 손상된 대사 효소의 기능적 손상을 보상하는 변경된 보조인자 수준의 능력을 지칭한다.
보조인자 보충은, 보조인자로 전환될 수 있는 보조인자 전구체 보충을 포함한다.
"보조인자" 는 관심 효소의 직접적 보조인자인 인자 (예를 들어, MTHFR, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A 및 MTHFS 에 대한 폴레이트) 뿐 아니라 관심 효소에 대한 간접적 보조인자인 인자를 지칭한다. 따라서, 보조인자는 효소 기능에 직접적 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있다.
당업계에 알려져 있는 빈도 측정은 대립형질 빈도, 즉 특이적 SNP 를 갖는 집단 내 유전자의 분율을 포함한다. 임의 유전자에 대한 대립형질 빈도는 그 합이 1 이 되어야 한다. 당업계에 알려져 있는 또다른 빈도 측정은 "이형접합체 빈도", 즉 2 개 대립형질, 또는 2 개 형태의 유전자 SNP (하나가 각 모체로부터 유전된) 를 수반하는 집단에서의 개인 분율이다. 대안적으로는, 유전자의 특정 대립형질에 대해 동형접합성인 개인의 수는 유용한 측정이 될 수 있다. 대립형질 빈도, 이형접합체 빈도 및 동형접합체 빈도 사이의 관계는, 평형의 자유 번식 집단에서의 대립형질 빈도, 이형접합체 빈도 및 동형접합체 빈도 사이의 관계를 제공하는 하디-바인베르크 (Hardy-Weinberg) 등식에 의해 많은 유전자에 대해 기재된다. 대부분의 인간 변이체는 실제적으로 하디-바인베르크 평형에 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "저빈도 대립형질" 은 4% 미만의 대립형질 빈도를 갖는다.
본원에서는, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되거나 관련되는 인간 효소-인코딩 유전자에 대한 대립형질이 개시된다. "폴레이트/호모시스테인 신진대사" 는 폴레이트 및/또는 호모시스테인 신진대사를 의미한다. 이러한 효소-인코딩 유전자는 MTHFR, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFS 를 포함한다. 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되거나 관련되는 효소-인코딩 유전자의 영국 유전자명명 위원회 (The Hugo Gene Nomenclature Committee (HGNC)) 기호, GeneID NCBI 뉴클레오티드 수탁 번호 (NC), NCBI 폴리펩티드 수탁 번호 (NB_) 및 명칭을 표 2 에 제공한다.
표 2 : 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되거나 관련되는 인간 효소-인코딩 유전자
Figure pct00002
MTHFR, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A, MTHFS 외의 기타 효소-인코딩 유전자는 AHCY, AHCYL1, AHCYL2, ALDH1L1, ALDHL2, AMT, BHMT1, BHMT2, CBS, CTH, DHFR, DMGDH, FPGS, GGH, MTFMT, MTHFD1, MTHFD2, MTR, MTRR, NAALAD2, SARDH, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 를 포함하며, 이들 모두를 표 3 에 나타낸다. 유전적 변이체는 표 A-X 에 열거된 것들 중 임의의 것일 수 있으며, 개인의 유전적 구성에 있어서 검출될 수 있고 개인용 제형에 대해 하나 이상의 보조인자, 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 선택하는데 사용될 수 있다. 표 G- X 에서 나타낸 바와 같이, 다형성 표현형화 (Phenotyping), ("PolyPhen," 예를 들어, http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/ 참조), SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant, 예를 들어, Ng and Henikoff , Nucleic Acids Res . 2003 July 1; 31(13): 3812-3814 참조), MAF (비주요 대립형질 빈도) 및 HWE (하디 바인베르크 평형) 가 유전적 변이체에 대해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들로부터의 정보는 유전적 변이체의 기능적 영향에 대한 정보를 제공하는데 사용될 수 있거나, 보조인자 의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성을 측정하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적 변이체의 기능적 영향은 본원에 개시된 효모 검정과 같은 생체내 검정에 의해 측정될 수 있다.
표 3 : 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되거나 관련되는 인간 효소-인코딩 유전자
Figure pct00003
한 양상에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 인간 효소-인코딩 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 보조인자-구제가능할 수 있거나 가능하지 않을 수 있는, MTHFR 대립형질, ATIC 대립형질, GART 대립형질, MAT1A 대립형질, MAT2A 대립형질 및 MTHFS 대립형질로 이루어지는 군에서 선택되는 효소-인코딩 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산을 제공한다. 이들 대립형질은 저빈도 대립형질을 포함한다. 이들 대립형질은 손상 대립형질을 포함한다. 대립형질은 또한 AHCY, AHCYL1, AHCYL2, ALDH1L1, ALDHL2, AMT, BHMT1, BHMT2, CBS, CTH, DHFR, DMGDH, FPGS, FTCD, GGH, MTFMT, MTHFD1, MTHFD2, MTR, MTRR, NAALAD2, SARDH, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 대립형질일 수 있다.
따라서, 본원에서는 MTHFR 유전자의 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공되는데, 상기 핵산은 MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 4078; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 4234; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 5733; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 5872; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6642; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6657; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6681; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 6774; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 10906; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11656; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11668; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 11902; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 12232; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 12622; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 12759; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 13040; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14593; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14612; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 14705; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 16170; MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 16401; 및 MTHFR 유전자의 뉴클레오티드 16451 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드에서 발견되는 SNP 를 포함한다. MTHFR 의 SNP 또는 유전적 변이체의 예를 표 A 및 S 에 제공한다.
또한 본원에서는, ATIC 유전자의 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공되는데, 상기 핵산은 ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1100; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1114; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1179; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1244; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1270; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1288; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1301; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1380; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1396; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1453; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1506; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 1689; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7227; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7232; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 7388; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 8756; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 8808; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14099; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14140; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14144; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14183; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14229; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14238; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14245; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14260; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14489; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 14970; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15003; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15040; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15043; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15149; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15240; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 15844; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 16063; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21363; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21372; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21400; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21521; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 21611; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22187; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22273; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22282; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22291; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22512; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22519; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22538; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22564; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22589; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 22737; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 24992; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 25009; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27757; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27855; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 27985; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 28015; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33901; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33919; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33920; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 33933; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35723; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35737; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35742; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35840; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35917; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35968; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 35973; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38338; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38437; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38342; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38582; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38627; ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38667; 및 ATIC 유전자의 뉴클레오티드 38725 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드에서 발견되는 SNP 를 포함한다. ATIC 의 SNP 또는 유전적 변이체의 예를 표 B 및 I 에 제공한다.
또한 본원에서는, MTHFS 유전자의 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공되는데, 상기 핵산은 MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8808; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8912; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8957; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 8998; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52560; MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52878; 및 MTHFS 유전자의 뉴클레오티드 52902 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드에서 발견되는 SNP 를 포함한다. MTHFS 의 SNP 또는 유전적 변이체의 예를 표 C 및 T 에 제공한다.
또한 본원에서는, MAT1A 유전자의 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공되는데, 상기 단리된 핵산은 MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5045; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5181; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 5233; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 6739; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 6795; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 9833; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10006; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10312; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10339; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10374; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10484; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 10555; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14038; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14114; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 14177; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15424; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15500; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15646; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15706; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15715; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15730; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15758; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16133; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16174; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15706; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15715; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15730; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 15758; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16133; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16174; MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16218; 및 MAT1A 유전자의 뉴클레오티드 16971 로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드에서 발견되는 SNP 를 포함한다. MAT1A 의 SNP 또는 유전적 변이체의 예를 표 D 및 O 에 제공한다.
또한 본원에서는, MAT2A 유전자의 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공되는데, 상기 핵산은 MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2871; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2873; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 2939; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3287; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3394; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3466; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3498; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3650; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 3704; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4174; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4449; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4476; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4608; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4660; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4692; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 4931; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5313; MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5460; 및 MAT2A 유전자의 뉴클레오티드 5480 으로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드에서 발견되는 SNP 를 포함한다. MAT2A 의 SNP 또는 유전적 변이체의 예를 표 E 및 P 에 제공한다.
또한 본원에서는, GART 유전자의 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산이 제공되는데, 상기 핵산은 GART 유전자의 뉴클레오티드 3782; GART 유전자의 뉴클레오티드 3842; GART 유전자의 뉴클레오티드 7745; GART 유전자의 뉴클레오티드 7984; GART 유전자의 뉴클레오티드 10775; GART 유전자의 뉴클레오티드 11521; GART 유전자의 뉴클레오티드 11522; GART 유전자의 뉴클레오티드 11541; GART 유전자의 뉴클레오티드 12356; GART 유전자의 뉴클레오티드 14200; GART 유전자의 뉴클레오티드 14273; GART 유전자의 뉴클레오티드 14282; GART 유전자의 뉴클레오티드 14739; GART 유전자의 뉴클레오티드 14781; GART 유전자의 뉴클레오티드 18055; GART 유전자의 뉴클레오티드 18064; GART 유전자의 뉴클레오티드 18130; GART 유전자의 뉴클레오티드 18142; GART 유전자의 뉴클레오티드 18197; GART 유전자의 뉴클레오티드 18232; GART 유전자의 뉴클레오티드 18401; GART 유전자의 뉴클레오티드 20812; GART 유전자의 뉴클레오티드 20825; GART 유전자의 뉴클레오티드 16174; GART 유전자의 뉴클레오티드 15706; GART 유전자의 뉴클레오티드 20862; GART 유전자의 뉴클레오티드 22481; GART 유전자의 뉴클레오티드 22521; GART 유전자의 뉴클레오티드 25425; GART 유전자의 뉴클레오티드 25433; GART 유전자의 뉴클레오티드 25601; GART 유전자의 뉴클레오티드 25867; GART 유전자의 뉴클레오티드 25912; GART 유전자의 뉴클레오티드 25951; GART 유전자의 뉴클레오티드 25956; GART 유전자의 뉴클레오티드 26127; GART 유전자의 뉴클레오티드 26195; GART 유전자의 뉴클레오티드 31627; GART 유전자의 뉴클레오티드 31641; GART 유전자의 뉴클레오티드 31887; GART 유전자의 뉴클레오티드 31902; GART 유전자의 뉴클레오티드 31933; GART 유전자의 뉴클레오티드 33173; GART 유전자의 뉴클레오티드 33264; GART 유전자의 뉴클레오티드 31933; GART 유전자의 뉴클레오티드 33173; GART 유전자의 뉴클레오티드 33264; GART 유전자의 뉴클레오티드 33286; GART 유전자의 뉴클레오티드 36963; GART 유전자의 뉴클레오티드 36964; GART 유전자의 뉴클레오티드 37428; GART 유전자의 뉴클레오티드 37433; GART 유전자의 뉴클레오티드 38762; GART 유전자의 뉴클레오티드 38914; 및 GART 유전자의 뉴클레오티드 38989 로 이루어지는 군에서 선택되는 GART 유전자에서의 뉴클레오티드에서 발견되는 하나의 SNP 를 포함한다. GART 의 SNP 또는 유전적 변이체의 예를 표 F 및 N 에 제공한다.
또한 본원에서는, AHCY, AHCYL1, AHCYL2, ALDH1L1, ALDHL2, AMT, ATIC, BHMT1, BHMT2, CBS, CTH, DHFR, DMGDH, FPGS, GART, GGH, MAT1A, MAT2A, MTFMT, MTHFD1, MTHFD2, MTHFR, MTHFS, MTR, MTRR, NAALAD2, SARDH, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 대립형질에서의 서열분석을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 유전적 변이체, 예컨대 SNP 일 수 있다. 일부 구현예에서, 대립형질은 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, GART, AHCY, AMT, CBS, CTH, DHFR, FPGS, MTHFD1, MTHFD2, MTR, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 유전적 변이체, 예컨대 표 A-X 에 열거된 것들을 포함한다. 예를 들어, 대립형질은 AHCY, AMT, CBS, CTH, DHFR, FPGS, MTHFD1, MTHFD2, MTR, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 유전적 변이체, 예컨대 표 G, H, J, K, L, M, Q, R, U, V, W 또는 X 에 열거된 것들을 포함할 수 있다. 단리된 핵산, 또는 이의 보체는 유전적 변이체 또는 SNP, 예컨대 표 A-X 에 나타낸 것들을 포함할 수 있다.
또한 본원에서는, AHCY, AHCYL1, AHCYL2, ALDH1L1, ALDHL2, AMT, ATIC, BHMT1, BHMT2, CBS, CTH, DHFR, DMGDH, FPGS, GART, GGH, MAT1A, MAT2A, MTFMT, MTHFD1, MTHFD2, MTHFR, MTHFS, MTR, MTRR, NAALAD2, SARDH, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 유전적 변이체, 예컨대 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, GART, AHCY, AMT, CBS, CTH, DHFR, FPGS, MTHFD1, MTHFD2, MTR, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 유전적 변이체, 예컨대 표 A-X 에 열거된 것들을 검출하기 위해 프로브, 예컨대 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 50, 또는 적어도 약 10, 15 또는 20 개 뉴클레오티드가 제공된다.
한 구현예에서, 본 발명은 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L 및 Q648P 로 이루어지는 군에서 선택되는 MTHFR 단백질에서의 비-동의성 돌연변이를 인코딩하는 서열을 포함하는 인간 MTHFR 대립형질에 대한 서열에 상응하는 단리된 핵산을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L 및 Q648P 로 이루어지는 군에서 선택되는 MTHFR 단백질에서의 비-동의성 돌연변이를 인코딩하는 서열을 포함하는 둘 이상의 인간 MTHFR 대립형질에 대한 서열에 상응하는 핵산을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된" 은 기타 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물 또는 이와 자연적으로 연관되는 기타 물질이 실제적으로 없는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 및 RNA 서열을 포함한다.
본원에서 제공되는 핵산은 본원에서 개시된 검출 방법에서의 프로브 (예를 들어, 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브) 또는 프라이머로서 유용할 수 있다. 이러한 목적의 적절한 프로브 또는 프라이머의 설계는 많은 인자의 고려를 필요로 한다. 예를 들어, 10, 15, 또는 18 개 뉴클레오티드 내지 약 20 개, 또는 내지 약 30 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단편이 특히 이용될 것이다. 더 긴 서열, 예를 들어 40, 50, 80, 90, 100 개, 심지어 전장 (full length) 까지의 서열이 특정 구현예에 대해 보다 더 바람직하다. 적어도 약 18 내지 20 개 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 길이가, 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브로서 유용하도록 충분히 특이적인 하이브리드화가 허용되기에 충분한 것으로서 당업자에 의해 널리 허용된다. 더욱이, 예상되는 적용에 따라, 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 정도의 선택성을 얻기 위해 다양한 조건의 하이브리드화를 이용하는 것이 필요할 것이다. 높은 선택성을 필요로 하는 적용에 대해서, 하이브리드를 형성하기 위해 상대적으로 엄격한 조건을 이용하는 것이 통상 필요할 것이다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건이, 예컨대 약 50℃ 내지 약 70℃ 의 온도에서 0.02M 0.15M NaCl 에 의해 제공된다. 이러한 선택적 조건은, 만약 있다 해도, 프로브와 주형 또는 표적 폴리뉴클레오티드 단편 사이의 미스매치를 극히 적게 용인할 수 있다.
또한 본원에서는, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 이들 벡터는 적절한 숙주 세포 내에서의 본 발명의 핵산의 발현을 제공하기 위한 발현 벡터를 포함한다.
추가적으로, 본 발명의 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산에 의해 인코딩되는 효소를 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 핵산에 의해 인코딩되는 단리된 효소가 제공된다.
손상 대립형질의 검출
본원에 개시된 방법 (예를 들어, 대사 경로에 포함되는 유전자의 손상 대립형질과 연관되는 병상 또는 질환의 스크리닝, 예방 및/또는 치료 방법) 은 일반적으로 손상 대립형질을 야기할 수 있는 대사 경로 내 하나 이상의 효소-인코딩 유전자에서의 다수의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP); 바람직하게는 시험 유전자 내 다수의 공지된 SNP5 의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 필요로 한다. 대립형질 및/또는 사전결정된 서열 SNP 는 정상 대립형질과 손상 대립형질 사이의 식별을 허용하는 대립형질 특이적 하이브리드화, 서열-의존적-기준 기술에 의해 검출될 수 있다. 대립형질 특이적 검정은, 매칭 (예를 들어, 정상:정상 또는 손상:손상) 서열에 비해, 서로 하이브리드화하기 위한 미스매치된 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 정상:손상) 의 변별력에 의존적이다.
다양한 방법이 개인에서의 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성의 존재를 검출하기 위해 이용가능하다. 이러한 분야에서의 발전은 정확하고, 쉽고, 비싸지 않은 대규모 SNP 유전자형분석 (genotyping) 을 제공하였다. 가장 최근에, 예를 들어, 동적 대립형질-특이적 하이브리드화 (DASH), 마이크로플레이트 어레이 사선 겔 전기영동 (MADGE), 실시간 서열분석 (pyrosequencing), 올리고뉴클레오티드-특이적 라이게이션, TaqMan 시스템 뿐 아니라 다양한 DNA 칩 기술 예컨대 Affymetrix SNP 칩을 포함하는 여러 새로운 기술이 기재되었다. 이들 방법은, 통상 PCR 에 의한 시험 유전자 증폭을 필요로 할 수 있다. 침습성 절단 이후 질량 분광계 또는 고정 자물쇠 프로브 및 회전환 (rolling-circle) 증폭에 의한 소신호 분자의 생성을 기준으로 하는 기타 새로이 개발된 방법은, 결국 PCR 에 대한 필요성을 제거시킬 수 있다. 특이적인 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하기 위한 당업계에 알려져 있는 여러 방법을 하기에 요약한다. 본 발명의 방법은 모든 이용가능한 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 촉진시키기 위해 여러 방법이 개발되어 왔다. 한 구현예에서, 예를 들어, Mundy, C. R. (미국 특허 제 4,656,127 호) 에서 개시된 바와 같이, 단일 염기 다형성은 특수화된 엑소뉴클레아제-저항성 뉴클레오티드를 사용하여 검출될 수 있다. 본 방법에 따라서, 대립형질에 대해 바로 3' 인 대립형질 서열에 상보적인 프라이머는 특정 동물 또는 인간으로부터 수득한 표적 분자에 하이브리드화되도록 허용되었다. 표적 분자에서의 대립형질이 존재하는 특정 엑소뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드 유도체에 대해 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 유도체는 하이브리드화 프라이머의 말단 상에 혼입될 것이다. 이러한 혼입은 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 저항성이 되게 함으로써, 이의 검출을 허용한다. 샘플의 엑소뉴클레아제-저항성 유도체의 정체성이 알려져 있기 때문에, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 저항성이 되었다는 발견은 표적 분자의 대립형질에 존재하는 뉴클레오티드가 반응에 사용한 뉴클레오티드 유도체에 대해 상보적이라는 것을 밝혀내었다. 상기 방법은 다량의 외부 서열 데이터의 결정을 필요로 하지 않는다는 이점을 갖는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 용액-기준 방법이 대립형질의 뉴클레오티드의 정체성을 결정하기 위해 사용된다. Cohen, D. et al. (프랑스 특허 제 2,650,840 호; PCT 출원 번호 W091/02087). 미국 특허 제 4,656,127 호의 먼디 (Mundy) 방법에서와 같이, 다형성 부위에 대해 바로 3' 인 대립형질 서열에 대해 상보적인 프라이머를 이용한다. 상기 방법은, 대립형질의 뉴클레오티드에 대해 상보성인 경우 프라이머의 말단 상에 혼입되게 될 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여 상기 부위의 뉴클레오티드 정체성을 결정한다.
유전적 비트 분석 (Genetic Bit Analysis) 또는 GBA 로서 공지되어 있는 대안적인 방법이 Goelet, P. et al. (PCT 출원 번호 92/15712) 에 의해 기재되어 있다. Goelet, P. et al. 의 방법은 표지된 터미네이터 및 프라이머 (대립형질에 대해 3' 인 서열에 대해 상보성임) 의 혼합물을 사용한다. 혼입되는 상기 표지된 터미네이터는 따라서 시험 유전자의 대립형질 내 존재하는 뉴클레오티드에 의해 결정되며, 이에 상보성이다. Cohen et al. 의 방법 (프랑스 특허 제 2,650,840 호; PCT 출원 번호 W091/02087) 과 반대로, Goelet, P. et al. 의 방법은 바람직하게는, 프라이머 또는 표적 분자가 고체상으로 고정되는 이종상 검정 (heterogeneous phase assay) 이다.
최근, DNA 에서의 대립형질을 검정하기 위한 여러 프라이머-안내된 뉴클레오티드 혼입 절차가 기재되어 있다 (Komher , J. S. et at ., Nucl . Acids . Res . 17:7779-7784(1989); Sokolov , B. P., Nucl . Acids Res . 18:3671 (1990); Syvanen , A. -C, et al ., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy , M. N. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant , T. R. et al , Hum . Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli , L. et al , GATA 9:107-112 (1992); Nyren , P. et al , Anal , Biochem . 208:171-175 (1993)). 이들 방법은, 대립형질에서의 염기 사이를 구별하기 위해, 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 모두 의존하는 GBA™ 과 상이하다. 이러한 포맷에서, 신호가 혼입된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하기 때문에, 동일한 뉴클레오티드의 실행에서 발생하는 단일 뉴클레오티드 다형성은 실행 길이에 비례하는 신호를 야기할 수 있다 (Syvanen , A. -C, et al , Amer. J. Hum . Genet . 52:46-59 (1993)).
임의의 세포 유형 또는 조직을 이용하여 본원에 기재된 진단에 사용하기 위한 핵산 샘플을 수득할 수 있다. 바람직한 구현예에서, DNA 샘플을 공지된 기술 (예를 들어 정맥 천자) 에 의해 수득된 체액, 예를 들어 혈액 또는 타액으로부터 수득한다. 대안적으로는, 핵산 시험은 건조한 샘플 (예를 들어 모발 또는 피부) 에 대해 수행될 수 있다. RNA 또는 단백질을 사용하는 경우, 이용할 수 있는 세포 또는 조직은 효소-인코딩 유전자를 발현해야만 한다.
검출 방법은 또한, 생검 또는 절제로부터 수득한 환자 조직의 조직 박편 (고정 및/또는 동결된) 상에서 직접적으로 제자리 (in situ) 수행될 수 있는데, 핵산 정제는 필요하지 않다. 핵산 시약은 이러한 제자리 절차에 대한 프로브 및/또는 프라이머로서 사용될 수 있다 (예를 들어, Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY 참조).
한 핵산 서열의 검출에 주로 중점을 둔 방법에 추가로, 프로파일이 또한 이러한 검출 계획에서 평가될 수 있다. 핑거프린트 프로파일이 예를 들어 차별적 디스플레이 (differential display) 절차, 노던 분석 및/또는 RT-PCR 을 이용함으로써 생성될 수 있다.
바람직한 검출 방법은, 효소 인코딩 유전자의 하나 이상의 대립형질의 부위와 겹치는 프로브를 사용하는 대립형질 특이적 하이브리드화이다.
대립형질 특이적 하이브리드화를 사용하는 손상 대립형질의 검출
당업계에 널리 알려져 있는 다양한 방법이 대립형질 특이적 하이브리드화에 의한 손상 대립형질의 검출을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 시험 대립형질은 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 로 탐색되며; 각각의 ASO 는 공지된 대립형질의 서열을 포함한다. ASO 분석은 표적 폴리뉴클레오티드 단편에 하이브리드화하기 위한 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브의 능력을 시험함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 단편에서의 특정 서열 치환을 검출한다. 바람직하게는, 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 손상 대립형질의 서열 (또는 이의 보체) 를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드 단편에서의 손상 대립형질의 존재는, 야생형 대립형질의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브가 표적 폴리뉴클레오티드 단편에 하이브리드화되지 않는 조건 하의 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와 표적 폴리뉴클레오티드 단편 사이의 하이브리드화에 의해 표시된다. 손상 대립형질의 서열을 갖는 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와 표적 폴리뉴클레오티드 단편 사이의 하이브리드화 결여는 표적 단편에서의 손상 대립형질의 부재를 표시한다.
한 구현예에서, 시험 유전자(들) 는 표준 도트 블롯 포맷으로 탐색될 수 있다. ASO 에 상응하는 서열을 포함하는 시험 유전자 내 각각의 부위는 고체 표면에, 예를 들어 멤브레인 상 개별적인 도트로서 개별적으로 적용된다. 각각의 개별적 부위는, 예를 들어 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 사용하여 분리 PCR 증폭 산물로서 생성될 수 있다 (예를 들어, Mullis, K. B., 1987, 미국 특허 제 4,683,202 호에서 설명한 실험적 구현예 참조).
ASO 분석을 수행하기 위한 도트 블롯 포맷에 대한 대안물로서 사용될 수 있는 멤브레인-기재 포맷은, 역점적 (reverse dot blot), (다중 증폭 검정), 및 다중 대립형질-특이적 진단 검정 (MASDA) 을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
역점적 포맷에서, 예를 들어, 공지된 서열을 갖는 공지된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 프로브는 고체 표면 상에서 고정되고, 이후 표지된 시험 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 샘플과 하이브리드화된다. 이러한 상황에서, 표지된 시험 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는 샘플을 제조하기 위한 증폭 전에 프라이머가 표지될 수 있거나 NTP 가 표지될 수 있다. 대안적으로, 시험 폴리뉴클레오티드 단편은 단리 및/또는 합성 이후 표지될 수 있다. 다중 포맷에서, 개별적 샘플은 단지 단일 표적 서열 대신에 시험 유전자 내에 다수의 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 각각 하나 이상의 ASO 표적 서열을 포함하는 다수의 PCR 산물은 Caskey et al, 미국 특허 제 5,582,989 호의 방법을 사용하는 단일 증폭 반응에서 동시에 생성될 수 있다. 그러므로, 동일한 블롯은 그의 상응하는 서열이 샘플 도트에서 표시되는 각각의 ASO 에 의해 탐색될 수 있다.
MASDA 포맷은 각각의 블롯 (다수의 표적 서열을 갖는 도트를 포함) 을 탐색하기 위해 다수의 ASO 를 사용함으로써 다수 포맷의 복합성 수준을 확대시킨다. 이러한 절차는 A. P. Shuber 에 의한 미국 특허 제 5,589,330 호, 및 Michalowsky et al ., American Journal of Human Genetics , 59(4): A272, poster 1573 ( October 1996) (각각 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 에서 상세히 기재되어 있다. 먼저, 다수의 ASO 프로브와 고정된 샘플 사이의 하이브리드화를 검출한다. 이 방법은 주어진 도트 내 다수의 표적 서열 중에서의 돌연변이의 존재가 충분히 희귀하여, 임의의 양성 하이브리드화 신호가 상응하는 손상 대립형질과 하이브리드화하는 프로브 혼합물 내 단일 ASO 로 인해 야기된다는 예측에 의존적이다. 하이브리드화 ASO 는 이후, 하이브리드화 부위로부터 이를 단리하고 이의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 확인된다.
도트 블롯, 역점적, 다수 및 MASDA 포맷에 사용할 수 있는 적합한 물질이 당업계에 널리 알려져 있으며, 나일론 및 니트로셀룰로오스 멤브레인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표적 서열이 PCR 증폭에 의해 생성되는 경우, 출발 물질은 염색체 DNA 일 수 있는데 이러한 경우 DNA 는 직접적으로 증폭된다. 대안적으로, 출발 물질은 mRNA 일 수 있는데 이러한 경우 mRNA 는 cDNA 로 먼저 역전사된 후 널리 알려진 RT-PCR 기술에 따라 증폭된다 (예를 들어, Gelfand et al. 에 의한 미국 특허 제 5,561,058 호 참조).
상기 기재된 방법은 제한된 수의 서열 변이 (예를 들어, 손상 대립형질) 의 중간 정도 스크리닝에 적합하다. 그러나, 신속한, 비용 효과적인 대규모 스크리닝을 위한 분자적 진단의 필요로, ASO 의 기본적 개념을 통합시키는 기술이 개발되었으나, 돌연변이 검출을 위한 수용력 및 샘플 수를 초과한다. 상기 기재된 것들에 대한 이들 대안적 방법은 대규모 칩 어레이 서열-기재 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대규모 어레이의 사용은 많은 서열 변이체의 신속한 분석을 가능하게 한다. 칩 어레이의 적용 및 개발에 있어서의 차이 개괄은 Southern, E. M., Trends In Genetics , 12: 110-115 ( March 1996) 및 Cheng et al,, Molecular Diagnosis , 1:183-200 ( September 1996) 에 의해 커버된다. 칩 어레이의 제조를 포함하는 여러 접근방식이 존재한다. 차이점은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 고정된 올리고뉴클레오티드에 부착시키기 위한 고체 지지체의 유형, 변이체의 확인을 위한 표지 기술 및 표적 폴리뉴클레오티드의 프로브에 대한 서열-기재 기술에서의 변화.
'DNA 칩' 에서의 대규모 분석을 위한 가능한 방법론은, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 [Hacia et al , Nature Genetics , 14:441447 (1996)] 에 상세히 기재되어 있다. Hacia et al. 에서 기재된 바와 같이, 96,000 개 올리고뉴클레오티드를 초과하는 고밀도 어레이 (각 20 개 뉴클레오티드 길이) 는 광 유도 화학적 합성을 사용하여 단일 유리 또는 규소 칩에 고정된다. 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브의 수 및 설계 여부에 따라, 잠재적으로 서열 내 모든 염기가 대체물에 대해 정보가 얻어질 수 있다. 그러므로, 칩에 적용된 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 변이, 예를 들어, 집단에서 발생하는 것으로 아직 알려져 있지 않은 SNP 를 포함할 수 있거나, 이는 집단에서 발생하는 것으로 알려져 있는 SNP 에 제한될 수 있다.
칩 상에서의 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와의 하이브리드화 전에, 당업자에게 널리 알려져 있는 수단에 의해 시험 샘플을 단리하고, 증폭하고 표지한다 (예를 들어 형광 마커). 시험 샘플을 이후 고정된 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드화한다. 고정된 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 표적 폴리뉴클레오티드 단편의 서열-기재 기술의 세기를 정량하고 참조 서열과 비교한다. 생성된 유전적 정보는 분자적 진단에 사용될 수 있다. 분자적 진단에서의 통상적인 (그러나 이에 제한되지는 않음) 'DNA 칩' 의 이용은 공지된 SNP 에 대한 스크리닝이다. 그러나, 이는 분야에서 기재되어 있는 돌연변이에서의 단지 관찰에 의한 기술에 대한 제한을 부여할 수 있다. 본 발명은 이전에 이용가능한 것보다 더 큰 수의 돌연변이로 수행되는 대립형질 특이적 하이브리드화 분석을 가능하게 한다. 따라서, 공지된 돌연변이로 뿐 아니라 편리한 방식으로, 대규모 ASO 분석의 효율 및 편이성이 넓어져, 번거로운 말단-대-말단 (end-to-end) 서열 분석에 대한 필요성을 감소시킬 것이며, 허용된 규칙에 의해 예측된 바와 같이 발생할 수 있는 모든 돌연변이, 및 이러한 번거로운 시험과 연관되는 비용 및 시간이 감소될 것이다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명은 효소-인코딩 유전자 또는 효소-인코딩 핵산의 손상 대립형질을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원에서는 MTHFR, ATIC, CBS, CTH, GART, MAT1A, MAT2A 및 MTHFS 의 대립형질을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 또한 본원에서는, AHCY, AHCYL1, AHCYL2, ALDH1L1, ALDHL2, AMT, BHMT1, BHMT2, DHFR, DMGDH, FPGS, FTCD, GGH, MTFMT, MTHFD1, MTHFD2, MTR, MTRR, NAALAD2, SARDH, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 대립형질을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법은 유전적 변이체, 예컨대 SNP, 예컨대 표 A-X 에 열거된 것들을 검출하는데 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 효소-인코딩 핵산에서 SNP, 또는 다른 유전적 변이체를 검출하는 것은 핵산 서열분석을 포함한다. 한 구현예에서, 효소-인코딩 핵산에서 돌연변이를 검출하는 것은 PCR 을 포함한다. 한 구현예에서, 효소-인코딩 핵산에서 돌연변이를 검출하는 것은 RFLP 분석을 포함한다. 한 구현예에서, 효소-인코딩 핵산에서 돌연변이를 검출하는 것은 핵산 하이브리드화를 포함한다. 하이브리드화를 통해 돌연변이 SNP 를 검출하는 것은, 예를 들어, 엄격한 조건 하에 상기 SNP 를 포함하는, 효소-인코딩 핵산 또는 이의 단편에 하이브리드화될 핵산을 포함하는 핵산 어레이를 사용하여 수행될 수 있다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 효소-인코딩 유전자의 대립형질의 활성을 측정하기 위한 생체내 검정의 사용을 포함한다.
방법의 조합이 또한, 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 검출하고 분석하는데 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 효소-인코딩 유전자의 활성을 측정하고, 효소-인코딩 핵산 내 SNP 를 검출하기 위한 생체내 검정의 사용을 포함한다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 효소 활성을 측정하기 위한 생체내 검정, 및 승온에서의 효소 안정성을 측정하기 위한 온도 감수성 검정의 사용을 포함한다.
한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 효소 활성을 측정하기 위한 생체내 검정, 및 효소의 특이적 활성을 측정하기 위한 시험관내 검정의 사용을 포함한다.
바람직한 구현예에서, MTHFR 의 손상 대립형질은 M110I, H213R, D223N, D291N, R519C, R519L 및 Q648P 로 이루어지는 군에서 선택되는 MTHFR 단백질에서의 돌연변이에 대해 인코딩하는 비-동의성 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 손상 대립형질은 M110I, H213R, D223N 및 D291N 으로 이루어지는 군에서 선택되는 MTHFR 단백질에서의 돌연변이에 대해 인코딩하는 비-동의성 치환을 포함한다.
효모 균주
한 양상에서, 본 발명은 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 효소의 손상 대립형질을 검출할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 이러한 효모 균주는 본원에서 개시된 방법에서 유용하다. 효모 균주는 관심의 기능적 상동 효소에 의한 상보성을 허용하는 제 1 돌연변이, 및 균주가 제 1 유전자의 기능에 관련되는 검정가능한 표현형에 대한 보조인자 보충에 의존적이게 하는 제 2 돌연변이 (또는 돌연변이군) 를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CTH 의 손상 대립형질을 검출하고 비타민 B6 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효모 균주는 6 겹-결실 sno1 △ sno2 △ sno3 △ snz1 △ snz2 △ snz3 △ 및 cys4 에서의 돌연변이를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CBS 의 손상 대립형질을 검출하고 비타민 B 에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효모 균주는 6 겹-결실 sno1 △ sno2 △ sno3 △ snz1 △ snz2 △ snz3 △ 및 cys4 에서의 돌연변이를 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 MTHFR 의 손상 대립형질을 검출하고 폴레이트에 대한 이의 반응성을 측정할 수 있는 효모 균주를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 효모 균주는 met13 및 fol3 에서의 돌연변이를 포함한다.
질환의 위험성에 대한 스크리닝
한 양상에서, 본 발명은 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 병상 또는 질환의 위험성에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질에 대한 스크리닝을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 효소 기능 장애와 연관되는 질환 또는 병상의 위험성에 대한 스크리닝 방법을 제공하는데, 상기 효소는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 질환 또는 병상은 심혈관계 질환, 관상동맥 질환, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결함, 구안지 구열, 임신중독증, 조산/저출생 체중, 재발성 초기 자연유산, 혈전증, 망막 동맥 폐쇄, 다운증후군, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열증, 알츠하이머병/치매, 노인성 황반 변성 및 녹내장으로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은, MTHFR 의 손상 대립형질, ATIC 의 손상 대립형질, MTHFS 의 손상 대립형질, MAT1A 의 손상 대립형질, MAT2A 의 손상 대립형질 및 GART 의 손상 대립형질로 이루어지는 군에서 선택되는 손상 대립형질을 검출하기 위한 방법의 사용을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CBS 기능 장애와 연관되는 질환 또는 병상의 위험성에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 질환 또는 병상은 심혈관계 질환, 관상동맥 질환, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결함, 구안지 구열, 임신중독증, 조산/저출생 체중, 재발성 초기 자연유산, 혈전증, 망막 동맥 폐쇄, 다운증후군, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열증, 알츠하이머병, 치매, 노인성 황반 변성 및 녹내장으로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 방법은, 본원에 기재된 바와 같은, 손상된 CBS 대립형질을 검출하기 위한 방법의 사용을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 CTH 기능 장애와 연관되는 질환 또는 병상의 위험성에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 질환 또는 병상은 심혈관계 질환, 관상동맥 질환, 허혈성 뇌졸중, 죽상동맥경화증, 신경관 결함, 구안지 구열, 임신중독증, 조산/저출생 체중, 재발성 초기 자연유산, 혈전증, 망막 동맥 폐쇄, 다운증후군, 대장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 우울증, 정신분열증, 알츠하이머병/치매, 노인성 황반 변성 및 녹내장으로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 손상된 CTH 대립형질을 검출하기 위한 방법의 사용을 포함한다.
화학요법 반응 가능성에 대한 스크리닝
한 양상에서, 본 발명은 개인의 화학요법 반응 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 방법의 사용을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다. 개인에서의 손상 대립형질 검출은 감소된 반응 가능성을 표시한다.
바람직한 구현예에서, 화학요법제는 메토트렉세이트 또는 5-플루오로우라실이다.
화학요법 독성에 대한 스크리닝
한 양상에서, 본 발명은 개인에 대한 화학요법 독성을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하기 위한 방법의 사용을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다. 개인에서의 손상 대립형질의 검출은 증가된 독성 가능성을 표시한다.
바람직한 구현예에서, 화학요법제는 메토트렉세이트 또는 5-플루오로우라실이다.
예방 및 치료
한 양상에서, 본 발명은 대사 효소 결핍과 연관되는 병상 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 보조인자-민감성 손상 대립형질의 존재를 알려주는 전술한 검정 및 방법에서 수득한 정보를 기준으로 개인의 보조인자 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에 기재된 바와 같은, 대사 유전자의 보조인자-구제가능 손상 대립형질을 검출하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 병상 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 폴레이트 및/또는 비타민 B 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 보조인자 구제가능한 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 갖는 개인에서의 효소 기능 장애와 연관되는 병상 또는 질환을 예방하는 방법을 제공하며, 상기 효소-인코딩 유전자는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 방법은 개인의 폴레이트 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 손상된 CBS 대립형질을 갖는 개인에서의 CBS 기능 장애와 연관되는 병상 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 비타민 B6 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 손상된 CTH 대립형질을 갖는 개인에서의 CTH 기능 장애와 연관되는 병상 또는 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 비타민 B5 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 비정상적 폴레이트/호모시스테인 신진대사와 연관되는 병상 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 폴레이트 및/또는 비타민 B6 섭취를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 방법은 본원에서 기재된 바와 같은, 폴레이트/호모시스테인 신진대사에 포함되는 유전자의 손상 대립형질을 검출하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 보조인자 구제가능한 효소-인코딩 유전자의 손상 대립형질을 갖는 개인에서의 효소 기능 장애와 연관되는 병상 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 효소-인코딩 유전자는 보조인자에 의해 구제가능한 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 방법은 개인의 폴레이트 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 손상된 CBS 대립형질을 갖는 개인에서의 CBS 기능 장애와 연관되는 병상 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 비타민 B6 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 손상된 CTH 대립형질을 갖는 개인에서의 CTH 기능 장애와 연관되는 병상 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인의 비타민 B6 섭취를 증가시키는 것을 포함한다.
제형
본 발명은 개인에 대한 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형을 추가로 제공한다. 상기 하나 이상의 보조인자는 개인의 유전적 구성을 기준으로 선택된다. 예를 들어, 상기 제형은 다수의 보조인자를 포함할 수 있는데, 다수의 보조인자 내의 하나 이상의 보조인자 부분집합은 개인의 유전적 구성을 기준으로 선택된다. 일부 구현예에서, 제형 내에 있는 것으로 선택되는 모든 보조인자는 개인의 유전적 구성을 기준으로 한다. 예를 들어, 부분집합, 예컨대 제형 내에 존재하는 다수의 보조인자 중 하나 이상은 개인의 유전적 구성을 기준으로 할 수 있다. 다른 구현예에서, 제형 내에 존재하는 다수의 보조인자 중 둘 이상은 개인의 유전적 구성을 기준으로 한다. 다른 구현예에서, 제형 내에 존재하는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 75 또는 100 개의 보조인자 (보조인자 모두, 또는 이의 부분집합이 제형 내에 존재함) 는 개인의 유전적 구성을 기준으로 제형에 대해 선택된다.
본원에 개시된 제형은 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재하는 하나 이상의 보조인자를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 제형은 보조인자를 포함하는데, 상기 보조인자는 개인의 유전적 구성을 기준으로 선택된 양으로 존재한다. 또다른 구현예에서, 상기 제형은 보조인자의 하나 이상의 부분집합이 개인의 유전적 구성을 기준으로 하는 양으로 존재하는 다수의 보조인자를 포함한다. 다른 구현예에서, 제형 내에 존재하는 다수의 보조인자 중 둘 이상은 개인의 유전적 구성을 기준으로 하는 양으로 존재한다. 다른 구현예에서, 제형 내에 존재하는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 50, 75 또는 100 개의 보조인자 (보조인자 모두, 또는 이의 부분 집합이 제형 내에 존재함) 는 개인의 유전적 구성을 기준으로 하는 양으로 존재한다.
유전적 구성의 분석
본원에 개시된 제형은 개인의 유전적 구성을 기준으로 선택된 하나 이상의 보조인자를 포함한다. 개인의 유전적 구성은 개인의 생물학적 샘플의 분석을 통해 결정될 수 있다. 분석은 보조인자 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 상관관계된 유전적 변이체의 부재 또는 존재를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 유전적 변이체가 분석된다. 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍을 갖는 위험성 또는 이의 소인을 측정하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 개인이 보조인자 구제가능 병상을 갖는 위험성 또는 이의 소인을 측정하는데 사용될 수 있다.
개인의 유전적 구성은 개인의 생물학적 샘플의 분석을 통해 수득될 수 있다. 상기 개인은 생물학적 샘플, 예컨대 유전적 샘플이 유래할 수 있는 임의의 샘플을 제공할 수 있다. 샘플은 구강 면봉 (buccal swab), 타액, 혈액, 모발 또는 개인에서 수득되는 임의의 다른 유형의 샘플로부터의 것일 수 있다. 상기 샘플 제 3 자에 의해 수득될 수 있으며 타자에 의해 분석될 수 있다. 상기 샘플은 미리 보관되어 있었을 수 있다. 대안적으로는, 상기 샘플은 단일한 자 (single party) 에 의해 수득되고 분석될 수 있다.
개인은 동물, 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 고양이, 개, 말, 닭, 양, 소, 원숭이 또는 기타 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 개인은 인간이다. 인간은 임의 연령의 인간일 수 있다. 인간은 태아, 아기, 아이, 청소년, 성인 또는 노인인 개인일 수 있다. 개인은 50 세 초과, 60 세 초과, 또는 그 이상 연령의 성인일 수 있다. 개인은 가임 연령일 수 있다. 개인은 여성 또는 남성일 수 있다.
일부 구현예에서, 개인은 임신한 여성이다. 다른 구현예에서, 개인은 곧 태어날 아이 (예컨대 태아), 또는 아직 임신 중인 아이의 부모, 여성 또는 남성일 수 있다. 예를 들어, 여성, 예컨대 아이를 갖는 것에 관심이 있는 여성 또는 임신한 여성의 유전적 구성을 분석하여 효소 결핍에 의존적이거나 보조인자 구제가능한 병상과 같은 병상을 갖는 아이의 위험성을 측정한다. 다른 구현예에서, 아버지 또는 아이의 아버지의 유전적 구성을 분석한다. 어머니 또는 아버지에 대한 제형을 이들의 유전적 구성을 기준으로 결정할 수 있는데, 상기 제형은 어머니, 아버지 및/또는 아이의 건강을 향상시키고, 어머니, 아버지 및/또는 아이의 보조인자 의존적 효소 결핍을 구제하거나, 어머니, 아버지 및/또는 아이의 보조인자 구제가능 병상을 구제할 수 있다.
개인은 보조인자-의존적 효소 결핍과 같은 대사 병상의 가족력을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 개인은 보조인자-의존적 효소 결핍과 같은 대사 병상의 임의의 증상 또는 병상을 경험하지 않는다. 다른 구현예에서, 개인은 보조인자-의존적 효소 결핍과 같은 대사 병상의 하나 이상의 증상 또는 병상을 경험한다.
개인의 유전적 구성을 분석하여 보조인자 의존적 효소 결핍과 같은 대사 병상의 소인, 위험성, 진단, 예후, 또는 치료진단을 측정할 수 있다. 분석을 사용하여 보조인자 의존적 효소 결핍의 치료 효과, 또는 치료에 대한 반응의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 분석을 사용하여 보조인자 구제가능 병상의 치료 효과, 또는 치료에 대한 반응의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다.
예를 들어, 상기 보조인자 구제가능 병상은 비타민 결핍일 수 있거나, 이러한 결핍의 증상을 나타낸다. 상기 비타민 결핍은 비타민 A 결핍, 비타민 A 과다증, 비타민 D 결핍 및 의존성, 비타민 D 과다증, 비타민 E 결핍 및 독성, 비타민 K 결핍, 비타민 K 과다증, 필수 지방산 결핍, 티아민 결핍, 리보플라빈 결핍, 니아신 결핍, 비타민 B6 결핍 및 의존성, 비오틴 결핍 및 의존성, 판토텐산 결핍, 카르니틴 결핍 또는 비타민 C 결핍일 수 있다. 또다른 구현예에서, 보조인자 구제가능 병상은 미네랄 결핍일 수 있거나, 이러한 결핍의 증상을 나타낸다. 예를 들어, 미네랄 결핍은 포스페이트 고갈, 요오드 결핍, 불소 결핍, 구리 신진대사에서의 아연 결핍 장애 (disturbance), 후천적 (acquired) 구리 결핍, 후천적 구리 중독증, 선천적 (inherited) 구리 결핍 또는 선천적 구리 중독증을 포함할 수 있다.
보조인자 구제가능 병상은 비타민결핍증 또는 비타민과다증일 수 있다. 일부 구현예에서 비타민결핍은, 이론에 의해 얽매이지 않고, 안구건조증 또는 야맹증과 같은 병상을 야기하는 비타민 A 결핍이고; 각기병과 같은 병상을 야기하는 티아민 결핍; 펠라그라와 같은 병상을 야기하는 니아신 결핍; 거대적아구성 빈혈과 같은 병상을 야기하는 비타민 B12 결핍; 괴혈병과 같은 병상을 야기하는 비타민 C 결핍; 구루병과 같은 병상을 야기하는 비타민 D 결핍, 또는 손상된 응고력과 같은 병상을 야기하는 비타민 K 결핍이다.
보조인자 구제가능 병상은 또한 면역 병상, 아동 발달, 심혈관 병상 및 노화의 영향과 같은 병상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 보조인자 구제가능 병상은 낮은 골밀도, 콘 질환 또는 다발성 경화증일 수 있다.
일부 구현예에서, 보조인자 구제가능 병상은 조산이 발생하는 것을 포함한다. 다른 병상은 이분척추증을 갖는 자손, 성장 및 정신 발달에서의 장애, 구개열, 무뇌증 또는 임의의 다른 신경관 결함 (NTD) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 보조인자 구제가능 병상은 보조인자 구제가능 병상을 갖는 아이를 가질 능력 또는 이에 대한 소인이다. 일부 구현예에서, 보조인자 구제가능 병상은 신경관 결함과 같은 선천성 결함을 갖는 아이를 가질 위험성 또는 이의 소인이다. 일부 구현예에서, NTD 는 이분척추증이다. 다른 결함은 조산 또는 구개열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 개인의 유전적 구성이 분석되며 개인은 보조인자 구제가능 병상에 대한 낮은 위험성 또는 소인을 갖는다. 분석을 사용하여 개인의 건강을 향상시키는 개인에 대한 제형용 보조인자, 또는 다수의 보조인자를 선택하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 대안적으로는, 제형은 보조인자 의존적 효소 결핍과 같은 개인의 알려져 있거나 알려져 있지 않은 병상의 하나 이상의 증상의 개선을 도울 수 있다.
개인의 유전적 구성은 또한 개인에 대한 제형에 존재하는 하나의 보조인자, 또는 다수의 보조인자의 양에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 개인의 유전적 구성이 분석되며 개인이 보조인자 구제가능 병상에 대한 낮은 위험성 또는 소인을 갖는 경우, 제형은 가이드라인에서 표시된 바와 같은 권장 투약량 또는 1 일 섭취량에 비해 낮은 양의 하나 이상의 보조인자를 포함할 수 있다 (예를 들어 표 5 및 6 참조). 대안적으로는, 제형은 보조인자 의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성 또는 진단을 갖는 개인에 대한 권장 투약량 또는 1 일 섭취량보다 더 높은 양을 포함할 수 있다.
하나 이상의 유전적 변이체의 분석을 사용하여 하나 이상의 보조인자 구제가능 병상의 위험성 또는 소인 또는 진단을 측정할 수 있다. 예를 들어, 개인의 생물학적 샘플로부터의 다수의 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험에 있는지를 표시할 수 있다. 보조인자-의존적 효소 결핍은 보조인자 구제가능 병상일 수 있다. 다수의 유전적 변이체는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 또는 100 개의 유전적 변이체를 포함할 수 있다. 유전적 변이체는 동일한 유전자, 동일한 대사 경로에서의 상이한 유전자, 또는 상이한 대사 경로에서의 상이한 유전자의 것일 수 있다. 다수의 유전적 변이체의 분석은 단일 유전적 변이체 또는 다수 미만의 유전적 변이체의 분석을 기준으로 한 제형에 비해 보조인자 구제가능 병상의 하나 이상의 증상의 향상된 건강적 이득 또는 향상된 개선을 제공하는, 개인에 대한 보다 편리하고 특이적인 제형을 제공할 수 있다.
유전적 변이체는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 절단 (truncation), 삽입, 결실 또는 반복일 수 있다. 유전적 변이체는 또한 뉴클레오티드 반복, 뉴클레오티드 삽입, 뉴클레오티드 결실, 염색체 전좌, 염색체 복사 또는 카피수 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 카피수 변이체는 부수체 반복, 뉴클레오티드 반복, 동원체 반복 또는 텔로머 반복이다.
유전적 변이체는 비타민과 같은 보조인자의 생합성에 대한 경로와 같은 대사 경로에서의 유전자의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 경로는 티아민 대사 경로, 리보플라빈 대사 경로, 비타민 B6 대사 경로, 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사 경로, 판토테네이트 및 CoA 생합성 경로, 비오틴 대사 경로, 리포 대사 경로, 폴레이트/호모시스테인 대사 경로, 레티놀 대사 경로, 포르피린 대사 경로, 유비퀴논 및 다른 테르페노이드-퀴논 생합성 경로를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
유전적 변이체는 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (칼시페롤), 비타민 E, 비타민 K (필로퀴논), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B9 (폴레이트/엽산), 비타민 B12 (토코페롤), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B5 (판토텐산) 또는 콜린을 대사하기 위한 경로에서의 유전자의 것일 수 있다.
한 구현예에서, 유전적 변이체는 폴레이트 경로에서의 유전자, 예컨대 AHCY, AHCYL1, AHCYL2, ALDH1L1, ALDHL2, AMT, ATIC, BHMT1, BHMT2, CBS, CTH, DHFR, DMGDH, FPGS, FTCD, GART, GGH, MAT1A, MAT2A, MTFMT, MTHFD1, MTHFD2, MTHFR, MTHFS, MTR, MTRR, NAALAD2, SARDH, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 것이다. SNP 와 같은 유전적 변이체는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, GART, AHCY, AMT, CBS, CTH, DHFR, FPGS, MTHFD1, MTHFD2, MTR, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 유전적 변이체에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 유전적 변이체는 표 A- X 로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적 변이체는 AHCY, AMT, CBS, CTH, DHFR, FPGS, MTHFD1, MTHFD2, MTR, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 것, 예컨대 표 G, H, J, K, L, M, Q, R, U, V, W 및 X 에서 열거한 하나 이상의 것이다.
유전적 변이체는 출판 문헌 또는 과학 저널 또는 회의를 통해 확인될 수 있다. 대안적으로는, 이는 본원에 개시된 방법을 통해 확인된 유전적 변이체일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 개인은 보조인자 구제가능 병상과 같은 알려져 있는 대사 병상을 가질 수 있다. 이의 게놈은 분석될 수 있으며 유전적 변이체가 확인될 수 있고, 상기 유전적 변이체를 본원에 개시된 방법, 예컨대 다른 개인에서의 유전적 변이체 검출 및 다른 개인에서의 보조인자 구제가능 병상 확인에 사용할 수 있다. 따라서, 본 개시물의 또다른 양상은 유전적 변이체 뿐 아니라 과학 문헌 및 다른 공개적으로 이용가능한 원천을 통해 확인된 유전적 변이체로 유전적 변이체 목록을 업데이트하는 것이다. 예를 들어, 유전적 변이체의 현존하는 데이터베이스 및 이들의 보조인자 의존적 효소 결핍, 보조인자 구제가능 병상, 권장 보조인자 및 보조인자의 양에 대한 상관관계는 유전적 변이체 또는 공개적으로 이용가능한 원천을 통해 확인된 새로운 유전적 변이체로 업데이트될 수 있다.
유전적 변이체는 본원에 기재된 것들과 같은 당업계에 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 분석은 DNA 서열분석, 실시간 PCR 과 같은 PCR 기재 방법, 질량 분석법 (MALDI-TOF/MS 법), 비드-기재 검정, 변성 곡선 분석 또는 마이크로어레이에 의해 수행될 수 있다. 분석은 또한 단편 길이 다형성 검정 (제한 단편 길이 다형성 (RFLP), 절단 (cleavage) 단편 길이 다형성 (CFLP)), 단일 가닥 형태 다형성 분석에 의해 수행될 수 있다. 주형으로서 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하는 하이브리드화 방법 (예를 들어, TaqMan PCR 방법, 인베이더 방법, DNA 칩 방법), 프라이머 연장 반응 방법, 증폭 불응성 돌연변이 시스템 (ARMS) 등이 또한 사용될 수 있다.
임의의 시판되는 키트, 시스템 및 플랫폼을 사용하여 본원에 기재된 유전적 변이체를 분석할 수 있다. 예를 들어 비제한적으로, 어레이, Affymetrix (Santa Clara, CA) 로부터의 어레이 예컨대 Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0, 또는 Agilent (Santa Clara, CA) 로부터의 어레이 예컨대 Human Genome CGH Microarray Kit 244A, 및 관련 제품을 사용할 수 있다. 비드-기재 플랫폼, 예컨대 Illumina (San Diego, CA) 로부터의 것, 예컨대 Infinium HD BeadChips 또는 게놈 분석기 (Genome Analzyer), 및 관련 플랫폼 및 기술이 또한 사용될 수 있다. 시판되거나 개발 중인 서열분석 플랫폼, 예컨대 Illumina 로부터의 것, Applied Biosystems (Foster City, CA) 로부터의 것, 예컨대 유전적 분석기 (Genetic Analyzer); 454 Life Sciences (Branford, CT) 로부터의 것, 예컨대 게놈 서열분석기 (Genome Sequencer); Helicos Biosciences Corporation (Cambridge, MA) 으로부터의 것, 예컨대 Helicos™ Genetic Analysis System; 및 다른 관련 제품 및 기술이 또한 사용될 수 있다. 변성 곡선 분석의 사용, 예컨대 비제한적으로, Qiagen HRM PCR 키트 (카탈로그 번호 6569627) 및 PCR-기재 방법의 사용, 예컨대 비제한적으로, TaqMan® PCR (예컨대 Roche, Base Switzerland 로부터의 것), 또는 정량 실시간 ARMS, 예컨대 Scorpion® Primers (DxS Ltd, Manchester, UK) 의 사용과 같은 다른 플랫폼이 또한 사용될 수 있다.
유전적 변이체의 검출은 간접적 또는 직접적일 수 있다. 예를 들어, 보조인자 구제가능 병상과 상관관계 있는 유전적 변이체, "SNP A" 가 직접적으로 검출될 수 있다. 대안적으로는, SNP A 는 또다른 유전적 변이체, "SNP B" 와 연관 불균형에 있을 수 있다. 그로서, SNP A 는 SNP B 의 검출을 통해 간접적으로 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 마이크로어레이를 사용하여 유전적 변이체를 검출한다. 예를 들어, 마이크로어레이는 샘플 내 하나 이상의 유전적 변이체를 검출하기 위해 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 표 A-X 에 열거된 것들과 같은 하나 이상의 유전적 변이체를 검출하기 위해 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 마이크로어레이는 이에 고정된, 표 A-X 에 열거된 것들과 같은 유전적 변이체를 포함하는 다수의 단리된 핵산을 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 표 A-X 에 열거된 것들과 같은 하나 이상의 유전적 변이체를 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함할 수 있다.
보조인자
본원에 개시된 제형은 하나 이상의 보조인자, 예컨대 다수의 보조인자를 포함할 수 있는데, 제형 내의, 보조인자 모두 또는 이의 다수의 부분집합은 개인의 유전적 구성으로부터 선택된다. 더욱이, 제형 내 하나 이상의 보조인자의 양은 개인의 유전적 구성으로부터 또한 결정될 수 있다.
보조인자는 비-단백질 화합물, 자연발생적 또는 합성적인데, 단백질과 연관되고 단백질의 생물학적 활성을 돕는다. 예를 들어, 보조인자는 통상 효소와 연관되며 종종 효소의 활성을 필요로 한다. 보조인자는 단백질과 느슨히 결합하거나 연관될 수 있다 (조효소로 지칭). 다른 구현예에서, 보조인자는 단백질과 단단히 연관되거나 결합한다 (예컨대 보결분자단). 본원에 개시된 보조인자는 관심 효소의 직접적인 보조인자일 수 있을 뿐 아니라 (예를 들어, MTHFR, ATIC, GART, MAT1A, MAT2A 및 MTHFS 에 대한 폴레이트) 관심 효소의 간접적인 보조인자일 수 있다. 따라서, 보조인자는 효소 기능에 직접적 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있다.
본원에 개시된 보조인자는 합성 또는 자연발생적일 수 있다. 예를 들어, 보조인자는 화학적 합성, 시험관내를 통해 제조될 수 있거나, 유기체로부터 정제될 수 있다. 제형은 합성, 자연발생적, 또는 이의 조합인 보조인자를 포함할 수 있다.
보조인자는 유기 또는 무기일 수 있다. 본원에서 개시된 제형은 유기, 무기 또는 이의 조합인 하나 이상의 보조인자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 보조인자는 유기 보조인자, 예컨대 비타민 또는 비타민 유래 분자일 수 있다. 보조인자는 이의 구조의 일부로서 뉴클레오티드 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 예컨대 ATP, 조효소 A, FAD 및 NAD+ 를 포함할 수 있다. 다른 유기 보조인자는 플라빈 또는 헴을 포함한다.
개인의 유전적 구성을 기준으로 선택되는 보조인자는 표 5 에서의 것들과 같은 비타민일 수 있다. 비타민은 수용성 또는 지용성일 수 있다. 예를 들어, 제형은 하나 이상의 하기 비타민을 포함할 수 있다: 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (칼시페롤), 비타민 E, 비타민 K (필로퀴논), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B9 (폴레이트/엽산), 비타민 B12 (토코페롤), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B5 (판토텐산) 또는 콜린. 제형은 상술한 비타민 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 비타민을 포함하지 않는다.
보조인자는 또한 무기 보조인자, 예컨대 미네랄 또는 금속 이온, 예컨대 표 6 에서 열거된 것들일 수 있다. 예를 들어, 무기 보조인자는 Mg2 +, Cu+, Mn2 + 또는 철-황 무리와 같은 금속 이온일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 제형은 칼슘, 인, 철, 요오드, 마그네슘, 아연, 셀레늄, 구리, 망간, 크롬 또는 몰리브덴 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 제형은 상술한 미네랄 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 미네랄을 포함하지 않는다.
보조인자의 양
본원에 개시된 제형의 또다른 양상에서, 제형 내 하나 이상의 보조인자의 양은 개인의 유전적 구성을 기준으로 선택된다. 한 구현예에서, 제형은 개인의 유전적 구성에 의해 결정되는 양의 보조인자를 포함한다. 또다른 구현예에서, 제형은 보조인자의 부분집합, 또는 모든 보조인자가 개인의 유전적 구성에 의해 결정되는 양으로 존재하는 다수의 보조인자를 포함한다. 제형 내 권장량은 통상 제형의 투약 요법을 기준으로 하는데, 예를 들어, 상기 양은 제형의 1 일 섭취를 기준으로 할 수 있다. 대안적으로는, 상기 양은 1 일 2 회, 1 일 3 회, 매주, 격주, 매월 또는 격월 요법을 기준으로 할 수 있다.
개인의 유전적 구성을 사용하여, 개인이 섭취해야 하거나 섭취하는 것을 권장하거나, 이것으로 이들의 식이요법을 보충하는 하나 이상의 보조인자의 양이 상이한 유전적 구성을 갖는 또다른 개인에 대해 권장된 바와 상이하다는 것을 결정할 수 있다. 예를 들어, 개인의 식이요법에 있어서 보조인자를 보충하기 위한 필요성과 상관관계가 있는 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 개인의 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 유전적 변이체의 존재를 검출하는 것은, 개인에 대한 보조인자의 권장량이 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량과 상이하다는 것을 결정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로는, 유전적 변이체의 부재를 측정하는 것은, 개인에 대한 보조인자의 권장량이 유전적 변이체를 갖는 개인에 대한 권장량과 상이하다는 것을 결정하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 유전적 변이체의 부재 또는 존재는, 개인이 섭취해야 하거나, 이들의 식이요법에 보충하는 하나 이상의 보조인자의 양을 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 또는 100 개 유전적 변이체의 존재 또는 부재는 개인에서 검출될 수 있으며, 개인이 섭취해야 하거나, 이것으로 이들의 식이요법을 보충하는 하나 이상의 보조인자의 양과 상관관계가 있다.
특정 유전적 변이체가 없는 개인과 비교하여 특정 유전적 변이체를 갖는 개인 사이의 보조인자의 권장량에 있어서의 차이는 보조인자의 중량, 질량 또는 IU 의 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000% 의 차이일 수 있다. 중량은 보조인자의 건조 중량이거나 보조인자의 등가 중량 또는 생물학적 활성일 수 있다.
예를 들어, 특정 SNP 를 갖는 개인은 400 mcg 엽산의 권장 1 일 투여량을 가질 수 있으나; SNP 가 없는 개인은 이의 1000% 인 권장 1 일 투여량을 가질 수 있다 (4 mg 의 엽산). 또다른 예에서, 특정 SNP 를 갖는 개인은 400 mcg 엽산의 권장 1 일 투여량을 가질 수 있으나; SNP 가 없는 개인은 이의 25% 인 권장 1 일 투여량을 가질 수 있다 (100 mcg 의 엽산).
일부 구현예에서, 개인에서의 유전적 변이체의 존재는, 유전적 변이체가 없는 개인에 대한 보조인자 권장량 초과인 보조인자 양을 개인이 섭취하는 권장사항과 상관관계가 있다. 대안적으로는, 개인에서의 유전적 변이체의 부재는 유전적 변이체를 갖는 개인에 대한 보조인자 권장량 초과인 보조인자 양을 개인이 섭취하는 권장사항과 상관관계가 있다. 예를 들어, 유전적 변이체의 존재는, 유전적 변이체가 없는 개인이 섭취해야 하거나 이것으로 이들의 식이요법을 보충하는 양의 적어도 약 1.1 배 초과인 보조인자의 양을 개인이 섭취해야 하는 것을 결정하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 유전적 변이체를 갖는 개인이 섭취해야 하는 보조인자 양은 유전적 변이체가 없는 개인이 섭취하는 것으로 권장되는 양의 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50 배이다. 예를 들어, 유전적 변이체의 존재는 임신한 여성으로부터의 샘플에서 검출된다. 유전적 변이체의 존재는 유전적 변이체가 없는 개인에 비해 엽산과 같은 보조인자 양의 5 배로 개인이 상기 여성의 식이요법을 보충한다는 권장사항과 상관관계가 있다 (조산 또는 이분척추증 또는 구개열을 갖는 아이의 출생과 같은 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성을 감소시킴).
다른 구현예에서, 유전적 변이체의 존재를 검출하는 것은, 유전적 변이체가 없는 개인이 섭취하도록 권장되는 양 미만인 보조인자 양을 섭취하도록 권장되는 개인과 상관관계가 있다. 대안적으로는, 유전적 변이체의 부재를 검출하는 것은, 유전적 변이체를 갖는 개인이 섭취하도록 권장되는 양 미만인 보조인자 양을 섭취하도록 권장되는 개인과 상관관계가 있다. 예를 들어, 개인 샘플에서의 유전적 변이체의 존재는 개인이 유전적 변이체가 없는 개인에 대해 권장된 바와 같은 보조인자 양의 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50 배 미만을 섭취해야 한다는 것을 표시할 수 있다.
개인의 유전적 구성은, 개인이 섭취해야 하거나, 이것으로 이들의 식이요법을 보충하는 하나 이상의 보조인자의 양이 정부 관계기관 또는 의료 기관에 의한 권장량 초과이고, 미만이거나 동일한 것을 결정하는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 개인의 유전적 구성은, 개인에 의해 섭취되는 하나 이상의 보조인자의 양이 식품의약국 (FDA) 에 의한 권장량 초과이고, 미만이거나 동일할 수 있다는 것을 결정하는데 사용될 수 있다.
개인의 유전적 구성은, 개인에 의해 섭취된 하나 이상의 보조인자가 영양소 기준치 (RDI) 초과이고, 미만이거나 동일해야 한다는 것을 결정하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 표 5 및 6 참조). 예를 들어, 가임 연령의 여성은 400 mcg 의 합성 엽산을 취하도록 권장된다 (예를 들어, 표 5 참조). 그러나, 여성의 유전적 구성의 분석은 5 배 이상 또는 10 배 이상의 양, 예컨대 4 mg 이상의 엽산을 취해야 한다는 것을 결정할 수 있다. 또다른 구현예에서, 개인의 유전적 구성은, 개인이 RDI 에서의 권장량 미만인 보조인자의 1 일 섭취를 가져야 한다는 것을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 개인의 제형은 RDI 량의 절반인 엽산의 양을 포함할 수 있다.
개인의 샘플은 개인의 식이요법에 보충되어야 하는 보조인자의 양과 상관관계가 있는 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 유전적 변이체의 존재를 검출하는 것은, 개인에 대한 보조인자의 권장량이 의료 기관에 의한 권장량과 상이하다는 것을 측정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로는, 유전적 변이체의 부재를 검출하는 것은, 개인에 대한 보조인자의 권장량이 정부 관계기관에 의한 권장량, 예컨대 RDI 양과 상이하다는 것을 측정하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 다수의 유전적 변이체의 부재 또는 존재는 개인이 섭취해야 하거나, 이들의 식이요법에 보충하는 하나 이상의 보조인자의 양을 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 또는 100 개의 유전적 변이체의 존재 또는 부재가 개인에서 검출될 수 있으며, 개인이 섭취해야 하거나 이것으로 그들의 식이요법을 보충하는 하나 이상의 보조인자의 양과 상관관계가 있다.
정부 관계기관에 의해 제안된 권장 수치, 예컨대 RDI 에 비교하여, 특정 유전적 변이체를 갖는 개인 사이의 보조인자의 권장량에 있어서의 차이는 보조인자의 중량, 질량 또는 IU 의 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000% 의 차이일 수 있다. 예를 들어 엽산에 대한 RDI 는 400 mcg 이나; 특정 SNP 를 갖는 개인은 이의 25% 인 권장 1 일 투여량을 가질 수 있다 (100 mcg 의 엽산). 또다른 예에서, 특정 SNP 를 갖는 개인은 RDI 의 1000% 의 권장 1 일 투여량을 가질 수 있다 (4 mg 의 엽산).
일부 구현예에서, 개인에서의 유전적 변이체의 존재는, 개인이 정부 관계기관에 의한 보조인자 권장량, 예컨대 RDI 양 초과인 보조인자 양을 섭취하는 권장사항과 상관관계가 있다. 대안적으로는, 개인에서의 유전적 변이체의 부재는, 개인이 정부 관계기관 또는 의료 기관에 의한 보조인자 권장량 초과인 보조인자 양을 섭취하는 권장사항과 상관관계가 있다. 예를 들어, 유전적 변이체의 존재는, 개인이 정부 관계기관 또는 의료 기관에 의한 권장량의 적어도 약 1.1 배 초과인 보조인자 양을 섭취해야 한다는 것을 결정하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 유전적 변이체를 갖는 개인이 섭취해야 하는 보조인자 양은 정부 관계기관 또는 의료 기관에 의한 권장량의 적어도 약 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50 배이다. 예를 들어, 유전적 변이체의 존재는 임신한 여성으로부터의 샘플에서 검출된다. 유전적 변이체의 존재는 RDI 양에 비해 엽산과 같은 보조인자 양의 5 배로 개인이 상기 여성의 식이요법을 보충한다는 권장사항과 상관관계가 있다 (조산 또는 이분척추증 또는 구개열을 갖는 아이의 출생과 같은 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성을 감소시키는 것을 도움).
다른 구현예에서, 유전적 변이체의 존재를 검출하는 것은, 정부 관계기관 또는 의료 기관에 의한 권장량 미만인 보조인자 양을 섭취하도록 권장되는 개인과 상관관계가 있다. 대안적으로는, 유전적 변이체의 부재를 검출하는 것은, 정부 관계기관 또는 의료 기관에 의한 권장량 미만인 보조인자 양을 섭취하도록 권장되는 개인과 상관관계가 있다. 예를 들어, 개인 샘플에서의 유전적 변이체의 존재는 개인이 유전적 변이체가 없는 개인에 대해 권장된 바와 같은 보조인자 양의 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 50 배 미만을 섭취해야 한다는 것을 표시할 수 있다.
개인적 특징
개인용 제형에 대한 하나 이상의 보조인자, 하나 이상의 보조인자의 양, 또는 둘 모두의 선택은 또한 개인의 개인적 특징을 기준으로 할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 보조인자의 선택은 개인의 유전적 구성 및 개인의 하나 이상의 개인적 특징을 기준으로 할 수 있다. 개인적 특징은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 상기 개인의 체중, 키, 체질량 지수, 인종, 가계, 성별, 연령, 가족력, 의료 기록, 운동 습관 또는 식습관.
예를 들어, 개인의 유전적 구성 분석은 개인에 대한 다수의 보조인자를 결정하는데 사용된다. 보조인자는 두 비타민 및 미네랄을 포함한다. 개인의 식습관은 개인이 미네랄을 높이 섭취함으로써, 개인에 대한 권장된 제형이 두 비타민을 포함한다는 것을 표시한다.
또다른 예에서, 개인의 유전적 구성은 개인에 대한 다수의 보조인자를 결정하는데 사용된다. 보조인자의 다양한 양의 세 비타민을 포함한다. 개인의 식습관은 개인이 이들 비타민을 낮게 섭취함으로써, 세 비타민을 포함하는 제형이, 개인의 유전적 구성의 분석 단독이 표시한 것보다 더 높은 투약량에 있다는 것을 표시한다. 대안적으로는, 개인의 식이요법은 이들 비타민의 높은 섭취를 표시할 수 있으며, 따라서, 비타민의 제형은 개인의 유전적 구성 분석 단독에 의해 결정된 바와 같은 양에 비해 감소된 양의 비타민을 함유한다.
한 구현예에서, 개인의 특징은 성별 및 임신 상태여서, 유전적 분석 단독으로 여성이 600 mcg 의 엽산을 섭취해야 한다는 것을 결정할 수 있다. 그러나, 임신한 상기 여성의 개인적 특징을 고려하면, 엽산의 권장량은 4 mg 이다.
다른 구현예에서, 개인의 대사율, 단백질, 핵산 (예컨대 mRNA, miRNA) 의 발현 수준, 대사산물의 수준과 같은 특징이 또한, 개인에 대한 제형의 하나 이상의 보조인자, 하나 이상의 보조인자의 양, 또는 둘 모두의 선택에 포함될 수 있다.
용어 "개인" 또는 "대상" 은 상호교환 가능하게 사용되며, 인간 대상을 포함하는 포유류 대상을 지칭한다.
투약 형태
개인의 유전적 구성에 의해 선택된 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형은 당업계에 알려져 있는 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 투여량, 예컨대 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 바와 같은 하나 이상의 보조인자의 양은 개인의 개인적 특징, 예컨대 대상의 체중 뿐 아니라 약물 형태, 투여의 경로 및 기간에 따라 또한 가변적일 수 있다. 예를 들어, 제형은 경구, 직장, 비경구, 장내, 경피, 정맥내, 국소, 피하, 근육내 또는 공급관 투여를 위해 제형화될 수 있다.
또한 본원에서는, 보조인자를 선택하고 (상기 보조인자는 개인의 유전적 구성을 기준으로 선택된 양으로 존재함); 보조인자를 섭취가능 또는 주사가능 형태로 부형제와 혼합하는 것을 포함할 수 있는 제형의 제조 방법이 제공된다. 제형의 제조 방법은 다수의 보조인자를 선택하고 (보조인자의 하나 이상의 부분집합은 개인의 유전적 구성을 기준으로 선택됨); 보조인자를 섭취가능 또는 주사가능 형태로 부형제와 혼합하는 것을 포함할 수 있다.
제형은 서방형 또는 신속 방출형 (quick release form) 으로서 제조될 수 있다. 상기 제형은 단위 투약량으로서 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 경구 섭취가능하다. 상기 제형은 분말 형태일 수 있거나, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. 상기 제형은 또한 액체 형태일 수 있다.
제형은 개인의 유전적 구성에 의해 선택된 하나 이상의 보조인자를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 정제, 펠렛, 캡슐, 좌제, 용액, 에멀젼, 현탁액 및 사용에 적합한 임의의 다른 형태에 대한 통상적인 비독성의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합공정화될 수 있다. 제형은 또한 담체 예컨대 탈크, 물, 글루코오스, 락토오스, 아카시아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 마그네슘 트리실리케이트, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 감자 전분, 우레아 및 제제 생산에 사용하기에 적합한 기타 담체를, 고체, 반고체 또는 액체 형태로 포함할 수 있으며, 추가적으로 보조제, 안정화제, 증점제 및 착색제 및 향이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 제형의 고체 조성물을 제조하기 위해서, 예컨대 정제 형태, 예컨대 캐플릿, 캡슐 (연질 젤라틴 캡슐 포함) 및 로젠지가 사용된다. 본원에 개시된 제형의 고체 형태는 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있으며, 적합한 결합제, 윤활제, 희석제, 붕해제, 착색제, 착향료, 흐름-유도제, 용융제, 당업계에 알려져 있는 많은 각종 물질을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 경구 투약 형태는 임의로는, 수분, 산소 및 빛 중 하나 이상으로부터 제형을 보호하거나 임의의 원치 않는 맛 또는 외양을 차폐하기 위해 필름 코팅을 가질 수 있다. 적합한 코팅제는 예를 들어 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 보조인자의 제형은 캡슐 내에 넣어진 다수의 비드이다. 예를 들어, 다수의 비드에서, 비드의 다양한 부분집합은 다양한 보조인자를 포함할 수 있다. 대안적으로는 다수의 비드는 단일 보조인자의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 비드는 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛ 의 직경을 가지며 보조인자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 크기는 약 300 ㎛ 내지 약 900 ㎛ 또는 약 450 ㎛ 내지 약 825 ㎛ 의 범위이다. 각각의 비드는 동일한 보조인자 또는 상이한 보조인자를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐 내 다수의 비드는 다수의 비드의 상이한 부분집합 내에 존재하는 상이한 보조인자를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 가용성 성분, 예를 들어, 당 (예를 들어, 수크로오스, 만니톨 등), 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 등), 계면활성제 (나트륨 라우릴 술페이트, 크레모포르, 트윈스, 스팬스 (spans), 플루로닉스 (pluronics) 등), 불용성 활택제 성분 (미세결정질 셀룰로오스, 인산칼슘, 탈크, 훈연 실리카 등), 코팅 물질 (적합한 코팅 물질의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 왁스, 지방산 등), 적합한 물질 중의 분산제 (예는 왁스, 중합체, 생리학적으로 허용가능한 오일, 가용성 작용제 등) 또는 상기의 조합과 혼합된 보조인자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제형이 제조되어 하나 이상의 보조인자의 실제적으로 균질한 혼합물을 함유하는 고체 조성물이 달성되어, 하나 이상의 보조인자가 조성물을 통해 균질하게 분산됨으로써, 상기 조성물이 정제, 알약 및 캡슐과 같은 동등하게 효과적인 단위 투약량 형태로 용이하게 세분될 수 있다.
본원에 개시된 제형이 경구 또는 주사 투여를 위해 혼입될 수 있는 액체 형태는, 수용액, 적절히 풍미화된 시럽, 수성 또는 오일 현탁액, 및 면실유, 참깨유, 코코넛유 또는 땅콩유와 같은 식용 오일로 풍미화된 에멀젼 뿐 아니라 엘릭시르 및 유사한 약학 비히클을 포함한다. 수성 현탁액에 대한 적합한 분산제 또는 현탁제는 합성 천연 고무, 예컨대 트래거캔스, 아카시아, 알기네이트, 덱스트란, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 포함한다.
경구 투여용 액체 제제는 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 사용 전 물 또는 기타 적합한 비히클로의 재구성을 위한 건조 생성물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 약학적으로 허용가능한 첨가제 예컨대 현탁제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로오스 또는 수소화 식용 지방); 에멀젼화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예를 들어, 아몬드 오일, 오일성 에스테르 또는 에틸 알코올); 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산); 및 인공 또는 천연 색소 및/또는 감미료와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다.
구강 (buccal) 투여를 위해서, 제형은 통상적인 수단으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
개인의 유전적 구성에 의해 선택된 하나 이상의 보조인자는, 통상적인 카테터 기술 또는 주입을 사용하는 것을 포함하는, 주사에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투약량 형태, 예를 들어 앰플, 또는 다용량 용기 (첨가된 보존제를 가짐) 로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로서의 이러한 형태를 취할 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로는, 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형은 사용 전 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열원-미포함 물로의 재구성을 위해 분말 형태일 수 있다.
본원에 기재된 제형은 또한 점진 방출형 (slow release), 서방형 또는 제어 방출형 (controlled release) 제형일 수 있다. 예를 들어, 제형은 속방형 제형의 경우보다 낮은 빈도 또는 속도로 하나 이상의 보조인자를 방출할 수 있는데 (즉, 1 일 1 회 대 1 일 2 회 또는 1 일 3 회), 이는 개인의 규정 준수 및 간병인 편리성을 향상시킬 수 있다. 이들 제형은, 규정 준수 및 고수를 보다 향상시키며 짧은 기간에 보조인자의 효과적인 정상 상태의 달성을 가능하게 하는 투여의 개시로부터 생물학적으로 효과적인 양으로 하나 이상의 보조인자를 제공하기 때문에 특히 유용할 수 있다. 또한, 제어 방출형 제형은 높은 투여량의 보조인자가 안전하게 투여되게 하여, 표시의 다양성을 위한 이들의 이용성을 다시금 증가시킨다.
본원에 제공된 제어 방출형 투약 형태를 사용하여, 하나 이상의 보조인자는, 동량의 보조인자의 속방형 제형에 대해 관찰된 것보다 느린 속도로 이의 투약 형태로 방출될 수 있다. 일부 구현예에서, 제어 방출형 제형에 대한, 투여로부터 최대 농도까지의 정의된 기간에 걸친 농도에 있어서의 변화로서 측정된 생물학적 샘플에서의 변화율은 속방형 제형의 비율의 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만이다. 또한 일부 구현예에서, 시간에 걸친 농도에서의 변화율은 속방형 제형에 대한 비율의 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만이다.
일부 구현예에서, 시간에 걸친 농도의 변화율은 상대적 비례 방식으로 최대 농도까지 시간을 증가시킴으로써 감소된다. 예를 들어, 최대 농도까지의 시간에 있어서의 2 배 증가는 농도에서의 변화율을 대략 2 의 비로 감소시킬 수 있다. 그 결과로서, 하나 이상의 보조인자가 제공될 수 있어, 이는 속방형 투약 형태에 대해 유의하게 감소되는 비율로 그 최대 농도에 도달한다. 본 발명의 조성물은 24 시간, 16 시간, 8 시간, 4 시간, 2 시간 또는 1 시간 이상으로 최대 농도에서의 이동이 제공되도록 제형화될 수 있다. 농도에서의 변화율에 있어서의 연관된 감소는 약 0.05, 0.10, 0.25, 0.5 또는 0.8 이상의 비에 의한 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 이는 하나 이상의 보조인자의 약 30%, 50%, 75%, 90% 또는 95% 미만을 이러한 투여 1 시간 내에 순환계 내로 방출함으로써 이루어진다.
임의로는, 제어 방출형 제형은 동일한 보조 인자의 동일한 투약의 속방형 제형에 대한 기울기의 75%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 초기 (예를 들어, 투여 2 시간 후에서 투여 4 시간 후까지) 기울기를 갖는 혈장 농도 곡선을 나타낸다.
일부 구현예에서, 용해 연구에서 측정된 바와 같은 보조인자의 방출률은 최초 1, 2, 4, 6, 8, 10 또는 12 시간에 걸친 동일한 보조인자의 속방형 제형에 대한 비율의 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만이다.
본원에서 제공된 제어 방출형 제형은 다양한 포맷을 차용할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 액체 투약 형태 (예를 들어 현탁액 또는 슬러리) 를 포함하는 경구 투약 형태, 및 경구 고체 투약 형태 (예를 들어 정제 또는 벌크 분말), 예컨대 비제한적으로, 본원에 기재된 것들이다.
본원에 개시된 제형의 제어 방출형 정제는 매트릭스, 저장소 또는 삼투 시스템의 것일 수 있다. 세 가지 시스템 중 어떠한 것도 적합하지만, 저장소나 삼투 시스템은, 개인의 유전적 구성에 따라, 상대적으로 큰 덩어리를 캡슐에 넣기 위한, 예컨대 대량의 단일 보조인자의 포함을 위한, 또는 다수의 보조인자의 포함을 위한, 보다 최적의 수용력을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 점진 방출형 정제는 저장소 시스템을 기준으로 하는데, 여기서 하나 이상의 보조인자를 함유하는 코어는 수화시 하나 이상의 보조인자가 이를 통해 확산되게 하는 다공성 멤브레인 코팅에 의해 캡슐에 넣어진다. 유효 성분의 조합된 덩어리가 일반적으로 g 의 양이기 때문에, 효과적인 전달 시스템은 최적의 결과를 제공할 수 있다.
따라서, 정제 또는 알약이 또한 코팅되거나 다르게는 혼합공정화되어 연장된 작용의 이점을 부여하는 투약 형태가 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 정제 또는 알약은 내부 투약 성분 및 외부 투약 성분을 포함할 수 있는데, 외부 투약 성분은 내부 투약 성분에 대한 외피의 형태이다. 두 성분은, 위에서의 붕해에 저항하며 내부 성분이 십이지장 내로 온전히 통과하거나 방출에 있어서 지연되도록 역할하는 장용층 (enteric layer) 에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용층 또는 코팅에 대해 사용될 수 있으며 상기 물질은 많은 중합산 및 중합산과 쉘락, 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질과의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 보조인자를 포함하는 제형은 상이한 속도 또는 상이한 시간에서 방출되는 상이한 보조인자를 가질 수 있다. 예를 들어, 장용층 사이에 배치된 보조인자의 추가적인 층이 존재할 수 있다.
서방형 정제 제조 방법은 당업계에 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 2006/051416 및 2007/0065512, 또는 본원에 개시된 다른 참고문헌 참조). 미국 특허 제 4,606,909 호, 제 4,769,027 호, 제 4,897,268 호 및 제 5,395,626 호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 하나 이상의 보조인자의 서방형 제형을 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제형은 OROS® 기술, 예컨대 미국 특허 제 6,919,373 호, 제 6,923,800 호, 제 6,929,803 호 및 제 6,939,556 호에 기재된 것과 같은 기술을 사용하여 제조된다. 다른 방법, 예컨대 미국 특허 제 6,797,283 호, 제 6,764,697 호 및 제 6,635,268 호에서 기재된 것과 같은 방법을 또한 사용하여 본원에 개시된 제형을 제조할 수 있다.
더욱이, 본원에 개시된 제형의 제조 방법은 또한 적합하고 원하는 맛, 질감 또는 점도를 갖도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 상기 제형은 작용제 예컨대 착향료, 착색제를 포함할 수 있으며, 다른 것들이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호 콜로이드성 접착제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올이 있다.
일부 구현예에서, 개인의 유전적 구성에 의해 결정되는 바와 같은 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형은 식품, 식품 첨가제 또는 음료와 같은 소비를 위한 적합하고 원하는 맛, 질감 및 점도를 갖도록 제형화될 수 있다. 임의의 적합한 식품 담체가 본 식품 조성물에 사용될 수 있다. 본 발명의 식품 담체는 실제로 임의의 식료품을 포함한다. 이러한 식품 담체의 예는 식품 바 (그래놀라 바, 단백질 바, 캔디 바 등), 시리얼 제품 (오트밀, 조식용 시리얼, 그래놀라 등), 제과 제품 (빵, 도넛, 크래커, 베이글, 패스트리, 케이크 등), 음료 (우유-기재 음료, 스포츠 드링크, 과일 주스, 알코올성 음료, 병 생수), 파스타, 곡물 (쌀, 옥수수, 귀리, 호밀, 밀, 곡분 등), 난제품, 스낵 (캔디, 칩, 껌, 초콜렛 등), 고기, 과일 및 채소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 구현예에서, 본원에서 이용되는 식품 담체는, 하나 이상의 보조인자에 존재하는 경우 원치 않는 맛 (예를 들어, 쓴 맛) 을 차폐할 수 있다. 필요한 경우, 본원에 표시되는 식품 조성물은 하나 이상의 보조인자의 경우보다 더 바람직한 질감 및 아로마를 나타낸다.
다른 구현예에서, 고체 식품 담체는 식사 대체물, 예컨대 보충된 스낵 바, 파스타, 빵 등의 형태로 본 식품 조성물을 수득하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 반고체 식품 담체는 껌, 말랑한 캔디 또는 스낵 등의 형태로 본 식품 조성물을 수득하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 음료의 형태와 같은 액체 식품 담체, 예컨대 보충된 주스, 커피, 차, 소다, 가향수 (flavored water) 등이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 음료는 제형 뿐 아니라 액체 성분, 예컨대 다양한 데오도란트 또는 천연 탄수화물 (통상적인 음료에 존재함) 를 포함할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 단당류 예컨대 글루코오스 및 프룩토오스; 이당류 예컨대 말토오스 및 수크로오스; 통상적인 당류 예컨대 덱스트린 및 시클로덱스트린; 및 당 알코올 예컨대 자일리톨 및 에리트리톨을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 천연 데오도란트 예컨대 타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A (levaudioside A), 글리시리진 및 합성 데오도란트 예컨대 사카린, 아스파탐 등이 또한 사용될 수 있다. 작용제 예컨대 착향료, 착색제 및 기타의 것들이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호 콜로이드성 접착제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올 또는 탄화제가 또한 사용될 수 있다. 과일 및 채소가 또한 본원에 토의된 제형을 포함하는 식품 또는 음료 제조에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 제형이 또한 개인에게, 또는 개인의 유전적 구성에 대한 보고, 투약량에 대한 지시 및 제형의 투여, 개인에 대한 생활방식 계획 (예컨대 권장된 운동 또는 식습관) 또는 유전적 변이체에 대한 정보 및 보조인자-의존적 효소 결핍 및 보조인자 구제가능 병상과의 상관관계와 함께 개인의 의료 서비스 (health care) 에 제공될 수 있다.
비즈니스 방법
또한 본원에서는, 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 검출함으로써 개인의 유전적 구성을 결정하고, 보조인자 의존적 효소 결핍을 측정하고, 유전적 구성, 보조인자 의존적 효소 결핍, 또는 둘 모두를 개인 또는 그의 대리인에게 보고하는 서비스를 제공하는 비즈니스 방법이 개시된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "그의 대리인" 은 개인의 보호자, 건강관리 운영자 (healthcare manager), 관리인 (예를 들어 의사, 간호사, 의료 보조인 등), 약사, 부모, 변호사, 의사, 회계사일 수 있다.
또한 본원에서는, 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 측정함으로써 개인의 유전적 구성을 결정하고, 개인용 제형에 대한 하나 이상의 보조인자를 선택하고, 유전적 구성, 하나 이상의 보조인자의 제형, 또는 둘 모두를 개인 또는 그의 건강관리 운영자에게 보고하는 서비스를 제공하는 비즈니스 방법이 제공된다. 상기 비즈니스 방법은 또한 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 검출함으로써 개인의 유전적 구성을 결정하고, 개인용 제형에 대한 하나 이상의 보조인자의 양을 결정하고, 유전적 구성, 하나 이상의 보조인자 양을 갖는 제형, 또는 둘 모두를 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 보고하는 서비스를 제공하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 것들과 같은 하나 이상의 개인적 특징을, 선택 또는 측정 단계에서, 보조인자 의존적 효소 결핍, 보조인자 구제가능 병상, 제형에 대해 선택된 하나 이상의 보조인자, 또는 제형에 대한 하나 이상의 보조인자 양을 결정하는데 포함시키는 것을 추가로 포함한다.
하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재와 같은 정보; 보조인자 의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 같은 대사 병상의 위험성, 소인, 진단 또는 예후; 개인의 유전적 구성을 기준으로 제형에 대해 선택된 보조인자(들); 제형에 대한 보조인자(들) 의 양; 투약 요법이, 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 서비스 또는 비즈니스로서 제공될 수 있다. 건강관리 운영자는 관리인, 의사, 간호사, 유전자 상담사 또는 또다른 건강관리 전문가일 수 있다. 일부 구현예에서, 건강관리 운영자는 건강관리 관련 회사, 예컨대 제약 회사 또는 기능 식품 회사이다. 건강관리 운영자는 상기 제형을 개인에게 투여하고, 개인을 모니터링하거나, 둘 모두를 할 수 있다.
예를 들어, 개인은 투여된 그의 유전적 구성을 기준으로 선택된 다수의 보조인자를 포함하는 제형을 가질 수 있다. 건강관리 운영자는 개인을 관찰하고 제형 내의 보조인자 양이 개인에게 적합하거나 변경되어야 하는지 여부를 결정할 수 있다. 생성된 데이터 및 정보는 하나 이상의 보조인자의 양을 개인에서의 하나 이상의 유전적 변이체와 관련시키는데 사용될 수 있으며, 추후 보조인자의 양을 다른 개인에서의 유전적 변이체와 관련시키는데 사용하기 위해 데이터베이스 또는 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된다. 상기 정보는 기능 식품 회사에 판매되거나 사용될 수 있다.
또다른 구현예에서, 건강관리 운영자는 제약 회사일 수 있다. 건강관리 운영자는 하나 이상의 보조인자의 제형 및 하나 이상의 보조인자의 양 (개인의 유전적 구성에 의해 선택된 바와 같음) 이 치료의 효능을 증강시킬 수 있는지를 측정하는데 관심을 가질 수 있다. 그로서, 제약 회사는 개인에게 투여되는 상이한 제형 뿐 아니라 치료제 및 이의 영향을 모니터링하는 임상 시험을 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 개인의 유전적 구성에 의해 선택된 바와 같은 하나 이상의 보조인자의 제형을 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 제공하는 것을 추가로 포함한다. 상기 제형은 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 바와 같은 하나 이상의 보조인자의 양을 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 보조인자, 하나 이상의 보조인자 양, 또는 둘 모두의 선택은 상기 토의된 바와 같은 개인의 하나 이상의 개인적 특징을 또한 기준으로 할 수 있다. 상기 제형은 본원에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 상기 제형은 개인의 유전적 구성의 분석을 수행하는 동일하거나 상이한 단체에 의해 제조될 수 있다.
하나 이상의 단체, 예컨대 동일 또는 상이한 단체(들) 는 개인으로부터 생물학적 샘플을 수집하거나 수득하고, 상기 생물학적 샘플로부터 하나 이상의 유전적 변이체를 검출하고, 하나 이상의 유전적 변이체를 기준으로 보조인자 의존적 효소 결핍을 측정하고, 개인의 유전적 구성을 기준으로 개인용 제형에 대한 하나 이상의 보조인자를 결정하고, 개인의 유전적 구성을 기준으로 개인용 제형에 대한 하나 이상의 보조인자 양을 결정하고, 임의의 상술한 단계의 결과 (예컨대 유전적 변이체의 존재 또는 부재, 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상에 대한 위험성 또는 소인, 제형) 를 보고하고, 상기 제형을 제조하거나, 상기 제형을 제공할 수 있다.
하나 이상의 단체는 이들이 제공하는 과정 또는 서비스 각각에 대한, 또는 이들이 제공하는 서비스 또는 과정의 부분집합에 대한 수수료를 부과할 수 있다. 서비스 수준을 기준으로 상이한 수준의 수수료 또는 요금이 있을 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 유전적 변이체를 검출하는 단체는 더 높은 수수료에 대해 더 많은 유전적 변이체를 검출하는 서비스를 제공할 수 있다.
또한 본원에서는, 보조인자 구제가능 병상을 갖는 개인을 분류하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 개인의 유전적 구성을 기준으로, 개인은 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 저위험성에서 고위험성 범위의 규모 내에서 분류될 수 있다. 분류 시스템은 1 에서 5 범위와 같은 수치 기입 시스템일 수 있는데, 여기서 1 은 저위험성을 나타내고 5 는 고위험성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 상기 분류 시스템은 서술적 또는 알파벳순 시스템이다. 예를 들어, 상기 시스템은 개인을 보조인자-의존적 효소 결핍에 대해 "저위험성", "중간 위험성" 또는 "고위험성" 으로서 분류할 수 있다. 대안적으로는, 상기 시스템은 A 에서 E 와 같은 알파벳순 시스템을 기준으로 개인을 분류할 수 있는데, 여기서 "A" 평가는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍에 대해 저위험성을 갖는다는 것을 나타내며 "E" 평가는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍에 대해 고위험성을 갖는다는 것을 나타낸다.
분류 시스템은 또한 상이한 색, 기호 또는 기타 시각 자료로 표시될 수 있다. 예를 들어, 녹색, 오렌지색 및 적색의 색 시스템 (color system) 이 사용될 수 있는데, 녹색은 저위험성의 보조인자-의존적 효소 결핍을 나타내는데 사용되고, 오렌지색은 중간 위험성의 보조인자-의존적 효소 결핍을 나타내는데 사용되고, 적색은 고위험성의 보조인자-의존적 효소 결핍을 나타내는데 사용된다. 다양한 분류 수단이 조합될 수 있다. 예를 들어, 상기 분류 시스템은 색 모식도와 서술적 모식도를 조합시킬 수 있다. 분류는 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 제시되는 레포트로 제공될 수 있다. 분류는 개인의 유전적 구성으로부터의 다른 결과를 보고하는 동일 또는 상이한 단체에 의해 제공될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 하나 이상의 레포트를 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 레포트는 개인의 유전적 구성, 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재와 같은 정보; 개인용 제형에 대한 하나 이상의 보조인자 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 결정하는 것에 포함된 개인의 개인적 특징; 개인의 유전적 구성을 기준으로 하는 보조인자 의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 같은 대사 병상의 위험성, 소인, 진단 또는 예후; 개인용 제형에 대해 선택된 하나 이상의 보조인자; 또는 개인용 제형에 대해 결정된 하나 이상의 보조인자의 양을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 방법은 또한 개인에 대한 하나 이상의 레포트로 개인화된 영양 또는 식이 계획을 제공할 수 있다.
레포트는 웹사이트에 의해 접근가능한 바와 같은 디지털 포맷으로 제공될 수 있다. 상기 레포트는 또한 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 저장된 디지털 포맷으로 제공될 수 있다. 상기 레포트는 또한 종이 형태로 제공될 수 있다. 상기 레포트는 네트워크를 거쳐 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 전송될 수 있다. 일부 구현예에서, 업데이트된 레포트가 생성되며 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 제공된다. 예를 들어, 새로운 유전적 변이체 및 상관관계가 과학적 조사, 출판 문헌 또는 기타 원천을 통해 수득될 수 있다. 새로운 유전적 변이체 및 상관관계는 보조인자-의존적 효소 결핍과 연관되는 것으로 이전에 알려져 있지 않은 유전적 변이체일 수 있다. 대안적으로는, 유전적 변이체는 보조인자-의존적 효소 결핍과 연관되는 것으로 알려져 있을 수 있으나, 상관관계는 이전에 발견된 것보다 더 약하거나 강할 수 있다. 또다른 구현예에서, 유전적 변이체가 알려져 있을 수 있으며 보조인자-의존적 효소 결핍과 이전에 연관되어 있을 수 있으나, 새로운 결과는 상이한 보조인자-의존적 효소 결핍과의 새로운 연관성을 나타낸다.
새로운 유전적 변이체 및 상관관계는, 개인에 대해 생성된 본래의 제형에 비해 개인에 대한 제형에서의 상이한 보조인자 또는 보조인자의 조합과 같은 새로운 결과를 생성하는데 사용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 개인에 대한 제형에서의 상이한 양의 하나 이상의 보조인자는 새로운 유전적 변이체로 인한 것이다.
또다른 구현예에서, 업데이트된 레포트가 개인의 업데이트된 개인적 특징으로 기준으로 생성된다. 예를 들어, 초기 레포트가 임신한 여성에 대해 생성되었다. 출산 후, 개인은 더 이상 임신하지 않은 여성에게 변화된 하나 이상의 보조인자의 권장된 제형이 주어진 것을 나타내는, 업데이트된 레포트를 가질 수 있다. 또다른 구현예에서, 초기 레포트가 최초로 생성된 때와 비교하여, 개인은 식이 계획에서의 새로운 의학적 상태 변화를 발견하는 것을 기준으로 업데이트된 레포트를 가질 수 있다. 업데이트된 레포트는 업데이트된 제형, 예컨대 상이한 보조인자 또는 보조인자의 상이한 양을 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템
본 발명의 또다른 양상에서, 본원에서 개시된 방법 중 하나 이상을 수행하기 위한 컴퓨터 시스템이 제공된다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 컴퓨터 시스템과 같은 대표적 논리 장치 (또는 디지털 장치) 에 의해 수행될 수 있다. 컴퓨터 시스템의 예를 도 7 에 표현하였는데, 이는 개인의 생물학적 샘플의 분석으로부터 생성된 데이터를 수신하고 저장할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템은 표 A-X 에 열거한 것들과 같은, 생물학적 샘플에서의 하나 이상의 유전적 변이체의 부재 또는 존재와 같은 데이터를 저장할 수 있다. 또한, 대표적 장치 또는 컴퓨터 시스템은 또한 데이터를 분석하여 개인에 대한 하나 이상의 보조인자의 제형을 결정하고, 개인에 대한 제형에서의 하나 이상의 보조인자 양을 결정하고, 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성 또는 소인을 측정하고, 보조인자-구제가능 병상의 위험성 또는 소인을 측정하고, 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자-구제가능 병상에 대한 상이한 위험성 카테고리에서 개인을 분류하고, 개인에 대한 개인화된 생활방식 권장 계획을 결정하고, 컴퓨터에 의해 결정된 제형을 취하기 위한 지시사항을 생성하거나, 상기 결정 (측정) 또는 분석 중 임의의 것을 기준으로 레포트를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 컴퓨터 시스템을 사용하여 상술한 과정 중 하나 이상을 수행할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템의 네트워크를 사용할 수 있는데, 상기 컴퓨터 시스템의 네트워크는 동일한 장소 또는 상이한 장소에 있을 수 있다. 상기 컴퓨터 시스템이 연결되어, 하나의 컴퓨터 시스템으로부터의 결과, 데이터 또는 정보가 하나 이상의 다른 컴퓨터 시스템으로 전송되고, 수신되고/되거나 출력될 수 있다. 전송은 네트워크 연결, 와이어리스 연결 또는 인터넷 연결일 수 있다. 이러한 연결은 월드 와이드 웹 (World Wide Web) 을 거친 통신을 위해 제공될 수 있다. 본 발명에 관련된 데이터는 이러한 네트워크를 거쳐 전송될 수 있다.
도 7 은 대표적 컴퓨터 시스템 (또는 디지털 장치) 를 나타내는데, 여기서 컴퓨터 시스템 (700) 은 고정 매체 (712) 를 갖는 서버 (709) 에 임의로 연결될 수 있는, 네트워크 포트 (705) 및/또는 매체 (711) 로부터의 지시를 판독할 수 있는 논리 기구로서 이해될 수 있다. 도 7 에 나타낸 시스템은 CPU (701), 디스크 드라이브 (703), 임의의 입력 장치 예컨대 키보드 (715) 및/또는 마우스 (716) 및 임의의 모니터 (707) 을 포함한다. 데이터 통신은 로컬 또는 원격 장소에서 서버 (709) 에 대한 표시된 통신 매체를 통해 이루어질 수 있다.
통신 매체는 임의 수단의 전송 및/또는 수신 데이터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 연결, 와이어리스 연결 또는 인터넷 연결일 수 있다. 이러한 연결은 월드 와이드 웹을 거친 통신을 위해 제공될 수 있다. 본 발명과 관련되는 데이터가 수신자 (722) 에 의한 접수 및/또는 검토를 위해 이러한 네트워크 또는 연결을 거쳐 전송될 수 있는 것으로 상상된다. 수신자 (722) 는 개인 또는 건강관리 운영자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구현예에서, 컴퓨터 판독가능 매체는 결과의 전송에 적합한 매체를 포함한다. 상기 매체는 제형, 보조인자 구제가능 병상에 대한 위험성 또는 소인, 또는 개인에 대한 개인화된 생활방식 권장 계획과 관련되는 결과 (본원에 기재된 방법을 사용하여 유도됨) 를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템은, 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성, 소인 또는 진단과 관련시킴으로써 개인의 생물학적 샘플로부터 수득한 유전적 데이터를 분석할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템은 대사 경로에서의 유전자의 하나 이상의 유전적 변이체를 보조인자-의존적 효소 결핍, 또는 보조인자-구제가능 대사 병상과 관련시키기 위한 코드를 가질 수 있다. 컴퓨터 시스템은 유전적 변이체 및 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자-구제가능 대사 병상에 대한 이의 연관 또는 상관관계의 데이터베이스, 예컨대 개인이 특정 유전적 변이체를 갖는 경우 결핍 또는 병상을 갖는 것의 오즈비 (odds ratio) 또는 상대 위험도를 가질 수 있다. 컴퓨터 시스템은 생물학적 샘플로부터 받은 데이터를 비교하고 이를 유전적 변이체 및 상관관계의 데이터베이스와 비교함으로써 개인의 위험성 또는 소인, 또는 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자-구제가능 대사 병상의 예후를 측정할 수 있다.
컴퓨터 시스템을 또한 사용하여, 개인의 생물학적 샘플의 분석으로부터 생성된 데이터를 기준으로 하는 것과 같은 개인의 유전적 구성을 기준으로 제형에 대한 하나 이상의 보조인자를 선택할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템은 유전적 변이체를 갖거나 갖지 않는 개인에 대한 보조인자 제형을 결정하기 위한 코드를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템을 또한 사용하여, 개인의 유전적 구성을 기준으로 제형에 대한 하나 이상의 보조인자의 양을 결정할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템은 특정 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 기준으로 개인에 대한 제형에서의 하나 이상의 보조인자의 양을 결정하기 위한 코드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 다수의 유전적 변이체를 분석하고 상관관계를 보일 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템은 개인의 위험성 또는 소인, 또는 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자-구제가능 대사 병상의 예후를 측정하기 위해 다수의 유전적 변이체를 관련시키기 위한 코드를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 또한 다수의 유전적 변이체를 개인에 대한 제형에서의 하나 이상의 보조인자의 양과 관련시키기 위한 코드를 포함할 수 있다. 또한, 컴퓨터 시스템은 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자-구제가능 대사 병상의 위험성 또는 소인; 개인용 제형 내에 존재해야 하는 하나 이상의 보조인자; 또는 개인용 제형에 대한 하나 이상의 보조인자의 양을 결정하는 것에 개인적 특징을 추가로 포함시킬 수 있다.
컴퓨터 시스템은 또한 레포트를 생성하고, 레포트를 출력하고, 레포트를 전송하기 위한 코드를 포함할 수 있다. 레포트의 전송은 보안 네트워크와 같은 네트워크를 거친 것일 수 있다. 유사하게, 보안 네트워크와 같은 네트워크를 거쳐 데이트를 전송함으로써 개인의 생물학적 샘플의 분석으로부터 수득한 데이터가 수신되고 송신될 수 있다. 일부 구현예에서, 레포트는 인터넷을 통해 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 전달된다. 레포트는 고유한 식별자 코드를 사용하여 전송될 수 있다. 레포트는 컴퓨터, 예컨대 가정용 컴퓨터, 작업용 컴퓨터 또는 개인 디지털 보조물 또는 개인 디지털 장치, 예컨대 스마트폰, 예컨대 Blackberry®, iPhone®, 또는 이용가능한 임의의 기타 장치에 이동될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 코드는 컴퓨터 시스템의 일부를 형성할 수 있는 컴퓨터 판독가능 매체 상에 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 컴퓨터 시스템은 데이터 처리 장치 상에 제 1 데이터세트를 포함할 수 있는데, 상기 제 1 데이터세트는 개인의 유전적 변이체의 존재를 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성과 관련시키는 정보를 포함한다. 컴퓨터 시스템은 데이터 처리 장치 상에 제 2 데이터세트를 추가로 포함하는데, 상기 제 2 데이터세트는 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상을 하나 이상의 보조인자의 제형과 매치시키는 정보를 포함한다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 다수의 유전적 변이체가 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성과 상관관계가 있다는 정보를 갖는 데이터세트를 포함한다. 또한, 컴퓨터 시스템은 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상을 하나 이상의 보조인자의 제형과 매치시키는 것에 개인적 특징을 추가로 포함시킬 수 있다. 하나 이상의 개인적 특징에 대한 정보는 본원에서 기재된 컴퓨터 시스템의 데이터 처리 장치 상에 또다른 데이터세트를 형성할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 또한 하나 이상의 유전적 변이체, 하나 이상의 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상, 하나 이상의 보조인자의 하나 이상 제형, 또는 개인의 하나 이상의 개인적 특징과 상관관계가 있는 생활방식 권장사항에 대한 추가적인 데이터세트를 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 제 1 데이터세트는 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 상관관계되는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 유전적 변이체에 관련되는 정보를 포함한다. 예를 들어, 상기 유전자는 티아민 대사 경로, 리보플라빈 대사 경로, 비타민 B6 대사 경로, 니코티네이트 및 니코틴아미드 대사 경로, 판토테네이트 및 CoA 생합성 경로, 비오틴 대사 경로, 리포 대사 경로, 폴레이트/호모시스테인 대사 경로, 레티놀 대사 경로, 포르피린 대사 경로, 유비퀴논 및 기타 테르페노이드-퀴논 생합성 경로에 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 유전적 변이체는 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (칼시페롤), 비타민 E, 비타민 K (필로퀴논), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B9 (폴레이트/엽산), 비타민 B12 (토코페롤), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B5 (판토텐산) 또는 콜린을 대사하기 위한 경로에서의 유전자의 것일 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 유전자는 폴레이트 경로로부터 선택되는 유전자, 예컨대 AHCY, AHCYL1, AHCYL2, ALDH1L1, ALDHL2, AMT, ATIC, BHMT1, BHMT2, CBS, CTH, DHFR, DMGDH, FPGS, FTCD, GART, GGH, MAT1A, MAT2A, MTFMT, MTHFD1, MTHFD2, MTHFR, MTHFS, MTR, MTRR, NAALAD2, SARDH, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 일 수 있다. 제 1 데이터세트는 다수의 유전적 변이체, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 또는 100 개의 유전적 변이체를 포함할 수 있다. 유전적 변이체는 동일한 유전자, 동일한 대사 경로에서의 상이한 유전자, 또는 상이한 대사 경로에서의 상이한 유전자의 것일 수 있다. SNP 와 같은 유전적 변이체는 MTHFR, ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A, GART, AHCY, AMT, CBS, CTH, DHFR, FPGS, MTHFD1, MTHFD2, MTR, SHMT1, SHMT2 또는 TYMS 의 유전적 변이체에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 유전적 변이체는 표 A- X 에서 선택될 수 있다.
컴퓨터 시스템은 샘플에서 확인된 하나 이상의 유전적 변이체에 대한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성, 소인 또는 이환성 (susceptibility) 을 부여하기 위해 유전적 변이체에 대한 정보를 포함하는 제 1 데이터세트를 사용한 후, 보조인자, 다수의 보조인자, 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 포함하는 제형을 부여하기 위해 제 2 데이터세트를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 제 3 데이터세트와 같은 또다른 데이터세트를 사용할 수 있다.
예를 들어, 컴퓨터 시스템은 개인적 특징에 대한 정보를 포함하는 제 3 데이터세트를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은, 제 1 데이터세트를 사용하여 수득한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성, 소인 또는 이환성을 변형시키고/시키거나, 제 2 데이터세트를 사용한 후 수득한 결과를 변형시킴으로써, 보조인자, 다수의 보조인자, 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 포함하는 제형을 부여하기 위해 개인적 특징의 제 3 데이터세트를 사용할 수 있다.
예를 들어, 개인은 고위험성의 보조인자 구제가능 병상을 표시하는 유전적 변이체를 갖는다. 개인은 또한 높은 섭취량의 보조인자를 갖는다. 제 1 데이터세트를 사용하여, 컴퓨터 시스템은 개인이 고위험성의 보조인자 구제가능 병상을 갖는지 측정하는데 있어서의 결과를 생성하지만, 개인적 특징을 갖는 제 3 데이터세트를 사용하여, 위험성이 변형되는데, 이는 개인의 식이요법이 높은 섭취량의 보조인자를 갖기 때문이다. 또다른 구현예에서, 제 2 데이터세트의 결과는 높은 양의 보조인자의 제형을 표시하지만, 개인이 높은 섭취량의 보조인자를 갖는 경우 제 3 데이터세트를 고려하여, 상기 제형은 낮은 양의 보조인자로 변형될 것이다.
또다른 구현예에서, 제 3 데이터세트는 개인에 대한 개인화된 생활방식 권장사항을 제공할 수 있는 생활방식 권장사항을 포함할 수 있다. 개인화된 생활방식 권장사항은 영양 계획, 식이 계획 또는 운동 계획을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 개인화된 생활방식 권장사항 계획은 특정 비타민 또는 미네랄과 같은 다양한 보조인자의 권장 최소량 및/또는 최대량, 어떤 식품 또는 음료가 개인의 식이요법에 포함되어야 하는지, 어떤 유형의 식품을 피해야 하는지, 그리고 어떤 유형의 운동을 포함시켜야 하는지를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 컴퓨터 시스템은 제 1 데이터세트를 사용하는 컴퓨터 시스템에 의해 결정된 바와 같은 생활방식 권장사항을 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 매치시키기 위해 생활방식 권장사항의 제 3 데이터세트를 사용할 수 있다. 생활방식 권장사항의 제 3 데이터세트가 또한 사용되어, 제 2 데이터세트 사용 후 수득한, 보조인자, 다수의 보조인자, 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 포함하는 제형을 기준으로 개인화된 권장사항을 제공할 수 있다.
예를 들어, 개인은 고위험성의 보조인자 구제가능 병상을 표시하는 유전적 변이체를 갖는다. 제 1 데이터세트를 사용하여, 컴퓨터 시스템은 개인이 고위험성의 보조인자 구제가능 병상을 갖는다는 것을 결정하는데 있어서의 결과를 생성하며, 생활방식 권장사항을 갖는 제 3 데이터세트를 사용하여, 하나 이상의 생활방식 권장사항을 보조인자 구제가능 병상에 대한 개인의 위험성과 매치시킨다 (예컨대 보조인자에서 높은 식품을 포함하는 개인에 대한 식이 계획을 제공함). 또다른 구현예에서, 제 2 데이터세트의 결과는 높은 양의 보조인자의 제형을 표시하며, 개인에 의해 섭취되는 제형을 기준으로, 개인의 제형 섭취를 보완하는 식이 계획과 같은 하나 이상의 생활방식 권장사항이 생성된다.
또다른 구현예에서, 본원에 기재된 컴퓨터 시스템은 4 개 이상의 데이터세트를 사용하는데, 예를 들어 샘플에서 확인된 하나 이상의 유전적 변이체에 대한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성, 소인 또는 이환성을 부여하기 위한 유전적 변이체에 대한 정보를 포함하는 제 1 데이터세트; 보조인자, 다수의 보조인자, 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 포함하는 제형을 부여하기 위한 제 2 데이터세트; 제 1 데이터세트를 사용하여 수득한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성, 소인 또는 이환성, 또는 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형을 변형시키기 위한 개인적 특징의 제 3 데이터세트; 및 개인화된 생활방식 권장사항을 제공하기 위한 제 4 데이터세트가 있다.
한 구현예에서, 4 개 이상의 데이터세트를 사용하는 컴퓨터 시스템은 샘플에서 확인된 하나 이상의 유전적 변이체에 대한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성, 소인 또는 이환성을 부여하기 위해 유전적 변이체에 대한 정보를 포함하는 제 1 데이터세트를 사용한다. 컴퓨터 시스템은 보조인자, 다수의 보조인자, 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 포함하는 제형을 부여하기 위해 제 2 데이터세트를 사용한다. 개인적 특징의 제 3 데이터세트를 사용하여, 제 1 데이터세트를 사용하여 수득한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 위험성, 소인 또는 이환성 및/또는 제 2 데이터세트를 사용하여 수득한 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형을 변형시킨다. 생활방식 권장사항의 제 4 데이터세트를 사용하여, 하나 이상의 생활방식 권장사항을 제 3 데이터세트를 사용하여 수득한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 변형된 위험성 또는 이환성 및/또는 제 3 데이터세트를 사용하여 수득한 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형과 매치시킴으로써 하나 이상의 생활방식 권장사항을 생성시킨다.
예를 들어, 개인은 고위험성의 보조인자 구제가능 병상을 표시하는 유전적 변이체를 갖는다. 개인은 또한 높은 섭취량의 보조인자를 갖는다. 제 1 데이터세트를 사용하여, 컴퓨터 시스템은 개인이 고위험성의 보조인자 구제가능 병상을 갖는지 측정하는데 있어서의 결과를 생성하지만, 개인적 특징을 갖는 제 3 데이터세트를 사용하여, 위험성이 변형되는데, 이는 개인의 식이요법이 높은 섭취량의 보조인자를 갖기 때문이다. 제 2 데이터세트의 결과는 높은 양의 보조인자의 제형을 표시하지만, 개인이 높은 섭취량의 보조인자를 갖는 경우 개인적 특징의 제 3 데이터세트를 고려하여, 상기 제형은 낮은 양의 보조인자로 변형될 것이다. 생활방식 권장사항의 제 4 데이터세트는 하나 이상의 생활방식 권장사항을 제 3 데이터세트의 사용으로 기인하는 보조인자 구제가능 병상과 매치시키고/시키거나 하나 이상의 생활방식 권장사항을 제 3 데이터세트의 사용으로 기인하는 보조인자의 변형된 제형과 매치시킨다.
다른 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 개인을 분류하기 위한 정보를 포함하는 데이터세트, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 분류 모식도를 추가로 포함한다. 분류 데이터세트를 본원에 기재된 임의의 데이터세트와 조합으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 제 1 데이터세트를 사용하여, 컴퓨터 시스템은 개인이 고위험성의 보조인자 구제가능 병상을 갖는 것을 측정하는데 있어서의 결과를 생성시킬 수 있다. 개인을 분류하는 것에 대한 정보를 포함하는 데이터세트를 사용하여, 분류 카테고리가 제 1 데이터세트를 사용하여 수득한 위험성과 매치된다. 또다른 구현예에서, 제 1 데이터세트를 사용하여 수득한 위험성은 개인적 특징을 갖는 데이터세트를 사용하여 변형된다. 개인을 분류하는 것에 대한 정보를 포함하는 것에 대한 데이터세트를 사용하여, 분류 카테고리가 개인적 특징의 데이터세트를 사용하여 수득한 변형된 위험성과 매치된다. 또다른 구현예에서, 개인을 분류하기 위해 데이터세트를 사용한 후, 하나 이상의 보조인자의 제형, 또는 하나 이상의 보조인자의 양에 대한 정보를 포함하는 데이터세트를 사용하여, 개인의 분류를 기준으로 하나 이상의 보조인자 및/또는 하나 이상의 보조인자의 양을 매치시킬 수 있다. 또다른 구현예에서, 생활방식 권장사항을 포함하는 데이터세트를 사용하여, 개인의 분류를 기준으로 하나 이상의 생활방식 권장사항을 개인과 매치시킬 수 있다.
또한, 본원에 기재된 데이터세트 중 임의의 하나는 업데이트될 수 있다. 예를 들어, 유전적 변이체의 데이터세트 및 그의 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상에 대한 상관관계는 새로운 유전적 변이체로 업데이트될 수 있으며 상관관계는 과학적 조사, 출판 문헌 및 기타 원천을 통해 수득될 수 있다. 새로운 유전적 변이체 및 상관관계는 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 연관되는 것으로 이전에 알려져 있지 않은 신규한 유전적 변이체일 수 있다. 대안적으로는, 유전적 변이체는 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 연관되는 것으로 알려져 있을 수 있으나, 상관관계는 이전에 발견된 것보다 더 약하거나 강할 수 있다. 또다른 구현예에서, 유전적 변이체가 알려져 있을 수 있으며 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 이전에 연관되어 있을 수 있으나, 새로운 결과는 상이한 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과의 새로운 연관성을 나타낸다. 새로운 유전적 변이체 및 상관관계는 본원에서 기재된 제 1 데이터세트에서 업데이트될 수 있다.
또다른 예에서, 보조인자, 다수의 보조인자, 또는 하나 이상의 보조인자의 양을 포함하는 제형을 부여하는데 사용된 데이터세트는 새로운 보조인자, 상이한 보조인자, 또는 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 주어진 위험성 또는 소인에 대해 부여하는데 원래 사용된 바와 상이한 양의 보조인자로 업데이트될 수 있다.
개인적 특징의 데이터세트는 또한 개인의 새로운 또는 변형된 특징을 포함하거나 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상과 연관되는 것으로 이전에 알려져 있지 않은 개인적 특징으로 업데이트되도록 업데이트될 수 있거나, 상관관계는 이전에 발견된 것보다 더 약하거나 강할 수 있다. 데이터세트는 생활방식 권장사항에 대한 정보를 포함할 수 있으며, 개인의 분류는 또한 새로운 과학 조사, 출판 문헌 또는 기타 원천을 반영하도록 업데이트될 수 있다. 예를 들어, 생활방식 권장사항은 상이한 보조인자 구제가능 병상과 관련되거나 변경될 수 있다.
본원에 기재된 컴퓨터 시스템은 또한 하기 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 레포트를 생성시킬 수 있다: 개인의 유전적 구성, 예컨대 개인의 샘플로부터 유전적 변이체 존재 또는 부재; 보조인자-의존적 효소 결핍 또는 보조인자 구제가능 병상의 개인의 위험성; 개인의 유전적 구성을 기준으로 하나 이상의 보조인자를 포함하는 제형; 개인의 유전적 구성을 기준으로 제형에 대한 하나 이상의 보조인자의 양; 개인에 대한 제형 또는 보조인자 구제가능 병상 또는 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성을 측정하는 것을 고려한 개인의 개인적 특징; 하나 이상의 생활방식 권장사항 또는 개인화된 생활방식 권장사항 계획; 및 개인의 분류.
레포트는 웹사이트에 의해 접근가능한 바와 같은 디지털 포맷으로 제공될 수 있다. 레포트는 또한 컴퓨터 판독가능 매체 상에 저장된 디지털 포맷으로 제공될 수 있다. 레포트는 또한 종이 형태로 제공될 수 있다. 레포트는 네트워크를 거친 전송에 의한 바와 같이 컴퓨터에 의해, 하나 이상의 단체, 예컨대 개인, 개인의 건강관리 운영자, 또는 또다른 제 3 자, 예컨대 상기 제형을 제조할 수 있는 제조사에 보내질 수 있다. 상기 제형은 이후 개인 또는 개인의 관리인에게 배송되거나 판매될 수 있다. 일부 구현예에서, 업데이트된 레포트가 생성되며 개인 또는 개인의 건강관리 운영자에게 제공된다. 상기 레포트는 고유한 식별자 코드를 사용하여 전송될 수 있다. 레포트는 컴퓨터, 예컨대 가정용 컴퓨터, 작업용 컴퓨터 또는 개인 디지털 보조물 또는 개인 디지털 장치, 예컨대 스마트폰, 예컨대 Blackberry®, iPhone®, 또는 이용가능한 임의의 기타 장치에 이동될 수 있다.
표 A : MTHFR 변이체
Figure pct00004
Figure pct00005
표 B : ATIC 변이체
Figure pct00006
Figure pct00008
표 C : MTHFS 변이체
Figure pct00009
표 D : MAT1A 변이체
Figure pct00010
Figure pct00011
표 E : MAT2A 변이체
Figure pct00012
Figure pct00013
표 F : GART 변이체
Figure pct00014
Figure pct00015
표 G : AHCY 유전적 변이체
Figure pct00016
Figure pct00017
표 H : AMT 유전적 변이체
Figure pct00018
Figure pct00019
표 I : ATIC 유전적 변이체
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
표 J : CBS 유전적 변이체
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
표 K : CTH 유전적 변이체
Figure pct00026
Figure pct00027
표 L : DHFR 유전적 변이체
Figure pct00028
표 M : FPGS 유전적 변이체
Figure pct00030
표 N : GART 유전적 변이체
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
표 O : MAT1A 유전적 변이체
Figure pct00035
Figure pct00036
표 P : MAT2A 유전적 변이체
Figure pct00037
표 O : MTHFD1 유전적 변이체
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
표 R : MTHFD2 유전적 변이체
Figure pct00043
Figure pct00044
표 S : MTHFR 유전적 변이체
Figure pct00045
표 T : MTHFS 유전적 변이체
Figure pct00047
Figure pct00048
표 U : MTR 유전적 변이체
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
표 V : SHMT1 유전적 변이체
Figure pct00052
표 W : SHMT2 유전적 변이체
Figure pct00053
Figure pct00054
표 X : TYMS 유전적 변이체
Figure pct00055
Figure pct00056
본 발명의 바람직한 구현예를 본원에 나타내고 기재하였으나, 이러한 구현예가 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 많은 변동, 변화 및 대체가, 본 발명에서 벗어나지 않고 이제 당업자에게 발생할 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 개시물의 구현예에 대한 다양한 대안물이 본 발명을 실행하는데 있어서 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기의 청구항이 본 발명의 범주를 정의하며, 이들 청구항의 범주 내의 방법 및 구조 및 이의 등가물이 이에 따라 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1: 인간에서의 폴레이트- 구제성 MTHFR 효소 변이체의 출현율
저빈도 변이의 발생 정도 및 영향을 측정하고 비타민 치료의 현상을 탐색하기 위한, 대규모 집단으로부터의 폴레이트-구제가능 MTHFR 효소 변이체의 출현율. 500 명이 넘는 개인으로부터, 14 가지의 상이한 비-동의성 대체물이 확인되었고, 이 중 5 가지는 효소 기능이 손상되었다. 모든 유해한 대립형질이 적어도 다소 폴레이트 반응성이었으나, 5 개의 돌연변이 단백질 중 4 개는 세포내 폴레이트 수준을 증가시킴으로써 정상 수준으로 완전히 회복될 수 있었다.
방법
DNA 샘플 집단. DNA 샘플은 Coriell Institute Cell Repository (Camden, New Jersey, USA) 로부터의 것이었다.
MTHFR 엑손 서열분석. 11 개의 MTHFR 코딩 엑손을, Variant SeqR 제품 계열에서 시판되는 프라이머 쌍 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 을 사용하고 공급된 프로토콜에 따라 PCR 서열분석에 의해 상기 샘플에서 서열분석하였다. 서열분석된 엑손 부위는 mRNA 에 대한 NCBI MTHFR 참조 서열 (NM_005957) 및 656 개 아미노산의 상응하는 단백질 (NP 005958) 에 상응하였다. 서열분석 암플리콘 (amplicon) 및 프로브 정보는 하기의 표적 암플리콘에 대해 http://www.ncbi.nlm.nihcov/genome/probe 에서 이용가능하다:
엑손 1 (RSA000045684); 엑손 2 (RSA000045680); 엑손 3 (RSA000577249); 엑손 4 (RSA000045678); 엑손 5 (RSA000045676); 엑손 6 (RSA001308795); 엑손 7 (RSA001253193); 엑손 8 (RSA000045669); 엑손 9 (RSA000580767); 엑손 10 (RSA000580766); 엑손 11 (RSA000580765, RSA000027240). 코딩 부위에 걸친 엑손 11 의 부분만을 서열분석하였다. 염기 해독 (base-calling) 에서의 높은 신뢰도를 확실히 하기 위해서, 오직 고품질의 판독만을 분석을 위해 사용하였다 (표적 엑손에 걸친 부위에 대한 평균 QV 스코어 > 40; 모든 엑손은 이중가닥 판독에 의해 포함되었음). 이들 필터링 기준을 근거로, 성공율은 각 엑손에 대해 89.9% 내지 95% 였다 (표 I 참조). SeqScape software suite (Applied Biosystems) 를 사용하여 모든 서열 정보를 분석하였다. 품질 대조군 측정으로서, 염기 해독의 부분집합을 TaqMan (Applied Biosystems) 대립형질-식별 검정에 의해 직접적으로 확인하고 하기 기재된 바와 같은 공개적으로 이용가능한 유전자형 데이터와 비교하였다.
플라스미드. 유도성 효모 GAL1 프로모터 및 URA3 선별가능 마커의 제어 하에 5'-말단 HA (헤마글루티닌 A) 에피토프-표지된 인간 MTHFR 개방 판독 프레임을 운반하는 플라스미드 phMTHFR (참조 단백질 서열 NP_005948) 는, Warren Kruger 의 후한 선물이었다 (Shan et al, 1999, 상기). 상기 플라스미드는 QuikChange 키트 (Stratagene) 를 사용하여 위치-지정 돌연변이유발에 의해 모든 MTHFR 변이체를 재구축하기 위한 골격으로서 역할하였다. 갈락토오스-유도성 MTHFR 변이체를 포함하는 통합 플라스미드를, URA3, GAL1 프로모터 및 MTHFR 코딩 부위 (phMTHFR-기재 플라스미드로부터의) 를 포함하는 단편을 pHOpoly-HO 내로 PCR 클로닝함으로써 제작하였는데 (Voth et al, 2001, Nucleic Acids Res. 29:e59), 이는 HO 유전자자리에서 상기 카세트의 표적화된 통합을 가능하게 한다.
균주. 모든 반수체 효모 균주는 S288c 배경에서 MAT α his3 leu2 ura3 lys2 였다 (Brachman et al , 1998, Yeast 14:115-32). MAT α/ MATa 이배체 균주를, 동질 유전자형 MAT α 및 MATa 균주를 접합시켜 제작하였다. fol3 △:: KanMX 및 fol3 △:: KanMX met13 △:: KanMX 균주를, S. 세레비지에 유전자-녹아웃 집합물 (Invitrogen) 로부터의 균주를 사용하여 표준 접합/포자형성 기술에 의해 수득하였다. 이배체 (MTHFR 변이체에 대해 동형접합성 또는 이형접합성) 를, 각각 GAL1 : MTHFR 변이체 카세트의 통합된 형태를 함유하는 fol3 △:: KanMX met13 △::KanMX 반수체를 접합시킴으로써 생성시켰다.
성장 조건. 폴레이트가 결핍된 합성 성장 배지는 비타민이 없는 효모 질소 베이스 (Qbiogene) 를 갖는 최소 배지였으며 (Sherman , 2002, Genetics & Molecular BioL , eds . Guthrie and Fink ( Academic , New York ), pp .3-41)), 폴레이트를 제외한 모든 비타민을 개별적으로 후에 추가하였다. 모든 fol3 △:: KanMX 세포에 50 ug/㎖ 폴린산 (Sigma) 을 보충하였다. 모든 역학적 성장 측정을 위해서, fol3 △:: KanMX met13 △:: KanMX 세포를 GAL1 프로모터-유도 MTHFR 변이체로 형질전환시키고 폴린산 (50 ug/㎖) 및 메티오닌 (20 ug/㎖) 을 보충한 합성 갈락토오스 배지 (2% 갈락토오스, 0.1% 글루코오스) 에서 로그상까지 성장시켰다. 세포를 3 회 세척하고, 가변량의 폴린산을 갖지만 메티오닌은 결핍된 새로운 갈락토오스 배지를 함유하는 96-웰 플레이트 내로 분취하였다. 웰 당 부피는 200 ul 였다 (출발 세포 밀도 OD = 0.01). 진탕하지 않고 30℃ 에서 Tecan GENios 플레이트 판독기에서 60 시간 이상 동안 15-30 분 마다 흡광도를 추적하였다. 도 1a 에서 사용한 MET13 세포를, 메티오닌의 부재 하에 모두 성장시킨 것을 제외하고는 동일한 방법으로 처리하였다.
MTHFR 효소 활성 검정. 생리학적 조건 하에 MTHFR 에 의해 촉매된 역반응을 측정하는 검정은 다음의 변경과 함께 기재된 바와 같다 (Shan et al ,, 1999, 상기): 효모 추출물을 350 ul 의 용해 완충액 (100 mM 수크로오스, 50 mM KHPO4 (pH 6.3), 프로테아제 저해제 칵테일) 중 40 CD595 세포 등가물 (상기와 같이 폴린산 및 메티오닌으로 보충된 fol3 △ met13 △ 세포) 의 비드 용해에 의해 생성시켰다. 추출물을 짧은 미세원심분리에 의해 분류하고, 10-200 ug 의 추출물을 사용하여 활성의 직선형 범위를 결정하였다. 방사능표지된 기질 (5-[14C]MeTHF) 은 GE Healthcare Life Sciences 사로부터의 것이었다. 열 처리를 위해서, 5-[14C]MeTHF 가 없는 반응 믹스를, 5-[14C]MeTHF 를 이후 추가하고 반응이 진행된 시점인 표시된 시간 동안 55℃ 로 가열하였다.
MTHFR 면역블롯 분석. 10 CD 세포 등가물 (상기와 같이 폴린산 및 메티오닌으로 보충된 fol3 △ met13 △ 세포) 을 200 ul 0.1 M NaOH 중에서 15 분 동안 추출하였다. 50 ul SDS 샘플 완충액 (0.5M Tris 6.8, 0.4% SDS) 을 상청액에 추가하고, 이후 이를 끓이고, 분류하고 SDS-PAGE 를 수행하였다. HA-표지된 MTHFR 변이체를 LI-COR 적외선 영상기에서 검출하였다. 마우스 단일클론 항-HA 항체는 Sigma 사로부터의 것이었다. 로딩 대조군인 효모 3-포스포글리세레이트 키나아제 (Pgklp) 를 Jeremy Thorner (University of California, Berkeley, CA) 에 의해 후하게 기증된 마우스 항체에 의해 검출하였다.
결과
인간에서의 MTI - fFR 변이체. 인간 MTHFR 의 전체 코딩 부위를, 다양한 인종의 564 명의 개인으로부터의 각각의 11 개 엑손에서의 코딩 부위를 증폭함으로써 서열분석하였다. 코딩 부위의 길이, 정보를 얻는 (interrogated) 대립형질의 수 및 모든 비-동의성 치환을 표 4 에 열거하였다. 모든 것에서, 코딩 DNA 2,081,106 bp, 및 1,000 개 초과의 대립형질의 깊이까지 샘플링된 모든 엑손을 분석하였다. 이들 데이터에서는 14 가지 비-동의성 변화가 밝혀졌는데, 이들 중 11 가지는 1% 미만의 비주요 대립형질 빈도 (MAF) 를 나타내었으며 7 가지 대립형질이 오직 1 회 나타났다. 일부 저빈도 대립형질을 이전에 나타냈다 (표 4 참조). 저빈도 비-동의성 치환의 수는 무작위 집단 내로 깊숙히 샘플링한 다른 연구에서 잘 일치하였다 (Martin et al , 2006, Pharmacogenet Genomics 16:265-77; Livingston, 2004, Genome Res 14:1821-31; Glatt et al , 2001, Nat . Genet . 27:435-38). 또한, 3 가지의 잘 연구된 통상적 치환이 관찰되었는데 이는 예측된 전세계 집단 빈도를 나타내었다 (A222V - 29.3%, E429A - 23.6%, R594Q - 4.4%).
염기 해독의 정확도에 대한 품질 관리 확인으로서, 8 개 변이체 (4 개체 포함) 를, 독립적으로 PCR-증폭되었으며 데이터의 100% 용어 색인이 나타난 100 개 샘플에서의 TaqMan 대립형질-식별 검정에 의해 재분석하였다. 또한, 모두 본 연구에서 일부 겹쳐지는 Coriell 샘플을 사용한 (dbSNP build 127), 환경 게놈 프로젝트 (Environmental Genome Project) (http:/fwww.niehs.nih.gov/envqenom/) 및 Perlegen (Mountain View, CA) 으로부터의 인구 유전자형분석 데이터는 817 개의 유전자형 해독 (genotype calls) 중 814 개 (99.6%) 의 유전자형 해독과 일치하였다. 3 개의 조화되지 않는 유전자자리 중 2 개에 대해서, 서열 데이터는 분명하였으며 올바른 것으로 보였다.
완전한 코딩 부위 서열을 480 명의 개인으로부터 수득하였다. 18 명 (4%) 은 저빈도 비-동의성 변이체를 수반하였다. 유의하게, 저빈도 변화의 범위를 갖는 3 개의 통상적 다형성 (A222V, E429A 및 R594Q) 의 조합은 다량의 개인 이종성을 일으켰다. 28 개의 상이한 비-동의성 유전자형이 이러한 군에서 발견되었는데, 이의 일배체형은 대부분의 경우 데이터로부터 추론될 수 없었다.
MTHFR -폴레이트 생체내 상호작용. 유전적 변이체의 임상적 중요성이 이의 기능적 결과에 있기 때문에, 모든 비-동의성 변화를 MTHFR 기능에 대한 이의 영향에 대해, 그리고 중요하게는 손상 대립형질이 폴레이트-반응성을 나타내는지 여부를 시험하였다. 폴레이트 영양요구주 (fol3) 를 met13 균주 내로 도입하여, 성장 배지에서 폴린산을 가변적이게 함으로써 세포내 폴레이트 농도의 적정을 가능하게 하였다. 폴린산 (5-포르밀-테트라히드로폴레이트) 은 효모에서 메테닐-테트라히드로폴레이트로 대사작용될 수 있는데, 이는 다음에는 다른 폴레이트 조효소로 전환될 수 있다 (Cherest et al . (2000) J. Biol . Chem . 275:14056-63). 이러한 방법으로, 인간 MTHFR 기능성 (메티오닌의 부재 하에서의 성장) 을 세포 폴레이트 상태를 점점 더 제한하는 것의 함수로서 측정하였다.
이러한 조건 하에서, 50 ug/㎖ 초과의 폴린산 보충은 어떠한 유리한 성장 이점도 부여하지 않았다 (도 1a). 그러나 50 ug/㎖ 미만의 온도에서는, 성장은 배지 내 이용가능한 폴린산과 명백히 상관관계가 있었다. 따라서 세포내 폴레이트 수준은 이러한 범위 내에서 비율-제한적이었다 (rate-limiting). FOL3 세포의 성장과 비교하는 경우, 폴린산 보충은 내인성 폴레이트 생합성의 결핍을 완전히 보상하지는 않았다. 그러나 이러한 간격은, 성장 속도 보다는 세포가 정지상으로 들어가는 밀도에서 주로 반영되었다 (폴린산 흡수에서의, 또는 단독 폴레이트원으로서 폴린산의 이용에서의 제한을 반영하는 가능성이 있음).
fol3 met13 세포를 보완하기 위한 인간 MTHFR 의 능력은 배지에서의 폴린산 보충의 기능이었다 (도 1b). 폴레이트 보충에 대해서는, GAL1 프로모터로부터의 인간 MTHFR 의 발현은 Met13p 의 손실을 완전히 보상하지 않았다 (도 1b 와, 도 1a 에서의 동등한 폴레이트 투여량에서의 FOL3 MET13 세포를 비교). 따라서, 50 ug/㎖ 폴린산 미만에서, 폴레이트와 MTHFR 모두는 성장에 대해 비율-제한적이었으며, MTHFR 활성에서의 심지어 감지하기 힘든 변화가 성장 판독에서 반영되게 한다. 50 ug/㎖ 초과의 폴린산 보충이 내인성 효모 MTHFR (MET13, 도 1a) 또는 주요 인간 대립형질 (도 1b) 을 발현하는 세포에 대해 유리한 유의한 성장을 부여하지 않았으나, MTHFR 의 손상 대립형질에 대해서는 유익하였다는 것에 주목한다 (하기 참조).
MTHFR 변이체의 기능적 영향. 폴레이트 농도의 범위에 걸쳐 시험한 5 개 비-동의성 대립형질은 관찰된 기능적 효과의 범위를 설명하였다 (도 2a). 100 ug/㎖ 에서 A222V 변이체의 기능이 거의 완전히 회복되었으며, 4 배 낮은 수준의 보충 (25 ug/㎖) 에서 활성은 유의하게 적었다 (주요 대립형질에 대해). 따라서, 이러한 조건 하에서 A222V 결함의 알려져 있는 폴레이트 구제가능성을 요약하였다. 이러한 조건 하의 효모에서 환원된 폴레이트의 정확한 세포내 농도는 알려져 있지 않다. 그럼에도 불구하고, A222V 대립형질의 거동은 효모 및 인간 세포에서의 세포내 농도를 효과적으로 교정하였다. A222V 효소는 통상적 대립형질의 대략 50% 의 고유 활성을 가졌으며 (Martin , 2006, Pharmacogenet Genomics 16:265-77; Rozen , 1997, Thromb . Haemost , 78:523-26) 성장률에 있어서의 50% 감소가 50 pg/㎖ 폴레이트 보충에서 관찰되었다. 또한, 50 ug/㎖ 폴린산에서 성장한 세포로부터의 세포-미함유 검정에서 A222V 효소 활성에 있어서의 동일한 50% 감소가 관찰되었다 (하기 도 3). 따라서, 효모에서의 A222V 의 거동은 인간 세포에서의 이의 거동을 요약하였다.
4 개 저빈도 대립형질을 동일한 방법으로 시험하였다 (도 2a). R519C 는, 모든 폴레이트 농도에서 성장이 영향을 받지 않았기 때문에 양성인 것으로 나타났다. R134C 는 활성이 다소 폴레이트-반응성이었으나, 모든 폴레이트 농도에서 심각하게 손상되었다. D223N 및 M110I 대립형질은 A222V 와 유사한 폴레이트-구제성 활성을 나타내었는데 (덜 심각히 손상되었음에도 불구하고) 여기서 성장은 50 ug/㎖ 폴린산 이상에서 주요 대립형질과 유사하였으나 50 ug/㎖ 폴린산 미만에서는 불량하게 기능하였다.
MTHFR 효소는 N-말단 촉매 도메인 및 C-말단 조절 도메인을 갖는데, 이는 알로스테릭 저해제 S-아데노실메티오닌에 결합한다 (AdoMet ; Sumner et ah , 1986, J. Biol. Chem , 261:7697-7700). 촉매 도메인 (M110I, R134C, H213R, A222V, D223N 및 D291N) 내에 포함되는 6 개 대립형질 중, H213R 만이 양성이었다 (도 2b). M110I, A222V, D223N 및 D291N 은 폴레이트-구제성 거동을 나타내었는데 여기서 이들 효소 변이체는 고농도의 폴레이트 보충 (50-200 ug/㎖ 폴린산) 에서 주요 대립형질과 유사하였으나 폴레이트가 보다 더 비율-제한적이 됨에 따라 상당히 약화되었다. R134C 변이체는 임의 수준의 폴레이트 보충에서의 성장을 지지하기 위한 주요 대립형질의 능력에 결코 접근하지 못하며, 따라서 반응성인 것으로 분류되었으나, 구제성 대립형질은 아니다. 조절 도메인 내의 모든 치환 (G422R 에서 T653M 까지) 은 주요 대립형질과 유사하게 거동하였다 (도 2b).
아미노산 치환 사이의 상승작용적 상호작용. 변이체의 분포는 2 개 (또는 그 이상) 치환을 함유하는 화합물 대립형질의 존재를 시사하였다. 그러므로 여러 화합물 대립형질 (개인 샘플에서의 이의 발생을 기준으로 하는) 을, 대립형질조합이 상승작용적 또는 억제적 영향을 일으키는지 여부를 시험하기 위해 생성시켰다. 통상적 변이체를 갖는 A222V 조합에 대해 (A222V E429A 및 A222V R5940), 비주요 대립형질 동형접합체가 기존 대립형질 (allele arid) 중 하나 이상에 대해 관찰되었으므로, 이러한 변이체가 존재한다는 것이 확실하다. 그러나, 저빈도 변이체에 대해, A222V 변이체와 신규한 변이체 모두는 항상 이형접합체로서 발생하였다. 일배체형이 알려져 있지 않기 때문에, 이들 개인은 2 개의 단일 치환 대립형질 또는 화합물 대힙형질을 포함할 수 있었다. 그러므로 모든 가능한 이중 치환 대립형질을 생성시키고 이의 기능에 대해 시험하였다 (예를 들어 M110I A222V, 도 2a). 시험한 2 가지 폴린산 농도에서, M110I A222V 변이체는 개인 대립형질의 합보다 더 불량하게 기능하였는데, 이는 화합물 대립형질에서의 상승작용적 결함을 나타낸다. 50 ug/㎖ 폴린산에서, M110I 변이체는 주요 대립형질과 거의 구별불가능하였는데, 이는 A222V 결함을 유의하게 증강시켰다. 시험한 모든 조합에 대해, 개별적으로 기능에 영향을 준 대립형질 (M110I 및 D291N) 은 A222V 와 조합되는 경우 상승작용시키는 한편, 양성 변화는 A222V 결함을 증강시키지 않았다.
생체내 기능에 있어서 요약된 생화학적 검정. 성장 검정의 신뢰성을 평가하기 위해서, 세포-미함유 MTHFR 효소 검정을 미정제 효소 용해물에서 모든 변이체에 대해 수행하였다 (물질 및 방법 참조). 특이적 활성을 측정하는 것에 추가로, 다양한 시간 동안 55℃ 에서의 열 처리에 의해 변이체를 열 불안정성에 대해 시험하였다 (효소 안정성의 측정). 고유 활성과 성장률 사이에 양호한 상관관계가 존재하였다 (도 3; 주요 MTHFR 대립형질, A222V 및 R134C 에 대한 열 처리되지 않은 샘플의 활성과 도 2 에서의 성장 곡선을 비교). 다시금, A222V 변이체는 주요 대립형질의 효소 활성의 대략 50% 를 나타내었다. 성장 검정에서와 같이, R519C 변이체는 주요 대립형질에 대해 유사한 활성을 나타내었으며, 통상적 E429A 변이체를 포함하는 조절 도메인에서의 모든 변화를 대표하였다 (데이터는 나타내지 않음). E429A 가 효소 기능에 영향을 주는 것이 보고된 바 있으나, 본 발명의 데이터는 이러한 변화가 양성이라는 다른 보고와 일치하였다.
A222V 돌연변이체 효소는 주요 형태보다 덜 안정하며 더 열 불안정성이며 (Guenther et al , 1999, Nat . Struct . Biol . 6:359-65; Yamada et al , 2001, Proc . Natl. Acad . Sci . 98:14853-58) 상기 변이체의 폴레이트 치료는 단백질의 안정화를 촉진함으로써 발생하는 것으로 여겨진다. 여기서 사용한 조건 하에서 (55℃, 20 m), A222V 는 모든 활성을 거의 손실한 한편 주요 대립형질은 이의 본래 활성의 약 30% 를 유지하였다 (이전의 연구와 일치). 효소 결함이 중대하지 않았음에도 불구하고, 신규한 D223N 대립형질은 또한 이러한 경우 폴레이트-구제가능성을 유사하게 설명할 수 있는 증가된 열 불안정성을 나타내었다.
이형접합체 표현형. 저빈도 대립형질이 통상 이형접합체로서 발생하기 때문에, 이의 중대성이 일축되는 경향이 있다. MTHFR 대립형질의 이형접합성의 기능적 중대성을 보다 잘 이해하기 위해서, 통합된 발현 카세트 (동형접합체) 로부터 발현된 동일한 대립형질 또는 이형접합체를 생성하기 위한 상이한 대립형질을 각각 갖는 반수체 균주를 접합시켜, 인간 MTHFR 2 카피를 갖는 이배체 효모를 생성시켰다 (방법 참조). 상기와 같이, 이들 균주를 폴레이트 보충의 함수로서 성장에 대해 시험하였다 (도 4). 이형접합체는, 폴레이트를 제한하는 조건 하에서 악화된, 상기 검정에서 성장 표현형을 나타내었는데, 이는 감소된 기능의 대립형질이 야생형과 공동우위종이었다는 것을 나타낸다.
성장 검정에서 측정된 바와 같은 세포 MTHFR 활성은 대립형질의 부가적 영향을 반영하는 것으로 나타났다. 또한, 반접합체로의 추가적인 실험 (단일한 통합된 발현 대립형질을 갖는 이배체; 데이터는 나타내지 않음) 은 이형접합체에서의 주요 및 비주요 대립형질 사이의 이형이량체의 형성이 돌연변이체 대립형질을 약간 구제하거나 구제하지 않는다는 것을 입증하였다. 예를 들어, 이배체 MTHFR 주요 대립형질/무효 (null) 세포 (반접합체) 는 모든 조건 하에 주요 대립형질/R134C 이형접합체와 유사하게 거동하며, 저 폴레이트 배지 (A222V 가 불활성화됨) 에서 주요 대립형질/A222V 이형접합체와 유사하게 거동하였다. 따라서, 이형접합체 세포에서의 유해한 대립형질의 표현형적 기여가 쉽게 관찰되어, 인간 게놈에서의 이형접합성으로부터의 보다 널리 퍼진 표현형적 결과의 가능성을 증가시킨다.
인산화에 의한 효모에서의 MTHFR 변이체의 변형. MTHFR 변이체 단백질의 풍부함은 N-말단 헤마글루티닌 A (HA) 에피토프 표지에 대해 유도된 항체를 사용하는 면역블로팅에 의해 측정되었다 (도 5a). 모든 샘플에서, 단백질은 대략 72kD 및 78kD 의 이중선으로서 실행되었다. 상기 패턴은, 상부 밴드가 N-말단 근처에서 배가-인산화된 MTHFR 을 나타내는, 곤충 세포에서 발현된 인간 MTHFR 에 대해 관찰된 것과 밀접히 유사하였다. 곤충 세포에서의 MTHFR 의 인산화는 위치 34 에서의 트레오닌 잔기에 의존적이며, 상기 트레오닌의 알라닌으로의 치환 (T34A) 은 효소가 인산화될 수 없게 한다. 이러한 돌연변이는 S. 세레비지에에서 발현된 인간 MTHFR 에 대해 동일한 영향을 가지며, 곤충 세포에서와 같이, 상부 밴드는 인산화된 MTHFR 이었다 (도 5a).
MTHFR 의 인산화 역할은 음성적 조절에 포함되는 것으로 제안된다. 이러한 가설을 지지하여, 여기서 관찰된 인산화 패턴은 세포 MTHFR 활성과 직접적으로 상관관계가 있었다. 구체적으로, 비인산화:인산화 형태의 풍부함 비율은 활성 감소와 함께 증가하였다 (도 5b). 흥미롭게도, 모든 변이체 (인산화 형태 + 비인산화 형태) 의 전체 풍부함은 두드러지게 상이한 것으로 나타나지 않았다. 다른 인자가 단백질 수준 측정에 포함되지 않는 한, 유해한 치환이 고유 효소 안정성에 영향을 주는 경우 이는 예측되지 않을 수 있다.
모든 기능적 손상 대립형질은 N-말단, 폴레이트 및 FAD 결합 부위를 포함하는 MTHFR 의 촉매적 절반에 밀집되어 있다. 한편, MTHFR 의 C-말단 조절 도메인에서의 8 개 비-동의성 치환이 확인되었으며 8 개 모두 상보성 및 세포-미함유 효소 검정 모두에서 양성으로 나타났다. 또한, 화합물 대립형질에서의 A222V 와 조절 도메인 치환 사이에는 상승효과가 발견되지 않았다 (도 2). 이들 변경은 E429A 에 대해 보고된 바와 같이 중립적이거나, 상기 검정은 이의 결합에 대해 민감하지 않았다. 그러나 이러한 발견은, 심각한 임상적 표현형을 야기하는 MTHFR 에서의 대부분의 돌연변이가 촉매 도메인에서 발생한다는 관찰과 일치하였다 (http://www.hgmd.cf.ac.uk!ac/index.nhP). 조절 도메인은 촉매 도메인의 안정화에 있어서 역할하는 것으로 제시되어 왔다. 그렇다면, 이러한 역할은 아미노산 치환에 대해 다소 관용적일 수 있으며, 아라비돕시스 (Arabidopsis) C-말단 도메인 (조절 도메인에서의 효모 효소의 대략 50 개 비-동의성 치환과 동등함) 에 융합된 S. 세레비지에 N-말단 도메인으로 이루어지는 키메라 MTHFR 이 어떻게 효소 활성에 해를 끼치지 않는지를 설명할 수 있다. COS-1 세포에서 발현된 경우, C-말단 도메인에서의 통상적인 R5940 변이체가 효소 활성에 영향을 주었다는 것이 이전에 보고된 바 있음에 주목해야 한다. 그러나 이러한 변화는, 효모에서 발현된 효소의 세포-기재 및 세포-미함유 검정에서 양성인 것으로 나타났다. 이러한 차이의 이유가 명확하지 않음에도 불구하고, 이들 저자가 그들의 면역블롯 분석에서 오직 단일 종류의 MTHFR (알려져 있지 않은 인산화 상태) 만을 관찰했기 때문에, 이는 숙주 발현 시스템을 반영할 수 있다.
이형접합체의 표현형. 기능적으로 손상된 MTHFR 대립형질에 대해 이형접합성인 이배체 효모의 거동은, 특히 폴레이트를 제한하는 조건 하에 이형접합체 표현형이 명백히 관찰가능했다는 것을 입증하였다 (도 4). 대부분의 유전적 변이가 이형접합성으로서 발생하며 저빈도 대립형질이 집단 내에서 이형접합체로서 주로 존재하기 때문에, 이형접합체에서의 표현형의 출현은 유의하였다. 이러한 결과는 림프구 추출물에서의 세포 MTHFR 활성이 유전자형과 직접적으로 상관관계가 있다는 관찰과 일치하며: A222V 에 대해 이형접합성인 개인 (NV) 은 주요 대립형질 (NA) 동형접합체에 대해 나타난 총 활성의 대략 65% 의 활성을 갖는데, 여기서 A222V 동형접합체 (VN) 는 A/A 동형접합체 활성의 30% 를 유지한다. 혈청 트리글리세라이드 수준에 영향을 주는 아디포카인 (adipokine) ANGPTL4 에서의 대립형질의 전체 스펙트럼을 검사하는 최근 연구에서, 비-동의성 E40K 대립형질에 대한 이형접합성은 낮은 혈장 트리글리세라이드 수준과 유의하게 연관되었다. 따라서, 동형접합체보다 더 많은 자릿수의 담체가 존재할 수 있기 때문에, 이형접합성이 표현형적으로 검출가능한 경우는 저빈도 변이체의 기여의 중대성을 증가시킨다. 이형접합체 표현형은 MTHFR 활성이 세포 성장에 대해 비율-제한적인 조건 하에 관찰되었다. 효소적 단계가 인간에서의 특정 경로에서 비율-제한적인지 여부는 유전적 인자와 환경적 인자 모두에 의존적이다.
돌연변이 및 MTHFR 인산화 및 풍부함. 촉매 도메인에서의 비-동의성 변화의 폴레이트 치료는 단백질 안정화 (A222V 에 대한 것과 같음) 또는 보조인자 Km 과 같은 분자 기능의 다른 양상 극복에 의해 발생할 수 있다. 하나 이상의 유해한 대립형질, D223N 은, 안정성 결합에 대해 논쟁 되었던 A222V 와 유사한 증가된 열 불안정성을 나타내었다 (도 3). MTHFR 의 폴레이트-구제성 대립형질이 폴레이트 종류가 효소의 불안정 형태를 안정화시키는 것들이라는 가설은, 제안되어 왔던 바와 같이, MTHFR 단백질 수준이 변이체의 고유 활성에 비례한다는 것을 제안한다. 그러나, 본 관찰은 인산화 상태가 효소 활성과 상관관계가 있는 한편 (도 5), 전체 풍부함 (인산화 형태 + 비인산화 형태) 은 두드러지게 변화하는 것으로 나타나지 않았다 (2 배 범위 내) 는 것을 나타내었다. 인산화된 MTHFR 가 효소의 활성 형태가 아닐 수 있는데, 이는 이전의 연구가 고유 활성에 대한 인산화의 저해 효과를 입증했기 때문이다. 이와 일치하여, 성장 및 효소 검정 모두에서의 비-인산화성 T34A 변이체의 거동은 주요 대립형질의 것과 유사하였다 (데이터는 나타내지 않음). 또한, 낮은 세포내 폴레이트 수준이 MTHFR 안정성을 감소시키는 한편 (풍부함에 의해 측정된 바와 같이), 이러한 효과는 기능을 손상시키는 변이체에서는 증강되지 않는다. 이들 결과가 유해한 변화의 예측된 단백질 불안정과 상충되기 때문에, 현재 조사 중에 있는 보상 조절 반응이 있어야만 한다는 것이 추론되었다. 이러한 방법으로 변이체의 활성은 두드러지게 상이할 수 있었던 반면 (도 2), 전체 단백질 풍부함은 그렇지 않을 수 있다 (도 5). 결과가 인산화에 의한 피드백 조절과 일치하지만, 턴오버에서의 인산화의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 맥락에서, 다른 손상 대립형질과 함께 T34A 변화의 효과를 측정하는 것이 흥미로울 것이다.
폴레이트/호모시스테인 대사 경로
폴레이트/호모시스테인 대사 경로는 신경관 결함 (NTD) 의 병인 및 폴레이트 보충이 예방적인 것으로 입증되며 상승된 혈장 호모시스테인 수준이 위험성 증가에 기여하는 다른 불리한 임신 결과와 관련된다. 폴레이트 및 호모시스테인 신진대사 경로는 메티오닌 신타아제 반응, 및 세포 배양물, 동물 모델 시스템 및 인간 손상 호모시스테인 재메틸화에서의 미미한 폴레이트 결핍을 통해 연결된다 (예를 들어, Stover PJ . 2004. Physiology of folate and vitamin B 12 in health and disease. Nutr Rev 62: S3 -12 참조). 호모시스테인은 NTD 에 대한 위험 인자로 가정된다 (예를 들어, Mills et . al ., 1995. Homocysteine metabolism in pregnancies complicated by neural tube defects . Lancet 345:149-1151 참조). 폴레이트 결핍은 또한, MTHFR 및 CBS 모두의 알로스테릭 저해제인 S-아데노실-메티오닌 (SAM; 예를 들어, 상기 Stover 참조) 에 의해 매개되는 메틸화를 손상시킨다 (예를 들어, Kraus et al , 1999. Cystathionine -3- synthase mutations in homocystinuria. Hum Mut 13:362-375; Daubner et al , 1982. In Flavins and Flavoproteins, eds . Massey , V. & Williams , C. H. ( Elsevier , New York ), pp . 165-172 참조). 또한, S-아데노실-호모시스테인:S-아데노실-메티오플린 (SAH/SAM) 비에서의 상승은 NTD 진전의 메커니즘에서 제시되어 왔다 (예를 들어, 상기 Stover ; Scott , 2001. Evidence of folic acid and folate in the prevention of neural tube defects . BibI Nutr Dieta 55:192-195. van der Put et al , 2001. Folate , Homocysteine and Neural Tube Defects : An Overview. Exptl Biol Med 226:43-270.1,5,6 참조).
호모시스테인 신진대사에서 포함된 비-폴레이트 이용 효소
시스타티오닌-β-신타아제 (CBS) 결함은 상승된 호모시스테인 수준을 야기하며 시스타티오닌-3-리아제 (CTH) SNP 는 상승된 호모시스테인과 유사하게 연관되어왔다 (예를 들어, Kraus et al , 상기; Wang et al , 2004. Single nucleotide polymorphism in CTH associated with variation in plasma homocysteine concentration. Clin Genet 65:483-486 참조). 폴레이트-이용 효소가 아니지만, CBS 및 CTH 모두는 비타민 B6-보조인자에 의존적이며, 손상 대립형질은 기능 장애성 폴레이트/호모시스테인 신진대사의 위험성을 제기한다. 본원에 기재된 바와 같은 MTHFR 손상 대립형질에 대한 폴레이트 요법과 유사하게, CBS 및 CTH 의 손상 대립형질은 B6 요법에 대한 표적이다. CBS 및 CTH 의 기능 및 비타민-반응성을 효모 상보성 검정에서 요약한다 (도 6).
CBS 돌연변이체 효소의 비타민 B-치료를 S. 세레비지에에서 요약한다.
효모 균주를 조작하여 세포내 비타민 B6 (피리독신) 농도의 함수로서 CTH 및 CBS 를 검정하였다 (도 6). CTH 및 CBS 에 대한 S. 세레비지에 오르토로그는 각각 cys3 및 cys4 인데, 이들의 결함은 시스테인 영양요구성을 야기한다. 균주 배경이 피리독신 생합성에 대해 결함이 있을 뿐 아니라 (6 겹-결실 sno1 △ sno2 △ sno3 △ snz1 △ snz2 △ snz3 △; Stolz et al , 2003. Tpnlp , the plasma membrane vitamin B 6 transporter of Saccharomyces cerevisiae . J Biol Chem 278:18990-18996) cys3 및 cys4 결함이 있다는 것을 제외하고는, MTHFR 에 대해 본원에 기재된 것과 유사한 방식으로 피리독신 농도의 함수로서 효소를 시험하였다.
도 6 은 고체 배지에서의 정성적 효모 성장 검정을 나타내며, 두 효소 모두가 피리독신 보충의 함수로서 유사한 효모 결함을 구제하며 CBS 의 두 호모시스테인증성 (homocystinuric) 대립형질 (I278T, R266K) 의 비타민-반응성이 이러한 상보성 검정에서 요약된다는 것을 입증한다: 이들 대립형질은 야생형 효소보다 B6 수준을 제한하는데 있어서 더 민감해지며 상응하게 더 큰 성장 결함을 나타낸다. 인간 CBS 에 의한 cys4 돌연변이체에서의 시스테인 영양요구성의 구제는 이전에 입증된 바 있다 (Kruger et al , 1995. A yeast assay for functional detection of mutations in the human cystathionine - synthase gene . Hum Mol Genet 4:1155-1161; Kruger et al , 1994. A yeast system for expression of human cystathionine betasynthase : structural and functional conservation of the human and yeast genes . Proc Natl Acad Sci 91:6614-6618).
실시예 2: 샘플 집단에서의 추가적인 MTHFR 변이체의 확인
게놈 DNA 를, 신경관 결함에 걸린 각 250 명의 신생아 또는 신경관 결함에 걸리지 않은 각 250 명의 신생아의 건조된 혈반 (Guthrie Cards) 으로부터 단리하였다. 단리된 게놈 DNA 샘플에서의 MTHFR 엑손을 실시예 1 에서 표시한 바와 같이 서열분석하였다. 효소 구조에 영향을 주는 돌연변이를, 컨센서스 인간 게놈 서열 (NM_005957) 에 대한 미스매치로서 서열 데이터로부터 확인하였다. 모든 치환을 표 A 에 열거하였다.
MTHFR 변이체의 기능적 영향을, 실시예 1 에서 기재된 바와 같은 기능적 효과를 관찰하기 위한 폴레이트 농도 범위에 걸쳐 본원에 개시된 생체내 효모 검정을 사용하여 시험하였다.
실시예 3: ATIC , MTHFS , MAT1A , MAT2A 및 GART 변이체의 확인
DNA 샘플 집단. 게놈 DNA 를, 신경관 결함에 걸린 각 250 명의 신생아 또는 신경관 결함에 걸리지 않은 각 250 명의 신생아의 건조된 혈반 (Guthrie Cards) 으로부터 단리하였다. 폴레이트/호모시스테인 대사 경로로부터의 18 개 후보 유전자에서의 총 234 개 엑손을 서열분석하였다. 효소 구조에 영향을 주는 암플리콘 돌연변이 및 서열분석을 ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 에 대해 표 2 에서 열거한 컨센서스 인간 게놈 서열에 대한 미스매치로서 서열 데이터로부터 확인하였다. ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 에 대한 모든 치환을 각각 표 B, C, D, E 및 F 에 열거하였다.
ATIC, MTHFS, MAT1A, MAT2A 및 GART 변이체의 기능적 영향을, 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 기능적 효과를 관찰하기 위한 개시된 생체내 효모 검정, 및 표 1 에 기재된 바와 같은 적절한 효모 균주 배경을 사용하여 폴레이트 농도 범위에 걸쳐 시험하였다.
모든 인용은 그 전체가 참조로 본원에 명백히 포함된다.
표 4 : 다양한 인종의 500 명 초과의 선택되지 않은 개인의 샘플링에서 관찰된 비동의성 MTHFR 대립형질의 스펙트럼
Figure pct00057
Figure pct00058
** 엑손 1 및 11 에 대해서, 엑손의 코딩 부위의 길이만이 제공됨.
표 5 : 권장된 비타민 섭취
Figure pct00059
Figure pct00060
* 영양소 기준치 (RDI) 는 영양소 표시 (labeling) 에서 사용하기 위해 식품의약국 (FDA) 에 의해 확립된 값이다. 초기에, 모든 연령군에 대해 필요성이 충족되었음을 확실히 하기 위해, 각각의 영양소에 대한 1968 년도 최고 권장 식사 허용량 (RDA) 을 기준으로 하였다.
** 영양 섭취 기준 (DRI) 은 1997-2001 년도 미국 의학 협회의 식품 영양 위원회 (Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine) 에 의해 확립된 식이 권장사항의 가장 최근 세트이다. 이는 이전의 RDA 를 대체하며, 결국 RDI 를 업데이트하기 위한 기초일 수 있다. 여기 나타낸 값은 각각의 영양소에 대한 최고 DRI 이다.
*** 상한치 (UL) 는 안전성 인자를 포함하는, 성인에 의해 사용하기에 안전한 것으로 고려되는 섭취의 상위 수준이다. 일부 경우, 어린이에 대해 낮은 UL 이 확립된 바 있다.
# 과거사적 (historical) 비타민 E 전환 인자는 DRI 레포트에서 개정되어, 15 mg 이 22 IU 의 천연 비타민 E 또는 33 IU 의 합성 비타민 E 의 등가물로서 정의되었다.
## 가임 연령의 여성은, 식이용 폴레이트에 추가로, 첨가 조식용 시리얼 또는 식이 보충제로부터 400 mcg 의 합성 엽산을 획득하는 것이 권장된다.
### 생물학적 이용가능성을 향상시키기 위해, 50 명을 초과하는 사람이 첨가 식품 또는 보충제를 통해 B-12 권장사항을 충족하는 것이 권장된다.
ND: 상한치 미측정. 상기 영양소의 고 섭취로부터 이상 반응 (adverse effect) 은 관찰되지 않았다.
[→ * 책임 있는 영양위원회 (Council for Responsible Nutrition) 웹사이트에서 획득함]
표 6 : 권장된 미네랄 섭취
Figure pct00061
* 영양소 기준치 (RDI) 는 영양소 표시 (labeling) 에서 사용하기 위해 식품의약국 (FDA) 에 의해 확립된 값이다. 초기에, 모든 연령군에 대해 필요성이 충족되었음을 확실히 하기 위해, 각각의 영양소에 대한 1968 년도 최고 권장 식사 허용량 (RDA) 을 기준으로 하였다.
** RDA 는 식품 영양 위원회 (Food and Nutrition Board) 에 의해 확립되었고 주기적으로 개정되었다. 나타낸 값은, 각 개정판에 표시된 연도에서, 각각의 영양소에 대한 최고 RDA 이다.
*** 영양 섭취 기준 (DRI) 은 1997-2001 년도 미국 의학 협회의 식품 영양 위원회에 의해 확립된 식이 권장사항의 가장 최근 세트이다. 이는 이전의 RDA 를 대체하며, 결국 RDI 를 업데이트하기 위한 기초일 수 있다. 여기 나타낸 값은 각각의 영양소에 대한 최고 DRI 이다.
[→ * 책임 있는 영양위원회 웹사이트에서 획득함]

Claims (57)

  1. 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재하는 보조인자를 포함하는 제형.
  2. 제 1 항에 있어서, 다수의 보조인자를 포함하는 제형으로서, 상기 다수 내의 보조인자의 하나 이상의 부분집합이 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재하는 제형.
  3. 제 1 항에 있어서, 보조인자가 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (칼시페롤), 비타민 E, 비타민 K (필로퀴논), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B9 (폴레이트/엽산), 비타민 B12 (토코페롤), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B5 (판토텐산) 및 콜린으로 이루어지는 군에서 선택되는 제형.
  4. 제 2 항에 있어서, 다수의 보조인자가 비타민 A (레티놀), 비타민 C (아스코르브산), 비타민 D (칼시페롤), 비타민 E, 비타민 K (필로퀴논), 비타민 B1 (티아민), 비타민 B2 (리보플라빈), 비타민 B3 (니아신), 비타민 B6 (피리독신), 비타민 B9 (폴레이트/엽산), 비타민 B12 (토코페롤), 비타민 B7 (비오틴), 비타민 B5 (판토텐산) 및 콜린으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 개 이상의 보조인자를 포함하는 제형.
  5. 제 1 항에 있어서, 서방형 형태로서 제조되는 제형.
  6. 제 1 항에 있어서, 경구 섭취가능한 제형.
  7. 제 1 항에 있어서, 정맥내, 피하 또는 근육내 투여용으로 제조되는 제형.
  8. 제 1 항에 있어서, 단위 투약량으로서 제조되는 제형.
  9. 제 1 항에 있어서, 정제 또는 캡슐로서 제조되는 제형.
  10. 제 1 항에 있어서, 액체 형태인 제형.
  11. 제 1 항에 있어서, 유전적 구성이 대사 경로에서의 하나 이상의 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자에서의 유전적 변이체를 포함하며, 상기 유전적 변이체가 보조인자 구제가능 병상과 상관관계가 있는 제형.
  12. 제 11 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 신경관 결함을 갖는 자손을 갖는 것인 제형.
  13. 제 11 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 이분척추증, 구개열 또는 무뇌증을 갖는 자손을 갖는 것, 또는 조산이 발생하는 것에서 선택되는 제형.
  14. 제 1 항에 있어서, 개인에 의한 사용을 위한 지시사항이 동반되는 제형.
  15. 하기를 포함하는, 제 1 항에 따른 제형을 제조하는 방법:
    (a) 보조인자를 선택하고;
    (b) 상기 보조인자를 섭취가능 또는 주사가능 형태로 부형제와 혼합함.
  16. 제 15 항에 있어서, 선택하는 단계가 다수의 보조인자 선택을 포함하며, 상기 다수 내 보조인자의 하나 이상의 부분집합이 개인의 유전적 구성에 의해 결정된 양으로 존재하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 보조인자가 개인의 하나 이상의 개인적 특징을 기준으로 선택되며, 상기 개인적 특징이 체중, 키, 체질량 지수, 인종, 가계, 성별, 연령, 가족력, 의료 기록, 운동 습관 및 식습관으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  18. 하기를 포함하는, 개인에 대한 보조인자의 양을 결정하는 방법:
    (a) 개인의 생물학적 샘플로부터의 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 검출하고 (상기 하나 이상의 유전적 변이체는 상기 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량에 비해 보조인자 질량의 1% 이상으로 상이한 보조인자 권장량과 상관관계가 있음);
    (b) 상기 하나 이상의 유전적 변이체가 상기 생물학적 샘플에서 검출되는 경우 개인에 대한 보조인자의 상이한 양을 권장함.
  19. 제 18 항에 있어서, 유전적 변이체가 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량보다 적어도 1% 초과로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 유전적 변이체가 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량보다 적어도 1% 미만으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 유전적 변이체가 500% 이상으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 개인이 보조인자 구제가능 병상에 대한 위험성 또는 소인을 갖는 여성인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 신경관 결함을 갖는 자손을 갖는 것인 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 이분척추증, 구개열 또는 무뇌증을 갖는 자손을 갖는 것; 또는 조산이 발생하는 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 여성이 임신했으며 보조인자 구제가능 병상이 이분척추증을 갖는 자손을 갖는 것인 방법.
  26. 하기를 포함하는, 개인에서의 보조인자 구제가능 병상에 대한 위험성 또는 소인을 측정하는 방법:
    (a) 개인의 생물학적 샘플로부터의 다수의 유전적 변이체의 존재 또는 부재를 검출하고 (상기 다수의 유전적 변이체는 표 A-X 에서 선택됨);
    (b) 상기 다수의 유전적 변이체가 상기 생물학적 샘플에서 검출되는 경우 보조인자 구제가능 병상에 대한 소인을 측정함.
  27. 제 26 항에 있어서, 다수의 유전적 변이체가 2 개 이상의 유전적 변이체를 포함하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 다수의 유전적 변이체가 3 개 이상의 유전적 변이체를 포함하는 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성을 개인 또는 개인의 건강관리 운영자 (healthcare manager) 에게 보고하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제 26 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 신경관 결함을 갖는 자손을 갖는 것인 방법.
  31. 제 26 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 이분척추증, 구개열 또는 무뇌증을 갖는 자손을 갖는 것; 및 조산이 발생하는 것으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  32. 핵산이 표 A-X 에 나타낸 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 포함하는, 단리된 핵산 또는 이의 보체.
  33. 제 32 항에 따른, 그에 고정된 다수의 단리된 핵산을 포함하는 어레이.
  34. 하기를 포함하는, 개인에 대한 개인화된 영양적 조언 계획을 제공하는 컴퓨터 지원 방법:
    (i) 제 1 데이터세트를 데이터 처리 장치 상에 제공하고 (상기 제 1 데이터세트는 개인의 유전적 변이체의 존재와 상관관계가 있는 정보를 포함하며, 유전적 변이체는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성에 있음을 나타냄);
    (ii) 제 2 데이터세트를 데이터 처리 장치 상에 제공하고 (상기 제 2 데이터세트는 하나 이상의 생활방식 권장사항과 보조인자-의존적 효소 결핍을 매치시키는 정보를 포함함);
    (iii) (i) 의 유전적 변이체를 기준으로 개인화된 영양적 조언 계획을 생성시킴 (상기 계획은 단계 (ii) 에서 매치된 하나 이상의 생활방식 권장사항을 포함함).
  35. 제 34 항에 있어서, 개인화된 생활방식 조언 계획이 최소 및/또는 최대 권장량의 비타민 아형을 포함하는 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, 개인화된 생활방식 조언 계획이 개인의 유전적 변이체를 기준으로 하는 양으로 권장된 하나 이상의 보조인자를 포함하는 방법.
  37. 제 34 항에 있어서, 고유한 식별자 코드를 사용하여 인터넷을 통해 개인에게 계획을 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  38. 제 34 항에 있어서, 개인 또는 그의 대리인에게 무선으로 계획을 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  39. 제 34 항에 있어서, I-Phone® 을 통해 개인에게 계획을 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 제 34 항에 있어서, (ii) 의 유전적 변이체가 하나 이상의 보조인자-의존적 효소 결핍과 상관관계가 있는 다수의 유전적 변이체를 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 하나 이상의 보조인자-의존적 효소 결핍이 폴레이트/엽산 결핍인 방법.
  42. 제 34 항에 있어서, 개인의 하나 이상의 개인적 특징에 대한 정보를 포함하는 제 3 데이터세트를 데이터 처리 장치 상에 추가로 포함하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 개인적 특징이 체중, 키, 체질량 지수, 인종, 가계, 성별, 연령, 가족력, 의료 기록, 운동 습관 및 식습관으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  44. 제 34 항에 있어서, (i) 의 제 1 데이터세트 및/또는 (ii) 의 제 2 데이터세트 제공이 개인 또는 그의 대리인에 의한 각각의 데이터세트 정보 입력에 의해 실행되는 방법.
  45. 제 34 항에 있어서, 계획이 하나 이상의 웹 사이트에 대한 하이퍼링크를 포함하는 방법.
  46. 제 34 항에 있어서, 제 1 데이터세트가 표 A-X 에서 선택되는 다수의 유전적 변이체를 포함하는 방법.
  47. 하기를 포함하는 컴퓨터 시스템:
    (i) 제 1 데이터세트 및/또는 제 2 데이터세트를 처리하도록 설정된 데이터 처리 장치 (상기 제 1 데이터세트는 개인의 유전적 변이체의 존재와 상관관계가 있는 정보를 포함하며 상기 유전적 변이체는 개인이 보조인자-의존적 효소 결핍의 위험성에 있음을 나타내고, 상기 제 2 데이터세트는 하나 이상의 생활방식 권장사항과 보조인자-의존적 효소 결핍을 매치시키는 정보를 포함함); 및
    (ii) 개인의 유전적 변이체를 기준으로 개인화된 영양적 조언 계획이 생성되도록 설정된 출력 장치 (상기 계획은 (i) 에서 매치된 하나 이상의 생활방식 권장사항을 포함함).
  48. 제 47 항에 있어서, 제 1 데이터세트 및/또는 제 2 데이터세트 상에 정보를 입력하기 위해 설정된 입력 장치를 추가로 포함하는 컴퓨터 시스템.
  49. 제 48 항에 있어서, 입력 장치가 개인의 하나 이상의 개인적 특징에 대한 정보를 입력하는 것으로 설정된 컴퓨터 시스템.
  50. 하기를 포함하는, 개인에 대한 개인화된 영양적 조언 계획을 제공하는 비즈니스 방법:
    (a) 개인의 생물학적 샘플로부터의 하나 이상의 유전적 변이체의 존재 또는 부재에 관련되는 정보를 수집하고 (상기 하나 이상의 유전적 변이체는 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량에 비해 보조인자의 1% 이상으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있음);
    (b) 하나 이상의 유전적 변이체가 생물학적 샘플에서 검출되는 경우 개인에 대한 보조인자의 상이한 양을 권장함.
  51. 제 50 항에 있어서, 유전적 변이체가 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량보다 적어도 1% 초과로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 방법.
  52. 제 50 항에 있어서, 유전적 변이체가 하나 이상의 유전적 변이체가 결핍된 개인에 대한 권장량보다 적어도 1% 미만으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 방법.
  53. 제 50 항에 있어서, 유전적 변이체가 500% 이상으로 상이한 보조인자의 권장량과 상관관계가 있는 방법.
  54. 제 50 항에 있어서, 개인이 보조인자 구제가능 병상에 대한 위험성 또는 소인을 갖는 여성인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 신경관 결함을 갖는 자손을 갖는 것인 방법.
  56. 제 54 항에 있어서, 보조인자 구제가능 병상이 이분척추증, 구개열 또는 무뇌증을 갖는 자손을 갖는 것, 또는 조산이 발생하는 것에서 선택되는 방법.
  57. 제 54 항에 있어서, 개인이 임신한 여성이며 보조인자 구제가능 병상이 이분척추증을 갖는 자손을 갖는 것인 방법.
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